Спосіб одержання біологічно активної добавки для лікування алкогольної та наркотичної залежності

Спосіб одержання біологічно активної добавки для лікування алкогольної та наркотичної залежності, який включає культивування метилотрофного мікроорганізму на живильному середовищі при певній температурі в аеробних умовах з наступним отриманням цільового продукту, який відрізняється тим, що як метилотрофний мікроорганізм використовують новий штам Methylobacterium extorquens 21Ч, депонований в Українській колекції мікроорганізмів під № В-3362, культивування проводять у живильному середовищі при температурі 30°С і з джерелом вуглецю - метанолом, для отримання кінцевого продукту біомасу висушують. (19) (21) u200605885 (22) 29.05.2006 (24) 15.01.2007 (46) 15.01.2007, Бюл. № 1, 2007 р. (72) Криштаб Тетяна Павлівна, Романовська Вікторія Олександрівна, Карпенко Валерій Іванович, Рокитко Павло Васильович, Таширєв Олександр Борисович, Литвинов Валентин Борисович, Стогній Ніна Андріївна, Ковтун Тамара Василівна, Лебедєв Дмитро Сергійович, Ісаєнко Володимир Миколайович, Кисла Любов Василівна (73) НАЦІОН АЛЬНА АКАДЕМІЯ УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ.Д.К.ЗАБОЛОТН ОГО 3 19993 4 21Ч, для якого джерелом вуглецю і енергії є метаглутаматі, триптофані. Використовує амонійну та нол, тобто рідина, а не газ (метан), чим вигідно нітратну форми азоту. Ростова активність штаму відрізняє цей штам від прототипу. Саме ця власвизначається оптичною густиною культуральної тивість була застосована у створенні даного засорідини. бу. Довгострокове зберігання штаму здійснюється Технічна задача вирішується тим, що у способі на скошеному агаризованому середовищі під шаодержання БАД з антиалкогольною та антинаркором вазелінової олії (6 місяців). тичною дією, який включає культивування метилПеріодичне культивування здійснюється на отрофного мікроорганізму на живильному середоагаризованих мінеральних середовищах. Середовищі в аеробних умовах з наступним отриманням вище Київське (К), грам на літер води (г/л): цільового продукту, використовують новий штам (NH4)2SO4 -0,5; КН2РО4 - 0,4; K 2HPО4 3Н2 О - 0,4; Meth ylobacterium extorquens 21Ч, депонований в NaCl - 0,3; MgSO4×7Н2О - 0,3; СаСІ2×6Н2О - 0,02; Українській колекції мікроорганізмів під № В-3362, FeCl3×6Н2О - 0,001; метанол - 5мл, водопровідна культивування проводять у живильному середовода - 0,7л; дистильована вода - 0,3л, агар - 20г. вищі при температурі 30°С з джерелом вуглецю Інокулюм наносять на поверхню твердого середометанолом, а для отримання кінцевого продукту вища. Інкубують при температурі 30°С 48 годин. біомасу висушують. Періодичне культивування в колбах здійснюється Штам мікроорганізмів, який пропонується для в рідкому середовищі вище наведеного складу (за використання у способі. винятком aгapу) на качалках протягом 24-36 годин. Видова назва: Methylobacterium extorquens Безперервне культивування здійснюється у ферНомер штаму: 21Ч. ментері в режимі хемостату. Розбавлення культуШтам ізольовано із природного середовища, із ральної рідини здійснюється середовищем такого дерново-підзолистого грунту (на глибині 0-2см під складу (г/л): (NH4)2SO4 - 1,5; КН2РО4 - 1,2; виноградом Vitis sp., Київ, Україна) в 1995р. Штам К2НРО4×3Н2О - 1,2; NaCl - 0,9; MgSO4×7Н2О - 0,9; зберігається в УКМ під № В-3362. СаСІ2×6Н2О - 0,06; FeCl3×6Н2О - 0,003; мікроелемеКультурально-морфологічні та фізіологонти (мкг/л): CuSO4×5Н2О - 200; MnSO4×4Н2О - 15; біохімічні особливості штаму. Клітини - палички та ZnSO4×7Н2О - 105; Н3ВО 3 - 15; Na2 MoO4×2H2O - 15; диплопалички, 0,8-1,0 х 1,5-3,2мкм. Спори та макCoSO4×7H2O - 45. рокапсули відсутні. Грамнегативні. Рухливі, мають Джерело вуглецю - метанол (5мл/л). Темпераодин полярний джгутик. На агаризованому мінература 30°С, рН 6,7. Концентрація біомаси при засіві льному середовищі утворюють пастоподібні опуклі - 0,5г/л. Лімітуючий фактор - азот амонію. Продукколонії з вологим блиском і рівними краями. Діативність синтезу біомаси - до 0,6г/л за годину (у метр колоній 2,0 - 4,0мм. прототипу - не більше 0,5г/л за годину). Колонії рожево-пігментовані. В рідкому сереЗ одержаної культуральної рідини клітини видовищі суспензія культури с гомогенною, рожевого діляють центрифугуванням при 5000g, осад сукольору. Аероб. Температурний діапазон росту 10спендують у воді. Сушку одержаних клітин бакте37°С, оптимальна температура росту 30°С. Діапарій здійснюють ліофільно в сублімаційній сушці зон рН 6,0-7,5, оптимум рН 6,6. Желатину не розтипу LZ-9,2 при температурі мінус 40°С на вході і ріджує, крохмаль не гідролізує. Позитивний по плюс 25°С на виході під вакуумом 5-6 Паскаля каталазі, оксидазі, глюкозооксидазі. Облігатний протягом 28 годин. аероб, тест Фогес-Проскауера на здатність рости в Патогенних властивостей не виявлено. анаеробних умовах негативний. Факультативний Генетичні особливості: не потребує вітамінів метилотроф. Як єдине джерело вуглецю і енергії та інших ростови х факторів. використовує метанол, етанол. Функціонує сериСклад біомаси Methylobacterium extorquens новий цикл асиміляції метанолу. Асимілює також 21Ч (В-3362): білок - 40%; амінокислоти - 23,8% сукцинат, лактат, гліцерин, крохмаль. Росте на (таблиця 1); ліпіди - 5,38%; вуглеводи - 3,7%; мікглюкозо-картопляному агарі (ГКА). На м'ясороелементи: Mg - 1,98%; Са - 9,44%; Na - 7,59%; К пептоному агарі (МЛА) ріст повільний (5-7 діб). Не - 7,11%; Ρ - 0,92%; Fe - 0,08%; вітаміни: В, росте на глюкозі, фруктозі, сахарозі, мальтозі, лак10,0мкг/г, В2 - 33,2мкг/г, В12 - 2,7мкг/г, РР тозі, рамнозі, трегалозі, арабінозі, ксилозі, галакто378,75мкг/г; каротиноїди - 10,0мкг/г. зі, цитраті, сорбиті, дульциті, інозиті, аспартаті, Таблиця 1 Амінокислотний склад біомаси Methylobacterium extorquens 21Ч (В-3362). Амінокислоти Лізин Гістидин Аргінін Аспаргінова к-та Треонін Серин Глутамінова к-та Пролін % від сухої ваги біомаси 1,425 0,436 2,546 1,613 1,096 0,865 4,100 1,278 % від загального вмісту амінокислот 5,98 1,83 10,68 6,77 4,60 3,63 17,20 5,36 5 19993 6 Продовження таблиці 1 Амінокислотний склад біомаси Methylobacterium extorquens 21Ч (В-3362). Гліцин Аланін Цистін Валін Метіонін Изолейцин Лейцин Тирозин Фенілаланін Загальна сума 1,445 2,641 0,053 1,439 0,069 0,975 2,001 0,790 1,066 23,838 Коли мова йде про алкогольну залежність, слід відмітити, що в основі механізму виникнення і розвитку цього захворювання лежать суттєві порушення метаболізму етанолу, пов'язані з накопиченням токсичного продукту його утворення - ацетальдегіду. Відомо, що ацетальдегід, як клітинна отрута, маючи високу токсичність, уражає печінку, нирки, мозок та інші органи і системи організму. В першу чергу порушується цілісність клітини в результаті деструктивних змін цитоплазматичної мембрани. Окислення алкоголю в організмі каталізують два основні ферменти: алкогольдегідрогеназа (АДГ), за допомогою якої етанол окислюється до ацетальдегіду, і альдегіддегідрогеназа (АлДГ), яка окислює ацетальдегід до ацетату. Останній метаболізується у трикарбоновому циклі. В головному мозку існують структури, які беруть участь в регуляції емоційного стану. Вони знаходяться, в основному, в гіпоталамусі, де знаходиться «центр задоволення», діяльність якого пов'язана з виробленням дофаміну (ДА). Потрапляння наркотику в організм сприяє посиленому синтезу дофаміну. З посиленням наркотичного навантаження відбувається перезбудження центру 6,06 11,08 0,22 6,04 0,29 4,09 8,40 3,31 4,47 і виснаження його функціональних можливостей. Вивчали ефективність дії запропонованої біомаси Methylobacterium extorquens 214 (В-3362) на активність ферментів обміну етанолу: алкоголь-та альдегіддегідрогенази, вміст малонового діальдегіду (МДА) в крові і дофаміну в стр уктурах мозку у білих безпородних статевозрелих щурів (самців) масою 250,0 - 280,0г. Були виділені 2 групи тварин: контрольна та дослідна. Щурам дослідної групи одноразово вводили біомасу 214 (В-3362) внутрішньошлунково в дозі 30,0мг/100г маси, а контрольним тваринам дистильовану воду. Через 1,5год після введення проводили декапітування (обезголовлювання) тварин. Активність АДГ- та АлДГ визначали по кількості відновленого нікотинаміддінукліотиду (НАД) з етанолом або ацетальдегідом за допомогою спектрофотометричного методу (15,16). Оцінку інтенсивності процесів пероксидного окислення ліпідів проводили за методом визначення малонового діальдегіду [17]. Вміст ДА в структура х мозку визначали за допомогою методу колонкової хроматографії на сефадексі G-10 [18]. Таблиця 2 Вплив біомаси штаму В-3362 на активність алкоголь- та альдегіддегідрогенази і вміст малонового діальдегіду (МДА) в крові нормальних тварин (М±m; n=6-7). Групи тварин Контрольна Дослідна Показники АДГ(нмоль НАД/хв/мг) АлДГ (нмоль НАДН/хв/мг) 0,064±0,020 0,42±0,01 0,100±0,028 0,88±0,06* МДА (мкМ/л) 5,70±0,04 6,20±0,05 Примітка: *- вірогідність по відношенню до контрольних тварин (р< 0,05). Μ - постійна величина; m - перемінна величина; n - кількість тварин у кожній групі. Через 1,5год після одноразового введення біомаси тваринам активність АлДГ в крові підвищується в 2 рази відповідно по відношенню до тварин контрольної групи (табл.2), що сприяє посиленню окислення ацетальдегіду, який у великих концентраціях є дуже токсичною сполукою. Вміст МДА у даних умовах не змінюється. Вміст дофаміну в різних структурах мозку у тварин, які одержували біомасу, знижується (табл. 3). 7 19993 8 Таблиця 3 Вплив біомаси штаму В-3362 на вміст дофаміну в мочку нормальних тварин (М±m; n=6-7). Групи тварин Контрольна Дослідна Структури мозку Середній мозок 0,42±0,01 0,37±0,01* Гіпоталамус 1,66±0,06 1,26±0,04* Нова кора 0,40±0,01 0,32±0,01* Примітка: *- вірогідність по відношенню до контрольних тварин (р< 0,05). Μ - постійна величина; m - перемінна величина; n - кількість тварин у кожній групі. Приклад 1. Ефективність дії запропонованої біомаси Methylobacterium extorquens 214 (В-3362) досліджено на моделі гострої і хронічної алкогольної га морфінної інтоксикації у білих безпородних статевозрілих щурів (самців) масою 250,0-280,0г. Вивчення впливу біомаси штаму В-3362 на інтенсивність метаболічних процесів у тварин проводили в порівнянні з прототипом Methylococcus thermophilus В-3126 (С-3126/29) [14]. Визначали вплив біомаси штаму В-3362 в порівнянні з 3126/29 на активність ферментів обміну етанолу алкоголь- та альдегіддегідрогенази та вміст малонового діальдегіду в крові щурів при введенні їм субнаркотичної дози етанолу. Були виділені наступні групи: інтактна, контрольна та дослідні. Тваринам контрольної групи одноразово внутрішньочеревно вводили 25% розчин етанолу в дозі 3,6г/кг маси тварин. Тварини дослідних груп за 30хв до введення етанолу одержували біомасу бактерій (В-3362 або С-3126/29) внутрішньошлунково в дозі 30,0мг/100г маси тварин. Інтактним тваринам в еквімолярній кількості вводили фізіологічний розчин. Через 1год після введення етанолу проводили декапітування тварин. Згідно з даними табл.4 через 1год після одноразового введення етанолу активність АДГ в крові щурів підвищується в 1,6 разів по відношенню до інтактних тварин. Таблиця 4 Вплив штаму В-3362 і засобу С-3126/29 (прототип) на активність алкоголь- і альдегіддегідрогенази та вміст малонового діальдегіду в крові тварин за умов гострої алкогольної інтоксикації (М±m; n=7). Групи тварин Інтактні Етанол Етанол + С-3126/29 (прототип) Етанол + В-3362 Показники АДГ (нмоль АлДГ (нмоль НАДН/хв/мг) АДГ/ АлДГ НАД/хв/мг) 0,11±0,01 0,60±0,04 1:5,4 0,18±0,02* 0,50±0,03 1:2,7 МДА (мкМ/л) 6,9±0,5 7,1±0,4 0,21±0,04* 0,43±0,02* 1:2,1 7,6±0,2 0,13±0,02 0,68±0,04 1:5,2 6,9±0,3 Примітка:*- вірогідність по відношенню до контрольних тварин (р< 0,05). Μ - постійна величина; m - перемінна величина; n - кількість тварин у кожній групі. Введення засобу В-3362 сприяє нормалізації активністі АДГ, підвищує активність АлДГ та співвідношення АДГ/АлДГ. Вміст малонового діальдегіду в даних умовах незмінюється (табл. 4). Таким чином, дія засобу В-3362 на основні ферменти метаболізму етанолу в умовах гострої алкогольної інтоксикації ефективніше, ніж прототипу - засобу С-3126/29. Приклад 2. Порівняння дії біомаси штаму В3362 з засобом С-3126/29 (прототип) на інтенсивність деяких метаболічних процесів проводили за умов хронічної алкогольної інтоксикації. Модель хронічної алкогольної інтоксикації на щурах була розроблена нами в процесі експерименту. Суть моделі полягала в наступному: протя гом 10 днів тварини одержували алкоголь. Перші 5 днів алкоголь вводили внутрішньочеревно в розрахунку 2,0г/кг маси тварини, а досліджувані препарати - внутрішньошлунково в дозі 30,0мг/100г маси тварин. Протягом наступних 5 днів тварин утримували в умовах вільного доступу до 25% розчину етанолу, а біомасу бактерій тварини споживали самостійно. Визначали наступні біохімічні показники: активність алкоголь- і альдегіддегідрогенази та вміст малонового діальдегіду. Порівняння дії біомаси штаму В-3362 з засобом С-3126/29 (прототип) в умовах хронічної алкогольної інтоксикації підтвердило перевагу ефективності впливу штаму В-3326 на ці ж показники. 9 Результати наведені у таблиці 5. 19993 10 Таблиця 5 Вплив біомаси штаму В-3362 і засобу С-3126/29 (прототип) на активність алкоголь- і альдегіддегідрогенази та вміст малонового діальдегіду в крові тварин за умов гострої алкогольної інтоксикації (M±m; n=7). Групи тварин Інтактні Етанол Етанол + С-3126/29 (прототип) Етанол + В Показники АДГ (нмоль НАД/хв/мг) АлДГ (нмоль НАДН/хв/мг) 0,11±0,01 0,49±0,03 0,26±0,01* 0,43±0,04 АДГ/ АлДГ 1:4,5 1:1,7 МДА(мкМ/л) 7,0±0,3 6,6±0,5 0,21±0,03* 0,44±0,02 1:2,1 5,6±0,4 0,13±0,01 0,67±0,05* 1:5,1 5,2±0,3 Примітка: *- вірогідність по відношенню до контрольних тварин (р