Штам penicillium tardum – продуцент позаклітинної a-l-рамнозидази

Реферат: Штам Penicillium tardum - продуцент позаклітинної -L-рамнозидази, що зареєстрований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під номером 1MB F-100074. UA 93345 U (54) ШТАМ PENICILLIUM TARDUM - ПРОДУЦЕНТ ПОЗАКЛІТИННОЇ -L-РАМНОЗИДАЗИ UA 93345 U UA 93345 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнологічної промисловості, а саме до одержання нового штаму, продуценту ферменту α-L-рамнозидази. α-L-Рамнозидаза [К.Ф. 3.2.1.40] - гідролітично відщеплює термінальні невідновлені залишки L-рамнози, що присутні як в синтетичних, так і природних глікозидах, оліго-, полісахаридах, гліколіпідах і різних глікокон'югатах: похідних флавоноїдів - рутин, неогесперидин, гесперидин, нарингін, кверцитрин; сапонінах - гінзенозидах; терпенових глікозидах -азіатикозидах. Лише у кверцитрині L-рамноза безпосередньо зв'язана з агліконовою частиною, в той час як всі інші субстрати - це глікозиди, в яких L-рамноза зв'язана з β-D-глюкопіранозильною одиницею за допомогою різних типів глікозидних зв'язків: α-1,2, α-1,4 та α-1,6. α-L-Рамнозидази використовують для створення на основі глікозидів рослинного походження, таких як рутин, кверцитрин, гесперидин засобів для лікування серцево-судинних захворювань, препаратів з противірусною та імунотропною дією. Гідролізуючи терпенові глікозиди, фермент сприяє вивільненню ароматичних сполук, які підсилюють аромат виноградних соків і вин тому використовуються в харчовій промисловості. Запропонований штам Реnісillium tardum (Saito) 1MB F-100074 - продуцент позаклітинної αL-рамнозидази - ізольований з повітря лабораторії в Інституті мікробіології і вірусології НАН України. Знаходиться в колекції живих культур Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Відомо, що α-L-рамнозидазу здатні синтезувати деякі ссавці [1], рослини [2], а також мікроорганізми - представники різних таксономічних груп. В першу чергу це мікроміцети, серед яких найбільша кількість продуцентів глікозидаз [3]. На сьогодні в промисловості використовуються ферментні препарати Реnісillium decumbens і Aspergillus niger, які синтезують нарингіназу і гесперидиназу відповідно (Sigma-Aldrich, USA). Проте найбільш вивченими є бактеріальні продуценти α-L-рамнозидаз, які виявлені серед Bacteroides, Fusobacterium K-60, Sphingomonas paucinmobilis, Bacillus sp., Clostridium stercorarium [4, 5]. Але всі ці продуценти синтезують внутрішньоклітинні α-L-рамнозидази, що значно ускладнює їх виділення, тому є економічно не рентабельним. Оскільки більшість мікробних продуцентів має ряд серйозних недоліків, пошук нових, більш ефективних продуцентів продовжує залишатися актуальним питанням, враховуючи те, що в Україні продуценти α-L-рамнозидаз взагалі відсутні. Найбільш близьким до корисної моделі по технічній суті та результату, що досягається, є штам Реnісillium sp. [3], при глибинному культивуванні якого в певних умовах можна одержати ферментний препарат a-L-рамнозидази з активністю 0,5 Од/мг білка (w-нітрофенільний субстрат). Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості Штам мікроскопічного гриба Реnісillium tardum добре росте на природних (сусло-агар, картопляно-глюкозний агар), штучних (агаризоване середовище Сабуро) та синтетичних середовищах (агаризоване середовище Чапека). На всіх середовищах при t 26-28 °C мікроміцет характеризується обмеженим ростом. На 14-ту добу культивування діаметр колонії досягає 1,52 см. На середовищі Чапека колонії пухнасті, оксамитові, ростуть обмежено. На початкових етапах культивування колонії білі, на 7-му добу із початком спороношення набувають сірозеленого кольору. Середина колонії піднята над середовищем, край колонії (0,5-5 мм) білий, проте на 7-му добу росту починає жовтіти. На 14-ту добу колонія - сіро-жовто-зеленого кольору. Реверзум колонії спочатку безбарвний, потім - жовтий, на 14-ту добу -жовто-коричневий. Запах не виражений, пліснявий. Утворення спороношення починається на 7-му добу. Китиці - типово бівертицелятні, симетричні, інколи знаходяться на різних рівнях. Конідієносці - різної величини. Утворюються на субстратных гіфах або відходять від повітряних (50-100  2,5-3 мкм), гладенькі, безбарвні. Метулі утворюються пучками по 5-8 штук на конідієносцях, 9-10  2,5 мкм, інколи - 12  2,5 мкм. Стеригми ланцетовидні із високою звуженою до верху шийкою, від 5 до 8 штук в пучках, паралельні, 8-9  1,7-2,5 мкм. Конідії еліптичні, із потовщеною оболонкою, інколи злегка шорсткуваті, 3-3,5  2-2,5 мкм, інколи зустрічаються шароподібні до 3 мкм в діаметрі. На сусло-агарі ріст починається на 5-ту добу, на 14-ту - від 1 мм до 1,5 см. Колонії темнозеленого кольору із вкрапленнями жовтого, край колонії весь час залишається білим (1-1,5 мм). Колонія пухнаста, оксамитова, із піднятим центром. Реверзум жовтуватого кольору. Морфологічні особливості як на середовищі Чапека. На картопляно-глюкозному агаризованому середовищі колонії ростуть обмежено: від 1 см на 5-ту добу до 1,5-2 см на 14-ту. На цьому середовищі колонії сіро-жовто-зеленого кольору. Колонії пухнасті, оксамитові, підняті в центрі. Край колонії жовтий, пухнастий, до 1,5 мм. 1 UA 93345 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Реверзум колонії світло-жовтого кольору, в центрі - коричневий. Запах - пліснявий. Морфологія як на сусло-агарі і картопляно-глюкозному агарі. На середовищі Сабуро ростуть обмежено. На 5-ту добу культивування при 26-28 °C колонії досягають 0,5 см в діаметрі, на 14-ту- до 2 см. Колонії бархатисті, густо пухнасті, темно-сірозеленого кольору, в центрі переплітаються жовто-зелені гіфи. Край колонії білий. На цьому середовищі немає піднятого центру. Реверзум - жовто-коричневий. Китиці - типово бівертицилятні, такі ж, як і на середовищі Чапека. Ферментація джерел вуглецю: відсутня. Асиміляція джерел вуглецю: асимілює: моносахариди (арабінозу, галактозу, глюкозу, ксилозу, манозу, рамнозу, сорбозу); дисахариди (мальтозу, лактозу, сахарозу); трисахариди (рафінозу), багатоатомні спирти (маніт, сорбіт, дульцит), а також соєве та кукурудзяне борошно. Штам редукує нітрати до нітритів. Фізіолого-біохімічні властивості Відношення до вуглецевого живлення: культура добре засвоює моносахариди - арабінозу, галактозу, глюкозу, ксилозу, L-рамнозу, дисахариди - лактозу, мальтозу, сахарозу, спирти дульцит, манніт, інозит, сорбіт, а також соєве борошно. Тільки L-рамноза забезпечує здатність культури до синтезу α-L-рамнозидази. Відношення до азотного живлення: однаково добре засвоює нітратний та амонійний азот. Із органічних джерел азоту асимілює пептон, гліцин, сечовину, дріжджовий автолізат. Найбільшу біосинтетичну активність забезпечує нітрат натрію і дріжджовий автолізат. Штам зберігається на сусло-агарі при 5 °C. Ідентифікація проведена за визначником: Пидопличко Н.М. Пенициллин / К.: Наук, думка, 1972. - 150 с Штам належить до групи авірулентних мікроорганізмів [6-9], не здатних до інвазії та змін внутрішніх органів досліджених теплокровних тварин - безпородних білих мишей. Середньодієва доза перевищує рекомендоване максимальне порогове значення для мало патогенних штамів культур грибів: ЕД50 per os > 40, ЕЦ50 в/ч > 12 млн. спор/мишу [7] Відношення до кисню: облігатний аероб. Відношення до температури: мезофіл, оптимальна температура для росту та біосинтезу ферменту 20-25 °C. Відношення до кислотності поживного середовища: культура росте в діапазоні рН від 5,0 до 8,0. Оптимальне вихідне значення рН середовища для синтезу ферменту становить 6,0, в процесі росту та ферментації спостерігається зростання рН до 7,0. Поживним середовищем для ферментації є середовище наступного складу, (г/л): рамноза 4; NaNO3-2,0; КН2РО4-1,0; MgSO4  7H2O-0,5; КСl-0,5; FeSO4 7H2O-0,015; вихідне значення ρΗ5,0. Вирощування грибної культури проводять в глибинних умовах у колбах Ерленмейєра (750 мл) на качалці, що робить 250 об/хв… (рівень аерації 16,76 мг О 2/лгод.) при 20-25 °C впродовж 5 діб. Засів поживного середовища проводили 10 %-ним тридобовим інокулюмом. Біомасу відділяли фільтруванням, ферментативну активність визначали у супернатанті культуральної рідини. Як субстрат для визначення активності використовували я-нітрофеніл-α-Lрамнопіранозид. Для визначення активності ферменту до 0,1 мл його розчину додавали 0,2 мл 0,1 Μ фосфатно-цитратного буферу (ФЦБ) рН 5,0 та 0,1 мл 0,01 Μ розчину субстрату у ФЦБ. Реакційну суміш інкубували протягом 10 хв. при температурі 37 °C. Реакцію зупиняли додаванням 2 мл 1 Μ розчину бікарбонату натрію. До контролю додавали ті ж компоненти, але у зворотному порядку. Кількість n-нітрофенолу, який було відщеплено у результаті гідролізу, визначали колориметричним методом на спектрофотометрі СФ-26 за поглинанням при 400 нм. За одиницю активності ферменту приймали таку його кількість, яка гідролізу є 1 мкмоль субстрату за 1 хв. в умовах досліду [10]. Встановлено, що при зберіганні та пересівах впродовж 1,5 років рівень ферментативної активності у Penicillium tardum штаму 1MB F-100074 не знижується. Активність α-L-рамнозидази, яка синтезується штамом Реnісillium tardum 1MB F-100074, в оптимальних умовах у культуральній рідині дорівнює 0,46-1,1 Од/мг білка. Перевагою запропонованого продуцента є його здатність синтезувати високоактивну та термостабільну a-L-рамнозидазу, відсутність сезонності та токсичності, що є технологічно ефективним. Ферментний препарат, одержаний з цієї культури осадженням сульфатом амонію (90 % насичення) здатний ефективно працювати при фізіологічних значеннях рН середовища (3,0-7,0) з помітним піком активності при рН 5,0. Фермент стабільний при зазначених вище значеннях рН впродовж доби. Ферментний препарат активний при 4-80 °C, з максимальною активністю при 60 °C. Термостабільність препарату при 25 °C повністю зберігається впродовж доби; при 60 °C - 120 хв. Препарат зберігає активність впродовж 1 року. 2 UA 93345 U 5 10 15 20 25 Запропонований фермент може знайти використання у харчовій промисловості та медикотехнологічних процесах. Таким чином, виділено новий штам, який, у порівнянні з відомими, має інші культуральні ознаки і є новою культурою зі стійкими біохімічними властивостями. Джерела інформації:: 1. Qian S., Yu H., Qian S. Purification and characterization of dioscin-a-L-rhamnosidase from pig liver // Chem. and Pharm. Bulletin. - 2005. - Vol. 53, № 8. - P. 911-914. 2. Locatelli M., Epifano F., Genovese S. Anthraquinone profile, antioxidant and antimicrobial properties of bark extracts of Rhamnus catharticus and R. orbiculatus II Natural Product Communications. - 2011. - Vol. 6, № 9. - P. 1275-1280. 3. Yadav V., Yadav P. K., Yadav S., Yadav K. D. S. α-L-Rhamnosidase: A review // Process Biochemistry. - 2010. - Vol. 45, № 8. - P. 1226-1235. 4. Варбанець Л. Д., Борзова Η. Β. - Глікозидази мікроорганізмів і методи їх дослідження / К.: Наук. Думка, 2010. - 437 с 5. Manzanares P., Valles S., Ramon D., Orejas M. α-L-Rhamnosidase: old and new insights // Industrial Enzymes, Springer, 2007. - P. 117-140. 6. Медико-біологічні дослідження виробничих штамів мікроорганізмів і токсико-гігієнічна оцінка мікробних препаратів, визначення їх безпеки та обґрунтування гігієнічних нормативів і регламентів. Методичні вказівки МОЗ України. Київ, 2004. 7. Методические рекомендации "Обоснование критериев оценки патогенности мицелиальных гибов-продуцентов и допустимости их применения в промышленности, г. Ангарск, 1986. 8. Методы исследования в ветеринарной микологии. Курасова В.В. и др. - М.: "Колос", 1971. 9. Справочник по микробиологическим методам исследования. Под ред. Биргер Μ. - Μ.: "Медицина", 1983. 10. Romero С, Manjon Α., Bastida J. A method for assaying rhamnosidase activity of naringinase / Analytical Biochemistry. 1985. - Vol. 149, № 2. - P. 566-571. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Штам Penicillium tardum - продуцент позаклітинної -L-рамнозидази, що зареєстрований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під номером 1MB F-100074. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3