Спосіб ідентифікації шиготоксинутворюючих генів (stx1/stx2) escherichia coli методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі

Реферат: Спосіб ідентифікації шиготоксиноутворюючих генів (stx1 і stx2) Escherichia coli методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) ентерогеморагічних ешерихій за допомогою ферментативної реакції з шістьма штучно синтезованими олігонуклеотидними ланцюгами, які багаторазово копіюють специфічні ділянки ДНК інфекційного агента при певних температурних і часових параметрах та кількості циклів. Для проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі використовують оригінальні праймери і флуоресцентні зонди з наступною нуклеотидною послідовністю: • STX1 FOR (5'-TACCAGGGCTTACGTTGGTC-3'); • STX1 REV (5'-AACCGAACAAACAGCAAAGG-3'); • STX1 PROBE (5'-FAM-CACGGTAAGGCGCAATAATT-BHQ1-3'); • STX2 FOR (5'-CCGCTTTCTTTACTGCGTTC-3'); • STX2 REV (5'-CGCTGGAAGGTGAAGAGTTC-3'); • STX2 PROBE (5'-VIC-AACTGTGTTCCTGGTTTGGC-BHQ1-3'). UA 115879 U (12) UA 115879 U UA 115879 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології, біотехнології та лабораторної діагностики і може бути використана для виявлення генів шиготоксинів у ентерогеморагічних Escherichia coli (зокрема у Е. coli 0157:Н7), які утворюють шигоподібні токсини. Шиготоксинпродукуючі Escherichia coli (STEC) віднесено до окремого класу патогенів. Вони спроможні синтезувати екзотоксини stx1 і stx2, які можуть зумовлювати захворювання у сільськогосподарських тварин з симптомокомплексом ураження шлунково-кишкового тракту та розвиток геморагічного коліту з гемолітико-уремічним синдромом при інфікуванні людей. Моніторинг STEC необхідно проводити в зразках біологічного матеріалу, в продуктах харчування тваринного і рослинного походження, інших об'єктах ветеринарно-санітарного та епідеміологічного нагляду. Типовим представником шиготоксинпродукуючих ешерихій є Е. соlі 0157:Н7. Відомий спосіб виявлення генів шиготоксинів Е. соlі методом полімеразної ланцюгової реакції із розділенням продуктів ампліфікації в агарозному гелі, який включає відбір зразків біологічного матеріалу, екстракцію ДНК із зразків крові, проведення полімеразної ланцюгової реакції, візуалізацію результатів за допомогою розділення продуктів реакції в агарозному гелі. [Peter К. / Fagan Detection of Shiga-Like Toxin (stx1 and stx2), Intimin (eaeA), and Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) Hemolysin (EHEC hlyА // Peter К., Fagan, Michael A. Hornitzky, Karl A. Bettelheim, and Steven P. Djordjevic. Appl Environ Microbiol. 1999 Feb; 65(2): P. 868-872.). Недоліком є те, що для візуалізації та аналізу результатів необхідним є проведення електрофорезу продуктів ампліфікації в агарозному гелі, що збільшує ризик контамінації та може призводити до отримання псевдопозитивних результатів дослідження. Крім того, для візуалізації продуктів ампліфікації в агарозному гелі використовують флуоресцентний інтеркалюючий барвник - бромистий етідій, який має канцерогенні властивості, що становить небезпеку для персоналу при обліку результатів досліджень. В основу корисної моделі поставлена задача створити спосіб виявлення у Е. соlі генів, що кодують синтез шиготоксинів (stx1 і stx2), тобто - виявлення STEC за допомогою мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Поставлена задача вирішується тим, що полімеразну ланцюгову реакцію в реальному часі проводять з оригінальними праймерами і флуоресцентними зондами (для детекції stx1 флуоресцентний зонд позначений барвником FAM, а для детекції stx2 - флуоресцентний зонд позначений флуоресцентним барвником VIC. Для проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі використовуються оригінальні праймери і флуоресцентні зонди з наступною нуклеотидною послідовністю: • STX1 FOR - (5'-TACCAGGGCTTACGTTGGTC-3'); • STX1 REV - (5'-AACCGAACAAACAGCAAAGG-3'); • STX1 PROBE - (5'-FAM-CACGGTAAGGCGCAATAATT-BHQ1-3'); • STX2 FOR - (5'-CCGCTTTCTTTACTGCGTTC-3'); • STX2 REV - (5'-CGCTGGAAGGTGAAGAGTTC-3'); • STX2 PROBE - (5'-VIC-AACTGTGTTCCTGGTTTGGC-BHQ1-3'). Спосіб ідентифікації шиготоксинутворюючих (STX1 / STX2) ESCHERICHIA COLI методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі можна описати наступними прикладами. Приклад 1. Методи відбору матеріалу для проведення досліджень. Для прижиттєвої діагностики ешерихіозу у лабораторію направляють матеріал від хворих тварин, яких не піддавали лікуванню антибактеріальними препаратами, відібраний у стерильні пробірки (флакони) з гумовими пробками: а) фекалії в кількості (2-3) г, відібрані безпосередньо з прямої кишки за допомогою попередньо прокип'яченого гумового катетера або в момент дефекації; 3 б) молоко в кількості (10-15) см , взяте вибірково від (10-20) корів стада після санітарної обробки шкіри і вилучення перших порцій молока, - одна збірна проба. Залежно від поголів'я корів на фермі кількість збірних проб молока може варіювати в межах від 3 до 5 (в межах 10-20 % поголів'я). Молоко має бути доставлено в лабораторію для дослідження в день відбирання проби. За відсутності такої можливості молоко консервують кристалічною борною кислотою (0,1 3 г на 10 см ). Консервоване молоко придатне для дослідження протягом 10 днів. Для посмертної (постмортальної) діагностики в лабораторію направляють матеріал від загиблих або вимушено забитих тварин, бажано, яких не піддавали лікуванню антибактеріальними засобами. Трупи дрібних тварин (поросят, хутрових звірів, птахів та ін.) направляють цілими (2-4 тушки). 1 UA 115879 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Від великих тварин відбирають наступний матеріал: серце, перев'язане лігатурою поблизу розрізу судин і аорти; селезінку; частку печінки з жовчним міхуром; нирку; уражені ділянки тонкого або товстого відділу кишечнику з вмістом, перев'язані з двох кінців лігатурою, разом з мезентеріальними лімфатичними вузлами (в окремому посуді або поліетиленовому пакеті); голову; трубчасту кістку; підщелепні лімфатичні вузли; у свиней і поросят ще й зіскрібки з задньої стінки глотки, з поверхні кореня язика і глоткових мигдалин, взяті стерильним скальпелем. Для діагностики ешерихіозу птахів з неблагополучних секцій пташника направляють по (3-5) свіжих трупів або (3-5) птахів з клінічними ознаками діареї. Хвору птицю забивають у лабораторії і піддають патологоанатомічному і бактеріологічному дослідженню. Проби м'ясної сировини, молока і вершків для бактеріологічного дослідження відбирають згідно з правилами і в кількостях, передбачених наступними ДСТУ: • ДСТУ ISO 707-2002 (ISO 707:1997, IDT) Молоко та молочні продукти. Настанови з відбирання проб. • ДСТУ ISO 5538:2004 (ISO 5538:1987, IDT) Молоко та молочні продукти. Відбирання проб. Контроль за якісними ознаками. • ДСТУ ISO 8197:2004 (ISO 8197:1988, IDT) Молоко та молочні продукти. Відбирання проб. Контроль за кількісними ознаками. • ГОСТ 7702.0-74 Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы оценки качества (М'ясо птиці. Методи відбору зразків. Органолептичні методи оцінки якості). • ГОСТ 7702.2.0-95 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям". • ГОСТ 30726-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli (ГОСТ 30726-2001 Продукти харчові. Методи виявлення та визначення кількості бактерій виду Escherichia coli). • ГОСТ 30518-97 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества группы кишечных палочек (колиформных бактерий) (ГОСТ 30518-97 Продукти харчові. Методи виявлення та визначення кількості групи кишкових паличок (коліформних бактерій)). • ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов (ГОСТ 26668-85 Продукти харчові та смакові. Методи відбору проб для мікробіологічних досліджень). • ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов (ГОСТ 26669-85 Продукти харчові та смакові. Підготовка проб для мікробіологічних досліджень). • ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов (ГОСТ 26670-91 Продукти харчові. Методи культивування мікроорганізмів). • ДСТУ ISO 9308-2:1990, IDT Якість води. Виявлення та підрахування колі формних бактерій та передбачуваної кількості Escherichia coli. Коренеплоди, що зберігаються в овочесховищах або буртах, піддають дослідженню не раніше ніж через 30 днів після їх закладки. Проби рослинних кормів для дослідження відбирають згідно з такими ДСТУ: • ДСТУ ISO 6497:2005 Корми для тварин. Методи відбирання проб. • ДСТУ 4984:2008 Буряки цукрові. Методи відбирання та готування проб коренеплодів для визначання технологічних показників їхньої якості. • ДСТУ ISO 874-2002 Фрукти та овочі свіжі. Відбирання проб. • ГОСТ 27262-87 Корма растительного происхождения. Методы отбора проб. Приклад 2. Попереднє збагачення (підрощення) зразка на лептонному бульйоні. Гомогенізувати 25 г зразка в 225 мл живильного середовища та відфільтрувати. Інкубувати на шейкері при 41,5±1 °C протягом 8-24 год. Приклад 3. Екстракція ДНК: 1 мл збагаченого (підрощеного) зразку центрифугувати при 13,5 тис. об/хв. протягом 2 хв. і видалити супернатант. Додати по 200 мкл ТЕ-буферу та інкубувати у термостаті при 95 °C протягом 5 хв. Центрифугувати при 5,0 тис. об/хв. протягом 2 хв. і відібрати 180-190 мкл супернатанту. Приклад 4. Проведення полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Приготувати реакційну суміш для досліджуваних зразків із розрахунку 19,8 мкл ПЛР-суміші та 0,2 мкл ферменту Taq-полімерази на один зразок. 96-лунковий планшет для ПЛР, або відповідну кількість 8-лункових стрипів помістити у спеціальний штатив із охолодженням, у лунки за допомогою автоматичного дозатора послідовно внести по 20,0 мкл ПЛР-суміші та додати по 5,0 мкл екстрагованої ДНК. У лунку, яка призначена для позитивного контролю, 2 UA 115879 U 5 внести 5,0 мкл реактиву «позитивний контроль», а у лунку, яка призначена для негативного контролю, внести 5,0 мкл реактиву «негативний контроль». Включити прилад для проведення ПЛР у реальному часі, помістити реакційний планшет у блок для зразків; відкрити програмне забезпечення до приладу, створити планшетний документ. Згідно з настановою до приладу, задати температурний профіль (табл. 1). Таблиця 1 Температурний профіль ампліфікації Стадія 1 2 Режим ампліфікації Температура, °C Час, с. 94 300 95 20 56 20 72 30 Процес Число циклів активація полімерази денатурація ДНК відпалювання праймерів* елонгація 1 40 Примітка: * стадія, на якій здійснюється реєстрація даних флуоресцентного сигналу 10 15 20 25 30 Приклад 5. Інтерпретація одержаних результатів. Основним критерієм оцінки отриманих результатів є визначення граничного циклу (Ct), що характеризує певний цикл полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі, на якому відмічається статистично достовірне збільшення флуоресценції порівняно із фоновим рівнем. Для інтерпретації результатів дослідження проводиться аналіз кривих ампліфікації контролів та невідомих зразків: - у позитивному контрольному присутня ампліфікація за барвником FAM та VIC (stx1 і stx2). - у негативному контрольному відсутня ампліфікація за барвником FAM та VІС. - зразок вважається позитивним, якщо відмічається ампліфікація за барвником FAM та/або VIC при значенні Ct  35. - зразок вважається негативним, у якого відсутня ампліфікація за барвником FAM та VIC. Результати аналізу не враховуються: - при відсутності ампліфікації за барвником FAM та VIC у позитивного контролю; - при наявності ампліфікації за барвником FAM та/або VIC у негативного контролю; - при великій розбіжності значень граничного циклу Ct у повторах (SD>0,5). В цих випадках проводиться повторна екстракція ДНК та постановка полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. На кресленні показано приклад зразку позитивного щодо шиготоксинів stx1 і stx2, у вигляді кривих ампліфікацій, отриманих за методом ПЛР в реальному часі: 1. Барвник VIC (stx2), 2. Барвник FAM (stx1) Таким чином, спосіб, призначений для виявлення специфічних фрагментів нуклеїнових кислот (ДНК) бактерій Escherichia coli, може бути використаний для індикації та ідентифікації бактерій в біологічному матеріалі, продуктах харчування, об'єктах довкілля, об'єктах ветеринарно-санітарного нагляду, в науково-дослідних роботах, в навчальних процесах. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 45 Спосіб ідентифікації шиготоксиноутворюючих генів (stx1 і stx2) Escherichia coli методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі, що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) ентерогеморагічних ешерихій за допомогою ферментативної реакції з шістьма штучно синтезованими олігонуклеотидними ланцюгами, які багаторазово копіюють специфічні ділянки ДНК інфекційного агента при певних температурних і часових параметрах та кількості циклів, який відрізняється тим, що для проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі використовують оригінальні праймери і флуоресцентні зонди з наступною нуклеотидною послідовністю: • STX1 FOR (5'-TACCAGGGCTTACGTTGGTC-3'); • STX1 REV (5'-AACCGAACAAACAGCAAAGG-3'); • STX1 PROBE (5'-FAM-CACGGTAAGGCGCAATAATT-BHQ1-3'); • STX2 FOR (5'-CCGCTTTCTTTACTGCGTTC-3'); • STX2 REV (5'-CGCTGGAAGGTGAAGAGTTC-3'); • STX2 PROBE (5'-VIC-AACTGTGTTCCTGGTTTGGC-BHQ1-3'). 3 UA 115879 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4