Спосіб отримання штамів streptomyces nogalаter – надпродуцентів ногаламіцину

Реферат: Спосіб отримання штамів Streptomyces nogalater - надпродуцентів ногаламіцину, який базується на уведенні додаткових копій регуляторного гена, причому як регуляторний ген використовують клонований у складі інтегративного вектора pRTAI та автономного вектора рKСЕАІІ ген relA, продуктом якого є RelA-синтетаза. UA 118567 U (12) UA 118567 U UA 118567 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до генетики, біохімії, селекції та біотехнології мікроорганізмів і може бути використана для отримання штамів Streptomyces nogalater - надпродуцентів антрациклінового антибіотика ногаламіцину шляхом генно-інженерних маніпуляцій з регуляторними генами. Відомий спосіб отримання штамів актиноміцетів - надпродуцентів антибіотиків, що базується на спрямованому руйнуванні генів, що кодують білки - інгібітори вторинного метаболізму, шляхом їхнього заміщення на генні касети стійкості до антибіотиків [Guo J., Zhang X., Luo S., He F., et al. A novel TetR family transcriptional regulators, SAV576, negatively controls avermectin biosynthesis in Streptomyces avermitilis II PLOS one. - 2013. - Vol. 8, № 8. - P. 1-11]. Використання цього способу передбачає маніпуляції з генами інгібіторів вторинного метаболізму, які досі не виявлені в геномі S. nogalater та потребує ідентифікації, секвенування, клонування таких генів, а також додаткового експериментального підтвердження їхньої функції. Найближчим за технічною суттю - прототипом є спосіб отримання штамів S. nogalater з підвищеним рівнем біосинтезу ногаламіцину, що базується на використанні шлях-специфічного регуляторного гена, продукт якого активує біосинтез антрациклінового антибіотика ногаламіцину у S. nogalater [Пат. України на корисну модель № 63824, МПК C12Q 1/00; опубл. 25.10.2011, Бюл. № 20, 2011 р.]. Ген, що кодує шлях-специфічний регуляторний білок переносили в клітини S. nogalater - продуцента ногаламіцину у складі плазмід pR3A та pSOKA з використанням технології міжродової кон'югації з клітин Escherichia coli. Транскон'юганти, що містили плазміди pR3A та pSOKA відбирали на селективному вівсяному середовищі, що містили антибіотики апраміцин (50 мкг/мл) та налідиксову кислоту (100 мкг/мл). У рекомбінантних штамів, що містили шлях-специфічний регуляторний білок, клонований у складі вектора pR3A, спостерігали зростання рівня продукції ландоміцину у 2,5 разу, а у складі вектора pSOKA - у 4,6 разу у порівнянні із вихідним штамом S. nogalater. Проте, цей спосіб базується на маніпуляціях із геном, що кодує шлях-специфічний регуляторний білок та не передбачає введення додаткових копій генів - глобальних регуляторів вторинного метаболізму актиноміцетів. Актиноміцети є основними продуцентами біологічно активних речовин. Ними синтезується більшість усіх антибіотиків бактерійного походження. S. nogalater є продуцентом промислового антибіотика антрациклінового ряду ногаламіцину. Похідні цього антибіотика широко застосовуються у медичній практиці [Li Н., Krueger С. The biochemical pharmacology of nogalamycin and its derivatives // Pharm. Ther. - 1991. V. 51. - P. 239-255]. 3 огляду на зростаючу потребу у впровадженні антрациклінових антибіотиків необхідно розробляти способи одержання їхніх продуцентів, що дозволить спростити технологію їхнього виробництва у лабораторних та промислових умовах. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалити спосіб отримання штамів Streptomyces nogalater - надпродуцентів ногаламіцину, шляхом експресії плейотропного регуляторного гена relA, клонованого у складі інтегративного вектора pRTAI та автономного вектора рKСЕАІІ, що надасть можливість спростити спосіб конструювання надпродуцентів ногаламіцину. Поставлена задача вирішується так, що у способі отриманні штамів Streptomyces nogalater надпродуцентів ногаламіцину, який базується на уведенні додаткових копій регуляторного гена, згідно з корисною моделлю, як плейотропний регуляторний ген використовують ген relA, продуктом якого є RelA-синтетаза, клонований у складі інтегративного вектора pRTAI та автономного вектора рKСЕАІІ. Для конструювання штамів - надпродуцентів ногаламіцину авторами вперше запропоновано використовувати плейотропний регуляторний ген relA. Цей ген кодує RelA-синтетазу 5. coelicolor у складі плазміди рKСЕАІІ та pRTAI [Klymyshyn D. Stimulation of nogalamycine production by coexpression of snorA and relA genes in Streptomyces nogalater II Біологія тварин. - 2016. Вип. 17. № 4. - С. 69-75]. Використання плейотропного регуляторного гена relA спрощує спосіб отримання рекомбінантних штамів S. nogalater - надпродуцентів ногаламіцину. Для клонування гена relA авторами запропоновано використовувати інтегративний вектор pRT801. Він інтегрується в хромосому продуцента ногаламіцину і стабільно успадковується в геномі бактерій, не впливаючи при цьому на культурально-морфологічні характеристики та рівень продукції ногаламіцину штамом S. nogalater [Климишин Д., Громико О., Федоренко В. Використання міжродової кон'югації Escherichia coli-Sterptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам Streptomyces nogalater IMET 43360 // Цит. и Генет. - 2007. - Т. 41, № 5. - С. 263-267]. Вектор pRT801 містить фрагмент oriT плазміди RK2, що зумовлює кон'югаційне перенесення плазміди з Е. coli. Схрещування з Е. coli є єдиним описаним способом доставки рекомбінантних плазмідних ДНК у клітини штамів 5. nogalater [Климишин Д., Громико О., 1 UA 118567 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Федоренко В. Використання міжродової кон'югації Escherichia coli-Sterptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам Streptomyces nogalater IMET 43360 // Цит. и Генет. 2007. - Т. 41, № 5. - С. 263-267]. Перевагою способу отримання штамів Streptomyces nogalater надпродуцентів ногаламіцину є те, що для селекції штамів, які містять рекомбінантні ДНК, що вбудовані в геном, не потрібно використовувати селективні середовища з антибіотиками. Ефективність цього способу також визначається тим, що усі штами, що містять клонований в інтегративній плазміді ген relA, характеризуються підвищенням рівнем продукції антрациклінового антибіотика ногаламіцину. Спосіб ілюструється схемами: на фіг. 1 - схема плазміди pRTAI, що несе ген relA, клонований з вектора pIJ8647, де 1 - ген relA; 2 - ген стійкості до апраміцину aac(3)IV; 3 - ділянка ініціації кон'югаційного перенесення oriT; 4-attP-сайт актинофага срВТІ; на фіг. 2 - схема плазміди рKСЕАІІ, де 1 - ген relA; 2 - ген snorA; 3 - ген стійкості до апраміцину aac(3)IV; 4 ділянка ініціації кон'югаційного перенесення oriT; 5 - промотор гена резистентності до еритроміцину ErmEp Saccharopolyspora erythraea; 6 - реплікон плазміди SCP2. Для здійснення способу отримання штамів Streptomyces nogalater - надпродуцентів ногаламіцину, як плазміди використали pRTAI та рKСЕАІІ, що відображено на фіг. 1 та фіг. 2. Для експресії гена relA у клітинах S. nogalater використовують інтегративну плазміду pRT801 та автономну плазміду рKС1218Е. Плазміда pRT801 інтегрується в геном актиноміцетів сайтспецифічно. В хромосомі S. nogalater виявлено два сайти інтеграції цієї плазміди [Климишин Д., Громико О., Федоренко В. Використання міжродової кон'югації Escherichia coli-Sterptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам Streptomyces nogalater MET 43360 // Цит. и Генет. 2007. - Т. 41, № 5. - С. 263-267]. Важливою характеристикою вектора є те, що його інтеграція в геном не впливає на біосинтез ногаламіцину у S. nogalater. Плазміда рKС1218Е є олігокопійною реплікативною плазмідою. Експресія клонованих в її складі генів відбувається під контролем конститутивного промотора гена резистентності до еритроміцину ErmEp Saccharopolyspora erythraea [Kieser Т., Bibb M., Chater К., Hopwood D. Practical Streptomyces genetics. - Norwich, England: John Innes Foundation. 2000. - 634 p.]. Рекомбінантні плазмідні ДНК доставляють у клітини S. nogalater за допомогою кон'югаційних схрещувань з Е. coli ET12567 (pUB307) [Климишин Д., Громико О., Федоренко В. Використання міжродової кон'югації Escherichia coli-Sterptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам Streptomyces nogalater IMET 43360 // Цит. и Генет. - 2007. - Т.41, №5. - С 263-267]. Спорову суспензію S. nogalater висівають на мінімальне середовище Хопвуда [Kieser Т., Bibb M., Chater K., Hopwood D. Practical Streptomyces genetics. - Norwich, England: John Innes Foundation. 2000. - 634 p.] та інкубують б діб за температури 28 °C. Штам Е. coli ET12567 (pUB307), що містить рекомбінантні плазміди, вирощують до середини логарифмічної фази росту (ОD600=0,65), осаджують центрифугуванням протягом 5 хв. при 8000 об/хв. Одержаний 7 осад ресуспендують в 100 мкл фізіологічного розчину до концентрації 10 клітин/мл. Суспензію 7 спор S. nogalater у концентрації 10 спор/мл піддають тепловому шоку за температури 52 °C протягом 10 хв, після чого змішують із клітинами донора у співвідношенні 1:2. Кон'югаційну суміш розподіляють на поверхні чашок з вівсяним середовищем (вівсяне толокно - 64 г/л, агар 16 г/л, вода -1л, рН - 7,2) та культивують 18 год. за температури 28 °C. Кон'югаційні схрещування переривають, вносячи 1 мл водного розчину антибіотиків, що містить апраміцин і налідиксову кислоту у кінцевих концентраціях 50 і 200 мкг/мл, відповідно. Відбирають апраміцин-стійкі колонії S. nogalater та перевіряють їх на наявність плазмід, що містять ген relA, шляхом трансформації клітин Е. coli DH5a сумарною ДНК рекомбінантних штамів із подальшим картуванням із використанням ендонуклеаз рестрикції [Kieser Т., Bibb M., Chater К., Hopwood D. Practical Streptomyces genetics. - Norwich, England: John Irmes Foundation. 2000. - 634 p.]. Рекомбінантні штами та штам дикого типу висівають на ферментаційне середовище SG (глюкоза - 20 г/л, соєвий пептон - 10 г/л, СаСО3-2г/л, СоС12-0,001 г/л, рН - 7,2) та культивують 6 діб за температури 28 °C. По 1,5 мл культуральної рідини кожного зразка відбирають для визначення біомаси. Біомасу осаджують, центрифугуючи її 10 хв при 13000 об/хв. Зважують мікропробірку з біомасою та підсушують її вміст 3 доби за температури 37 °C. Суху біомасу визначають за різницею ваги мікропробірки з висушеною біомасою та вагою порожньої мікропробірки. Порівнюють антибіотичну активність штамів, що містять плазміди pRTAI, рKСЕАІІ, та штаму дикого типу з використанням ногаламіцин-чутливої тест-культури Sarcina lutea. На чашки Петрі з тест-культурою накладають паперові диски однакового діаметра, на які наносять по 30 мкл екстрактів антибіотиків. Проводять порівняння середніх значень індексів продуктивності (ІП), які визначають як відношення зон пригнічення росту Sarcina lutea до діаметру диска. Для штаму, в 2 UA 118567 U 5 10 15 якому клоновано ген relA у складі плазміди pRTAI, ІП становить 3,1±0,2 мм, а для S. nogalater, що несе relA, клонований у плазміді рKСЕАІІ - 3,3±0,2 мм. ІП для штаму дикого типу становить 2,3±0,2 мм. Антибіотики екстрагують з 20 мл культуральної рідини, змішуючи з рівним об'ємом хлороформу. Суміш струшують протягом 2 год. Центрифугують 10 хв при 3 тис. об/хв і відбирають нижню фракцію, що містить антибіотик, розчинений у хлороформі. Розчинник випарюють у роторному випарювачі протягом 5 год., а сухий залишок розчиняють в 1 мл метанолу та аналізують фотоелектроколориметрично (λ=480 нм). Концентрацію ногаламіцину визначають за калібрувальною кривою. Уведення додаткових копій плейотропного регуляторного гена relA, продуктом якого є RelA-синтетаза, у складі інтегративного вектора pRTAI та автономного вектора рKСЕАІІ приводить до зростання біосинтезу ногаламіцину у 2,8 та 5,0 разів відповідно. Таке підвищення синтезу антибіотика характерне для 100 % транскон'югантів, що містять рекомбінантні плазміди рKСЕАІІ та pRTAI. Одержані дані доказують зростання синтезу ногаламіцину у S. nogalater, що підтверджує одержання технічного результату. Запропонований спосіб може бути використаний для отримання штамів - надпродуцентів ногаламіцину шляхом уведення додаткових копій плейотропного регуляторного гена relA у складі інтегративного вектора pRTAI та автономного вектора рKСЕАІІ і може бути рекомендований до біотехнологічного виробництва ногаламіцину. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб отримання штамів Streptomyces nogalater - надпродуцентів ногаламіцину, який базується на уведенні додаткових копій регуляторного гена, який відрізняється тим, що як регуляторний ген використовують клонований у складі інтегративного вектора pRTAI та автономного вектора рKСЕАІІ ген relA, продуктом якого є RelA-синтетаза. 3 UA 118567 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4