Спосіб експресного визначення токсичності комплексних поліфункціональних харчорих добавок

Реферат: Спосіб експресного визначення токсичності комплексних поліфункціональних харчових добавок включає підготовку тест-культури інфузорії, відбір проб досліджуваного продукту, екстрагування проби, фільтрування відібраного екстракту, внесення фільтрату в тест-культуру інфузорій, термостатування одержаної суміші і визначення токсичності досліджуваного продукту при спостереженні за життєдіяльністю інфузорій під час термостатування. Як тест-об'єкт визначення токсичності комплексних поліфункціональних харчових добавок використовують інфузорію Tetrahymena pyriformis. Екстрагування токсичних речовин досліджуваних зразків проводять в трьох повторах з використанням одночасно ацетону і води. Облік результатів проводять за критеріями загибелі та реєстрації морфологічних змін у тест-об'єктів протягом 1 години контакту з ацетоновим екстрактом та 96 годин контакту з водним екстрактом. UA 115878 U (12) UA 115878 U UA 115878 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі оцінки безпечності продуктів харчування за допомогою біоіндикації, а саме до експрес-біоіндикації небезпечних харчових продуктів, і може бути використана для скринінгу потенційно небезпечних комплексних поліфункціональних харчових добавок. У харчовій промисловості світу використовується понад 2000 харчових добавок, лише 600 із яких занесені до списку безпечних речовин (Щеткіна Т.М., 2006). Значна кількість харчових добавок, у тому числі зі смаковими та ароматичними властивостями, особливо синтетичного походження, є сторонніми речовинами для організму людини та при споживанні можуть проявляти токсичні ефекти, спричиняючи додаткове навантаження на детоксикаційні системи (Смоляр В.І., 2005). Композиції харчових добавок потребують додаткового вивчення щодо канцерогенної, мутагенної, алергенної, ембріо-, нейро- та імуннотоксичної дії за різних дозувань та режимів надходження до організму людини, так як комплексна дія хімічних речовин на організм людини може викликати різні типи відповідних реакцій - синергізм, антагонізм, адитивність [Росивал Л., 1998; Лаврушенко Л.Ф., 1998; Орещенко А.В., 1998; Попович Н.А., 2000; звіти JECFA FAO/WHO]. Класична методологія токсикологічної оцінки субстанцій харчового призначення, передбачає використання як лабораторних моделей теплокровних тварин: щурів, мишей, кроликів та ін. для встановлення міри токсичності за основними параметрами (ЛД 50, ЛД100). Проте вказані методики передбачають використання великої кількості лабораторних тварин. Виявлення токсичних речовин за допомогою хроматографічних та спектрометричних методів можливе, але їх недоліком є тривалість проведення досліджень, наявність вартісного обладнання та висококваліфікованого персоналу. Відомий спосіб діагностики якості водного середовища [Патент України № 55842 А від 15.04.2003, МПК G01N33/18, бюл. № 4], що включає введення у середовище тест-організмів і визначення токсичності середовища, причому використовують одночасно тест-організми трьох різних систематичних груп, витримують тест-організми у середовищі протягом 1-5 діб, беруть клітини організмів і здійснюють цитогенетичний аналіз за якісними характеристиками ядерець, мікроядер та подвійних ядер, і на підставі летальних та сублетальних ефектів тест-організмів і цитогенетичних ефектів клітин тих самих тест-організмів отримують комплексну оцінку токсичності, генотоксичності та цитотоксичності водного середовища. Але застосування вказаного способу не передбачає тестування харчових добавок. Також, відомий спосіб "Застосування інфузорії Paramecium caudatum Ehrenberg для експресвизначення токсичності лікарських засобів" [Патент України № 30232. Бюл. № 6 від 15.11.2000], використання якого забезпечує прискорене визначення токсичності лікарських засобів, а як критерій виявлення токсичної дії є зміна форми тіла, поведінки, кількості найпростіших Paramecium caudatum Ehrenberg, та ознаки втрати життєдіяльності парамеції - повне припинення локомоторної функції, деформація тіла, розшарування та руйнування оболонки, розсіювання цитоплазми, а для підрахунків чисельності використовують лічильну камеру Богорова. Але за вказаним способом неможливо визначати безпеку харчових добавок для споживачів. Найближчим аналогом корисної моделі та єдиним стандартизованим методом в Україні для визначення токсичності продовольчої сировини є ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97) "Зерно фуражне, продукти його переробки, комбікорми. Методи визначення токсичності", сфера якого не поширюється на харчові добавки та пряно-ароматичні суміші. Найближчим аналогом є Патент України № 32482 від 15.05.2008 "Спосіб визначення токсичності кормів для непродуктивних тварин", який передбачає використання інфузорій Colpodasteinii як тест-об'єкта, відбір проб досліджуваного продукту, екстрагування проби, фільтрування відібраного екстракту, внесення фільтрату в тест-культуру інфузорій, термостатування одержаної суміші при температурі +26…+28 °C і визначення токсичності досліджуваного продукту при спостереженні за життєдіяльністю інфузорій під час термостатування, екстрагування проби проводять хімічно чистим ацетоном, який беруть у 3 кількості 15-20 см , а перед внесенням в тест-культуру інфузорій фільтрат розбавляють 3 3 розчином Лозина-Лозинського, який беруть у кількості 40 см на 0,5 см фільтрату. Проте застосування вказаного способу не поширюється на тестування харчових добавок. При моніторингу безпечності харчових добавок в суміші із пряно-ароматичними компонентами (комплексних поліфункціональних харчових добавок), здійснити експрес-оцінку їх потенційної токсичності на лабораторних тваринах, які мають розвинуті детоксикаційні системи організму, за відносно короткий проміжок часу, неможливо. Враховуючи необхідність оперативного визначення безпечності (відсутності токсичних речовин) харчових добавок та 1 UA 115878 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пряно-ароматичних сумішей, та зважаючи на відсутність в Україні стандартизованого пришвидшеного методу оцінки токсичності речовин харчового призначення. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб для експрес-виявлення токсикантів. Поставлена задача вирішується за рахунок застосування методу тестування з використанням Tetrahymena pyriformis - модельних організмах, використання яких на сьогодні практикується у скринінгових токсикологічних дослідженнях у сфері ветеринарно-санітарного контролю, фармації та медицині. Спосіб експресного визначення токсичності харчових продуктів може бути описано наступними прикладами. Приклад 1. У токсикологічних дослідженнях при тестуванні різних субстанцій, потенційно небезпечних, використовуються вільноживучі війчасті інфузорії із класу Oligohymenophore підкласу Hymenostomatia роду Tetrahymena понад 30 років. Переважно за контрольований параметр чутливості біоіндикаторного організму приймають визначення інгібування росту, аніж життєвість клітин культури (Schults, 1997). При цьому, за для оцінки затримки росту використовують наступні критерії: токсикологічні - LD50 та LC50, а для визначення інгібування ензиматичної активності - ID50 та ІС50. Окрім визначення індикативних біологічних властивостей Tetrahymena, що доводять її валідність, як модельного біологічного інструменту у токсикологічних випробуваннях, вченими накопичено базу експериментальних даних молекулярно-генетичних досліджень щодо функціонування геному інфузорій in vivo. Заслуговують високої уваги досягнення великої групи вчених зі США та Канади, якими розшифровано геном інфузорій та виявлено, що вони мають близьке число генів до геному людини [Eisen J. Et al. Macronuclear Genom of the Ciliate Tetrahymena thermophila, a model Eukaryote// PloS Biology, Volume 4, Issue 9, 2006]. Генетична спорідненість геномів людини та інфузорій за набором генів та їх функціональними характеристиками представляє Tetrahymena показовим модельним об'єктом у дослідженні біологічно важливих процесів [Cervantes M., Hamilton E., Xiong J., Lawson M., Yuan D. Et al Selecting one or several mating types through gene segment joining and deletion in Tetrahymena thermophila II PloS Biology, 2013, 11 (3): ЄІ001518 DOI: 10.1371 / journal.pbio.1001518]. На основі порівняння чутливості Tetrahymena та клітин теплокровних тварин до токсикантів, доведена можливість їх використання як комплементарних та/або взаємозамінних біоінформативних моделей, для відносно швидкого та недорогого детектування токсичності екотоксикантів [Dayehetal., 2005], харчових добавок [Stefanidouetal., 2003], ароматичних субстанцій [ShijinRen, 2003; Cronin M.T.D., Manga N., Seward J.R. etal., 2001; Gonzalez M. P., Diaz H. G., Cabrera M. A., Ruiz R. M, 2004; Yoshioka, OseandSato, 1985; Schultz, 1999]; фармпрепаратів [Koutnaetal., 2004], канцерогенів [Bonnetetal., 2003], детергентів та мікотоксинів [Benitezetal., 1994], біофлавоноїдів [Chen, Leick, 2004], неорганічних та органічних хімічних речовин [Bogaertsetal., 2001], інсектицидів [Nistiaretal., 1990] та інших ксенобіотиків [Nilsson, 1989; Sauvantetal., 1999; Lukacinovaetal., 2007]. Приклад 2. Відбір проб для дослідження. Наважку досліджуваної харчової добавки відбирають у кількості, яка міститься в 1 кг готового продукту, для виготовлення якої призначена добавка. Приклад 3.Виготовлення поживного середовища для культивування Tetrahymena pyriformis. До 100 см дистильованої води додають в грамах: пептона - 1,5-2,5; глюкози - 0,3-0,8; дріжджового екстракту - 0,1-0,2; морської солі - 0,05-0,15. Доводять рН отриманого розчину до 7-7,5 розчином гідроксиду натрію молярної концентрації еквівалента 0,1 або 0,01 моль/дм. Стерилізують кип'ятінням 30 хв. Приклад 4. Екстрагування ацетоном. Екстрагування токсичних речовин з проб комплексних поліфункціональних харчових добавок ацетоном проводять за наступною схемою: - Наважку переносять у колбу (пробірку) і до неї додають 2-3 об'єми ацетону, поміщають у шуттель-апарат на 20 хв. (70-100 об/хв.), фільтрують через фільтрувальний папір, повторну екстракцію проводять за описаною вище схемою. Фільтр промивають одним об'ємом екстрагенту (ацетону). Екстракти об'єднують, і випарюють до повного випарювання екстрагенту. 3 - Після випарювання 1-2 см ацетону змивають маслянистий осад зі стінок чашки, і вносять 3 10 см середовища для культивування інфузорій. Перемішують і випарюють до повного видалення запаху екстрагенту, фільтрують у флакони і доводять до рН 7-7,5. Приклад 5. Екстрагування водою. Екстрагування токсичних речовин з проб комплексних поліфункціональних харчових добавок водою проводять за наступною схемою: відбирають ряд 3 наважок (50-100-150-200-250-300 мг) у пробірки, в пробірки вносять по 2 см водопровідної 2 UA 115878 U 5 10 15 20 25 30 відстояної стерильної води, закривають ватно-марлевими пробками і прогрівають на водяній бані 15-20 хв., при температурі 80-90 °C. Потім охолоджують до кімнатної температури. Приклад 6. Визначення токсичності ацетонових екстрактів. Випробування проводять в трьох 3 3 повторах. У три флакона, що містять по 1 см досліджуваного матеріалу, вносять 0,1 см 3-5добової культури інфузорії Tetrahymena pyriformis i залишають при кімнатній температурі. Через 30 і 60 хвилин з усіх флаконів відбирають проби і підраховують кількість живих і загиблих інфузорій у краплі на предметному склі за допомогою мікроскопу (збільшення 5-10). Контроль - пептонне середовище з культурою інфузорій. Приклад 7. Облік результатів визначення токсичності ацетонових екстрактів. Ступінь токсичності досліджених зразків комплексних поліфункціональних харчових добавок визначають за кількістю живих Tetrahymena pyriformis на 30 і 60 хв. від початку випробувань: - Токсичні - 100 % загибель інфузорій протягом 60 хв. контакту інфузорій з досліджуваним матеріалом; - Середньотоксичні - загибель 50 % і вище Tetrahymena pyriformis та реєстрація морфологічних змін протягом 60 хв. контакту інфузорій з досліджуваним матеріалом; - Малотоксичні - загибель до 50 % Tetrahymena pyriformis та реєстрація морфологічних змін протягом 60 хв. контакту інфузорій з досліджуваним матеріалом; - Нетоксичні - загибель до 2 % Tetrahymena pyriformis; морфологічні зміни не реєструється протягом 60 хв. контакту інфузорій з досліджуваним матеріалом. Приклад 8. Визначення токсичності водних екстрактів комплексних поліфункціональних харчових добавок. Випробування проводять в трьох повторах. У пробірки з охолоджених екстрактом вносять по 3 0,05 см розведеної тест-культури Tetrahymena pyriformis і ставлять у термостат при +25 °C±0,5 °C на 96 годин. Облік результатів проводять кожні 24 години інкубації. Приклад 9. Облік результатів визначення токсичності водних екстрактів комплексних поліфункціональних харчових добавок. Результати тестування обліковують кожну добу шляхом мікроскопії в краплі з дослідних пробірок на предметному склі під мікроскопом (збільшення 5-10). При цьому визначають кількість живих і загиблих клітин Tetrahymena pyriformis, рухливість, ріст порівняно з контрольною пробою, інші зміни (таблиця). Таблиця Ступінь токсичності водних екстрактів комплексних поліфункціональних харчових добавок Оцінка токсичності Нетоксичний Малотоксичний Середньотоксичний Сильнотоксичний Результат спостережень загибель клітин Морфологічні зміни до 2 % відсутні до 50 % можливі 50 % і більше можливі 100 % загибель Таким чином, згідно із запропонованим способом, ми можемо здійснити експрес-виявлення токсичності комплексних поліфункціональних харчових добавок. 35 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 Спосіб експресного визначення токсичності комплексних поліфункціональних харчових добавок, який включає підготовку тест-культури інфузорії, відбір проб досліджуваного продукту, екстрагування проби, фільтрування відібраного екстракту, внесення фільтрату в тест-культуру інфузорій, термостатування одержаної суміші і визначення токсичності досліджуваного продукту при спостереженні за життєдіяльністю інфузорій під час термостатування, який відрізняється тим, що як тест-об'єкт визначення токсичності комплексних поліфункціональних харчових добавок використовують інфузорію Tetrahymena pyriformis, а екстрагування токсичних речовин досліджуваних зразків проводять в трьох повторах з використанням одночасно ацетону і води, причому облік результатів проводять за критеріями загибелі та реєстрації морфологічних змін у тест-об'єктів протягом 1 години контакту з ацетоновим екстрактом та 96 годин контакту з водним екстрактом. 3 UA 115878 U Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4