Спосіб отримання рекомбінантних штамів метилотрофних дріжджів hansenula polymorpha, здатних до надсинтезу глутатіону

Реферат: Винахід стосується способу отримання рекомбінантних штамів метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha, здатних до надсинтезу глутатіону, що включає трансформацію H. polymorpha вектором pUC19/prGAP_MET4/NTC, позначеним на Фіг. 1, що містить додаткові копії генів GSH2, що кодує перший фермент біосинтезу глутатіону, та МЕТ4, що кодує транскрипційний активатор генів біосинтезу цистеїну, який є попередником глутатіону. UA 111511 C2 (12) UA 111511 C2 UA 111511 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до галузі біотехнології і є способом отримання ефективного продуцента глутатіону на основі метилотрофних дріжджів Н. polymorpha за рахунок посиленої експресії генів, залучених у його біосинтез та синтез його попередників. Глутатіон (γ-L-глутаміл-L-цистеїніл-гліцин, GSH) - біологічно активна речовина пептидної природи, що відіграє важливу роль у широкому спектрі клітинних реакцій. Фізіологічна роль GSH полягає в захисті клітин від оксидативного стресу, температурного та осмотичного шоку, детоксикації ксенобіотиків та важких металів, забезпеченні функціонування багатьох ферментів, регулюванні клітинної проліферації та апоптозу. Дефіцит глутатіону у людини асоційований з рядом медичних розладів, викликаних оксидативним стресом, отруєнням або послабленою імунною системою. Ці порушення включають нейродегенеративні захворювання, рак, СНІД, катаракту, цироз печінки, захворювання легень, запалення шлунково-кишкового тракту і підшлункової залози та гемолітичну анемію. Глутатіон активно застосовується у медицині як лікарський препарат. Глутатіон використовується також у складі різноманітних косметичних продуктів (компонент емульгаторів, сонцезахисних засобів, олійних речовин і зволожувачів, що мають відбілюючий ефект та запобігають появі зморщок). Глутатіон застосовується як інгредієнт різних харчових продуктів, зокрема хлібобулочних виробів, алкогольних та безалкогольних напоїв, сухих сніданків, сирів, приправ, молочних продуктів, жирів, олії, соусів та м'яса. Потреби промислового виробництва глутатіону зростають і відповідно до цього зростає світовий ринок цього трипептиду. Здатність глутатіону до взаємодії з екзогенними металами та ксенобіотиками дозволяє використовувати мікробні продуценти цього трипептиду для детоксикації важких металів та ксенобіотиків у стічних водах [1]. Промислове виробництво GSH здійснюється з використанням ензиматичних підходів або шляхом ферментації природних та генетично модифікованих мікроорганізмів Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Escherichia coli, Lactoccocus lactis [2]. Обмежуючими факторами надсинтезу GSH мікроорганізмами є механізми репресії та інгібування біосинтезу кінцевим продуктом біосинтетичного шляху, а також деградація його надлишку. Біосинтез глутатіону відбувається в два етапи, що каталізуються ферментами γ-глутамілцистеїнілсинтетазою (γGCS) та глутатіонсинтетазою (GS), які у дріжджів S. cerevisiae або бактерії Е. coli кодуються, відповідно, генами GSH 1 або GSH A та GSH 2 або GSH B [3]. Найбільш близьким до запропонованого є спосіб отримання надпродуцентів глутатіону на основі дріжджів S. cerevisiae або бактерії Е. coli із застосуванням методології метаболічної інженерії за рахунок посилення експресії генів біосинтезу цього трипептиду [4, 5]. Однак посилення експресії гомологічних генів GSH 1 та GSH 2 в клітинах S. cerevisiae призводило до лише двократного зростання внутрішньоклітинного вмісту глутатіону, тоді як питома активність γ-GCS підвищувалася в десятки разів [4]. Подібний ефект спостерігався в клітинах Е. coli [5]. Отримані результати свідчать про наявність регуляції експресії першого гену біосинтезу глутатіону, а також питомої активності відповідного ферменту по принципу інгібування кінцевим продуктом. Термотолерантні метилотрофні дріжджі Hansenula polymorpha з природно високим вмістом GSH та стійкістю до різних видів стресу розглядаються як перспективні штами для генетичної модифікації та конструювання конкурентного продуцента цього трипептиду [6]. В основу винаходу поставлено задачу отримати ефективний продуцент глутатіону на основі дріжджів Н. polymorpha за рахунок посиленої експресії гена GSH 2 Н. polymorpha, що кодує γглутамілцистеїнсинтетазу, та гена МЕТ4, що кодує транскрипційний активатор генів біосинтезу цистеїну (попередник синтезу глутатіону). Поставлена задача вирішується тим, що у способі отримання рекомбінантних штамів дріжджів Н. polymorpha, здатних до надсинтезу глутатіону, згідно з винаходом, в геном Н. polymorpha вводять додаткові копії генів GSH 2, що кодує перший фермент біосинтезу глутатіону, та МЕТ4, що кодує транскрипційний фактор, залучений в асиміляцію сульфату в сірковмісних амінокислотах. Суть винаходу полягає у введенні в геном дріжджів вектора для мультикопійної інтеграції, що містить промотор та відкриту рамку зчитування гена γ-глутамілцистеїнсинтетази, а також вектора, що містить експресійну касету, яка складається з сильного конститутивного промотора гена гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази та відкритої рамки зчитування гена транскрипційного активатора МЕТ4, що забезпечує суттєве підвищення внутрішньоклітинного рівня глутатіону. У запропонованому способі використовуються методи: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), конструювання рекомбінантних плазмід, виділення плазмід з Escherichia coli, рестрикційний аналіз, електрофорез в агарозному гелі, трансформація Е. coli методом 1 UA 111511 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 електропорації, описані в [7]. Трансформацію Н. polymorpha проводять, як описано в [8]. Виділення сумарної ДНК з трансформантів Н. polymorpha проводиться як для S. cerevisiae [7]. Спосіб отримання рекомбінантних штамів дріжджів Н. polymorpha, здатних до надсинтезу глутатіону, ілюструється графічними матеріалами: На Фіг. 1 зображено лінійну схему плазміди pUC19/prGAP_MET4/NTC, де промотор та термінатор гена гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази позначено темно-сірим та чорним прямокутниками відповідно; фрагмент ДНК Н. polymorpha, що містить ВРТ гена МЕТ4 позначений чорно-білими вертикальними смужками, ген стійкості до норзеотрецину - чорнобілими клітинками; ген стійкості до ампіциліну bla - сірий прямокутник; послідовність pUC57 тонка чорна лінія. Скорочення сайтів рестрикції: В, BamHI; Xb, XbaI; Xh, XhoI; K, KpnI; Sl, SalI; H, HindIII. На Фіг. 2. зображено вміст внутрішньоклітинного глутатіону отриманих рекомбінантних штамів з посиленою експресією генів МЕТ4 та GSH 2 Н. polymorpha (mcGSH 2 /MET4) під час культивування на мінімальному середовищі YNB з глюкозою порівняно із штамом з надекспресією гена GSH 2 (mcGSH 2). На Фіг. 3 зображено вміст позаклітинного глутатіону отриманих рекомбінантних штамів Н. polymorpha з посиленою експресією генів МЕТ4 та GSH 2 (mcGSH 2/MET4) під час культивування на мінімальному середовищі YNB з глюкозою (А) та метанолом (Б) порівняно із штамом з надекспресією гена GSH 2 (mcGSH 2) та штамом дикого типу (WT). Етап 1. Конструювання вектора для посилення експресії гена МЕТ4 у метилотрофних дріжджів Н. polymorpha Для отримання рекомбінантних штамів метилотрофних дріжджів Н. polymorpha з посиленою експресією транскрипційного активатора MET4 проводять комп'ютерний аналіз з метою пошуку послідовностей нуклеотидів гена МЕТ4 Н. polymorpha, використовуючи базу даних Н. polymorpha NCYC495 leu1.1 v2.0 (http://genoine.jgi-psf.org/Hanpo2). За допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з геномної ДНК Н. polymorpha отримують ген МЕТ4, що кодує транскрипційний активатор, залучений у біосинтез цистеїну. Нативний промотор та термінатор даного гена замінюють сильним конститутивним промотором та термінатором гена GAP1 Н. polymorpha, що кодує гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу. На першому етапі промотор та термінатор гена GAP1 ампліфікують з геномної ДНК Н. polymorpha за допомогою ПЛР, використовуючи відповідні пари праймерів Ко644/Ко645 та Ко646/Ко647. Отримані фрагменти з'єднують за допомогою overlap-ПЛР з використанням праймерів Ко644 та Ко647. Ампліфікований фрагмент розміром 0,8 т. п. н., обробляють ендонуклеазами рестрикції BamНІ та SalI (сайт впізнавання відповідних рестриктаз підкреслено в послідовності нуклеотидів праймерів) і клонують по відповідних сайтах у вектор pUC19. Отриману плазміду названо pUC19/prGАР. На наступному етапі ген стійкості до норзеотрецину natNT2 ампліфікують з плазміди pRS41N [9] за допомогою ПЛР, використовуючи праймери ОК42/ОК43. Отриманий фрагмент розміром 1,3 т. п. н. обробляють ендонуклеазою рестрикції NdeI і клонують у NdeIлінеаризовану плазміду pUC19/GAP. У результаті генетичних маніпуляцій отримують рекомбінантну плазміду pUC19/prGAP/NTC. Ген МЕТ4 ампліфікують з геномної ДНК Н. polymorpha за допомогою ПЛР, використовуючи праймери Ко655 та Ко677, і клонують у XbaI/NotI-лінеаризований вектор pUC19/prGAP/NTC. Отриманий вектор названо pUC19/prGAP_MET4/NTC (Рис. 1). 45 Таблиця Перелік праймерів, які використовують на 1 етапі способу Назва Послідовність нуклеотидів праймера Ко644 Ко645 Ко646 Ко647 2 UA 111511 C2 ОК42 ОК43 Ко655 Ко677 5 10 15 20 25 30 35 40 Етап 2. Отримання та аналіз продукції глутатіону рекомбінантних штамів дріжджів Н. polymorpha з посиленою експресією генів GSH 2 та МЕТ4 Плазміду pUC19/prGAP_MET4/NTC використовують для посилення експресії гена МЕТ4 в попередньо сконструйованих рекомбінантних штамах Н. polymorpha з посиленою експресією гена GSH 2 під контролем нативного промотора, що характеризувалися підвищеною в 2,5 разу продуктивністю синтезу глутатіону порівняно із штамом дикого типу [10]. Вектор pUC19/prGAP_MET4/NTC вводять у клітини реципієнтного штаму Н. polymorpha з посиленою експресією гена GSH 2 за допомогою методу електропорації. Селекцію плазмідовмісних трансформантів проводять на середовищі YPD із додаванням норзеотрицину (100 мг/л). На третю добу культивування відбирають низку трансформантів. Для отримання стабільних рекомбінантних штамів трансформанти культивують в неселективних умовах з подальшим відбором клонів, які зберігають здатність рости на середовищі з антибіотиком. За допомогою ПЛР у цих трансформантів підтверджують наявність в геномі гена МЕТ4 під контролем промотора гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (prGAP), використовуючи праймери Ко644 та Ко677. Отримані стабільні рекомбінантні штами відбирають для дослідження синтезу глутатіону. Для дослідження продуктивності синтезу глутатіону трансформанти засівають у мінімальне синтетичне середовище YNB з 2 % глюкозою або 1 % метанолом та вирощують протягом 5 діб в умовах повної аерації (220 об/хв, 37 °C). Визначення вмісту глутатіону в клітинах та культуральній рідині здійснюють як описано раніше [10]. Отримані результати свідчать, що рекомбінантні штами з посиленою експресією генів МЕТ4 та GSH 2 характеризуються у 2-3 рази вищим вмістом внутрішньоклітинного глутатіону на 72-96 год. культивування на середовищі з глюкозою порівняно із штамом з надекспресією лише гена GSH 2 (Рис. 2). Отримані штами з коекспресією генів МЕТ4 та GSH 2 характеризуються також вищим вмістом позаклітинного глутатіону, зокрема на середовищі з метанолом вміст глутатіону у культуральній рідині є у 1,5-2 рази вищим у порівнянні з реципієнтним штамом з надекспресією гена GSH 2. Отже, за допомогою підходів метаболічної інженерії, а саме посилення експресії генів МЕТ4 та GSH 2, отримано рекомбінантні штами дріжджів Н. polymorpha, здатних до надсинтезу глутатіону. Джерела інформації: 1. Penninckx M.J. et al. FEMS Yeast Research. - 2002. - P. 295-305. 2. Li Y. et al. Applied Microbiology and Biotechnology. - 2004. - P. 305-315. 3. Pocsi I. et al. Advances in Microbial Physiology. - 2004. - Vol.49. - P. 13-86. 4. Grant C.M. et al. Mol Biol Cell-1997. - 8(9): 1699-707. 5. Gushima H. et al. J Appl Biochem. - 1983. - 5:43-52. 6. Gellisen G et al. Appl Microbiol Biotechnol 2000, 62:741-750. 7. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. - М.: Мир. - 1984. - 480 с. 8. Faber К.N. et al. Curr Genet. - 1994. - 25: 305-310. 9. Taxis С. et al. BioTechniques-2006. - 40:73-78. 10. Ubiyvovk V.M. et al. BMC Biotechnol. - 2011. - 11:8. 45 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 Спосіб отримання рекомбінантних штамів метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha, здатних до надсинтезу глутатіону, який відрізняється тим, що включає трансформацію H. polymorpha вектором pUC19/prGAP_MET4/NTC, позначеним на Фіг. 1, що містить додаткові копії генів GSH2, що кодує перший фермент біосинтезу глутатіону, та МЕТ4, що кодує транскрипційний активатор генів біосинтезу цистеїну, який є попередником глутатіону. 3 UA 111511 C2 4 UA 111511 C2 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5