Живильне середовище для культивування штаму c-06 іrpex lacteus fr. – продуцента ферменту молокозсідальної дії

Реферат: Живильне середовище для культивування штаму С-06 Irpex lacteus Fr. - продуцента молокозсідального ферменту, на основі компонентів - глюкози, органічного азотвмісного компонента, KН2РО4, K2НРО4, MgSO4×7H2O, СаСl2, ZnSO4×7H2O, дистильованої води. Як азотвмісну складову використовують мінеральну сіль (NH 4)2HPO4. UA 90388 U (54) ЖИВИЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ ШТАМУ C-06 ІRPEX LACTEUS FR. ПРОДУЦЕНТА ФЕРМЕНТУ МОЛОКОЗСІДАЛЬНОЇ ДІЇ UA 90388 U UA 90388 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до області біотехнології виробництва ферментних препаратів і може бути використана в науково-дослідних і промислових мікологічних лабораторіях. Зважаючи на дефіцит сичугового ферменту тваринного походження в багатьох країнах світу як його замінник використовують до 18-20 % ферментних препаратів бактеріального і грибного походження за виробництва сирів [7]. У зв'язку з цим пошук активних продуцентів ферментів сичугової дії серед базидіальних грибів та розробка оптимальних живильних середовищ для їх культивування є актуальним. Дереворуйнівний базидіальний гриб Irpex lacteus Fr. - перспективний продуцент ферментів сичужної дії [2, 3]. За своєю активністю молокозсідальні ферментні препарати з культуральної рідини гриба I. lacteus не поступаються ферментам тваринного або мікробного походження [5, 11]. В лабораторних умовах ізоляти гриба I. lacteus культивують на живильних середовищах різного компонентного складу. Оптимізація умов і складу живильного середовища для культивування гриба I. lacteus надасть можливість збільшити вихід сичужного ферменту в культуральну рідину. Відомо, що зміна джерела азотного живлення здатна впливати на синтетичну активність базидіальних грибів [1, 4]. Відомі живильні середовища для культивування вищих базидіальних грибів сусло-агар, картопляний агар характеризуються невизначеністю співвідношення вуглецю і азоту, що може суттєво впливати на продуктивність екзопротеїназ молокозсідальної дії [5]. Відомі також рідкі живильні середовища, що містять глюкозу і мінеральні компоненти середовище Чапека-Докса, сахарозу і мінеральні компоненти - середовище Білай забезпечують вихід молокозсідального ферменту в культуральну рідину [5]. До суттєвих недоліків цих живильних середовищ належать низька молокозсідальна активність культуральної рідини штамів гриба І. lacteus. Найбільш близьким аналогом за технічною суттю та досяжністю результату є глюкозопептонне живильне середовище з вмістом пептону як джерела азоту, що широко застосовується в мікологічних дослідженнях [8]. Найближчий аналог містить компоненти в наступному співвідношенні (г/л): глюкоза - 10, пептон - 3, MgSO4×7H2O-0,5, KН2РО4-0,6, K2НРО40,4, СаСl2-0,05, ZnSO4×7H2O-0,001, вода до 1 л. Приготування живильного середовища за найближчим аналогом дає невисокий вихід сичужного ферменту в культуральну рідину штаму С-06 I. lacteus впродовж усього часу культивування, що свідчить про недостатнє забезпечення продуцента компонентами живильного середовища. Склад живильного середовища для культивування штаму С-06 I. lacteus потребує його оптимізування, яке стимулювало би накопичення корисного продукту - ензиму сичужної дії. В основу корисної моделі поставлена задача оптимізувати склад живильного середовища для культивування штаму С-06 базидіоміцету I. lacteus з максимальним виходом молокозсідального ферменту в культуральну рідину шляхом заміни джерела азоту - пептону на мінеральну сіль - (NH4)2HPO4 і зміни концентрації чотирьох основних компонентів - глюкози, 4 (NH4)2HPO4, MgSO4×7H2O і СаСl2 за методом повного факторного експерименту ПФЕ-2 , за яким можна виявити вплив та взаємозв'язок кожного фактора на синтез молокозсідального ферменту штаму С-06 гриба I. lacteus [6], за рахунок чого підвищується ферментативна активність. Поставлена задача вирішується тим, що живильне середовище для культивування штаму С-06 гриба I. lacteus - продуцента молокозсідального (сичужного) ферменту, яке містить глюкозу, азотвмісний компонент, MgSO4×7H2O, СаСl2, KН2РО4, K2НРО4, ZnSO4×7H2O, дистильовану воду, згідно з корисною моделлю, як азотвмісний компонент використовують мінеральну сіль (NH4)2HPO4 у такому співвідношенні компонентів, г/л: глюкоза - 12, (NH4)2HPO43,31, MgSO4×7H2O-0,6, СаСl2-0,06, K2НРО4-0,4, KН2РО4-0,6, ZnSO4×7H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Статистичну обробку отриманих результатів експериментів проводили однофакторним дисперсійним аналізом якісних і кількісних ознак, а порівняння середніх арифметичних величин - методом Дункана [6]. За даними статистичної обробки результатів експериментів визначений достовірний вплив фактора. Експериментальні дані з молокозсідальної активності культуральної рідини штаму С-06 гриба I. lacteus наведені у таблиці. 55 1 UA 90388 U Таблиця Молокозсідальна активність культуральної рідини штаму С-06 гриба Irpex lacteus № живильного середовища 1 (контроль) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 5 10 15 20 25 30 35 Загальна МЗА КР, од./мл 133,99±21,85 143,43±11,76 194,19±0,00 92,15±3,75 113,56±0,00 217,33±34,83 50,70±0,00 489,42±101,05 252,67±4,42 118,60±13,70 145,31±2,37 370,62±0,00 0,00±0,00 162,74±14,01 184,48±36,20 310,39±23,22 483,74±0,00 Питома МЗА КР, од./мг білка 1425,46±232,46 667,12±54,74 414,93±0,00 1196,68±48,78 1275,90±0,00 157,71±25,28 109,97±0,00 1390,78±287,18 286,30±5,02 502,53±58,08 111,53±1,82 718,27±0,00 0,00±0,00 204,20±17,57 234,41±45,99 434,11±32,48 2218,99±0,00 Використовували рідке живильне середовище, що готували шляхом послідовного розчинення кожного компонента з наступним доведенням до 1 л дистильованою водою. Кислотність живильних середовищ доводили 10 %-м розчином НСl до рН 4,0, яке є оптимальним для росту продуцента. Живильне середовище розливали по 50 мл в конічні колби на 100 мл, стерилізували при 0,8-1,0 атм впродовж 40 хвилин. Гриб культивували 15 діб за оптимальної температури 32 °C. Молокозсідальну активність культуральної рідини визначали за методом Kawai, Mukai [9]. За одиницю молокозсідальної активності беруть кількість ферменту, яка згортає 100 мл молока за 40 хвилин за температури 35 °C. Приклад конкретного виконання Приклад 1. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 10, (NH4)2HPO4-2,31, MgSO4×7H2O-0,5, СаСl2-0,05, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Живильне середовище розвивали по 50 мл в конічні колби на 100 мл. Стерилізували в автоклаві при 0,81,0 атм впродовж 40 хв. Після охолодження і контролю стерильності середовище інокулювали шматочком міцелію штаму С-06 розміром 5×5 мм. Гриб вирощували за температури 32 °C впродовж 15 діб. Приклад 2. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 8, (NH4)2HPO4-1,31, MgSO4×7H2O-0,4, СаСl2-0,04, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 3. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 12, (NH4)2HPO4-1,31, MgSO4×7H2O-0,4, СаСl2-0,04, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 4. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 8, (NH4)2HPO4-3,31, MgSO4×7H2O-0,4, СаСl2-0,04, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 5. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 12, (NH4)2HPO4-3,31, MgSO4×7H2O -, СаСl2 -, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 6. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 8, (NH4)2HPO4-1,31, MgSO4×7H2O-0,6, СаСl2-0,04, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода 1л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 7. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 12, (NH4)2HPO4-1,31, MgSO4×7H2O-0,6, СаСl2-0,04, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода 1л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. 2 UA 90388 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 8. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 8, (NH4)2HPO4-3,31, MgSO4×7H2O-0,6, СаСl2-0,04, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 9. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 12, (NH4)2HPO4-3,31, MgSO4×7H2O-0,6, СаСl2-0,04, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 10. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 8, (NH4)2HPO4-1,31, MgSO4×7H2O-0,4, СаСl2-0,06, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 11. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 12, (NH4)2HPO4-1,31, MgSO4×7H2O-0,4, СаСl2-0,06, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 12. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 8, (NH4)2HPO4-3,31, MgSO4×7H2O-0,4, СаСl2-0,06, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 13. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 12, (NH4)2HPO4-3,31, MgSO4×7H2O-0,4, СаСl2-0,06, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 14. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 8, (NH4)2HPO4-1,31, MgSO4×7H2O-0,6, СаСl2-0,06, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 15. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 12, (NH4)2HPO4-1,31, MgSO4×7H2O-0,6, СаСl2-0,06, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 16. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 8, (NH4)2HPO4-3,31, MgSO4×7H2O-0,6, СаСl2-0,06, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 17. Живильне середовище наступного складу (г/л): глюкоза - 12, (NH4)2HPO4-3,31, MgSO4×7H2O-0,6, СаСl2-0,06, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Таким чином, культивування штаму С-06 гриба I. lacteus на живильному середовищі за найближчим аналогом і на живильних середовищах зі складом компонентів, що наведені в прикладах 4 і 7, призводить до зниження молокозсідальної активності культуральної рідини, і в прикладі 13 - до відсутності молокозсідальної активності культуральної рідини. Максимальні значення сичужної активності культуральної рідини визначені для середовища 17. Отримані дані свідчать про доцільність використання модифікованого живильного середовища, що містить наступні компоненти у новому співвідношенні (г/л): глюкоза - 12, (NH4)2HPO4-3,31, MgSO4×7H2O-0,6, СаСl2-0,06, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4H2O-0,001, дистильована вода - 1 л., що призводить до підвищення молокозсідальної активності культуральної рідини. Джерела інформації: 1. Антоненко Л.О. Вплив джерел живлення на ріст грибів роду Coriolus Quel (Trametes Fr.) і їх антиокислювальну активність / Л.О. Антоненко, В.М. Кучма, Ю.С. Крисюк // Наукові вісті НТУУ "КПІ". - 2010. - № 3. - С. 10-15. 2. Белова Н.В. Базидиомицеты - источник биологически активных веществ // Растительные ресурсы. - 1991. - № 2. - С. 8-17. 3. Бойко С.М. Біологічні особливості штамів Irpex lacteus Fr. - продуцентів протеїназ молокосзідальної дії: автореф. дис. на здобуття наук, ступеня канд. біол. наук: 03.00.21 "Мікологія" / С.М. Бойко. - Київ, 2002. - 20 с. 4. Бухало А.С Влияние различных источников углерода и азота в синтетических средах на рост базидиомицетов / А.С. Бухало, Л.П. Пархоменко, М.Н. Марченко // Микология и фитопатология. - 1972. - Т. 6, вып. 3. - С. 241-244. 5. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. - К.: Наукова думка, 1973. - 592 с. 6. Приседський Ю.Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів / Ю.Г. Приседський. - Донецьк: Кассиопея, 1999. - 210 с. 7. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. - М.: Мир, 1987. - 390 с. 8. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов: Справочник / С.М. Семенов. - М.: Агропромиздат, 1990. - 240 с. (прототип) 9. Kawai M., Mukai N. Studies on milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes. I. Screening test of Basidiomycetes for the production of milk clotting enzymes. - P. 159-163. 3 UA 90388 U 10. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Milk-clotting enzyme from Irpex lacteus as a calf substitute for cheddar cheese manufacture // Agric. Biol. Chem. - 1985. - V. 49, № 6. - P. 1605-1609. 11. Kikuchi E., Kobaesoshi H., Kusakobe I., Muracami K. Fiber-structured cheese making with Irpex lacteus milk-clotting enzyme / // Agr. Biol. Chem. 1988. - Vol. 52, № 5. - P. 1277-1278. 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Живильне середовище для культивування штаму С-06 Irpex lacteus Fr. - продуцента молокозсідального ферменту, на основі компонентів - глюкози, органічного азотвмісного компонента, KН2РО4, K2НРО4, MgSO4×7H2O, СаСl2, ZnSO4×7H2O, дистильованої води до 1 л, яке відрізняється тим, що як азотвмісну складову використовують мінеральну сіль (NH 4)2HPO4 при наступному співвідношенні компонентів, г/л: глюкоза 12 (NH4)2HPO4 3,31 MgSO4×7H2O 0,6 СаСl2 0,06 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 ZnSO4×7H2O 0,001 дистильована вода 1 л. Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4