Трансгенний варіант цукрового буряку gm rz13

Реферат: Винахід належить до трансгенного варіанта цукрового буряку, позначеного як GM RZ13, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка є унікальною для варіанта GM RZ13. Також винахід належить до пари нуклеотидних праймерів, які функціонують разом у зразку у присутності як матриця ДНК цукрового буряку варіанта GM RZ13, способу виявлення присутності молекули нуклеїнової кислоти, яка є унікальною для варіанта GM RZ13 та насіння рослин цукрового буряку, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка є унікальною для варіанта GM RZ13. UA 106061 C2 (12) UA 106061 C2 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується нового трансгенного варіанта цукрового буряка, позначеного як GM RZ13, і нуклеїнових кислот, які є унікальними для варіанта GM RZ13. Винахід стосується також аналізів, призначених для виявлення присутності варіанта GM RZ13 на основі послідовностей ДНК рекомбінантних конструкцій, вбудованих у геном цукрового буряка, які приводять до одержання варіанта GM RZ13, і геномних послідовностей, що фланкують сайт інсерції. Представлені також варіанти здійснення винаходу, що стосуються рослин цукрового буряка, що містять генотип GM RZ13, які є стійкими до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка (BNYVV), способів одержання рослини цукрового буряка шляхом схрещування рослини цукрового буряка, що містить генотип GM RZ13, з такою ж рослиною або з іншим сортом цукрового буряка. Насіння рослин цукрового буряка, що містять генотип GM RZ13, також є об'єктами даного винаходу. Передумови створення винаходу Даний винахід стосується в цілому галузі молекулярної біології рослин, трансформації рослин і селекції рослин. Більш конкретно винахід стосується стійких до хвороб трансгенних рослин цукрового буряка, що містять новий трансгенний генотип, і способів виявлення присутності ДНК рослини цукрового буряка в зразку, і комбінацій цих варіантів. Вірус некротичного пожовтіння жилок буряка (BNYVV) є збудником ризоманії (Tamada і Baba, 1973), однієї з найбільш важливих хвороб цукрового буряка в усьому світі, яка може знижувати врожайність чутливих сортів на величину, що становить аж до приблизно 90 % (Johansson, 1985). В інфікованих рослин цукрового буряка може бути також знижений вміст цукру в головному корінні на величину, що становить від приблизно 17 % до приблизно 11 %. Ризоманія вперше описана в Італії 1950-их роках (Canova, 1959), але в цей час є дані про те, що нею уражено більше 80 % площ, на яких культивується цукровий буряк, в усьому світі (Lennefors і ін., 2005). BNYVV передається за допомогою Polymyxa betae (Tamada, 1975), представника протоктистів, які живуть у ґрунті, спори якого в спочиваючому стані можуть залишатися живими в ґрунті протягом більше ніж 15 років (Abe і Tamada, 1986). Характерними симптомами захворювання ризоманії ("сказ коренів") у цукрового буряка є наявність пожовтілого, карликового, маленького головного кореня і підвищена кількість волокнистого кореня. Для судинних тканин головного кореня характерна зміна кольору на яснокоричневий. У рідких випадках вірус поширюється системним шляхом на листя, приводячи до некротичного пожовтіння жилок, але, як правило, вірус залишається обмеженим кореневим тканинами (Johansson, 1985; Tamada, 1975). Різні генетичні штами або ізоляти BNYVV ідентифіковані за допомогою аналізів на основі поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів або поліморфізму конформації одного ланцюга (Kruse і ін., 1994; Koenig і ін., 1995). Основні групи (типи) європейських ізолятів BNYVV позначені як A, B і P, з яких тип A є найбільш широко розповсюдженим. Для типів A і B характерна наявність чотирьох одноланцюгових геномних РНК, а тип P містить також п'ятий вид РНК. P-тип вважається більш патогенним або вірулентим, ніж A- і B-типи (Heijbroek і ін., 1999). Оскільки інші стратегії, такі, наприклад, як біологічна боротьба або внесення мінеральних добрив, не забезпечують достатні рівні стійкості або вимагають застосування фунгіцидів або фумігантів, то, як правило, вважається, що для гарантії економічної рентабельності виробництва цукрового буряка в ґрунтах, заражених ризоманією, необхідно здійснювати інтрогресію зумовлюючих стійкість генів у культивари цукрового буряка. Внаслідок поширення ризоманії компанії, що займаються виведенням нових сортів цукрового буряка, уже протягом 20 років інтенсивно здійснюють програми з селекції з метою створення стійких до ризоманії сортів. Перший випущений на ринок стійкий до ризоманії сорт, позначений як "Rizor", був отриманий на основі зародкової плазми з італійських джерел (Biancardi і ін., 2002; De Biaggi, 1987). Однак найбільша кількість відомих до теперішнього часу комерційних стійких до ризоманії сортів отримані з використанням як джерела лінії Holly (Lewellen і ін., 1987), у якій стійкість до BNYVV обумовлює основний домінантний ген Rz1 (Pelsy і Merdinoglu, 1996; Scholten і ін., 1996). У цей час цей традиційний тип стійкості присутня приблизно в 90 % стійкі до ризоманії сортів цукрового буряка. Іншими джерелами стійкості до BNYVV є WB41 і WB42, які були отримані із двох рослин Beta vulgaris ssp maritime, зібраних у Данії (Lewellen і ін. 1987; Whitney, 1989). Створена лінія стійкої до ризоманії цукрового буряка C48 шляхом схрещування WB41 і WB42 з лінією C37 (Lewellen і Whitney, 1993). У цей час у декількох сортах об'єднана стійкість, властива лінії C48, зі стійкістю, властивою лінії Holly. Іншими джерелами стійкості до ризоманія є WB151, WB169, C28 і C50 (Lewellen, 1995). Однак стійкість до BNYVV рослин цукрового буряка, отримана із традиційних джерел, імовірно, є лише частковою, оскільки має місце зараження рослин вірусом, який потім починає 1 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розмножуватися. Хоча розмноження вірусу є більш низьким у порівнянні з розмноженням у чутливих генотипах, такий рівень розмноження вірусу усе ще дає йому можливість поширюватися. Крім того, при підвищених рівнях зараження вірусом існує ризик того, що традиційні джерела не забезпечать достатній рівень стійкості. Крім того, селекція за ознакою стійкості до ризоманії обмежена стійкістю традиційної ознаки стійкості в пулі зародкової плазми цукрового буряка. Так, виражені симптоми ризоманії, які викликаються високопатогеними зміненими штамами BNYVV, виявлені в стійких до ризоманії стійких сортів, у яких як джерела застосовувалася лінії Holly (Liu і ін., 2005). Ці високопатогенні змінені штами BNYVV були виявлені в деяких областях у США і Європі протягом декількох останніх років. Досить імовірно (і вже навіть виявлено в польових умовах), що часткова стійкість, обумовлена традиційними джерелами стійкості (типу Holly або C48) долається цими високопатогеними зміненими штамами BNYVV. На противагу інтрогресії генів із традиційних джерел стійкості використання трансгенної експресії виведених з вірусу послідовностей є альтернативним розв'язанням питання боротьби з вірусними хворобами, ця стратегія відома як виведена з патогену стійкість. Концепція виведеної з паразита або патогену стійкості була створена Sanford і Johnston (1985) і вперше випробувана на трансгенних рослинах тютюну (Nicotiana tabacum), які експресують ген оболонкового білка вірусу тютюнової мозаїки (Powell-Abel і ін., 1986). Після цього було продемонстровано, що вона застосовна для багатьох різних культур і відносно великої кількості вірусів (Kaniewski і Lawson, 1998). Крім рослин, які експресують гени оболонкових білків, стійкість була досягнута також у рослин, які експресують і інші вірусні послідовності типу, наприклад, реплікази або зумовлюючих дисфункцію транспортних білків (Baulcombe, 1996). Відкриття того факту, що рослини мають вроджену захисну систему відносно вірусних інвазій, основою якої є специфічне для послідовності розщеплення чужорідних або аномальних РНК, позначене як пост-транскрипційне мовчання генів, знайшло широке застосування і являє собою інструмент для створення стійкості до вірусів і значно підвищує можливості трансгеної експресії виведених з вірусів послідовностей (Waterhouse і ін., 1999; Voinnet, 2001). Були висловлені припущення про механізми, що лежать в основі трансгенної стійкості до вірусних інфекцій. Однак, дані про те, що трансгенна стійкість до вірусів і пост-транскрипційне мовчання генів (PTGS) у деяких випадків спільно беруть участь у багатьох характеристиках, привели до виникнення нових поглядів і з'явилися передумови створення стійкості до вірусів у рослин (Waterhouse і ін., 2001; Tenllado і ін., 2004). Встановлено, що трансформація тютюну конструкцією, що містить інвертований повтор вірусних послідовностей, які виведені з вірусу картоплі Y, що приводить до трансгенної експресії dsРНК, забезпечує високий рівень стійкості з винятково високою частотою (Waterhouse і ін., 1998). Таким чином, може виявитися доцільним забезпечувати стійкість до BNYVV у цукрового буряка шляхом трансформації цукрового буряка конструкцією, що містить інвертований повтор вірусних послідовностей, виведених з BNYVV, що приводить до трансгенної експресії dsРНК, що забезпечує високі рівні стійкості до вірусу. На експресію чужорідних генів у рослинах може впливати їх положення на хромосомі, можливо через структуру хроматину або близькості регулюючих транскрипцію елементів до сайту інтеграції (див., наприклад, Weising і ін., "Foreign Genes in Plants", Ann. Rev. Genet. 22, 1988, стор. 421-477). Із цієї причини часто необхідно здійснювати скринінг великої кількості варіантів для ідентифікації варіанта, що відрізняється оптимальною експресією інтодукованого гена, що представляє інтерес. Наприклад, для рослин і інших організмів встановлено, що між індивідуальними відібраними варіантами можуть існувати широкі варіації в рівнях експресії гетерологічного гена, інтродукованого в хромосому рослинного генома. Можуть бути також відмінності в просторових або часових схемах експресії, наприклад, відмінності у відносному рівні експресії трангсгена в різних рослинних тканинах, що може не відповідати схемам, очікуваним на основі регулюючих транскрипцію елементів, що присутні в інтродукованій генній конструкції. Варіант, що характеризується необхідним рівнем або схемою експресії трансгена, можна застосовувати для інтрогресії трансгена в інші генетичні фони шляхом статевого аутокросингу з використанням традиційних методів розведення. Потомство таких схрещувань зберігає характеристики трансгенної експресії вихідного трансформанту. Цю стратегію застосовують для гарантії надійності генної експресії в ряді сортів, які добре адаптовані до місцевих умов оброблення. Таким чином, актуальним є також забезпечення можливості виявлення присутності конкретного варіанта в рослині з метою розв'язання питання про те, чи буде потомство статевого схрещування містити трансген, що представляє інтерес. Крім того, важливим є спосіб виявлення конкретного варіанта, що задовольняє, наприклад, вимогам, яким необхідно відповідати на стадії надходження в продаж і розробки етикетки для харчових продуктів, 2 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отриманим з рекомбінантних культурних рослин. Виявлення присутності трансгена можна здійснювати за допомогою добре відомого методу виявлення нуклеїнових кислот, включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) термальну ампліфікацію (полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)) з використанням полінуклеотидних праймерів або ДНК-гібридизацію з використанням нуклеотидних зондів. Як правило, для простоти й однорідності реагентів і методологій, застосовуваних для виявлення конкретної конструкції ДНК, яку використовували для трансформації різних сортів рослин, ці методи виявлення, як правило, засновані на часто застосовуваних генетичних елементах, наприклад, промоторах, термінаторах і маркерних генах, оскільки для багатьох конструкцій ДНК ділянка кодувальної послідовності є взаємозамінною. У результаті такі методи можуть виявитися непридатними для дискримінації конструкцій, які відрізняються тільки за кодувальною послідовністю. Крім того, вказані методи не придатні для дискримінації різних варіантів, насамперед отриманих за допомогою однієї й тієї ж конструкції ДНК, якщо послідовність хромосомної ДНК, що прилягає до вбудованої гетерологічної ДНК ("фланкуюча ДНК"), не є відомою. Виходячи з вищевикладеного, слід вважати, що існує необхідність у стійкому до BNYVV трансгенному варіанті цукрового буряка, який відрізняється вираженою стійкістю до BNYVV, що перевищує стійкість, отриману при використанні традиційних джерел, і відрізняється стабільною стійкістю до високопатогенних змінених штамів BNYVV, які виявлені в цей час. Вказаний стійкий до BNYVV трансгенний варіант цукрового буряка містить нуклеотидні послідовності, унікальні для трансгенного варіанта цукрового буряка, які можна застосовувати для ідентифікації трансгенного варіанта цукрового буряка й для виявлення нуклеїнових кислот із трансгенного варіанта цукрового буряка в біологічному зразку. Короткий виклад суті винаходу Даний винахід стосується трансформованого цукрового буряка (Beta vulgaris L.), позначеного як GM RZ13 (або SBVR111, позначення, яке можна застосовувати взаємозамінно з позначенням GM RZ13), який має новий трансгенний генотип, що включає інвертований повтор, який містить частину транскрипту гена RNA-1 BNYVV. Ця частина гена RNA-1 BNYVV кодує ген РНК-залежної РНК-полімерази (RdRp) або реплікази. Варіант GM RZ13 може містити також ген manA (відомий також як pmi) з Escherichia coli, який кодує білок фосфоманозоізомерази (PMI), що надає клітинам цукрового буряка здатність утилізувати манозу як джерело вуглецю. Варіант GM RZ13 позначають також як SBVR111. Винахід стосується також трансгенних рослин цукрового буряка, які мають генотип, запропонований у винаході, насіння трансгенних рослин цукрового буряка, які мають генотип, запропонований у винаході, і способів одержання трансгенної рослини цукрового буряка (наприклад, гібридної рослини), яка має генотип, запропонований у винаході, шляхом схрещування інбредної лінії цукрового буряка, який має генотип, запропонований у винаході, з такою ж або іншою лінією цукрового буряка, що має інший генотип. Трансгенні рослини цукрового буряка, запропоновані у винаході, можуть мати практично всі морфологічні й фізіологічні характеристики відповідної ізогенної нетрансгенної рослини цукрового буряка додатково до характеристик, які надає рослині цукрового буряка новий генотип, запропонований у винаході. У європейському патенті EP 1169463 описане застосування послідовностей, які містять від 15 і аж до 6746 нуклеотидів геному RNA1 вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка (BNYVV), в антисмисловому підході для надання стійкості до BNYVV рослині цукрового буряка. Однак у цьому патенті не представлені які-небудь дані про польові досліди й, зокрема, відсутні дані про польові досліди на ґрунтах, заражених різними штамами BNYVV, насамперед новими й агресивними високопатогенними зміненими штамами BNYVV. Однак, з іншого боку, конкретний варіант, запропонований у даному винаході, забезпечує стійке й сильне зниження титру вірусу всіх типів BNYVV у порівнянні з варіантами із традиційною стійкістю, і, крім того, забезпечує строгий контроль нового високопатогенного штаму BNYVV. У публікації Lennefors зі співавторами (2006), яка стосується опосередковуваної dsРНК стійкості до зараження BNAVV цукрового буряка, описана трансформація цукрового буряка з використанням конструкції, запропонованої в даному винаході, і стійкі до BNYVV рослини цукрового буряка, отримані в результаті вказаної трансформації. Однак у цій публікації не представлена яка-небудь конкретна інформація, що стосується конкретного стійкого до BNYVV варіанта, запропонованого в даному винаході, і тому вона не дозволяє фахівцеві в даній галузі створювати вказаний варіант. Даний винахід стосується також композицій і способів виявлення присутності нуклеїнових кислот з варіанта GM RZ13 на основі послідовності ДНК інвертованого повтору, який містить фрагмент гена реплікази BNYVV, вбудований у геном цукрового буряка, що приводить до одержання варіанта GM RZ13, і геномних послідовностей, що фланкують вбудований сайт. 3 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Варіант GM RZ13 можна характеризувати також шляхом аналізу рівнів експресії білків PMI, а також шляхом оцінки ефективності у відношенні BNYVV. Таким чином, першим об'єктом даного винаходу є молекула нуклеїнової кислоти, насамперед виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка є унікальною для варіанта GM RZ13. Інші варіанти здійснення даного винаходу стосуються молекули нуклеїнової кислоти, переважно виділеної молекулі нуклеїнової кислоти, що містить принаймні 10 суміжних нуклеотидів гетерологічної послідовності ДНК, яка вбудована в геном рослини цукрового буряка варіанта цукрового буряка GM RZ13, і принаймні 10 суміжних нуклеотидів геномної ДНК рослини цукрового буряка, що фланкують сайт інсерції гетерологічної послідовності ДНК, вбудованої в геном рослини цукрового буряка варіанта цукрового буряка GM RZ13. У деяких варіантах цього об'єкта винаходу молекула нуклеїнової кислоти, що є цим об'єктом винаходу, може містити принаймні 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або принаймні 50 суміжних нуклеотидів гетерологічної послідовності ДНК, яка вбудована в геном рослини цукрового буряка варіанта цукрового буряка GM RZ13, і принаймні 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або принаймні 50 суміжних нуклеотидів геномної ДНК рослини цукрового буряка, що фланкують сайт інсерції гетерологічної послідовності ДНК, вбудованої в геном рослини цукрового буряка варіанта цукрового буряка GM RZ13. Слід розуміти, що поняття « принаймні х нуклеотидів" включає молекули нуклеїнових кислот, у яких кількість нуклеотидів має будь-яке чисельне значення, що починається з х, і вище. Наприклад, під поняття « принаймні 15 нуклеотидів" підпадають молекули нуклеїнових кислот, що мають 16, 17, 18, 19, 20 і більша кількість нуклеотидів. В іншому варіанті цього об'єкта винаходу вказаний молекула нуклеїнової кислоти, насамперед у виділеній формі, містить як послідовність, унікальну для варіанта GM RZ13, нуклеотидну послідовність, яка вибрана із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 і їх комплементи. В іншому варіанті цього об'єкта винаходу вказаний молекула нуклеїнової кислоти, що входить у насіння цукрового буряка, являє собою молекулу, яка депонована в NCIMB, Абердин, Шотландія під реєстраційним № 41601. Наступним об'єктом даного винаходу є молекула нуклеїнової кислоти, насамперед виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить принаймні одну стикувальну послідовність варіанта GM RZ13. Стикувальна послідовність охоплює ділянку стику між гетерологічною послідовністю ДНК, що містить інвертований повтор, який включає фрагмент гена реплікази BNYVV, вбудований у геном цукрового буряка, і ДНК із геному цукрового буряка, яка фланкує сайт інсерції, і вона є діагностичною для варіанта GM RZ13. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу стикувальну послідовність вибирають із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 і їх комплементи. Наступним об'єктом даного винаходу є молекула нуклеїнової кислоти, насамперед виділена молекула нуклеїнової кислоти, що з'єднує гетерологічну молекулу ДНК із геномом рослини цукрового буряка у варіанті цукрового буряка GM RZ13, яка містить послідовність, що має від приблизно 11 до приблизно 20 суміжних нуклеотидів. Слід розуміти, що довжина вказаної виділеної нуклеотидної послідовності може мати будь-яке чисельне значення у вказаному діапазоні. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу нуклеїнову кислоту вибирають із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 і їх комплементи. Іншим об'єктом винаходу є амплікон, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, запропоновану у винаході. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу амплікон містить молекулу нуклеїнової кислоти, запропоновану у винаході, яку вибирають із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 і їх комплементи. Ще одним об'єктом винаходу є праймерні фланкуючі послідовності, призначені для виявлення варіанта GM RZ13. Вказані праймерні фланкуючі послідовності містять нуклеотидну послідовність, що складається принаймні з 10-15 суміжних нуклеотидів з 5’- або 3’-фланкуючої послідовності. І в цьому випадку слід розуміти, що довжина вказаної праймерної фланкуючої послідовності може мати будь-яке чисельне значення в вказаному діапазоні. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу суміжний нуклеотиди вибирають із нуклеотидів 1-237 (включно) SEQ ID NO: 8 (умовно позначена в контексті даного опису як 5'-фланкуюча послідовність, ця послідовність представлена в даному описі як SEQ ID NO: 9) або її комплементів. В іншому варіанті цього об'єкта винаходу суміжний нуклеотиди вибирають із нуклеотидів 1-347 (включно) SEQ ID NO: 2 (умовно позначена в контексті даної заявки як 3'-фланкуюча послідовність, ця послідовність представлена в даному описі як SEQ ID NO: 3) або її комплементів. Наступним об'єктом даного винаходу є пара полінуклеотидних праймерів, що містить перший полінуклеотидний праймер і другий полінуклеотидний праймер, які функціонують разом у присутності в зразку як матриця ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13 з утворенням 4 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амплікону, діагностичного для варіанта GM RZ13. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу одна із праймерних послідовностей являє собою або є комплементарною до геномної послідовності рослини цукрового буряка, яка фланкує сайт інсерції гетерологічної послідовності ДНК, вбудованої в геном рослини цукрового буряка варіанта цукрового буряка GM RZ13, а друга полінуклеотидна праймерна послідовність являє собою або є комплементарною до гетерологічної послідовності ДНК, вбудованої в геном рослини цукрового буряка варіанта цукрового буряка GM RZ13. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу одну із праймерних послідовностей вибирають із SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 8 і SEQ ID NO: 9. В іншому варіанті цього об'єкта винаходу перший полінуклеотидний праймер містить принаймні 10 суміжних нуклеотидів з SEQ ID NO:3 або з положень 461-807 SEQ ID NO: 2, або їх комплементи, або містить принаймні 10 суміжних нуклеотидів з SEQ ID NO:9 або з положень 1-237 SEQ ID NO: 8, або їх комплементи. У переважному варіанті здійснення винаходу перший полінуклеотидний праймер містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 і їх комплементи. В іншому варіанті цього об'єкта винаходу другий полінуклеотидний праймер містить принаймні 10 суміжних нуклеотидів, виведених з положень 1-460 послідовності, представленої в SEQ ID NO: 2, або виведених з положень 238-484 послідовності, представленої в SEQ ID NO: 8, або їх комплементи. У наступному варіанті цього об'єкта винаходу другий полінуклеотид праймер вибирають із групи, яка включає SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26 і їх комплементи. В іншому варіанті цього об'єкта винаходу пару праймерів вибирають із групи пар праймерів, що включає (a) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 13, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 18, і їх комплементи; (б) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 14, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 10 або SEQ ID NO: 18, і їх комплементи; (в) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 15, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 18, і їх комплементи; (г) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 16, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 18, і їх комплементи; (д) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 12, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в будь-якій з SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, в SEQ ID NO: 6, і їх комплементи; (е) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 19, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 24, і їх комплементи; (ж) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 20, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 24, і їх комплементи; і (з) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 25, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 26, і їх комплементи. В іншому варіанті цього об'єкта винаходу пару праймерів вибирають із групи пар праймерів, що включає (a) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 13, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 11 або в SEQ ID NO: 17, і їх комплементи; (б) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 12, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 21 або в SEQ ID NO: 22, і їх комплементи; полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 19, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 23, і їх комплементи; і полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 20, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 23, і їх комплементи. Наступним об'єктом винаходу є способи виявлення присутності ДНК, унікальної для варіанта GM RZ13, у біологічному зразку. Вказані способи полягають у тому, що: (а) приводять у контакт зразок, що містить ДНК, з парою праймерів, які при їх застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномної ДНК із варіанта цукрового буряка GM RZ13 продукують амплікон, який є діагностичним для варіанта цукрового буряка GM RZ13; (б) здійснюють реакцію 5 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ампліфікації нуклеїнової кислоти, одержуючи тим самим амплікон; і (в) виявляють амплікон. У переважному варіанті здійснення винаходу застосовувана у вищевказаному способі пара праймерів являє собою одну із вказаних вище пар праймерів, запропонованих у даному винаході. В іншому переважному варіанті здійснення винаходу спосіб виявлення присутності ДНК, унікальної для варіанта GM RZ13, у біологічному зразку, являє собою або заснований на застосуванні гелю аналіз, який включає стадії, на яких (I) приводять у контакт зразок, що містить нуклеїнові кислоти цукрового буряка, з парою праймерів, які мають послідовності, представлені в SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO: 12, або парою праймерів, які мають послідовності, представлені в SEQ ID NO: 13 і SEQ ID NO: 18; (II) здійснюють реакцію ампліфікації нуклеїнової кислоти, одержуючи тим самим амплікон; і (III) виявляють амплікон; або TaqMan -аналіз, який включає стадії, на яких (I) приводять у контакт зразок, що містить нуклеїнові кислоти цукрового буряка, з парою праймерів, які мають послідовності, представлені в SEQ ID NO: 25 і SEQ ID NO: 26, і TaqMan-зондом, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 27; (II) здійснюють реакцію ампліфікації нуклеїнової кислоти, одержуючи тим самим амплікон; і (III) виявляють підвищення флуоресценції, що випромінюється репортерним барвником, відщепленим від зонда й відділеним від гасника барвником під час стадії ампліфікації (II). В іншому варіанті здійснення винаходу вказаний метод полягає в тому, що: (a) приводять у контакт зразок із зондом, який гібридизується в строгих умовах з геномною ДНК із варіанта GM RZ13 і не який гібридизується в строгих умовах із ДНК із контрольної рослини цукрового буряка; (б) піддають зразок і зонд гібридизації в строгих умовах і (в) визначають гібридизацію зонда з молекулою нуклеїнової кислоти. В іншому варіанті цього об'єкта винаходу амплікон або зонд містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 і їх комплементи. Наступним об'єктом винаходу є набір, призначений для виявлення нуклеїнових кислот, унікальних для варіанта GM RZ13, у біологічному зразку. Набір включає принаймні одну молекулу нуклеїнової кислоти, що містить суміжні полінуклеотиди, довжина яких достатня для того, щоб функціонувати як праймер або зонд в методі виявлення нуклеїнової кислоти, і які при ампліфікації або гібридизації з нуклеотидною послідовністю-мішенню в зразку з наступним виявленням амплікону, або гібридизації з послідовністю-мішенню, є діагностичними відносно присутності в зразку нуклеотидних послідовностей, унікальних для варіанта GM RZ13. Набір містить також інші матеріали, необхідні для здійснення методів гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу молекула нуклеїнової кислоти, що входить у набір, містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 і їх комплементи. Даний винахід стосується також рослини цукрового буряка, що має трансгенний генотип, запропонований у винаході, де трансгенний генотип обумовлює стійкість рослини цукрового буряка до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка або здатність утилізувати манозу як джерело вуглецю, або як стійкість до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, так і здатність утилізувати манозу як джерело вуглецю. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу трансгенний генотип, що обумовлює стійкість рослини цукрового буряка до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка й здатність утилізувати манозу як джерело вуглецю, містить кодувальну послідовність pmi. Одним з об'єктів винаходу є рослини й насіння цукрового буряка, стійкі до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, які містять одну або декілька молекул нуклеїнових кислот, запропонованих у винаході. Одним із прикладів рослини цукрового буряка, стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, є цукровий буряк, насіння якого, що містять молекули нуклеїнових кислот, запропоновані у винаході, депоноване 11 грудня 2008 г в NCIMB і мають реєстраційний № 41601. Винахід стосується також рослин, отриманих з рослини цукрового буряка, стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, запропонованого в даному винаході, насіння якого депоноване в NCIMB під реєстраційним № 41601. Ще одним об'єктом винаходу є насіння, депоноване в NCIMB під реєстраційним № 41601, а також трансгенна стійка до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослина цукрового буряка, яка утворюється, виведена або отримана із цього насіння. Ще одним об'єктом даного винаходу є біологічний зразок, отриманий з рослини, тканини або насіння цукрового буряка GM RZ13, де зразок містить нуклеотидну послідовність, яка являє собою або є комплементарною до послідовності, унікальної для варіанта GM RZ13, і де послідовність можна виявляти в зразку за допомогою методу ампліфікації нуклеїнових кислот або методу гібридизації нуклеїнових кислот. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу 6 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотидна послідовність являє собою або є комплементарною до SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8. Іншим об'єктом даного винаходу є екстракт, отриманий з рослини, тканини або насіння цукрового буряка GM RZ13, де зразок містить нуклеотидну послідовність, яка являє собою або є комплементарною до послідовності, унікальної для варіанта GM RZ13, і де послідовність можна виявляти в зразку за допомогою методу ампліфікації нуклеїнових кислот або методу гібридизації нуклеїнових кислот. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу нуклеотидна послідовність являє собою або є комплементарною до SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8. У переважному варіанті здійснення винаходу метод ампліфікації нуклеїнових кислот або гібридизації нуклеїнових кислот, який можна застосовувати для виявлення нуклеотидної послідовності, яка являє собою або є комплементарною до послідовності, унікальної для варіанта GM RZ13, у біологічному зразку, запропонованому в даному винаході, або в екстракті, запропонованому в даному винаході, являє собою метод виявлення присутності молекули нуклеїнової кислоти, яка є унікальною для варіанта GM RZ13, запропонованого в даному винаході й описаного вище. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб одержання рослини цукрового буряка, стійкої принаймні до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, який полягає в тому, що (a) здійснюють статеве схрещування першої батьківської рослини цукрового буряка й другої батьківської рослини цукрового буряка, де перша або друга батьківська рослина цукрового буряка містить ДНК варіанта GM RZ13, з одержанням множини рослин покоління першої генерації; (б) відбирають рослину покоління першої генерації, яка має стійкість принаймні до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, (в) дають самозапилюватися рослині покоління першої генерації, одержуючи тим самим множину рослин покоління другої генерації; і (г) відбирають із рослин покоління другої генерації рослину, яка має стійкість принаймні до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка; у якому рослини покоління другої генерації містять нуклеотидну послідовність, яка являє собою або є комплементарною до нуклеотидної послідовності, вибраної із групи, яка включає SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 7. У переважному варіанті способу одержання рослини цукрового буряка, стійкої принаймні до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, вказана перша або друга батьківська рослина цукрового буряка, застосовувана на стадії a), яка містить ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13, являє собою стійку до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослину цукрового буряка, запропоновану в даному винаході й описану вище, або рослину, отриману з насіння, запропонованого у даному винаході й описаного вище. Наступним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання стійкого до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка гібридного насіння цукрового буряка. Способи полягають у тому, що: (a) одержують стійку до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка лінію цукрового буряка як першу батьківську лінію, (б) одержують другу лінію цукрового буряка з іншим генотипом як другу батьківську лінію; де одна з батьківських лінія, отриманих на стадії (a) або стадії (б), являє собою лінію із цитоплазматичною чоловічою стерильністю (ЦЧС) і де інша батьківська лінія має чоловічу фертильність, і (в) дають рослинам батьківської лінії, що мають чоловічу фертильність, запилювати квітки батьківської лінії, що має чоловічу стерильність, дають розвиватися насінням і збирають гібридне насіння, де зібране гібридне насіння являє собою насіння стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка гібридної рослини цукрового буряка. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу, що має чоловічу стерильність (ЦЧС) батьківська лінія цукрового буряка, отримана на стадії (а) або (б), являє собою інбредну лінію цукрового буряка, яка містить нуклеотидну послідовність, запропоновану в даному винаході, яка є унікальною для варіанта GM RZ13. В іншому варіанті цього об'єкта винаходу другу батьківську лінію вибирають із групи, яка включає (a) інбредну лінію рослини цукрового буряка, стійку принаймні до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, яка має інший генотип, але містить одну або декілька або всі нуклеотидні послідовності, запропоновані в даному винаході; (б) інбредну лінію рослини цукрового буряка, стійку або толерантну принаймні до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, яка має походження з джерела, що зустрічається в природніх умовах, вибраного із групи, яка включає Holly-джерело, WB41, WB42, WB151, WB169, C28, C48, C50 або Rizor, або отримана в результаті їх схрещування; і (в) інбредну лінію рослини цукрового буряка, що не має стійкості до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка. Іншим переважним варіантом здійснення даного винаходу є гібридне насіння стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослини цукрового буряка. Відповідно одному з об'єктів даного винаходу гібридне насіння одержують за допомогою способу одержання стійкого до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка гібридного насіння цукрового буряка, запропонованого в даному винаході. Наступним об'єктом даного винаходу є стійка до вірусу 7 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 некротичного пожовтіння жилок буряка рослина цукрового буряка, отримана шляхом вирощування гібридного насіння, запропонованого в даному винаході. Переважно гібридна рослина містить ДНК варіанта цукрового бурякаGM RZ13. Іншим переважним варіантом здійснення даного винаходу є частина стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка гібридної рослини цукрового буряка, запропонованої в даному винаході. Переважно вказану частину вибирають із групи, яка включає насіння, мікроспори, протопласти, клітини, насінні зачатки, пилок, вегетативні частини, сім'ядолі, зиготи. Наступним об'єктом даного винаходу є застосування стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослини цукрового буряка або її клітин або тканин, біологічного зразка або екстракту, запропонованої в даному винаході, у способі, вибраному із групи, яка включає способи одержання цукру, способи аеробної ферментації й способи анаеробної ферментації. Переважно вказане застосування являє собою застосування стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослини цукрового буряка або її клітин або тканин, біологічного зразка або екстракту, запропонованої в даному винаході, у способі одержання цукру. Інші об'єкти даного винаходу стосуються способу одержання цукру, у якому стійка до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослина цукрового буряка або її клітини або тканини, біологічний зразок або екстракт, запропонований у даному винаході, переробляють із одержанням цукру. Крім того, даний винахід стосується цукру, отриманого за допомогою способу одержання цукру, запропонованого в даному винаході. І, нарешті, останнім об'єктом даного винаходу є спосіб одержання одного або декількох видів біопалива, вибраного із групи, яка включає етанол, бутанол, біогази та/або дизельне біопаливо, у якому стійка до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослина цукрового буряка або її клітини або тканини, біологічний зразок або екстракт, запропонований у даному винаході, переробляють із одержанням одного або декількох видів біопалива, вибраного із групи, яка включає етанол, бутанол, біогази і/або дизельне біопаливо. Крім того, винахід стосується біопалива або видів біопалива, вибраного (их) із групи, яка включає етанол, бутанол, біогази та/або дизельне біопаливо, яке (і) отримане (і) за допомогою способу одержання одного або декількох видів біопалива, запропонованого в даному винаході. Вищевикладені й інші об'єкти винаходу повинні стати очевидними з наведеного нижче докладного опису винаходу. Визначення Наведені нижче визначення й способи представлені з метою переважного розуміння даного винаходу як посібник, що дозволяє звичайному фахівцеві в даній галузі втілити на практиці даний винахід. Поняття, застосовувані в даному описі, якщо не вказано інше, мають значення, які використовують звичайні фахівці у відповідній галузі. Визначення загальноприйнятих у молекулярній біології понять містяться також в Rieger і ін., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5-е вид., вид-во Springer-Verlag: New York, 1994. Номенклатура основ ДНК і амінокислот, застосовувана в контексті даного опису, представлена в 37 C.F.R. § 1.822. У даному описі й доданій формулі винаходу мається на увазі, якщо з контексту очевидно не випливає інше, що вживані в однині іменник включає також множину. Так, наприклад, посилання на "рослину" включає однуабо декілька рослин, а посилання на "клітину" включає суміші клітин, тканин і т.п. Поняття "вірус некротичного пожовтіння жилок буряка" або "BNYVV" у контексті даного опису стосується збудника ризоманії. Вірус належить до роду Benyvirus і переноситься протоктистами, які живуть у ґрунті (Polymyxa betae). Поняття "ризоманія" у контексті даного опису стосується одного з найбільш важливих захворювань цукрового буряка, яке викликається зараженням вірусом некротичного пожовтіння жилок буряка (BNYVV). Симптомами захворювання (яке називається також "сказом коріння") є пожовтіння рослин, карликовість, наявність маленького головного кореня і підвищена кількість волокнистого кореня. Для судинних тканин головного кореня характерна зміна кольору на яснокоричневий. Якщо в рідких випадках вірус поширюється системним шляхом на листя, то це приводить до некротичного пожовтінню жилок. Поняття « кодувальна послідовність » стосується нуклеотидної послідовності, яка транскрибується в РНК, таку як мРНК, рРНК, тРНК, мяРНК (мала ядерна РНК), смислова РНК або антисмислова РНК. Переважно РНК потім транслюється в організмі з утворенням білка. Вона може являти собою "безперервну кодувальну послідовність », тобто послідовність, у якій відсутні інтрон, таку як кднк, або може включати один або декілька інтронів, обмежених відповідними сплайсинговими стиками. "Інтрон" являє собою послідовність РНК, яка входить у первинний транскрипт, але яка видаляється в результаті розщеплення й повторного лігування РНК у клітині з утворенням зрілої мРНК, яка може транслюватися в білок. 8 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У контексті даного опису поняття "цукровий буряк" стосується всіх видів і підвидів роду Beta, а також до всіх сортів культурного буряка Beta vulgaris на будь-якій стадії розвитку. Культурні сорти буряка поділяють на чотири групи: листовий буряк, городній буряк, кормовий буряк і цукровий буряк. Поняття "цукровий буряк" стосується також всіх культурних сортів буряка, включаючи сорти, які вирощують для цілей, відмінних від одержання цукру, наприклад, для одержання етанолу, пластиків або індустріальних продуктів. Зокрема поняття "цукровий буряк" стосується кормового буряка й цукрового буряка, але найбільш переважно цукрового буряка. Поняття "цукровий буряк" стосується також рослин цукрового буряка, адаптованих для вирощування в тропічних або субтропічних регіонах. Поняття "культивовані (культурні)» відносно рослин цукрового буряка стосується будь-якої рослини цукрового буряка, яка вирощена з метою її комерційного виробництва. Поняття "культивована (культурна) рослина цукрового буряка" стосується рослин, які підготовляли до культивування й піддавали вибірковій селекції з метою вирощування. До культурних рослин цукрового буряка не належать види дикого типу, які містять ознаку, запропоновану у даному винаході, як ознаку, що зустрічається в природніх умовах, і/або частини їх природнього генетичного фону. Поняття "клітина рослини цукрового буряка" стосується структурної й фізіологічної одиниці рослини цукрового буряка, що включає протопласт і клітинну оболонку. Клітина рослини цукрового буряка може знаходитися у формі виділеної окремої клітини або культивованої клітини або являти собою частину високоорганізованої одиниці, таку, наприклад, як тканина рослини, орган рослини або ціла рослина. Поняття "матеріал рослини цукрового буряка" стосується листя, стебел, коренів, квіток або частин квіток, плодів, пилку, яйцеклітин, пиляків, зигот, насіння, відсадків, культур клітин або тканин або будь-якої іншої частини або продукту рослини. Воно включає також калус або тканина калусу, а також екстракти (наприклад, екстракти головного кореня) або зразки. Як правило, поняття "матеріал рослини цукрового буряка" стосується відносно не переробленого рослинного матеріалу, що включає інтактні рослинні клітини. "Орган рослини цукрового буряка" означає окрему й чітко структурно оформлену диференційовану частину рослини, таку як корінь, стебло, лист, листова брунька або зародок. У контексті даного опису поняття "тканина рослини цукрового буряка" стосується групи клітин рослини цукрового буряка, організованих у вигляді структурної й функціональної одиниці. Під це поняття підпадає будь-яка тканина рослини цукрового буряка, яка присутня в самій рослині або знаходиться в культурі. Це поняття включає (але, не обмежуючись тільки ними) цілі рослини, органи рослини, насіння рослини, культуру тканини й будь-які групи клітин рослини цукрового буряка, які організовані у вигляді структурних і/або функціональних одиниць. Використання цього поняття в комбінації із вказівкою якого-небудь конкретного типу тканини рослини цукрового буряка (або безвідносно до неї), як це має місце вище або в іншому місці в даному описі, не слід витлумачувати в тому розумінні, що воно не може стосуватися будь-якого іншого типу тканини рослини цукрового буряка. Поняття "експресія" при застосуванні відносно нуклеотидної послідовності, такої як ген, ВРЗ або їх частина або трансгенна рослина, стосується процесу перетворення генетичної інформації, яка кодується у гені, у РНК (наприклад, мРНК, рРНК, тРНК або мяРНК) за допомогою "транскрипції" гена (тобто за допомогою ферментативної активності РНКполімерази) і, якщо це можливо, у білок (коли ген кодує білок) за допомогою "трансляції" мРНК. Експресію генів можна регулювати на багатьох стадіях цього процесу. Наприклад, у випадку антисмислових конструкцій або конструкцій dsРНК відповідно поняття "експресія" може стосуватися транскрипції тільки антисмислової РНК або тільки dsРНК. Крім того, поняття "експресія" стосується транскрипції й стабільного накопичення смислової (мРНК) або функціональної РНК. Поняття "експресія" може стосуватися також виробництва білка. У контексті даного опису поняття "набір для виявлення" стосується набору, застосовуваного для виявлення присутності або відсутності в зразку ДНК із рослин варіанта GM RZ13. Набір для виявлення включає нуклеотидні зонди та/або праймери, запропоновані в даному винаході, які гібридизуються специфічно в строгих умовах з послідовністю ДНК-мішені, і інші матеріали, необхідні для здійснення методів гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот. У контексті даного опису поняття "варіант (випадок)» стосується рекомбінантної рослини цукрового буряка, отриманої шляхом трансформації клітини або тканини рослини цукрового буряка гетерологічною ДНК, наприклад, касетою експресії, яка включає ген, що представляє інтерес, і регенерації. Поняття "варіант (випадок)» стосується вихідного трансформанта та/або потомства трансформанта, яке включає гетерологічну ДНК. Поняття "варіант (випадок)» стосується також потомства, отриманого шляхом статевого ауткросингу трансформанта й іншої лінії цукрового 9 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 буряка. Навіть після повторного поворотного схрещування з рекурентним (батьківська форма, з якою гібрид схрещується знову) батьком вбудована ДНК і фланкуюча ДНК із трансформованої батьківської рослини присутні в потомстві, отриманому від схрещування, у тій же самій локалізації на хромосомі. Поняття "варіант (випадок)» стосується також ДНК із вихідного трансформанта, який містить вбудовану ДНК і фланкуючу геномну послідовність, що безпосередньо примикає до вбудованої ДНК, яка, як очікується, повинна переноситися в потомство, яке набуває вбудовану ДНК, що включає трансген, що представляє інтерес, у результаті статевого схрещування однієї батьківської лінії, яка включає вбудовану ДНК (наприклад, вихідний трансформант і потомство, отримане в результаті самозапилення), і батьківської лінії, яка не містить вбудовану ДНК. Як правило, трансформація рослинної тканини приводить до одержання декількох варіантів, кожний з яких несе інсерцію конструкції ДНК у різній локалізації в геномі рослинної клітини. Конкретний варіант можна відбирати на основі експресії трансгена або інших необхідних характеристик. Поняття "варіант GM RZ13", "GM RZ13" або "GM RZ 13-варіант" можна використовувати взаємозамінно для варіанта цукрового буряка GM RZ13, запропонованого в даному винаході. Варіант цукрового буряка GM RZ13 відомий також як SBVR111. У контексті даного опису поняття "унікальний" стосується відмітних характеристик варіанта GM RZ13. Таким чином, нуклеїнові кислоти, унікальні для варіанта GM RZ13, не зустрічаються в інших рослин цукрового буряка, що не належать до варіанта GM RZ13. Варіант рослини цукрового буряка GM RZ13, що має стійкість до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, можна одержувати шляхом першого статевого схрещування першої батьківської рослини цукрового буряка, яка являє собою рослину цукрового буряка, вирощену із трансгенного варіанта рослини цукрового буряка GM RZ13, таку як рослина цукрового буряка GM RZ13, вирощену з насіння, яке депоновано в NCIMB під реєстраційним № 41601, і її потомство, отримане в результаті трансформації касетами експресії, що представляють собою варіанти здійснення даного винаходу, які надають стійкість до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, і другої батьківської рослини цукрового буряка, у якої відсутня стійкість до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка або яка відрізняється лише толерантністю або лише частковою стійкістю до вірусу, одержуючи тим самим множину рослин покоління першої генерації; і наступного відбору рослини покоління першої генерації, стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка; і самозапилення рослини покоління першої генерації з одержанням множини рослин покоління другої генерації; наступного відбору з рослин покоління другої генерації рослини, стійкого до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка. У ці стадії можна додатково включати поворотне схрещування стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослини покоління першої генерації або стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослини покоління другої генерації або рослини покоління третьої генерації з одержанням рослини цукрового буряка, стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка. Рослини, толерантні до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, являють собою рослини, у яких швидкість розмноження патогену є високою, але при цьому розвиток рослини не сповільнюється. Часткова стійкість присутня в рослинах цукрового буряка у випадках, коли рослини інфікуються, але швидкість розмноження вірусу є більш низькою, ніж в рослинах, що мають чутливий генотип. У контексті даного опису "касета експресії" означає молекулу нуклеїнової кислоти, яка має здатність забезпечувати експресію конкретної нуклеотидної послідовності у відповідній клітиніхазяїні, вона містить промотор, функціонально зв'язаний з нуклеотидною (ими) послідовністю (ями), що представляє (ють) інтерес, яка (і) функціонально зв'язана (і) із сигналами термінації. Вона, як правило, містить також послідовності, необхідні для правильної трансляції нуклеотидної (их) послідовності (ей). Касета експресії може містити також послідовності, які не є необхідними для забезпечення експресії нуклеотидної (их) послідовності(ей), що представляє (ють) інтерес, але присутність яких зв'язана зі створенням відповідних сайтів рестрикції, призначених для видалення касети з експресійного вектора. Касета експресії, яка містить нуклеотидну (і) послідовність (і), що представляє (ють) інтерес, може бути химерною, тобто принаймні один з її компонентів є гетерологічним відносно принаймні одного з інших її компонентів. Касета експресії може являти собою також касету, яка зустрічається в природніх умовах, але яка була отримана в рекомбінантній формі, придатній для гетерологічної експресії. Однак, як правило, касета експресії є гетерологічною для хазяїна, тобто конкретна нуклеотидна послідовність експресійної касети не зустрічається в природніх умовах у клітині-хазяїні і її необхідно інтродукувати у клітину-хазяїна або попередника клітини-хазяїна за допомогою відомого в даній галузі методу трансформації. Експресія нуклеотидної (их) послідовності (ей) у касеті експресії може знаходитися під контролем конститутивного промотору або 10 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 індуцибельного промотору, який ініціює транскрипцію тільки при впливі на клітину-хазяїна деяких певних зовнішніх стимулів. У випадку багатоклітинного організму, такого як рослина, промотор може також бути специфічним для конкретної тканини або органа або стадії розвитку. Касету експресії або її фрагмент при трансформації рослини можна позначати також як "вбудована послідовність" або « послідовність-вставка". Поняття "ген" стосується певної ділянки, яка локалізована в геномі і яка крім вказаної вище кодувальної послідовності, може містити інші, насамперед регуляторні нуклеотидні послідовності, які відповідають за контроль експресії, тобто за транскрипцію й трансляцію кодувальної ділянки. Ген може містити інші 5'- і 3'-нетрансльовані послідовності й термінуючі послідовності. Можуть бути присутні інші елементи, наприклад, інтрони. Поняття « ген, що представляє інтерес, » стосується будь-якого гена, який при переносі в рослину надає рослині необхідну ознаку або фенотип, таку, наприклад, як стійкість до антибіотиків, стійкість до вірусів, стійкість до комах, стійкість до хвороб або стійкість до інших шкідників, толерантність до гербіцидів, підвищена живильна цінність, поліпшені характеристики з позицій промислового процесу або змінена репродуктивна здатність. У контексті даного опису поняття "генотип" стосується генетичного матеріалу, наслідуваного від батьківських рослин цукрового буряка, який не весь обов'язково експресується в потомстві рослин цукрового буряка. Генотип GM RZ13 стосується гетерологічного генетичного матеріалу, яким трансформований геном рослини, а також генетичного матеріалу, який фланкує вбудовану послідовність. "Гетерологічна" нуклеотидна послідовність означає нуклеотидну послідовність, яка не зустрічається в природніх умовах у клітині-хазяїні, у яку вона інтродукована, включаючи множинні копії, що не зустрічаються в природніх умовах, нуклеотидної послідовності, що зустрічається в природніх умовах. Поняття "гетерологічний" відносно гена або нуклеїнової кислоти стосується гена, який кодує фактор, який не зустрічається в його природньому оточенні (тобто змінений людиною). Наприклад, гетерологічний ген може включати ген з одного виду, інтродукований в інший вид. Гетерологічний ген може також включати ген, нативний для організму, який змінений яким-небудь способом (наприклад, у результаті мутацій, додавання множини копій, зв'язування з ненативною промоторною або енхансерною послідовністю і т.д.). Гетерологічні гени можуть містити також рослинні генні послідовності, які містять форми кднк рослинного гена; послідовності кднк можна експресувати або в смисловій (з одержанням мРНК), або в антисмисловій орієнтації (з одержанням антисмислового РНК-транскрипту, який є комплементарним до мРНК-транскрипту). Відповідно до одного з об'єктів винаходу гетерологічні гени відрізняються від ендогенних рослинних генів тим, що гетерологічні генні послідовності, як правило, зчеплені з нуклеотидними послідовностями, які містять регуляторні елементи, такі як промотори, які не асоційовані в природніх умовах з геном білка, який кодується гетерологічним геном, або з рослинними генними послідовностями в хромосомі, або асоційовані із частинами хромoсоми, які не зустрічаються в природніх умовах (наприклад, гени, які експресуються в локусах, в яких ген у нормі не експресується) "Гомологічна нуклеотидна послідовність" означає нуклеотидну послідовність, яка в природніх умовах асоційована із клітиною-хазяїном, у яку вона інтродукована. Поняття "полінуклеотид" у контексті даного опису стосується полімеру ДНК або РНК. Поняття "нуклеїнова кислота" стосується дезоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів і їх полімерів, які можуть бути одноланцюговими або дволанцюговими, необов'язково містять синтетичні, що не зустрічаються в природніх умовах або змінені нуклеотидні основи, які можна вбудовувати в полімери ДНК або РНК, складаються з мономерів (нуклеотидів), які містять цукор, фосфат і основу, що належить або до пуринів, або до піримідинів. Якщо спеціально не вказане інше, то під поняття підпадають нуклеїнові кислоти, які містять відомі аналоги нуклеотидів, що зустрічаються в природніх умовах, які мають подібні здатності до зв'язування з нуклеїновою референс-кислотою, і які метаболізуються аналогічно до шляху метаболізму нуклеотидів, що зустрічаються в природніх умовах. "Фрагмент нуклеїнової кислоти" являє собою частину даної молекули нуклеїнової кислоти. У вищих рослинах дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) являє собою генетичний матеріал, а рибонуклеїнова кислота (РНК) бере участь у переносі інформації, що входить у ДНК, на білки. Поняття "нуклеотидна послідовність" або "послідовність нуклеїнової кислоти" стосується полімеру ДНК або РНК, який може бути одноабо дволанцюговим, що необов'язково містить синтетичні, що незустрічаються в природніх умовах або змінені нуклеотидні основи, які можуть включатися в полімери ДНК або РНК. Поняття "нуклеотидна послідовність" або "послідовність нуклеїнової кислоти" можна застосовувати взаємозамінно для позначення гена, кДНК, ДНК і РНК, що кодується геном. Поняття "виділений" у контексті молекул нуклеїнових кислот, запропонованих у даному 11 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаході, стосується нуклеотидної послідовності, ідентифікованої в хромосомі й виділеної/відділеної від хромосомної нуклеотидної послідовності, що присутні у відповідному організмі-джерелі. Виділена нуклеїнова кислота не є нуклеїновою кислотою, яка зустрічається в природніх умовах, якщо реально існує її дублікат, що зустрічається в природніх умовах. На противагу цьому, невиділені нуклеїнові кислоти являють собою нуклеїнові кислоти, такі як ДНК і РНК, які знаходяться у такому ж стані, у якому вони зустрічаються в природніх умовах. Наприклад, конкретна послідовність ДНК (наприклад, ген) присутній у хромосомі клітини-хазяїна поблизу від сусідніх генів. Виділена нуклеотидна послідовність може знаходитися в одноланцюговій або дволанцюговій формі. В альтернативному варіанті вона може містити смисловий і антисмисловий ланцюг (тобто нуклеотидна послідовність може бути дволанцюговою). У контексті рослинного геному молекула нуклеїнової кислоти, запропонована у винаході, відрізняється від її дублікатів, що зустрічаються в природніх умовах, інсерційною ділянкою, вбудованою у геном, і послідовностями, що фланкують вказаний інсерційний сайт. У переважному варіанті здійснення винаходу мається на увазі, що молекули нуклеїнових кислот, запропоновані у винаході, повинні бути виділеними. Поняття "білок", "пептид" і "поліпептид" у контексті даного опису використовують взаємозамінно. Поняття "функціональне зв'язані" стосується асоціації нуклеотидних послідовностей на одному фрагменті нуклеїнової кислоти так, що функція однієї впливає на функцію іншої. Наприклад, промотор функціонально зв'язаний з кодувальною послідовністю або функціональною РНК, коли він має здатність впливати на експресію кодувальної послідовності або функціональної РНК (тобто транскрипція кодувальної послідовності або функціональної РНК знаходиться під контролем промотору). Кодувальні послідовності у смисловій або антисмисловій орієнтації можуть бути функціонально зв'язані з регуляторними послідовностями. "Праймери" у контексті даного опису означають виділені нуклеїнові кислоти, які мають здатність до ренатурації із комплементарним ланцюгом ДНК-мішені в результаті гібридизації нуклеїнових кислот з утворенням гібриду між праймером і ланцюгом ДНК-мішені, а потім до подовження ланцюга ДНК-мішені за допомогою полімерази, такої як ДНК-полімераза. Пари або набори праймерів можна застосовувати для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або інших загальноприйнятих методів ампліфікації нуклеїнових кислот. Поняття « ПЛР-праймер" у контексті даного винаходу стосується коротких фрагментів виділеної одноланцюгової ДНК, які використовують для ПЛРАмпліфікації специфічних ділянок ДНК. Поняття "ПЛР" або "полімеразна ланцюгова реакція" у контексті даного винаходу стосується методу одержання у відносно більших кількостях специфічних областей ДНК, що дозволяє здійснювати різні аналізи, засновані на використанні цих областей. У контексті даного опису поняття "ампліфікований" стосується створення множини копій молекули нуклеїнової кислоти або множини копій послідовності, комплементарної до молекули нуклеїнової кислоти, з використанням принаймні однієї з молекул нуклеїнової кислоти як матриці. Системи ампліфікації включають систему на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), систему на основі лігазної ланцюгової реакції (ЛЛР), транскрипційний метод ампліфікації нуклеїнових кислот (ампліфікація на основі нуклеотидних послідовностей) (NASBA, фірма Cangene, Миссіссауга, провінція Онтаріо), системи на основі Q-Бета реплікази, транскрипційну систему ампліфікації (TAS) і ампліфікацію з видаленням (витисненням) ланцюга (SDA) (див., наприклад, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, під ред. D. H. Persing і ін., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1993). Продукт ампліфікації називають ампліконом. "Зонд" означає виділену нуклеїнову кислоту, з якою зв'язана придатна мітка, що виявляється, або репортерна молекула, така як радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний агент, флуоресцентна мітка або фермент. Такий зонд є комплементарним до ланцюга нуклеїнової кислоти-мішені, або, у контексті опису даного винаходу - ланцюга геномної ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13. Геномну ДНК GM RZ13 можна одержувати з рослини цукрового буряка або зі зразка, який включає ДНК вказаного варіанта. Згідно із даним винаходом зонди включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також поліаміди й інші придатні як зонди матеріали, які специфічно зв'язуються з послідовністю ДНК-мішені і які можна застосовувати для виявлення присутності послідовності ДНК-мішені. Праймери й зонди, як правило, складаються з 10-15 або більшої кількості нуклеотидів. Праймери й зонди можуть складатися принаймні з 20 або більшої кількості нуклеотидів або принаймні з 25 або більшої кількості нуклеотидів, або принаймні з 30 або більшої кількості нуклеотидів. Такі праймери й зонди специфічно гібридизуються з послідовністю-мішенню в 12 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 строгих умовах гібридизації. Праймери й зонди, запропоновані в даному винаході, можуть мати послідовність, повністю комплементарну до послідовності-мішені, хоча за допомогою загальноприйнятих методів можна створювати зонди, що відрізняються від послідовностімішені, але які зберігають здатність гібридизуватися з послідовностями-мішенями. Слід розуміти, що довжина праймерів і зондів, запропонованих у даному винаході, може мати будьяке чисельне значення, що знаходиться у вказаних в даному описі діапазонах. Наприклад, до праймерів і зондів, що складаються із 10-15 або більшої кількості нуклеотидів, належать праймери й зонди, що складаються із 10, 11, 12, 13, 14 або 15 нуклеотидів, у той час як поняття « принаймні 20 нуклеотидів" включає також праймери й зонди, що складаються із 16, 17, 18, 19 або 20 нуклеотидів. Це застосовне також до понять « принаймні 25 або більша кількість нуклеотидів" і « принаймні 30 або більша кількість нуклеотидів". Поняття "мовчання гена" стосується залежного від гомології пригнічення вірусних генів, трансгенів або ендогенних ядерних генів. Мовчання гена може бути транскрипційним, коли пригнічення обумовлене зниженою транскрипцією "уражених" генів, або пост-транскрипційним, коли пригнічення обумовлене підвищеним кругообігом (розщеплення) видів РНК, гомологічних до "уражених" генів. Мовчання гена включає індуковане вірусом мовчання гена. Поняття «РНК-інтерференція" (РНКi) стосується процесу здійснення специфічного для послідовності пост-транскрипційного мовчання гена в рослин і тварин, опосередковуваному малими інтерферуючими РНК (siРНК). Різні поняття, такі як siРНК, молекула РНК-мішень, фермент Dicer або рибонуклеаза III, являють собою концепції, відомі фахівцям у даній галузі, і в літературі є докладний опис вказаних понять і інших концепцій, що стосуються РНКi. Однак слід мати на увазі, що для втілення на практиці даного винаходу не є необхідним ґрунтуватися на якій-небудь конкретній гіпотезі, що стосується механізмів РНКi. "dsРНК" або "дволанцюгова РНК" являє собою РНК із двома комплементарними ланцюгами, яка контролює специфічне для послідовності розщеплення мРНК за допомогою процесу, відомого як РНК-інтерференція (РНКi). dsРНК перетворюються в результаті розщеплення в siРНК, які виявляють інтерферуючий вплив на експресію специфічного гена. Поняття "інвертований" повтор стосується нуклеотидної послідовності, що присутня у двох сайтах однієї й тієї ж нуклеотидної послідовності, але в протилежній орієнтації. Поняття "siРНК" стосується малих інтерферуючих РНК. У деяких варіантах здійснення винаходу siРНК містять дуплекс або дволанцюгову ділянку, що складається приблизно з 21-23 нуклеотидів; часто siРНК містять приблизно від 2 до 4 неспарених нуклеотидів на 3'-кінці кожного ланцюга. Принаймні один ланцюг дуплекса або дволанцюгової ділянки siРНК є практичним гомологом або практично комплементарний до молекули РНК-мішені. Ланцюг, комплементарний до молекули РНК-мішені, являє собою "антисмисловий ланцюг": ланцюг, гомологічний до молекули РНК-мішені, являє собою "смисловий ланцюг", і він комплементарний також до антисмислового ланцюга siРНК. siРНК можуть містити також додаткові послідовності; прикладами таких послідовностей є (але, не обмежуючись тільки ними) зв'язувальні послідовності (послідовності-лінкери) або петлі, а також "стовбур" і інші складчасті структури. Імовірно, siРНК функціонують як посередники, які мають вирішальне значення, що брав участь у запуску РНК-інтерференції, у безхребетних і хребетних тварин і в запуску специфічного для послідовності розщеплення РНК у процесі пост-транскрипційного мовчання генів у рослин. Поняття "молекула РНК-мішень" стосується молекули РНК, по відношенню до якої принаймні один ланцюг короткої дволанцюгової ділянки siРНК є гомологічним або комплементарним. Як правило, коли ступінь вказаної гомології або комплементарності становить приблизно 100 %, то siРНК може викликати мовчання або інгібувати експресію молекули РНК-мішені. Хоча, імовірно, мішенню для siРНК є процесована мРНК, даний винахід не обмежений якою-небудь конкретною гіпотезою, і такі гіпотези не є необхідними для втілення на практиці даного винаходу. Так, мається на увазі, що й інші молекули РНК також можуть бути мішенями для siРНК. Вказані молекули РНК-мішені являють собою непроцесовану РНК, рибосомну РНК і вірусну геномну РНК. Не є необхідним, щоб 100 %-на гомологія між молекулою РНК-мішенню й dsРНК мала місце по всій довжині dsРНК, але "шпильки" dsРНК повинні містити ділянки, що складаються принаймні з 21 нуклеотиду, переважно принаймні з 23 нуклеотидів, більш переважно принаймні з 50 нуклеотидів, ще більш переважно принаймні з 500 нуклеотидів, найбільш переважно принаймні з 700 нуклеотидів і аж до 1000 нуклеотидів, для яких характерна гомологія на рівні, що становить принаймні 95 %, переважно 100 %, з молекулою РНК-мішенню. У контексті даного опису "стекінг" гена або ознаки означає об'єднання (угруповання) необхідних ознак в одній трансгенній лінії. Селекціонери рослин об'єднують трансгенні ознаки, здійснюючи схрещування батьків, кожний з яких має необхідну ознаку, і потім, ідентифікуючи потомство, яке має обидві необхідні ознаки (так звані отримані шляхом селекції групи). Іншим 13 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шляхом об'єднання генів є одночасне перенесення двох або більшої кількості генів у ядро клітини рослини в процесі трансформації. Ще одним шляхом об'єднання генів є повторна трансформація трансгенної рослини іншим геном, що представляють інтерес. Наприклад, "стекінг" генів можна застосовувати для об'єднання двох різних ознак стійкості до комах, ознаки стійкості до комах і ознаки стійкості до хвороб або ознаки стійкості до хвороб і ознаки стійкості до гербіцидів (наприклад, стійкості до гліфосату). Застосування селектованого маркера крім гена, що представляє інтерес, слід розглядати також як "стекінг" Гени, що представляють інтерес для здійснення "стекінгу", є Gm-ознаки (ознаки, отримані в результаті генної модифікації, ГМ) і не-gm-ознаки. Gm-ознаками, що представляють інтерес є, наприклад, стійкість до гербіцидів, стійкість до комах, стійкість до хвороб, трансгенні рослини, що представляють інтерес, які мають фенотип уповільненого стрілкування або із заінгібованим стрілкуванням, трансгенні рослини зі зміненим і/або посиленим складом вуглеводів. не-gmознаками, що представляють інтерес є, наприклад, стійкість до хвороб або стійкість до BNYVV, отримана із традиційних джерел (типу Holly, WB41, WB42, WB151, WB169, C28, C48, C50 або Rizor або продуктів їх схрещування), або до вірусів, відмінних від BNYVV, або толерантність до шкідників, таким, наприклад, як бурякові нематоди, кореневі попелиці, яванські галові нематоди, або толерантність до грибів, таких, наприклад, як представники Cercospora, Aphanomyces, Rhizoctonia, Fusarium, Ramularia, Erysipe, Peronospora, Erwinia, Sclerotium, Verticillium, Phoma або до збудників іржі, або толерантність до вірусів, таких, наприклад, як вірус кучерявості верхівки буряка, вірус пожовтіння буряка, м'який вірус пожовтіння буряка, західний вірус пожовтіння буряка. Поняття "строгі умови гібридизації" і "умови відмивання, що відповідають строгій гібридизації" у контексті експериментів з гібридизації нуклеїнових кислот, таких як Саузерн- і нозерн-гібридизації, залежать від послідовності і є різними при застосуванні різних параметрів навколишнього середовища. Для специфічної гібридизації більш довгих послідовностей використовують більш високі температури. Докладним посібником з гібридизації нуклеїнових кислот є робота Tijssen, 1993. Строгі умови гібридизації описані, наприклад, в Sambrook і ін. Прикладом строгих умов гібридизації на фільтрі методом Саузерн- або нозерн-блотингу для гібридизації комплементарних нуклеїнових кислот, які мають більше 100 комплементарних залишків, є застосування 50 %-ного формаміду з 1 мг гепарину при 42ºС при здійсненні гібридизації протягом ночі. Прикладом дуже строгих умов відмивання є застосування 0,15M NaСl при 72ºC протягом приблизно 15 хв. Прикладом строгих умов відмивання є відмивання 0,2×SSC при 65ºC протягом 15 хв (опис Ssc-буфера див. в Sambrook). Поняття "трансформація" означає процес інтродукції гетерологічної нуклеїнової кислоти в клітину-хазяїна або організм-хазяїн. Зокрема, "трансформація" означає стабільну інтеграцію молекули ДНК у геном організму, що представляє інтерес. Поняття "трансформований»/«трансгенний»/«рекомбінантний" стосуються організму рослини, у який інтродукована гетерологічна молекула нуклеїнової кислоти. Молекула нуклеїнової кислоти може бути стабільно інтегрована в геном рослини-хазяїна або молекула нуклеїнової кислоти може бути присутня також у вигляді позахромосомної молекули. Така позахромосомна молекула може мати здатність до самореплікації. Слід розуміти, що трансформовані клітини, тканини або рослини включають не тільки кінцевий продукт процесу трансформації, але також і його трансгенне потомство. Поняття "нетрансформований", "нетрансгенний" або "нерекомбінантний" хазяїн стосуються організму рослини дикого типу, який не містить гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти. У контексті даного опису поняття "трансгенний" стосується рослини, рослинної клітини або множини структурованих або неструктурованих рослинних клітин, об'єднаних за допомогою добре відомих методів генетичних маніпуляцій і інсерцій генів з послідовністю нуклеїнової кислоти, яка відповідає гену, що представляє інтерес, у рослинному геномі, і, як правило, знаходиться в хромосомі клітинного ядра, мітохондрії або інших органелах, що містять хромосоми, у локусі, відмінному від присутнього звичайно в нативній рослині або рослинній клітині, або має більшу кількість копій у порівнянні з нативною рослиною або рослинною клітиною. Маніпуляції або інсерції вказаних нуклеотидних послідовностей для одержання трансгенних рослин відрізняються від застосування мутацій, що зустрічаються у природних умов, призначених для одержання рослини, що незустрічається в природніх умовах або рослини з генотипом, що не зустрічається в природніх умовах. Методи трансформації рослин і рослинних клітин добре відомі в даній галузі, і вони можуть являти собою, наприклад, електропорацію, мікроін'єкцію, опосередковувану Agrobacterium трансформацію й балістичну трансформацію. "Трансгенна рослина" являє собою рослину, що несе одну або декілька рослинних клітин, яка (і) містять експресійний вектор. Поняття "цукор" стосується ферментованих моносахаридів, 14 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дисахаридів і трисахаридів, насамперед моно- і дисахаридів. Так, у контексті даного винаходу до цукрів належать (але, не обмежуючись тільки ними) сахароза, фруктоза, глюкоза, галактоза, мальтоза, лактоза й маноза. Поняття "біопаливо" у контексті даного опису стосується будь-якого біопалива, отриманого з біомаси, тобто, що жили або живуть зараз біологічних організмів, таких як рослинні або тваринні залишки. Біопаливо включає (але, не обмежуючись тільки ними) дизельне біопаливо, біоводень, біогаз, отриманий з біомаси диметилфуран (ДМФ) і т.п. Зокрема, поняття "біопаливо" можна використовувати для позначення спиртів рослинного походження, таких як етанол, метанол, пропанол або бутанол, які при необхідності перед застосуванням можна денатурувати. Поняття "біопаливо" стосується також сумішевого палива, що містить отримане з рослини паливо, такого як суміші спирту/газоліну (тобто, газохоли). Газохоли можуть мати будь-який бажаний процентний вміст отриманого з рослин спирту (тобто приблизно 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % або 95 % отриманого з рослини спирту). Наприклад, однією з відомих сумішей на основі біопалива є E85, яка містить 85 % етанолу й 15 % газоліну. Поняття "біопаливо" стосується будь-якого біопалива, отриманого за допомогою аеробної або анаеробної ферментації рослинного матеріалу. Поняття "ферментація" стосується процесу перетворення органічної молекули в іншу молекулу за допомогою мікроорганізму. Якщо не вказано інше, поняття "ферментація" включає анаеробну й аеробну ферментацію. Методи аеробної та/або анаеробної ферментації відомі фахівцям у даній галузі. Короткий опис креслень і послідовностей На кресленнях показано: на фіг. 1 – карта бінарного вектора pSYN15965 (раніше був позначений як pHiNK188), що містить конструкцію для РНКi (що включає послідовність, отриману з гена RNA1 BNYVV), який застосовували для трансформації цукрового буряка; на фіг. 2 – результати аналізу методом нозерн-блотингу накопичення мРНК (фіг. 2, верхня панель) і siРНК (фіг. 2, нижня панель), отримані при трансгенній експресії виведеного з гена реплікази BNYVV інвертованого повтору. Корені збирали через 0, 7, 14, 21 або 28 днів після пересадження (dpi) у ґрунт, заражений BNYVV B-типу, або в стерильний пісок. Примітка до креслення: a – трансгенна рослина, вирощена в стерильному піску; б – трансгенна рослина, вирощена в зараженому ґрунті; в - нетрансгенна рослина, вирощена в зараженому ґрунті; г нетрансгенна рослина, вирощена в стерильному піску; I – листя рослини Nicotiana benthamiana, підданої агроінфільтрації бінарним вектором pHiNK188, який застосовували для трансформації цукрового буряка. 5S рРНК (внизу) застосовували як контроль однакового завантаження РНК; на фіг. 3 – результати аналізу за допомогою ELISA титру BNYVV у зразках тонкоподрібненого (буряковий жом) цукрового буряка, вирощеного в процесі польового досліду в США в 2009 р. (див. приклад 7). Середнє значення рівня BNYVV на групу [нг BNYV/мл соку] становило: 88 із середньоквадратичним відхиленням 39 для лінії "Holly" (протестовано 16 рослин), 125 із середньоквадратичним відхиленням 18 для лінії "Holly+C48" (протестовано 3 рослини) і 5 із середньоквадратичним відхиленням 5 для лінії "Holly+GMRZ" (протестовано 9 рослин) відповідно. Середні значення позначені вертикальними лініями; SEQ ID NO: 1-3’- стикувальна послідовність варіанта GM RZ13; SEQ ID NO: 2 – послідовність, що складається з 807 нуклеотидів, що перекриває 460 нуклеотидів на 3’-кінці RZ-вставки (нуклеотиди 1-460; права гранична послідовність) і 347 нуклеотидів геномної ДНК цукрового буряка, яка фланкує вставку (нуклеотиди 461-807), у варіанті GM RZ13; SEQ ID NO: 3 – послідовність геномної ДНК цукрового буряка (347 нуклеотидів), яка фланкує 3’-кінець RZ-вставки у варіанті GM RZ13; SEQ ID NO: 4 – послідовність праймера FE1005; SEQ ID NO: 5 – послідовність праймера FE1006; SEQ ID NO: 6 – послідовність праймера FE1007; SEQ ID NO: 7-5’-стикувальна послідовність варіанта GM RZ13; SEQ ID NO: 8 – послідовність, що складається з 484 нуклеотидів, що перекриває 247 нуклеотидів геномної ДНК цукрового буряка, яка фланкує 5’-кінець RZ-вставки (нуклеотиди 238484), і 237 нуклеотидів 5’-кінця RZ-вставки (нуклеотиди 1-237; ліва гранична послідовність), у варіанті GM RZ13; SEQ ID NO: 9 – послідовність геномної ДНК цукрового буряка (237 нуклеотидів), яка фланкує 5’-кінець RZ-вставки у варіанті GM RZ13; SEQ ID NO: 10 – послідовність праймера ESPCR0008; SEQ ID NO: 11 – послідовність праймера FE0902; 15 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 12 – послідовність праймера FE02226; SEQ ID NO: 13 – послідовність праймера FE02216; SEQ ID NO: 14 – послідовність праймера FE02236; SEQ ID NO: 15 – послідовність праймера FE02237; SEQ ID NO: 16 – послідовність праймера FE02238; SEQ ID NO: 17 – послідовність праймера FE0622; SEQ ID NO: 18 – послідовність праймера FlkSeq0008; SEQ ID NO: 19 – послідовність праймера FE0820; SEQ ID NO: 20 – послідовність праймера FlkSeq0010; SEQ ID NO: 21 – послідовність праймера FE0885; SEQ ID NO: 22 – послідовність праймера FE0927; SEQ ID NO: 23 – послідовність праймера FE02201; SEQ ID NO: 24 – послідовність праймера FE02202; SEQ ID NO: 25 – послідовність праймера FE06202; SEQ ID NO: 26 – послідовність праймера FE06311; SEQ ID NO: 27 – послідовність праймера FE06312; SEQ ID NO: 28 – послідовність праймера HiNK285; SEQ ID NO: 29 – послідовність праймера HiNK283; SEQ ID NO: 30 – послідовність праймера HiNK284. Докладний опис винаходу У даному винаході запропонована генетично поліпшена лінія цукрового буряка, який містить інвертований повтор, що включає фрагмент гена реплікази BNYVV, і продукує фермент фосфоманозоізомеразу (PMI), яка надає рослині здатність утилізувати манозу як джерело вуглецю. Винахід стосується насамперед трансгенного варіанта цукрового буряка, позначеного як GM RZ13 (або SBVR111, вказане позначення можна застосовувати взаємозамінно з позначенням GM RZ13), що має новий генотип, а також композицій і способів виявлення в біологічному зразку нуклеїнових кислот вказаного варіанта. Винахід стосується також рослин цукрового буряка, що мають генотип GM RZ13, трансгенного насіння вказаних рослин цукрового буряка й способів одержання рослини цукрового буряка, що має генотип GM RZ13, шляхом схрещування інбредної лінії цукрового буряка, що має генотип GM RZ13, із цією же лінією або з іншою лінією цукрового буряка з одержанням гібридів, які мають генотип GM RZ13, і застосування стійких до BNYVV рослин цукрового буряка, запропонованих в даному винаході, для одержання цукру або для аеробної або анаеробної ферментації, наприклад, з метою одержання одного або декількох видів біопалива. Одним з варіантів здійснення даного винаходу є молекула нуклеїнової кислоти, насамперед виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка є унікальною для варіанта GM RZ13. У переважному варіанті здійснення винаходу молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка є унікальною для варіанта GM RZ13, являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, насамперед виділену молекулу нуклеїнової кислоти, яка зв'язує гетерологічну молекулу ДНК, вбудовану в геном рослини цукрового буряка варіанта GM RZ13, з геномної ДНК рослини цукрового буряка варіанта GM RZ13 і яка містить принаймні 10 або більше (наприклад, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50) суміжних нуклеотидів гетерологічної молекули ДНК і принаймні 10 або більше (наприклад, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50) суміжних нуклеотидів геномної ДНК рослини цукрового буряка, яка фланкує сайт інсерції гетерологічної молекули ДНК. В інших переважних варіантах здійснення винаходу молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка є унікальною для варіанта GM RZ13, являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, насамперед виділену молекулу нуклеїнової кислоти, яка зв'язує гетерологічну молекулу ДНК, вбудовану в геном рослини цукрового буряка варіанта GM RZ13, з геномної ДНК рослини цукрового буряка варіанта GM RZ13 і яка містить принаймні 10, переважно принаймні 20 і найбільш переважно принаймні 50 суміжних нуклеотидів гетерологічної молекули ДНК і принаймні 10, переважно принаймні 20 і найбільш переважно принаймні 50 суміжних нуклеотидів геномної ДНК рослини цукрового буряка, яка фланкує сайт інсерції гетерологічної молекули ДНК. Винахід стосується також нуклеотидних послідовностей, які містять 10 або більшу кількість суміжних нуклеотидів, що примикають до послідовності вставки з варіанта GM RZ13 і принаймні один нуклеотид фланкуючої ДНК із варіанта GM RZ13, суміжний з послідовністю вставки. Вказані нуклеотидні послідовності є унікальними й діагностичними для варіанта GM RZ13. Ампліфікація нуклеїнової кислоти геномної ДНК цукрового буряка варіанта GM RZ13 дозволяє одержувати амплікон, що містить вказані унікальні послідовності, що і є діагностичним для варіанта GM RZ13. Одним з аспектів цього 16 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіанта здійснення винаходу є нуклеотидна послідовність, унікальна для варіанта GM RZ13, яка вибрана із групи, яка включає SEQ ID NO: 1 (стикувальна послідовність варіанта GM RZ13), SEQ ID NO: 2 (послідовність, що перекриває 460 нуклеотидів на 3’-кінці RZ-вставки й 347 нуклеотидів геномної ДНК цукрового буряка, яка фланкує вставку у варіанті GM RZ13), SEQ ID NO: 7 (5’-стикувальна послідовність варіанта GM RZ13), SEQ ID NO: 8 (послідовність, що перекриває 247 нуклеотидів геномної ДНК цукрового буряка, яка фланкує 5’-кінець RZ-вставки, і 237 нуклеотидів 5’-кінця RZ-вставки у варіанті GM RZ13) і їх комплементи. Іншим варіантом здійснення винаходу є молекула нуклеїнової кислоти, насамперед виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка несе принаймні одну стикувальну послідовність варіанта GM RZ13, де стикувальна послідовність перекриває ділянку стику між гетерологічною касетою експресії, вбудованою в геном цукрового буряка, і ДНК із геному цукрового буряка, яка фланкує сайт інсерції і яка є діагностичною для варіанта. Одним з аспектів цього варіанта здійснення винаходу є стикувальна послідовність, вибрана із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 і їх комплементи. Стикувальні послідовності перекривають ділянку стику між гетерологічною касетою експресії, вбудованою в геном цукрового буряка, і ДНК із геному цукрового буряка, яка фланкує сайт інсерції. Оскільки відома тільки одна гетерологічна касета експресії, вбудована в геном цукрового буряка, який приводить до утворення варіанта GM RZ13, то як стикувальна послідовність, що містить 5’кінець гетерологічної касети експресії, який зчеплений із фланкуючою геномною послідовністю, так і стикувальна послідовність, що містить 3’-кінець гетерологічної касети експресії, який зчеплений із фланкуючою геномною послідовністю, відповідно є унікальними для варіанта GM RZ13. Завдяки їх унікальній природі, ці послідовності є діагностичними для варіанта GM RZ13. Наступним об'єктом даного винаходу є молекула нуклеїнової кислоти, насамперед виділена молекула нуклеїнової кислоти, що зв'язує гетерологічну молекулу ДНК із геномом рослини цукрового буряка у варіанті цукрового буряка GM RZ13, яка містить послідовність, що включає від приблизно 11 до приблизно 20 суміжних нуклеотидів. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу нуклеїнова кислота вибрана із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 і їх комплементи. Наступним об'єктом даного винаходу є молекула нуклеїнової кислоти, насамперед виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 (послідовність геномної ДНК цукрового буряка, яка фланкує 3’-кінець RZ-вставки у варіанті GM RZ13), SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 (послідовність геномної ДНК цукрового буряка, яка фланкує 5’-кінець RZ-вставки у варіанті GM RZ13) і їх комплементи. В одному з аспектів цього варіанта здійснення винаходу молекула нуклеїнової кислоти входить у насіння цукрового буряка, депоноване в NCIMB під реєстраційним № 41601. Одним з варіантів здійснення даного винаходу є амплікон, що містить нуклеотидну послідовність, унікальну для варіанта GM RZ13. В одному з об'єктів цього варіанта здійснення винаходу амплікон, запропонований у даному винаході, містить нуклеотидну послідовність, запропоновану в даному винаході й описану вище, переважно вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 і їх комплементи. Одним з об'єктів даного винаходу є пара полінуклеотидних праймерів, що включає перший полінуклеотидний праймер і другий полінуклеотидний праймер, у результаті спільного функціонування яких у тому випадку, коли в зразку присутня як матриця ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13, відбувається утворення амплікону, діагностичного для варіанта GM RZ13. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу одна вказана праймерна послідовність являє собою або є комплементарною до геномної послідовності цукрового буряка, яка фланкує сайт інсерції гетерологічної послідовності ДНК, вбудований у геном рослини цукрового буряка варіанта цукрового буряка GM RZ13, а інша полінуклеотидна праймерна послідовність являє собою або є комплементарною до гетерологічної послідовності ДНК, вбудовану в геном рослини цукрового буряка варіанта цукрового буряка GM RZ13. Як повинно бути очевидно фахівцеві в даній галузі, як правило, одну із вказаних праймерних послідовностей можна виводити з T-ДНК-вставки, вбудованої в геном цукрового буряка, а іншу праймерну послідовність можна виводити з послідовності, що фланкує вставку; або одну із праймерних послідовностей можна виводити з однієї зі стикувальних послідовностей, а іншу праймерну послідовність можна виводити або з T-ДНК-вставки, або з послідовності, що фланкує вставку. У цьому контексті слід підкреслити, що вираз "одна із праймерних послідовностей" може означати першу праймерну послідовність, застосовувану в ПЛР-реакції (тобто або прямий, або зворотний праймер), а "інша полінуклеотидна праймерна послідовність" може означати другу праймерну послідовність, застосовувану в ПЛР-реакції (тобто або прямий, або 17 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зворотний праймер) (або навпаки). У переважних варіантах здійснення винаходу перший полінуклеотидний праймер, що входить до пари полінуклеотидних праймерів, запропонованих у даному винаході, виводять ізпослідовності, що фланкує вставку GM RZ, а другий полінуклеотидний праймер виводять із послідовності вставки, вбудованої в геном цукрового буряка. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу одну із праймерних послідовностей вибирають із SEQ ID NO: 2 (послідовність, що перекриває 460 нуклеотидів на 3’-кінці RZ-вставки й 347 нуклеотидів геномної ДНК цукрового буряка, яка фланкує вставку у варіанті GM RZ13, SEQ ID NO:3 (послідовність геномної ДНК цукрового буряка, яка фланкує 3’-кінець RZ-вставки у варіанті GM RZ13), SEQ ID NO: 8 (послідовність, що перекриває 247 нуклеотидів геномної ДНК цукрового буряка, яка фланкує 5’-кінець RZ-вставки, і 237 нуклеотидів 5’-кінця RZ-вставки у варіанті GM RZ13) або SEQ ID NO: 9 (послідовність геномної ДНК цукрового буряка, яка фланкує 5’-кінець RZ-вставки у варіанті GM RZ13). Слід зазначити знову, що вираз "одна із праймерних послідовностей" може означати першу праймерну послідовність, застосовувану в ПЛР-реакції (тобто або прямий, або зворотний праймер). В іншому варіанті цього об'єкта винаходу перший полінуклеотидний праймер містить принаймні 10 суміжних нуклеотидів з SEQ ID NO: 3 або з положення 461-807 SEQ ID NO: 2, або містить принаймні 10 суміжних нуклеотидів з SEQ ID NO: 9 або з положення 1-237 SEQ ID NO: 8 і їх комплементи. Таким чином, перший полінуклеотидний праймер містить послідовності, виведені з послідовності, яка фланкує RZ-вставку, вбудовану в геномну ДНК варіанта GM RZ13. В іншому переважному варіанті здійснення винаходу перший полінуклеотид, що входить до пари полінуклеотидних праймерів, запропонованих у даному винаході, містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 і їх комплементи. В іншому варіанті цього об'єкта винаходу другий полінуклеотидний праймер містить принаймні 10 суміжних нуклеотидів з положень 1-460 SEQ ID NO: 2, або з положень 238-484 SEQ ID NO: 8 або являє собою їх комплементи. Таким чином, другий полінуклеотидний праймер містить послідовності, виведені з RZ-вставки, вбудованої в геномну ДНК варіанта GM RZ13. У наступному варіанті цього об'єкта винаходу другий полінуклеотидний праймер, що входить до пари полінуклеотидних праймерів, запропонованих у даному винаході, містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 і їх комплементи. У наступному варіанті цього об'єкта винаходу пару праймерів, запропонованих у даному винаході, вибирають із групи праймерних пар, що включає: (a) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 13, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 18, і їх комплементи; (б) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 14, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена або в SEQ ID NO: 10, або в SEQ ID NO: 18, і їх комплементи; (в) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 15, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 18, і їх комплементи; (г) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 16, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 18, і їх комплементи; (д) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 12, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в будь-якій з SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 або SEQ ID NO: 6, і їх комплементи: (е) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 19, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 24, і їх комплементи; (ж) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 20, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 24, і їх комплементи; і (з) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 25, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 26, і їх комплементи. Наступним об'єктом даного винаходу є пара праймерів, які вибирають із групи пар праймерів, що включає: (a) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 13, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена або в SEQ ID NO: 11, або в SEQ ID NO: 17, і їх комплементи; 18 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (б) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 12, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена або в SEQ ID NO: 21, або в SEQ ID NO: 22, і їх комплементи; (в) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 19, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 23, і їх комплементи; і (г) полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 20, як перший полінуклеотидний праймер, і другий полінуклеотидний праймер, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 23, і їх комплементи. Полінуклеотидні праймери, послідовності яких представлені в SEQ ID NO: 11, 17, 21 і 22, виводять із фланкуючих послідовностей, які виходять за межі фланкуючих послідовностей, представлених у даному описі в SEQ ID NO: 3 і 9. Очевидно, що в компетенції фахівця в даній галузі є одержання додаткової послідовності також і з геномної послідовності, що фланкує будь-який кінець вбудованих гетерологічних послідовностей ДНК, для застосування як праймерної послідовності, яку можна використовувати у вказаних праймерних парах для ампліфікації послідовностей, що є діагностичними для варіанта GM RZ13. У контексті даного опису фраза "також і з геномної послідовності, що фланкує будь-який кінець вбудованих гетерологічних послідовностей ДНК" стосується конкретно послідовного переміщення від кінців вбудованих гетерологічних послідовностей ДНК сайтів, у яких вбудовані послідовності ДНК примикають до нативної геномної послідовності ДНК, і в геномну ДНК конкретної хромосоми, у яку вбудовані гетерологічні послідовності ДНК. Переважно праймерна послідовність, що відповідає або комплементарна до частини вбудованої послідовності, повинна примувати транскрипційне подовження утворюваного ланцюга ДНК або РНК в бік стику з найближчою фланкуючою послідовністю. Отже, праймерна послідовність, що відповідає або комплементарна до частини вбудованої послідовності, повинна примувати транскрипційне подовження утворюваного ланцюга ДНК або РНК в бік стику з найближчою фланкуючою послідовністю. Праймерна послідовність може являти собою або бути комплементарною до гетерологічної послідовності ДНК, вбудованої в хромосому рослини, або геномної фланкуючої послідовності. Фахівець у даній галузі легко може оцінити користь того, що праймерна послідовність повинна являти собою або повинна бути комплементарною до послідовності, розташованої всередині вбудованої гетерологічної послідовності ДНК, залежно від природи продукту, який потрібно одержати шляхом застосування гніздового набору праймерів, призначених для застосування при ампліфікації конкретної фланкуючої послідовності, що містить стик між геномною послідовністю ДНК і вбудованою гетерологічною послідовністю ДНК. Наступним об'єктом винаходу є спосіб виявлення в біологічному зразку присутності молекули нуклеїнової кислоти, яка є унікальною для варіанта GM RZ13. Способи полягають у тому, що: (а) приводять у контакт зразок, що містить ДНК, з парою праймерів, які при їх застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномної ДНК із варіанта цукрового буряка GM RZ13 продукують амплікон, який є діагностичним для варіанта цукрового буряка GM RZ13; (б) здійснюють реакцію ампліфікації нуклеїнової кислоти, одержуючи тим самим амплікон; і (в) виявляють амплікон. В одному з варіантів здійснення винаходу застосовувана у вищевказаному способі на стадії (а) пара праймерів являє собою одну із вказаних вище пар праймерів, запропонованих у даному винаході, які представлені в даному описі. В іншому переважному варіанті здійснення винаходу застосовувана у вищевказаному способі на стадії (б) пара праймерів являє собою одну із вказаних вище пар праймерів, запропонованих у даному винаході, які представлені в даному описі. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу амплікон, який одержують і виявляють згідно із вказаним способом, містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 і їх комплементи. В іншому переважному варіанті цього об'єкта винаходу в способі виявлення в біологічному зразку присутності молекули нуклеїнової кислоти, яка є унікальною для варіанта GM RZ13, застосовують або аналіз, заснований на використанні гелю, або TaqMan -аналіз. Інші методи виявлення в біологічному зразку присутності молекули нуклеїнової кислоти, яка є унікальною для варіанта GM RZ13, відомі фахівцям у даній галузі. Переважно заснований на застосуванні гелю аналіз включає стадії, на яких (I) приводять у контакт зразок, що містить нуклеїнові кислоти цукрового буряка, з парою праймерів, які мають послідовності, представлені в SEQ ID NO: 5 і 12, або парою праймерів, які мають послідовності, представлені в SEQ ID NO: 13 і 18; (II) здійснюють реакцію ампліфікації нуклеїнової кислоти, одержуючи тим самим амплікон; і (III) виявляють амплікон. Іншим переважним варіантом здійснення винаходу є TaqMan-аналіз, який включає стадії, на яких (I) приводять у контакт зразок, що містить нуклеїнові кислоти цукрового 19 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 буряка, з парою праймерів, які мають послідовності, представлені в SEQ ID NO: 25 і 26, і TaqMan-зондом, який має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 27; (II) здійснюють реакцію ампліфікації нуклеїнової кислоти, одержуючи тим самим амплікон; і (III) виявляють підвищення флуоресценції, що випромінюється репортерним барвником, відщепленим від зонда й відділеного від гасника барвника під час стадії ампліфікації (II). Стандартні умови здійснення заснованого на застосування гелю аналізу й TaqMan -аналізу відомі фахівцеві в даній галузі. Як у заснованому на застосування гелю аналізі, так і в TaqMan -аналізі праймерна пара, яку застосовують на стадії (a), може являти собою будь-яку праймерну пару, запропоновану в даному винаході й описану вище. TaqMan-зонд, який застосовують в TaqMan-аналізі, мічений на 5’-кінці репортерним барвником і на 3’-кінці гасником барвника, повинен мати здатність до ренатурації з нуклеїновими кислотами цукрового буряка в зразку. Якщо зонд є інтактним, гасник пригнічує флуоресценцію репортерного барвника. Під час реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти на стадії (б) ДНК-полімераза Taq розщеплює зонд і тим самим витісняє його з нуклеїнових кислот цукрового буряка, продукуючи при цьому амплікон. У процесі розщеплення зонда репортерний барвник відділяється від гасника барвника, що приводить до підвищення флуоресценції. Підвищена флуоресценція проявляється тільки, якщо відбувається ампліфікація послідовності-мішені, яка комплементарна зонду, що дозволяє попереджати виявлення неспецифічної ампліфікації. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується способу виявлення в зразку присутності молекули нуклеїнової кислоти, яка є унікальною для варіанта GM RZ13, який полягає в тому, що: (a) приводять у контакт зразок із зондом, який гібридизується в строгих умовах з геномною ДНК із варіанта GM RZ13 і не який гібридизується в строгих умовах із ДНК із контрольної рослини цукрового буряка; (б) піддають зразок і зонд гібридизації в строгих умовах і (в) визначають гібридизацію зонда із ДНК. Виявлення амплікону або зонда можна здійснювати за допомогою будь-яких засобів, добре відомих у даній галузі, включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) флуоресцентні, хемілюмінесцентні, радіологічні, імунологічні або ін. У випадку, коли передбачається застосування гібридизації для ампліфікації конкретної послідовності для одержання амплікону, який є діагностичним для варіанта цукрового буряка GM RZ13, то можна застосовувати будь-які добре відомі в даній галузі засобу одержання й виявлення амплікону, який служить ознакою здійснення передбачуваної гібридизації з послідовністю-мішенню в тому випадку, коли застосовують один зонд або праймер, або послідовностей у тому випадку, коли застосовують два або більша кількість зондів або праймерів. Поняття "строгі умови" або "строгі умови гібридизації" стосуються умов, при яких зонд повинен гібридизуватися з послідовністю-мішенню в помітно більш високому ступені, ніж з іншими послідовностями. Строгі умови залежать від послідовності-мішені й повинні відрізнятися залежно від структури полінуклеотиду. Контролюючи строгість умов гібридизації та/або відмивання, можна ідентифікувати послідовності-мішені, які на 100 % комплементарні до зонду (гомологічне зондування). Більш довгі послідовності специфічно гібридизуються при більш високих температурах. Докладний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот наведений в Tijssen в Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, частина I, розділ 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", вид-во Elsevier: New York, 1993; і в Current Protocols in Molecular Biology, розділ 2, під ред. Ausubel і ін., вид-во Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1995, а також в Sambrook і ін., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (5-е вид., вид-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 2001). Специфічність, як правило, визначається умовами відмивань після гібридизації, факторами, що мають вирішальне значення є іонна сила й температура кінцевого розчину для відмивання. Як правило, вибирають дуже строгі умови гібридизації й відмивання, при яких температура приблизно на 5ºС нижче, ніж кінцева температура плавлення (Tm) для конкретної послідовності при певній іонній силі й значенні рН. Tm означає температуру (при певній іонній силі й значенні рН), при якій 50 % послідовностей-мішеней гібридизується з точно підібраним зондом. Як правило, у строгих умовах зонд повинен гібридизуватися з підпослідовністю-мішенню, але не повинен гібридизуватися з іншими послідовностями. Прикладом строгих умов гібридизації на фільтрі методом Саузерн- або нозерн-блотингу для гібридизації комплементарних нуклеїнових кислот, які мають більше 100 комплементарних залишків, є застосування 50 %-ного формаміду з 1 мг гепарину при 42ºC, при здійсненні гібридизації протягом ночі. Прикладом дуже строгих умов відмивання є застосування 0,15M NaСl при 72ºC протягом приблизно 15 хв. Прикладом строгих умов відмивання є відмивання 0,2×SSC (0, 2-кратного SSC) при 65ºC протягом 15 хв. (опис Ssc-буфера див. в Sambrook, нижче). 20 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для зондів, що складаються приблизно з 10-50 нуклеотидів, строгі умови, як правило, включають концентрації солей, що відповідають менше, ніж 1,0M концентрації іонів Na, як правило, приблизно від 0,01 до 1,0M концентрації іонів Na (або інших солей) при ph від 7,0 до 8,3, при цьому температура, як правило, становить принаймні приблизно 30ºC. Строгі умови можуть бути отримані також при додаванні дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Як правило, величина відношення сигналу до шуму, рівна 2 (або вище) у порівнянні з виявленою при застосуванні неспорідненого зонда в конкретному досліді з гібридизації, свідчить про наявність специфічної гібридизації. Нуклеїнові кислоти, які не гібридизуються одна з одною у строгих умовах, ще є практично ідентичними, якщо білки, які вони кодують, є практично ідентичними. Це має місце, наприклад, у тому випадку, коли копію нуклеїнової кислоти створюють із використанням максимальної вирожденості кодонів, що допускається генетичним кодом. Нижче наведені приклади наборів умов гібридизації/відмивання, які можна застосовувати для гібридизації нуклеотидних послідовностей, які практично ідентичні до нуклеотидних послідовностей, запропонованих у даному винаході, з якими проводиться порівняння (референс-послідовність): нуклеотидна референс-послідовність переважно гібридизується з нуклеотидною референс-послідовністю в 7 %-ному додецилсульфаті натрію (ДСН), 0,5М Napo4, 1 мМ ЕДТК при 50ºС із відмиванням 2×SSC, 0,1 % ДСН при 50ºС, переважно в 7 %-ному додецилсульфаті натрію (ДСН), 0,5М Napo4, 1 мМ ЕДТК при 50ºС із відмиванням 1×SSC, 0,1 % ДСН при 50ºС, більш переважно в 7 %-ному додецилсульфаті натрію (ДСН), 0,5М Napo4, 1 мМ ЕДТК при 50ºС із відмиванням 0,5×SSC, 0,1 % ДСН при 50ºС, ще більш переважно в 7 %-ному додецилсульфаті натрію (ДСН), 0,5М Napo4, 1 мМ ЕДТК при 50ºС із відмиванням 0,1×SSC, 0,1 % ДСН при 50ºС, і ще більш переважно в 7 %-ному додецилсульфаті натрію (ДСН), 0,5М Napo4, 1 мМ ЕДТК при 50ºС із відмиванням 0,1×SSC, 0,1 % ДСН при 65ºС. Послідовності, запропоновані в даному винаході, можна виявляти з використанням вказаних вище умов. Для цілей, вказаних у винаході, застосовують строгі умови гібридизації. У компетенції фахівця в даній галузі знаходиться застосування різних методів для виявлення присутності в зразку молекули нуклеїнової кислоти, яка є унікальною для варіанта GM RZ13. Прикладами цих методів, які підпадають під обсяг даного винаходу, є (але, не обмежуючись тільки ними) виявлення на рівні РНК або білка. Прикладами інших методів є ELISA, метод, заснований на застосуванні тест-смужок за допомогою системи Lateral flow, і метод, заснований на застосуванні діагностичних смужок (dipsticks). Виявлення на рівні РНК може включати виявлення послідовності siРНК, виведеної з гена RNA1 BNYVV, включеного у вставку в GM RZ13. Виявлення на рівні білка (за допомогою наприклад, ELISA, методу, заснованого на застосуванні тест-смужок за допомогою системи Lateral flow, і методу, заснованого на застосуванні діагностичних смужок (dipsticks), може включати виявлення білка PMI, включеного у вставку GM RZ13, або білка, який є мішенню РНКi-конструкції, що входить у вставку GM RZ13. Вказані методи виявлення РНК і білків відомі фахівцеві в даній галузі. Мається на увазі, що поняття "біологічний зразок" стосується зразка, який містить або може містити нуклеїнову кислоту, що складається з 5-10 нуклеотидів, що знаходяться на будь-якій стороні від сайту, у якому один або два кінці вбудованої гетерологічної послідовності ДНК контактують із геномною послідовністю ДНК всередині хромосоми, у яку вбудована гетерологічна послідовність ДНК, які позначені також як стикувальні послідовності. Крім того, стикувальна послідовність містить як мінімум два нуклеотиди: з них перший нуклеотид розташований всередині фланкуючої геномної ДНК, і він примикає й ковалентно зв'язаний з першим нуклеотидом у вбудованій гетерологічній послідовності ДНК. В одному з аспектів цього варіанта здійснення винаходу амплікон або зон містить нуклеотидну послідовність, виведену із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 і їх комплементи. У цьому контексті поняття "виведений" означає, що амплікон або зонд може містити повну послідовність однієї з послідовностей, які представлені в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 і їх комплементи, або містити фрагмент або частина цих послідовностей. Ще одним варіантом здійснення даного винаходу є набір, призначений для виявлення в біологічному зразку нуклеїнових кислот, які є унікальними для варіанта GM RZ13. У набір входить принаймні одна молекула нуклеїнової кислоти, що містить полінуклеотид, який складається із суміжних нуклеотидів достатньої довжини для того, щоб функціонувати як праймер або зонд в методі виявлення нуклеїнової кислоти, і які після ампліфікації або гібридизації з нуклеотидною послідовністю-мішенню в зразку з наступним виявленням амплікону або гібридизації з послідовністю-мішенню, служать для діагностики присутності в зразку нуклеотидних послідовностей варіанта GM RZ13. У набір входять також інші матеріали, 21 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 необхідні для здійснення методів гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот. В одному з об'єктів цього варіанта здійснення винаходу вказана молекула нуклеїнової кислоти, що входить у набір, може являти собою будь-яку з послідовностей, запропонованих у даному винаході й описаних вище, але переважно містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 і їх комплементи. Мається на увазі, що фраза "молекула нуклеїнової кислоти, що містить полінуклеотид, що складається із суміжних нуклеотидів достатньої довжини для того, щоб функціонувати як праймер або зонд" стосується обох послідовностей, які (1) відповідають конкретним нуклеотидним послідовностям, представленим вище, або послідовностям, які (2) виведені з конкретних нуклеотидних послідовностей, представлених вище. Можна застосовувати різні методи виявлення, включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) TaqMan-аналіз (фірма Perkin Elmer), термічну ампліфікацію, лігазну ланцюгову реакцію, Саузерн-гібридизацію, методи на основі ELISA і колориметричні й флуоресцентні методи виявлення. Зокрема, даний винахід стосується наборів для виявлення присутності в зразку, який містить геномну нуклеїнову кислоту з GM RZ13, послідовності-мішені, тобто принаймні одного інвертованого повтору, який містить фрагмент із послідовності гена реплікази BNYVV або стикувальну послідовність. У набір входить принаймні один полінуклеотид, що має здатність зв'язуватися із сайтом-мішенню, або, що практично примикає до сайту-мішені, і принаймні один із засобів виявлення зв'язування полінуклеотиду із сайтом-мішенню. Засоби виявлення можуть бути флуоресцентними, хемілюмінесцентними, колориметричними або ізотопними й для виявлення зв'язування їх можна застосовуватися в комбінації принаймні з імунологічними методами. Мається на увазі також, що за допомогою набору можна виявляти присутність у зразку сайту-мішені, тобто принаймні одного інвертованого повтору, який містить фрагмент із послідовності гена реплікази BNYVV або стикувальну послідовність, використовуючи переважно дві або більшу кількість полінуклеотидних послідовностей, які разом мають здатність зв'язуватися з нуклеотидними послідовностями, що примикають або розташованими всередині фрагмента довжиною приблизно 100 пар основ або всередині фрагмента довжиною приблизно 200 пар основ або всередині фрагмента довжиною приблизно 500 пар основ або всередині фрагмента довжиною приблизно 1000 пар основ послідовностімішені, і які можна подовжувати в напрямі один до одного з одержанням амплікону, який містить принаймні один сайт-мішень. Даний винахід стосується також рослини цукрового буряка, що має трансгенний генотип, запропонований у винаході, де трансгенний генотип надає рослині цукрового буряка стійкість до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка або здатність утилізувати манозу як джерело вуглецю або як стійкість до некротичного пожовтіння жилок буряка, так і здатність утилізувати манозу як джерело вуглецю. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу трансгенний генотип, який надає стійкість до некротичного пожовтіння жилок буряка або здатність утилізувати манозу як джерело, несе кодувальну послідовність pmi. Одним з об'єктів винаходу є рослини й насіння цукрового буряка, стійке до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, яке містить молекулу нуклеїнової кислоти, запропоновану у винаході, що включає нуклеотидну послідовність, яка є унікальною для варіанта GM RZ13. Наприклад, стійкі до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослини цукрового буряка являють собою цукровий буряк, насіння якого містять молекули нуклеїнових кислот, депоновані 11 грудня 2008 р. в NCIMB під реєстраційним № 41601. Винахід стосується також рослин, отриманих зі стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослини цукрового буряка, запропонованої у винаході, насіння якого депоновані в NCIMB під реєстраційним № 41601. Іншим об'єктом даного винаходу є насіння цукрового буряка, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, запропоновану у винаході, яка містить нуклеотидну послідовність, унікальну для варіанта GM RZ13. Ще одним об'єктом винаходу є насіння, депоновані в NCIMB під реєстраційним № 41601, а також трансгенна стійка до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослина цукрового буряка, отримана із цього насіння. Крім того, даний винахід стосується також потомства трансгенної стійкої до BNYVV рослини цукрового буряка, депонованого в NCIMB під реєстраційним № 41601. Поняття "отримані (виведені)» щодо рослин, отриманих зі стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослини цукрового буряка, запропонованої у винаході, або отриманих із трансгенної стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослини цукрового буряка, виведеної з насіння, яке депоновано в NCIMB під реєстраційним № 41601, стосується рослин, які утворювалися або отримані із вказаної стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослини або 22 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 насіння цукрового буряка. Трансгенна рослина цукрового буряка, запропонована в даному винаході, є стійкою до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка й позначена як GM RZ13 (або SBVR111). Трансгенна цукровий буряк варіанта GM RZ13 експресує інвертований повтор (RZM) частини транскрипту гена RNA-1 BNYVV (див. приклад 1, нижче). Ця частина гена RNA-1 кодує РНКзалежну РНК-полімеразу (RdRp) або білок реплікази. Експресія RZM під контролем промотору й інтрону з гена убіквітину (Ubiquitin3) (Ubi3) Arabidopsis thaliana надає стійкість до BNYVV шляхом спрямованого впливу РНК-транскрипту реплікази інфікуючого вірусу за допомогою РНКiмеханізму й, як наслідок, шляхом впливу на репродуктивну систему вірусу. Вказаний вплив приводить до погіршення розвитку вірусу в рослині. Крім того, у трансгенній рослині цукрового буряка, запропонованій в даному винаході, має місце експресія гена manA (який відомий також як pmi) з Escherichia coli. Цей ген кодує фосфоманозоізомеразу, PMI, фермент, який діє як селектований маркер, що дозволяє трансформованим рослинним клітинам утилізувати манозу як основне джерело вуглецю. Експресія pmi знаходиться під контролем промотору білка теплового шоку (80) (з Brassica oleracea). Нетрансформовані рослини цукрового буряка не можуть використовувати манозу, і тому білок PMI служить як селектований маркер, коли рослини вирощують у середовищах, що містять манозу як єдине джерело вуглецю. Варіант цукрового буряка GM RZ13, запропонований у даному винаході, створювали за допомогою стандартних методів опосередковуваної Agrobacterium tumefaciens трансформації, які описані нижче в прикладі 2. Карта плазміди pSYN15965 (раніше позначеної як pHiNK188), яку застосовували для трансформації, представлена на фіг. 1. Розмір, функція й сайти ініціації кожного компонента pSYN15965 представлено в таблиці 1. Іншим об'єктом даного винаходу є рослина цукрового буряка, що містить принаймні першу й другу послідовність ДНК, які зв'язані одна з одною з утворенням суміжної нуклеотидної послідовності, де перша послідовність ДНК знаходиться в стикувальній послідовності й містить принаймні приблизно 11 суміжних нуклеотидів, вибраних із групи, яка включає нуклеотиди 461807 SEQ ID NO: 2, нуклеотиди 1-237 SEQ ID NO: 8 і їх комплементи, де друга послідовність ДНК знаходиться в гетерологічній вбудованій послідовності ДНК, яка відповідає нуклеотидам 1-460 SEQ ID NO: 2, нуклеотидам 283-484 SEQ ID NO: 8 і їх комплементам; і де першу й другу послідовність ДНК можна застосовувати як нуклеотидні праймери або зонди для виявлення присутності в біологічному зразку нуклеотидних послідовностей варіанта цукрового буряка GM RZ13. В одному з аспектів цього варіанта здійснення винаходу застосовують нуклеотидні праймери в методі ампліфікації ДНК для ампліфікації послідовності ДНК-мішені з використанням як матриці ДНК, екстрагованої з рослини цукрового буряка, і рослини цукрового буряка можна відрізняти від інших рослин цукрового буряка за утворенням амплікону при використанні вказаних першого й другого нуклеотидних праймерів у вказаному методі ампліфікації ДНК. Іншим об'єктом даного винаходу є біологічний зразок, отриманий з рослини, тканини або насіння цукрового буряка варіанта GM RZ13, де зразок містить нуклеотидну послідовність, яка являє собою або є комплементарною до нуклеотидної послідовності, унікальної для варіанта GM RZ13, і де послідовність можна виявляти в зразку за допомогою методу ампліфікації нуклеїнових кислот або гібридизації нуклеїнових кислот. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу нуклеотидна послідовність, унікальна для варіанта GM RZ13, являє собою або є комплементарною до послідовності, представленої в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8. Зразок можна одержувати з насіння, стебла, листя, коренів, квітки або їх частин. Поняття "рослина цукрового буряка GM RZ13" у цьому контексті стосується рослини цукрового буряка, запропонованої в даному винаході, яка містить нуклеотидну послідовність, унікальну для варіанта GM RZ13. Поняття "тканина або насіння цукрового буряка GM RZ13" стосується тканини або насіння рослини цукрового буряка, запропонованої в даному винаході, яка містить нуклеотидну послідовність, унікальну для варіанта GM RZ13. Наступним об'єктом даного винаходу є екстракт, отриманий з рослини, тканини або насіння кукурудзи варіанта GM RZ13, який містить нуклеотидну послідовність, яка являє собою або є комплементарною до нуклеотидної послідовності, унікальної для варіанта GM RZ13, і де послідовність можна виявляти в зразку за допомогою методу ампліфікації нуклеїнових кислот або гібридизації нуклеїнових кислот. В одному з варіантів цього об'єкта винаходу нуклеотидна послідовність, яка унікальна для варіанта GM RZ13, являє собою або є комплементарною до SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 8. Метод ампліфікації нуклеїнових кислот або гібридизації нуклеїнових кислот може являти собою будь-який метод ампліфікації нуклеїнових кислот або гібридизації нуклеїнових кислот, відомий фахівцеві в даній галузі. 23 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переважно метод ампліфікації нуклеїнових кислот або гібридизації нуклеїнових кислот являє собою метод виявлення присутності в зразку нуклеотидної послідовності, унікальної для варіанта GM RZ13, запропонованого в даному винаході. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб виявлення білка в біологічному зразку варіанта цукрового буряка GM RZ13, який полягає в тому, що: (a) екстрагують білок зі зразка тканини варіанта цукрового буряка GM RZ13; (б) аналізують екстрагований білок за допомогою імунологічного методу, що передбачає застосування антитіла, специфічного для інсектицидного білка або білка селектованого маркера, який продукується варіантом GM RZ13; і (в) визначення зв'язування антитіла з інсектицидним білком або білком селектованого маркера. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб одержання рослини цукрового буряка, стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, який полягає в тому, що (а) здійснюють статеве схрещування першої батьківської рослини цукрового буряка із другою батьківською рослиною цукрового буряка, де перша або друга батьківська рослина цукрового буряка містить ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13, одержуючи тим самим множину рослин покоління першої генерації; (б) відбирають рослина покоління першої генерації, що має стійкість принаймні до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка; (в) дають самоопилитися рослині покоління першої генерації, одержуючи тим самим множину рослин покоління другої генерації; (г) відбирають із рослин покоління другої генерації рослину, яка має стійкість принаймні до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка; де рослини покоління другої генерації містять нуклеотидну послідовність, яка являє собою або є комплементарною до нуклеотидної послідовності, вибраної із групи, яка включає SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 7. У переважному варіанті цього об'єкта винаходу вказаний спосіб являє собою спосіб, у якому перша або друга батьківська рослина цукрового буряка, що містить ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13, який застосовують на стадії (a), являє собою стійку до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослину цукрового буряка, запропоновану в даному винаході й описану вище, або рослину, отриману з насіння, запропонованого у даному винаході й описаного вище. У цьому контексті вираз "рослина цукрового буряка, що містить ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13" стосується рослини цукрового буряка, яка містить нуклеотидну послідовність, унікальну для варіанта GM RZ13. Фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13, запропоновану в даному винаході (тобто нуклеотидну послідовність, запропоновану в даному винаході, яка унікальна для варіанта GM RZ13) можна інтрогресувати шляхом схрещування з іншими лініями цукрового буряка, що мають інші трансгенні або нетрансгенні генотипи. Наприклад, інбредну лінію цукрового буряка, що містить ДНК варіанта GM RZ13, запропоновану в даному винаході (тобто рослину цукрового буряка, що містить нуклеотидну послідовність, унікальну для варіанта GM RZ13), можна схрещувати з інбредною лінією цукрового буряка, що має трансгенний генотип, що обумовлює стійкість до різних вірусів, які, як відомо, заражають рослини цукрового буряка. Утворене насіння й рослини-потомки повинні нести об'єднані ознаки стійкості. Наприклад, інбредну лінію цукрового буряка GM RZ13 можна схрещувати з інбредною лінією цукрового буряка, що має трансгенний генотип, який обумовлює стійкість до гліфосату, такий як варіант H7-1 (заявка на європейський патент EP-A1-1597373, яка включена в даний опис як посилання). Утворене насіння й рослини-потомки мають об'єднані ознаки стійкості як до гербіциду гліфосату, так і до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка. Крім того GM (ГМ)-ознаки типу стійкості до гербіцидів, стійкості до комах, стійкості до хвороб, трансгенні рослини, що мають фенотип уповільненого або заінгібованого стрілкування, трансгенні рослини зі зміненим і/або посиленим складом вуглеводів, можна застосовувати також для об'єднання із трансгенними рослинами, запропонованими в даному винаході, які містять ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13 (тобто рослину цукрового буряка, що містить нуклеотидну послідовність, унікальну для варіанта GM RZ13). Прикладом стійкості до гербіцидів є, зокрема, стійкість до гліфосату, обумовлена описаним вище стійким до гліфосату варіантом H7-1, прикладами стійкості до комах є стійкість до комах, що харчуються надземними частинами (з використанням, наприклад, гена VIP і/або гена Cry (такого як Cry1Ab (див., наприклад, заявку на європейський патент EP 0618976B1, яка повністю включена в даний опис як посилання) або патенти, що належать до родини цього патенту), або VIP3 (див., наприклад, міжнародну заявку на патент WO 96/10083 або міжнародну заявку на патент WO 98/44137 (обидві заявки повністю включені в даний опис як посилання) і патенти, що належать до родини цих заявок на патент), і стійкість до комах, що харчуються підземними частинами (така, наприклад, як стійкість до нематод (наприклад, до бурякової нематоди)); а прикладом стійкості до грибів є стійкість до одного або декількох грибів. Прикладами рослин, які мають фенотип уповільненого або заінгібованого стрілкування, є рослини, у яких експресія одного або декількох генів, вибраних із 24 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 групи, яка включає FT, AGL20, FLC або PRR7, модифікована. Крім того, гени Cry і VIP і інші гени, що є кандидатами для модифікації зв'язаної зі стрілкуванням поведінки цукрового буряка, добре відомі фахівцям у даній галузі. Рослини цукрового буряка з модифікованою експресією генів цукрового буряка FT описані в міжнародній заявці на патент PCT/EP2009/006319 (яка повністю включена в даний опис як посилання), рослини цукрового буряка з модифікованою експресією генів AGL20 і FLC описані в міжнародній заявці на патент WO 2007/122086 (яка повністю включена в даний опис як посилання), і рослини цукрового буряка з модифікованою експресією гена PRR7 описані в міжнародній заявці на патент WO 2009/141446 (яка повністю включена в даний опис як посилання). Приклади модифікованого зміненого та/або посиленого складу вуглеводів описані в міжнародній заявці на патент WO 2004/099403 і в міжнародній заявці на патент PCT/US2009/046968 (зміст обох заявок повністю включене в даний опис як посилання). У переважних варіантах здійснення винаходу стійкість до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка в рослинах, запропонованих у даному винаході, поєднують із будь-яким з наступних факторів (a) стійкість до гліфосату, (б) стійкість до комах (Vip3 або Cry1Ab, або обидва); (в) трансгенний фенотип уповільненого або заінгібованого стрілкування в результаті модифікації експресії одного або декількох генів, вибраних із групи, яка включає FT, AGL20, FLC і PRR7; (г) стійкість до гліфосату й стійкість до комах (Vip3 або Cry1Ab, або обидва) як трикомпонентний "стек", (д) стійкість до гліфосату й трансгенний фенотип уповільненого або заінгібованого стрілкування в результаті модифікації експресії одного або декількох генів, вибраних із групи, яка включає FT, AGL20, FLC і PRR7, як трикомпонентний "стек"; (е) стійкість до комах (Vip3 або Cry1Ab, або обидва) і трансгенний фенотип уповільненого або заінгібованого стрілкування в результаті модифікації експресії одного або декількох генів, вибраних із групи, яка включає FT, AGL20, FLC і PRR7, як трикомпонентний "стек"; і (ж) стійкість до гербіцидів, стійкість до комах (Vip3 або Cry1Ab, або обидва) і трансгенний фенотип уповільненого або заінгібованого стрілкування у результаті модифікації експресії одного або декількох генів, вибраних із групи, яка включає FT, AGL20, FLC і PRR7, як чотирикомпонентний "стек". В іншому переважному варіанті здійснення винаходу не-gm-ознаки типу стійкості до хвороб або стійкості до BNYVV, отриманої із традиційних джерел (типу Holly, WB41, WB42, WB151, WB169, C28, C48, C50 або Rizor або продуктів їх схрещування), або до вірусів, відмінних від BNYVV, можна застосовувати також для об'єднання в трансгенних рослинах, запропонованих у даному винаході, які містять ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13 (тобто рослина цукрового буряка, яка містить нуклеотидну послідовність, унікальну для варіанта GM RZ13). Толерантність до шкідників, таким, наприклад, як бурякові нематоди, кореневі попелиці, яванські галові нематоди, або толерантність до грибів, таких, наприклад, як представники Cercospora, Aphanomyces, Rhizoctonia, Fusarium, Ramularia, Erysipe, Peronospora, Erwinia, Sclerotium, Verticillium, Phoma або до збудників іржі, або толерантність до вірусів, таких, наприклад, як вірус кучерявості верхівки буряка, вірус пожовтіння буряка, м'який вірус пожовтіння буряка, західний вірус пожовтіння буряка, являє собою додаткові ознаки, які можна поєднувати в трансгенних рослинах, запропонованих у даному винаході, які містять ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13 (тобто рослина цукрового буряка, яка містить нуклеотидну послідовність, унікальну для варіанта GM RZ13). Повинно бути очевидно також, що інші комбінації або об'єднані групи можна створювати в трансгенних рослинах, запропонованих у даному винаході, які містять ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13 (тобто рослина цукрового буряка, яка містить нуклеотидну послідовність, унікальну для варіанта GM RZ13), і ці приклади не слід розглядати як обмежуючі обсяг винаходу. Фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно також, що трансгенне насіння цукрового буряка, що містить нуклеотидну послідовність, запропоновану в даному винаході, яка є унікальною для варіанта GM RZ13, можна обробляти різними призначеними для обробки насіння хімічними агентами, включаючи різні пестициди й інсектициди, для додаткового підвищення стійкості до BNYVV. ДНК варіанта цукрового буряка GM RZ13, запропоновану в даному винаході (тобто нуклеотидну послідовність, запропоновану в даному винаході, яка є унікальною для варіанта GM RZ13) можна інтрогресувати у будь-яку інбредну або гібридну лінію цукрового буряка з використанням відомих у даній галузі методів схрещування. Метою схрещування рослин є об'єднання в одному сорті або гібриді різних необхідних ознак. Для польових культур ці Gmознаки й не-GM ознаки, що представляють інтерес, можуть включати перераховані вище ознаки й також агрономічні ознаки, такі, наприклад, як підвищена врожайність і більш висока агрономічна якість. При механічному зборі врожаю багатьох культур є важливою однорідність 25 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 характеристик рослин, таких як проростання й утворення головного кореня, швидкість росту, дозрівання й розмір коренів. Рослини, яким давали самозапилюватися й відбирали відносно типу протягом багатьох генерацій, ставали гомозиготними практично у всіх генних локусах і давали однорідну популяцію чисто сортового потомства. Схрещування між двома різними гомозиготними лініями дає однорідну популяцію гібридних рослин, які можуть бути гетерозиготними по багатьом генним локусам. Схрещування двох рослин, кожна з яких є гетерозиготною за декількома генними локусами, повинне приводити до одержання популяції гібридних рослин, які відрізняються генетично й не можуть бути однорідними. Методи схрещування рослин, які відомі в даній галузі і які можна застосовувати в програмах селекції цукрового буряка, включають (але, не обмежуючись тільки ними) рекурентну (періодичну) селекцію, поворотне схрещування, селекцію на базі родоводу, селекцію підвищеної ефективності на основі поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів, селекцію підвищеної ефективності на основі генетичних маркерів і трансформацію. Для створення гібридів цукрового буряка в рамках програми селекції цукрового буряка потрібно, у цілому, створення гомозиготних інбредних ліній, схрещування цих ліній і оцінка результатів схрещування (кросів). Методи селекції на базі родоводу й рекурентної селекції використовують для створення інбредних ліній із призначених для розведення популяцій. У програмах селекції цукрового буряка поєднують генетичні фони із двох або більшої кількості інбредних ліній або різних інших джерел зародкової плазми в пули для розведення, з яких створюють нові інбредні лінії шляхом самозапилення й відбору необхідних фенотипів. Нові інбредні лінії схрещують із іншими інбредними лініями й гібриди, отримані в результаті цих схрещувань, оцінюють для виявлення тих з них, які потенційно можна використовувати для продажу. Розведення рослин і створення гібридів при втіленні на практиці програми селекції рослин цукрового буряка є дорогими що представляють інтерес й такими, що потребують значних часових витрат. Селекція на базі родоводу починається зі схрещування двох генотипів, кожний з яких може мати одну або декілька необхідних характеристик, які відсутні в іншому, або які доповнюють інший. Якщо два вихідні батьки не забезпечують присутність усіх необхідних характеристик, то в популяцію для розведення можна включати інші джерела. При використанні методу селекції на базі родоводу рослини вищої якості запилюють і відбирають послідовні покоління. У послідовних поколіннях гетерозиготний стан дозволяє одержувати гомозиготні лінії в результаті самозапилення й селекції. Як правило, при використанні на практиці методу селекції на базі родоводу для самозапилення й селекції застосовують п'ять або більшу кількість поколінь: F1 → F2; F2 → F3; F3 → F4; F4 → F5 і т.д. Розведення на основі рекурентної селекції, наприклад, поворотне схрещування, можна використовувати для поліпшення інбредної лінії й гібриду, створеного з використанням цих інбредних ліній. Поворотне схрещування можна застосовувати для перенесення конкретної необхідної ознаки з однієї інбредної лінії або з одного джерела в інбредну лінію, у якій відсутня ця ознака. Це можна здійснювати, наприклад, шляхом першого схрещування інбредної лінії вищої якості (рекурентний батько) з інбредною лінією-донором (нерекурентний батько), яка несе відповідний(і) ген(и), що обумовлює(ють) ознаку, що представляє інтерес. Потім потомство цього схрещування піддають поворотному схрещуванню з рекурентним батьком вищої якості з наступною селекцією утвореного потомства відносно необхідної ознаки, яка повинна бути перенесена з нерекурентного батька. Після одержання 5 або більшої кількості поколінь беккросів з їх селекцією за необхідною ознакою потомство повинно бути гомозиготним за локусом, що контролює характеристику, що підлягає перенесенню, але повинно бути схожим на батька вищої якості відносно всіх інших генів. Потім останнє покоління беккросів запилюють із одержанням чисто сортового потомства відносно гена(ів), що підлягає(ють) переносу. Гібрид, створений з інбредних ліній, що містять перенесений(і) ген(и), є практично таким же, що й гібрид, отриманий із цих інбредних ліній без перенесеного(их) гена(ів). Елітні інбредні лінії, які являють собою чисто сортові (практично) гомозиготні інбредні лінії, можна застосовувати також як вихідний матеріал для селекції або популяцій-джерел, з яких створюють інші інбредні лінії. Ці інбредні лінії виводять із елітних інбредних ліній за допомогою описаних раніше методів розведення, таких як селекція на базі родоводу й рекурентна селекція. Наприклад, коли поворотне схрещування використовують для створення цих виведених ліній при здійсненні програми селекції рослин цукрового буряка, елітні інбредні лінії можна застосовувати як батьківську лінію або вихідний матеріал або популяцію-джерело і вони можуть служити або як донор, або як рекурентний батько. Як повинно бути очевидно фахівцеві в даній галузі, вище викладені лише деякі різні шляхи, за допомогою яких можна одержувати інбредну лінію, запропоновану в даному винаході, 26 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вибрану для інтрогресії ДНК цукрового буряка варіанта GM RZ13, запропонованого в даному винаході (тобто нуклеотидної послідовності, запропонованої в даному винаході, яка є унікальною для варіанта GM RZ13), в інші лінії цукрового буряка. Фахівцеві в даній галузі повинні бути відомі й інші шляхи, тому наведені вище приклади представлені тільки з метою ілюстрації. Простий гібрид одержують у результаті схрещування двох інбредних ліній, кожна з яких має генотип, комплементарний до генотипу іншого. Гібридне потомство першого покоління позначають як F1. При створенні призначених для продажу гібридів при здійсненні програми селекції рослин цукрового буряка бажано застосовувати тільки гібридні F1-рослини. Переважні F1-гібриди є більш сильними, ніж їх інбредні батьки. Ця гібридна сила або гетерозис може проявлятися в багатьох полігенних ознаках, включаючи підвищений вегетативний ріст і підвищену врожайність. Створення гібриду цукрового буряка при здійсненні програми селекції рослин цукрового буряка включає три стадії: (1) відбір рослин, отриманих з різних пулів зародкової плазми для початкових кросбридингів; (2) самозапилення відібраних рослин, отриманих у результаті кросбридингу декількох поколінь, з одержанням серій інбредних ліній, які хоча відрізняються одна від одної, є чисто сортовими й мають високий ступінь однорідності; і (3) схрещування відібраних інбредних ліній з різними інбредними лініями з одержанням гібридного потомства (F1). У процесі інбридингу цукрового буряка сила ліній знижується. Сила відновлюється, коли дві різні інбредні лінії схрещують із одержанням гібридного потомства (F1). Важливим результатом гомозиготності й гомогенності інбредних ліній є те, що гібрид двох різних пар інбредних ліній завжди є тим же самим. Після ідентифікації інбредних ліній, які дають гібрид вищої якості, гібридний насінний матеріал можна необмежено розмножувати, якщо зберігається гомогенність інбредних батьків. Простий гібрид одержують у тому випадку, коли схрещують дві інбредні лінії з одержанням F1-потомства. Подвійний гібрид одержують у результаті попарного схрещування чотирьох інбредних ліній (A × B і C × D), а потім два F1-гібриди схрещують знову (A × B) × (C × D). Трилінійний гібрид одержують із трьох інбредних ліній, при цьому схрещують дві із цих інбредних ліній (A × B), а потім утворений F1-гібрид схрещують із третьою інбредною лінією (A ×B) × C. Більша частина гібридної сили, характерної для F1-гібридів, губиться в наступному поколінні (F2). Отже, насінний матеріал гібридів не можна застосовувати як посадковий матеріал. При виробництві гібридного насіння переважно елімінують або інактивують виробництво пилку материнською особиною. Неповне видалення або інактивація пилку залишає потенційну можливість самозапилення. Ці отримані в результаті небажаного самозапилення насіння можуть бути ненавмисно зібрані й упаковані разом з гібридним насінням. Після посіву насіння можна ідентифікувати й відбирати ці отримані в результаті самозапилення рослини. Ці отримані в результаті самозапилення рослини будуть генетично еквівалентні до жіночої інбредної лінії, застосовуваної для одержання гібриду. Як правило, ці отримані в результаті самозапилення рослини можна ідентифікувати й відбирати за їх зниженою силою. Жіночі рослини, отримані в результаті самозапилення, ідентифікують за зниженням сили вегетативних і/або репродуктивних характеристик. Ідентифікацію цих отриманих у результаті самозапилення ліній можна здійснювати також за допомогою аналізу з використанням молекулярних маркерів. Однак існує проста й ефективна система контролю запилення, що гарантує наявність гетерозису, шляхом виключення самозапилення при виробництві призначених для продажу гібридного насіння. Якщо один з батьків має самостерильність (SI), цитоплазматичну чоловічу стерильністу (ЦЧС) або ядерну чоловічу стерильність (ЯМС), то рослина не може самозапилюватися або не здатна виробляти пилок, при цьому повинне мати місце тільки перехресне запилення. Шляхом елімінації пилку одного із застосовуваних для схрещування батьківських сортів рослинник-селекціонер гарантує одержання гібридного насінного матеріалу однорідної якості за умови, що батьки мають однорідну якість і селекціонер здійснює одне схрещування. Цитоплазматична чоловіча стерильність (ЦЧС) являє собою успадковувану за материнською лінією ознаку, генетичні детермінанти якої локалізовані в геномі цитоплазматичних органел, мітохондрій. У таких рослин у значній мірі порушена здатність утворювати функціональні пилкові зерна. Гени-відновники системи ЦЧС являють собою домінантні ядерні гени, які пригнічують ефекти чоловічої стерильності, властиві цитоплазмі. Прояв чоловічої стерильності в рослинах, що мають ЦЧС, є результатом несумісності між рецесивним ядерним геном і специфічним для чоловічої стерильності цитоплазматичним геномом. Наступним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання гібридного насіння цукрового 27 UA 106061 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 буряка, стійкого до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка. Спосіб полягає в тому, що: (а) одержують стійку до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка лінію цукрового буряка як першу батьківську лінію, (б) одержують другу батьківську лінію цукрового буряка з іншим генотипом як другу батьківську лінію; (в) дають рослинам першої батьківської лінії, отриманої на стадії (a), і рослинам другої батьківської лінії, отриманої на стадії (б), запилювати одна одну, дають розвиватися насінню й збирають гібридний насінний матеріал, де зібране гібридне насіння являють собою насіння стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослини цукрового буряка. У переважному варіанті здійснення винаходу для одержання гібридних рослин цукрового буряка, запропонованих у даному винаході, застосовують систему ЦЧС. У цій системі чоловічу стерильну лінію, що має ЦЧС, застосовують як материнську особину, яку запилюють чоловічою фертильною лінією, застосовуваної як батьківську особину. Переважно молекулу нуклеїнової кислоти, запропоновану в даному винаході, яка є унікальною для варіанта цукрового буряка GM RZ13, підтримують у варіанті, що має чоловічу стерильність, для того щоб уникнути геномодифікованих (GM) забруднень через пилок, що містить ознаку, переносиму батьківською особиною. Таким чином, у переважному варіанті здійснення винаходу чоловіча батьківська лінія цукрового буряка, що має ЦЧС, отримана на стадії (а) або (б) описаного вище способу, являє собою інбредну лінію цукрового буряка, яка містить нуклеотидну послідовність, запропоновану в даному винаході, унікальну для варіанта GM RZ13. Крім того, у такій системі обидва батьки можуть являти собою трансгенні рослини. Таким чином, іншим переважним варіантом способу є спосіб одержання стійкого до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка гібридного насіння цукрового буряка, який полягає в тому, що (а) одержують стійку до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка лінію цукрового буряка як першу батьківську лінію, (б) одержують другу батьківську лінію цукрову буряка з іншим генотипом як другу батьківську лінію; де одна з батьківських ліній, застосовуваних на стадії (а) або стадії (б), являє собою чоловічу стерильну лінію зі ЦЧС і де інша батьківська лінія являє собою лінію із чоловічою фертильністю;(в) дають рослинам батьківської лінії із чоловічою фертильністю запилювати квітки батьківської лінії із чоловічою стерильністю, дають розвиватися насінню й збирають гібридний насінний матеріал, де зібране гібридне насіння являють собою насіння стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка лінії цукрового буряка, переважно гібридне насіння стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка лінії цукрового буряка, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти, запропоновану в даному винаході, яка є унікальною для варіанта цукрового буряка GM RZ13. В іншому переважному варіанті цього об'єкта винаходу стійка до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка лінія, застосовувана як першу батьківську лінію на стадії (а), являє собою стійку до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка інбредну лінію цукрового буряка, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти, запропоновану в даному винаході, яка є унікальною для варіанта цукрового буряка GM RZ13. В іншому варіанті цього об'єкта другу батьківську лінію вибирають із групи, яка включає (a) інбредну лінію цукрового буряка, стійку принаймні до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, що має інший генотип, але містить молекулу нуклеїнової кислоти, запропоновану в даному винаході, яка є унікальною для варіанта цукрового буряка GM RZ13; (б) інбредну лінію цукрового буряка, стійку принаймні до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, який має походження із джерела, що зустрічається в природніх умовах, такого як Holly-джерело, WB41, WB42, WB151, WB169, C28, C48, C50 або Rizor, або продуктів їх схрещування; і (в) інбредну лінію цукрового буряка, що не має стійкість до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка. Вираз "інбредна лінія цукрового буряка, стійка принаймні до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, що має інший генотип, але містить молекулу нуклеїнової кислоти, запропоновану в даному винаході, яка є унікальною для варіанта цукрового буряка GM RZ13" означає рослину цукрового буряка, яка містить нуклеотидну послідовність, запропоновану в даному винаході, але відрізняється принаймні одним геном або ознакою. Така інбредна рослина цукрового буряка може містити додаткові Gm-Ознаки або не-GM- ознаки, вказані вище. Інбредна рослина цукрового буряка, застосовувана на стадії (а), може являти собою стійку до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослину цукрового буряка, запропоновану в даному винаході й описану вище, або рослину, отриману з насіння стійкої до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка рослини цукрового буряка, запропонованої в даному винаході й описаної вище. Поняття "має походження, отриманий" у контексті джерел, що зустрічаються в природніх умовах, стійкості до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряка, вибраних із групи, яка включає Holly-джерело, WB41, WB42, WB151, WB169, C28, C48, C50 або Rizor, або продукти їх схрещування, стосується стійких до BNYVV рослин цукрового буряка, стійкість яких до BNYVV виведена із традиційних ліній цукрового буряка або диких типів цукрової буряка, які не мають 28