Спосіб скринінгу мікроміцетів, що продукують меланінові пігменти з високим рівнем антиоксидантної активності

Реферат: Спосіб скринінгу мікроміцетів, що продукують меланінові пігменти з високим рівнем антиоксидантної активності за хіміко-біологічними параметрами передбачає вирощування досліджуваних штамів на агаризованому культуральному середовищі, визначення їх радіотропізму. UA 71518 U (12) UA 71518 U UA 71518 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до мікробіології, а саме до способів, що забезпечують оцінку здатності мікроорганізмів до продукції пігментів меланінової природи. Більш конкретно, спосіб стосується виявлення активних штамів мікроскопічних грибів з меланіновими пігментами, які мають високу антиоксидантну активність. Запропонований спосіб скринінгу може знайти своє застосування для пошуку продуцентів меланінів з високою антиоксидантною ємністю для їх подальшого використання у фармацевтичній промисловості як ефективних сорбентів для виведення радіонуклідів з організму. Останніми роками підвищився інтерес дослідників до високомолекулярних пігментів фенольної природи - меланінів. Це пов'язано з тим, що природні меланіни мають ряд захисних функцій та є перспективними для використання як основні діючі речовини лікарських препаратів [Jacobson E.S., Hove E., Herschell S.E. Antioxidant function of melanin in black fungi //Infection and Immunity.-1995.-65, N12. - С. 4944-4945; Наконечна А.А., Дранник Г.М., Кушко Л.Я. та ін. Клінікоімунологічна ефективність препарату Мікотон в комплексному лікуванні хронічних гепатитів // Імунологія та алергологія. - 1999. - № 4. - С. 41-45; Барабой В.А. Біологічна роль і перспективи застосування меланінів //Фармацевтичний журнал. - 2003. - № 3. - С. 47-55; Schweitzer AD, Revskaya E, Chu Ρ, Pazo V, Friedman M, Nosanchuk JD, Cahill S, Frases S, Casadevall A, Dadachova E. Melanin-covered nanoparticles for protection of hone marrow. Підвищення рівня радіоактивного фону в районах, що постраждали від забруднення радіонуклідами в результаті аварії на ЧАЕС, призвело до реальної необхідності широкого використання в повсякденному житті радіопротекторів. Доведено, що малі дози радіації, не здійснюючи помітного фізіологічного впливу на організм, підвищують частоту генетичних мутацій в клітинах. Традиційні препарати, що володіють короткочасною дією і високою токсичністю, є непридатними при хронічному опроміненні. Тому ряд дослідників проводили пошук радіопротекторних сполук. При цьому пігмент меланін, що здатен знижувати вихід мутацій, був продемонстрований як найбільш ефективний в цьому відношенні [Моссэ И.Б., Кострова Л.Н., Дубовик Б.В., Плотненкова С.И., Молофей В.П. Влияние меланина на мутагенное действие хронического облучения и адаптивный ответ у мышей // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1999. - Т. 39, № 2-3. - С. 329-333.]. Показано, що пігмент меланін має високу генопротекторну активність при гострій дії іонізуючої радіації в широкому інтервалі доз, але особливо ефективним є при хронічному опроміненні малими дозами [Гавриленко Н.В., Кукулянская Т.А., Новиков Д.А., Курченко В.П. Генопротекторные свойства меланиновых пигментов различного происхождения // Сб. тр. науч. конф., посвящ. 75-летию биол. фак. БГУ. - Минск, 1997. - С. 234-238]. Було встановлено, що меланін ефективно знижує частоту індукованих іонізуючою радіацією мутацій як в соматичних, так і в зародкових клітинах. Унікальною є здатність меланіну зменшувати майже до контрольного рівня частоту генетичних пошкоджень, що передаються з покоління в покоління і накопичуються в популяціях у вигляді "генетичного тягаря" [Моссэ И.Б., Жаворонков Л.П., Молофей В.П. и др. Разработка на основе меланина средства профилактики генетических и онтогенетических последствий облучения //Вестник ВОГиС.-2005. - Т. 9, № 4. С. 527-533. Дружина М.О., Пухова Г.Г., Бурлака А.П., Жданова Н.М., Сидорик Є.П. Процеси перекисного окислення в системі крові та їх корекція меланіном у тварин в зоні впливу аварії на Чорнобильській АЕС // Укр. радіол. журн. - 1994. - № 4. - С. 271-273]. Таким чином, меланіни, продуцентами яких в основному є гриби, володіють вираженою генопротекторною і антиоксидантною активністю, вони нетоксичні і можуть бути отримані в промислових об'ємах для одержання сорбентів ряду радіонуклідів та іонів важких металів [Курченко В.П., Сушинская Н.В., Кукулянская ТА., Горовой Л.Ф., Сенюк О.Ф. Механизм сорбции тяжелых металлов грибными меланинами // Успехи медицинской микологии. - М.: Национальная академия микологии, 2005. - Т. 5. - С. 197-201.]. Незважаючи на широкі можливості меланінів, на сьогоднішній день кількість лікарських препаратів на їх основі є обмеженою. В зв'язку з цим актуальним є використанням мікроскопічних грибів як продуцентів меланіну. Основним показником, що визначає радіопротекторні властивості меланіну, є його антиоксидантна ємність (або активність). Меланіни, які продукуються різними грибами, мають показники антиоксидантної ємності, що коливаються у широких межах. Для визначення цих показників гриби-продуценти вирощують у прийнятному середовищі, відокремлюють меланін від клітин та інших продуктів клітин, із осаду екстрагують пігменти загальноприйнятим для екстракції меланінів методом лужного гідролізу, як було описано раніше [Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Филимонова Т.В., Григорчук Ε.А. Меланиновые пигменты грибов Paecilomyces variotii и Aspergillius carbonarius //Прикл. биохим. микробиол. - 2000. -36, № 2. - С. 153-159.]. 1 UA 71518 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Отриманий екстракт підкислють до рН 2 і відокремлюють пігменти центрифугуванням при 6000 об./хв. протягом 15 хв. Отриманий пігмент використовують для подальших досліджень його фізико-хімічних властивостей. Антиоксидантну ємність меланінових пігментів у штамів мікроміцетів визначають при + використанні АБТС радикалу та антиоксидантну активність досліджуваних сполук визначають за допомогою спектрофотометру за зміною екстинкції при довжині хвилі 734 нм протягом 3 хв. [Инструкция по определению антиоксидантного статуса набором фирмы Randox // Randox Laboratories Ltd., UK. 2000. P. 2-9.]. Даний спосіб є вибраний авторами як прототип заявленого способу. Таким чином, використовуваний спосіб відбору мікроорганізмів, які продукують меланін з високим показником антиоксидантної активності, базується на проведенні біохімічного аналізу, який є надзвичайно трудомістким та потребує використання багатьох хімічних реагентів. При цьому кожний потенціальний кандидат на роль продуцента необхідно піддавати аналізу окремо від інших. Заявленій корисній моделі поставлена задача розробки простого способу скринінгу мікроміцетів на їх здатність продукувати меланінові пігменти з високим рівнем антиоксидантної активності, який забезпечує достовірну одночасну оцінку багатьох штамів. Вирішення поставленої задачі забезпечується за рахунок того, що спосіб скринінгу мікроміцетів, що продукують меланінові пігменти з високим рівнем антиоксидантної активності, передбачає вирощування досліджуваних штамів на агаризованому культуральному середовищі, визначення їх радіотропізму, при цьому штами, які мають здатність до синтезу меланінових пігментів з високим рівнем антиоксидантної активності, здатність до синтезу меланінових пігментів з високим рівнем антиоксидантної активності, характеризуються позитивним радіотропізмом у порівнянні зі штамами, які мають негативний радіотропізм або низький рівень позитивного радіотропізму. Більш конкретно, наявність радіоадаптивних властивостей (радіотропізм) у мікроскопічних грибів досліджували при використанні створеної нами раніше модельної системи (патент на корисну модель №68061, опубл. 14.09.2011) за кутом повороту дистального кінця грибної гіфи до точки потоку -квантів від джерела випромінювання, де кут повороту від 0 до 90° свідчить про ріст до джерела опромінення, тобто про позитивний радіотропізм, а кут повороту, що перевищує 90°, свідчить про ріст від джерела опромінення, тобто про негативний радіотропізм. Таким чином, оцінюючи радіотропізм мікроміцетів та його ступінь, можна прогнозувати здатність мікроскопічних грибів до синтезу меланінових пігментів з високим рівнем антиоксидантної активності. Спосіб згідно із заявленою корисною моделлю пояснюється приведеними нижче прикладами його здійснення. Приклад 1 Визначення радіотропізму штамів мікроміцетів Для здійснення запропонованого способу скринінгу проводили дослідження радіотропізму різних ізолятів мікроміцетів. Культури мікроміцетів підтримували на агаризованому середовищі Чапека до використання в експерименті. Конідії досліджуваних штамів суспендували у стерильній дистильованій воді до отримання титру 10 конідій/мл та наносили у борозенки агаризованого середовища Чапека з концентрацією глюкози 20 г/л у пластикових чашках Петрі (d=60 мм). Чашки помішали на вершину пристрою для визначення кута повороту дистального кінця грибної гіфи до точки потоку -квантів від джерела випромінювання. Таким чином досліджували розмноження спор та подальший ріст гіф у відповідь на вплив джерела випромінювання. Час опромінення складав від 24 до 48 годин при температурі 20 °C. Отримували цифрові зображення до та після опромінення у зоні впливу та при визначеній відстані від цієї зони. Зображення піддавали аналізу при використанні цифрового фотоапарату Nikon Coolpix. Кут повороту визначали у 30-50 конідій. Кожний експеримент проводили у трьохкратній повторності при використанні тих самих штамів мікроміцетів. За контроль брали ріст гіф за відсутності опромінення. Визначення кута повороту здійснювали за допомогою комп'ютерної програми Scion Image. Статистичну обробку результатів здійснювали при використанні програми Statistica 6.O. Дослідження радіотропізму здійснювали за кутом повороту дистального кінця кожної грибної гіфи до точки потоку -квантів від джерела випромінювання. При цьому кут повороту, менший за 90°, свідчить про ріст до джерела випромінювання та позитивний радіотропізм, а кут повороту 90-180° свідчить про ріст від джерела, що є показовим для негативного радіотропізму. Приклад 2 Визначення антиоксидантної активності меланінів, які продукуються різними ізолятами мікроміцетів, згідно із запропонованим способом 2 UA 71518 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Для оцінки ефективності запропонованого способу проводили дослідження рівня антиоксидантної ємності ряду ізолятів двох видів мікроміцетів Cladosporium cladosporioides та Aspergillus versicolor. Спочатку визначали антиоксидантну активність синтезованих досліджуваними ізолятами меланінів за допомогою стандартного способу для оцінки вказаного параметру. Для цього проводили поверхневе культивування мікроміцетів на рідкому поживному середовищі Чапека з метою накопичення грибної біомаси. Після 14-ти добового культивування при температурі 23-25 °C проводили розділення біомаси і культуральної рідини шляхом двоступеневої фільтрації. Перше (грубе) фільтрування здійснювали крізь капроновий фільтр, друге - крізь паперовий червоний фільтр. Відфільтровану біомасу дезінтегрували рідким азотом у фарфорових ступках з метою руйнування клітин. Від залишків клітин звільнялись шляхом центрифугуванням отриманого дезінтеграту при 8000 об/хв. Із осаду екстрагували пігменти загальноприйнятим для екстракції меланінів методом лужного гідролізу - розчином 2 % NaOH протягом 24 годин з коефіцієнтом розведення 1:10 як було описано раніше [Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Филимонова Т.В., Григорчук Е.А. Меланиновые пигменты грибов Paecilomyces variotii и Aspergillius carbonarius //Прикл. биохим. микробиол. - 2000. - 36, № 2. - С. 153-159.]. Отриманий екстракт підкислювали до рН 2 концентрованою НСl та утворений осад пігменту відокремлювали центрифугуванням при 6000 об./хв. протягом 15 хв. Процедуру повторювали двічі. Отриманий осад розчиняли в 2 % NaOH, після чого діалізували розчин пігменту проти дистильованої води, потім висушували до постійної ваги при 65 °C. Отриманий пігмент використовували для подальших досліджень його фізико-хімічних властивостей. Рівень синтезу меланінових пігментів виражали відношенням ваги виділених пігментів до маси абсолютно сухої біомаси (АСБ), яку визначали ваговим методом при висушуванні до постійної маси при 65 °C. Антиоксидантну ємність меланінових пігментів у штамів мікроміцетів визначали з + + використанням АБТС радикалу. Радикал АБТС (АБТС ) одержували у відповідності із модифікованим методом Ре [Re R., Pellegrini Ν., Proteggente, Α., Pannala Α., Yang Μ., Rice-Evans С. II Free Radical Biol. Medi. 1999. V. 26. №9/10. P. 1231-1237.]. Антиоксидантну активність досліджуваних сполук визначали за допомогою спектрофотометру за зміною екстинкції при довжині хвилі 734 нм протягом 3 хв. [Инструкция по определению антиоксидантного статуса набором фирмы Randox // Randox Laboratories Ltd., UK. 2000. P. 2-9.]. Досліджувані пігменти не + мають оптичного поглинання при 734 нм, яке змінюється в процесі їх взаємодії з АБТС , що дозволяє коректно інтерпретувати отримані дані. Для аналізу та порівняння отриманих даних з даними літератури антиоксидантну ємність меланіну виражали у еквіваленті активності Тролоксу. Вона визначалась як концентрація розчину Тролоксу з такою антиоксидантною ємністю, яка еквівалентна антиоксидантній ємності досліджуваної сполуки при концентрації 1 мМ. Як стандарт використовували Тролокс (синтетичний аналог вітамину Е, 6-гідрокси-2,5,7,8тетраметилхроман-2-карбонова кислота; Aldrich, США). Для побудови калібрувальної кривої використовували розчин Тролоксу в інтервалі концентрацій від 0 до 10 мкМ у цитратному буфері при рН 3,75 та 4,25. Величина антиоксидантної ємності відображає здатність антиоксидантів, що є донорами водню, відновлювати катіон-радикал АБТС. Антиоксидантну ємність виражали на молекулярну масу кожного з досліджуваних препаратів меланіну. Було визначено, що ізоляти Cladosporium cladosporoiodes 4, Cladosporium cladosporoiodes 10, Aspergillus versicolor 55 та Aspergillus versicolor 57 характеризуються здатністю до синтезу меланінів з високою антиоксидантною активністю, у той час, як меланіни, які синтезувалися Cladosporium cladosporoiodes 396 та Aspergillus versicolor 432 не мали високої антиоксидантної здатності. Ізоляти, які досліджували в експерименті, піддавали аналізу на наявність радіотропізму так, як описано у Прикладі 1. Дані стосовно визначення радіотропізму та антиоксидантної ємності меланінових пігментів у досліджуваних ізолятах мікроміцетів приведені у Таблиці. Було встановлено, що антиоксидантна ємність меланінів ізолятів мікроміцетів з радіоадаптивними властивостями більш ніж на порядок перевищувала таку для штамів, які не мали позитивного радіотропізму. Як контролі в експерименті використовували аскорбінову та галову кислоту, які являють собою відомі антиоксидантні сполуки. 3 UA 71518 U Таблиця Антиоксидантна ємність меланінових пігментів мікроскопічних грибів Ізолят продуценту меланінових пігментів Cladosporium cladosporoiodes 396 Cladosporium cladosporoiodes 4 Cladosporium cladosporoiodes 10 Aspergillus versicolor 432 Aspergillus versicolor 55 Aspergillus versicolor 57 Наявність радіотропізму Антиоксидантна ємність меланінових пігментів АОЄ моль Тролоксу/моль меланіну позитивний радіотропізм, низький ступінь позитивний радіотропізм, високий ступінь позитивний радіотропізм, середній ступінь негативний радіотропізм позитивний радіотропізм, середній ступінь позитивний радіотропізм, середній ступінь Аскорбінова кислота Галова кислота 5 10 0,2407±0,012 2,3157±0,013 2,2112±0,011 0,1074±0,0054 1,2020±0,0059 1,3010±0,0063 0,9398±0,0047 4,0307±0,201 Таким чином, результати щодо визначення здатності штамів мікроміцетів продукувати меланінових пігментів з високою антиоксидантною активністю, отримані при використанні запропонованого у даній заявці критерію, повністю співпадають з даними визначення антиоксидантної активності меланінових пігментів кожного із штамів на основі традиційного спектрофотометричного способу. При цьому штами мікроміцетів, які демонструють позитивний радіотропізм високого та середнього ступеня, є здатними до синтезу меланінових пігментів з високою антиоксидантною активністю, що підтверджує достовірність запропонованого способу, що базується на визначенні ступеня радіотропізму. штамів, для оцінки здатності грибів до синтезу ефективних меланінових пігментів. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб скринінгу мікроміцетів, що продукують меланінові пігменти з високим рівнем антиоксидантної активності, за хіміко-біологічними параметрами, який відрізняється тим, що він передбачає вирощування досліджуваних штамів на агаризованому культуральному середовищі та визначення їх радіотропізму, при цьому штами, які мають здатність до синтезу меланінових пігментів з високим рівнем антиоксидантної активності, характеризуються позитивним радіотропізмом у порівнянні зі штамами, які мають негативний радіотропізм або низький рівень позитивного радіотропізму. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4