Живильне середовище для культивування штаму с-06 гриба irpex lacteus fr. – продуцента молокозсідального ферменту

Реферат: Живильне середовище для культивування штаму С-06 Irpex lacteus Fr. - продуцента молокозсідального ферменту на основі компонентів - мальтози, пептону, KН2РО4, K2НРО4, MgSO4×7H2O, CaCl2, ZnSO4×7H2O, дистильованої води. З метою підвищення виходу молокозсідального ферменту в культуральну рідину беруть мальтозу, пептон, MgSO 4×7H2O, СаСl2, KН2РО4, K2НРО4, ZnSO4×H2O, дистильовану воду. UA 82991 U (12) UA 82991 U UA 82991 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до біотехнології і може бути використана в науково-дослідних і промислових мікологічних лабораторіях для отримання ферментного препарату молокозсідальної (сичужної) дії з культуральної рідини штаму С-06 базидіального дереворуйнівного гриба Irpex lacteus Fr., дефіцит якого відмічається в багатьох країнах світу [1, 2]. Гриб Irpex lacteus Fr. - перспективний продуцент протеолітичних ферментів, в тому числі й молокозсідальної дії. Сичужні ферменти, отримані з культуральної рідини відповідних базидіоміцетів, за своєю активністю не поступаються ферментним препаратами тваринного або мікробного походження [7, 8]. В лабораторних умовах штами гриба культивують на живильних середовищах певного компонентного складу. Оптимізації умов і способів культивування гриба I. lacteus надасть можливість збільшити вихід сичужного ферменту в культуральну рідину. Відоме глюкозо-пептонне живильне середовище, до складу якого входять: глюкоза, пептон і ряд мінеральних солей [3]. До недоліків належить низька молокозсідальна активність культуральної рідини штамів гриба I. lacteus. Найбільш близьким за технологічною суттю та досяжністю результату є живильне середовище з мальтозою як джерелом вуглецю, яке широко застосовується у мікологічній практиці [4]. Найближчий аналог містить компоненти в наступному співвідношенні (г/л): мальтоза - 10, пептон - 3, MgSO4×7H2O-0,5, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, СаСl2-0,05, ZnSO4×H2O0,001. Приготування живильного середовища за найближчим аналогом дає невисокий вихід екзопротеїназ молокозсідальної дії штаму С-06. В основу корисної моделі поставлена задача підбору компонентів живильного середовища для культивування штаму С-06 базидіоміцету I. lacteus з максимальним виходом молокозсідального ферменту в культуральну рідину. Поставлена задача вирішується тим, що живильне середовище для культивування штаму С-06 гриба I. lacteus - продуцента молокозсідального ферменту, яке містить мальтозу, пептон, MgSO4×7H2O, СаСl2, KН2РО4, K2НРО4, ZnSO4×H2O, дистильовану воду згідно з корисною моделлю, з метою підвищення виходу молокозсідального ферменту в культуральну рідину беруть мальтозу, пептон, MgSO4×7H2O, СаСl2, KН2РО4, K2НРО4, ZnSO4×H2O, дистильовану воду у такому співвідношенні, г/л: мальтоза 14 пептон 1 MgSO4×7H2O 0,3 СаСl2 0,05 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 ZnSO4×H2O 0,001 дистильована вода 1 л. Статистичну обробку отриманих результатів експериментів проводили однофакторним дисперсійним аналізом якісних і кількісних ознак, а порівняння середніх арифметичних величин - методом Дункана [5]. За даними статистичної обробки результатів експериментів визначений достовірний вплив фактору. Експериментальні дані з молокозсідальної активності культуральної рідини штаму С-06 наведені у таблиці. Використовували рідке живильне середовище, яке готували шляхом послідовного розчинення кожного компонента з наступним доведенням до 1 л дистильованою водою. Кислотність живильних середовищ доводили 10 %-м розчином НСl до значення 4,0, яке є оптимальним для росту продуцента. Живильне середовище розливали по 50 мл в конічні колби на 100 мл, стерилізували при 0,8-1,0 атм впродовж 40 хвилин. Гриб культивували 15 діб за оптимальної температури 32 °C. Молокозсідальну активність культурального рідини визначають за методом Kawai, Mukai [6]. За одиницю молокозсідальної активності беруть кількість ферменту, яка згортає 100 мл молока за 40 хвилин за температури 35 °C. Результати оптимізації складу живильного середовища для культивування штаму С-06 I. lacteus свідчать про наступне. Для культивування штаму С-06 I. lacteus з метою підвищення виходу ферменту молокозсідальної дії найпридатнішим виявилось живильне середовище № 10, для якого характерна взаємодія двох компонентів, що варіюють, - мальтози і СаСl2. Максимальна питома молокозсідальна активність культуральної рідини штаму С-06 I. lacteus на даному середовищі становила 4669,1±529,1 од./мг білка, достовірно перевищуючи контроль середовище № 17. 1 UA 82991 U Таблиця Питома молокозсідальна активність культуральної рідини штаму С-06 гриба I. Lacteus Живильне середовище 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 5 10 15 20 25 30 35 Питома молокозсідальна активність, од./мг білка 2536,4±102,5 3125,1±133,7 1834,6±73,8 1854,3±164,9 2285,0±156,7 3812,1±367,9 2137,7±174,9 1986,8±177,1 2589,8±257,8 4669,1±529,1 2338,8±237,0 1507,9±78,5 2833,6±28,1 3027,8±183,8 1914,7±92,7 1577,2±43,2 1706,4±147,7 Приклад конкретного виконання Приклад 1 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 10, пептон - 1, MgSO4×7H2O-0,3, СаСl2-0,03, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Живильне середовище розливали по 50 мл в конічні колби на 100 мл. Стерилізували в автоклаві при 0,8-1,0 атм впродовж 40 хв. Після охолодження і контролю стерильності середовище інокулювали шматочком міцелію штаму С-06 розміром 5×5 мм. Гриб вирощували за температури 32 °C впродовж 15 діб. Приклад 2 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 14, пептон - 1, MgSO4×7H2O-0,3, СаСl2-0,03, КН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 3 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 10, пептон - 3, MgSO4×7H2O-0,3, СаСl2-0,03, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 4 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 14, пептон - 3, MgSO4×7H2O-0,3, СаСl2-0,03, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 5 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 10, пептон - 1, MgSO4×7H2O-0,5, СаСl2-0,03, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 6 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 14, пептон - 1, MgSO4×7H2O-0,5, СаСl2-0,03, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 7 2 UA 82991 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 10, пептон - 3, MgSO4×7H2O-0,5, СаСl2-0,03, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 8 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 14, пептон - 3, MgSO4×7H2O-0,5, СаСl2-0,03, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 9 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 10, пептон - 1, MgSO4×7H2O-0,3, СаСl2-0,05, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 10 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 14, пептон - 1, MgSO4×7H2O-0,3, СаСl2-0,05, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 11 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза -10, пептон - 3, MgSO4×7H2O-0,3, СаСl2-0,05, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 12 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 14, пептон - 3, MgSO4×7H2O-0,3, СаСl2-0,03, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 13 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 10, пептон - 1, MgSO4×7H2O-0,5, СаСl2-0,05, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 14 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 14, пептон - 1, MgSO4×7H2O-0,5, СаСl2-0,05, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 15 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 10, пептон - 3, MgSO4×7H2O-0,5, СаСl2-0,05, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 16 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 14, пептон - 3, MgSO4×7H2O-0,5, СаСl2-0,05, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НС1. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Приклад 17 Живильне середовище наступного складу (г/л): мальтоза - 10, пептон - 3, MgSO4×7H2O-0,5, СаСl2-0,05, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4×H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСl. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Підвищення вмісту мальтози і зниження вмісту пептону і MgSO 4×7H2O в живильному середовищі № 10 призводить до підвищення молокозсідальної активності культуральної рідини за культивування штаму С-06 I. lacteus. Таким чином, отримане живильне середовище № 10 порівняно з найближчим аналогом забезпечує підвищений вихід в культуральну рідину екзопротеїназ молокозсідальної дії штамом С-06 гриба I. lacteus. Джерела інформації:, використані при складанні заявки: 3 UA 82991 U 5 10 15 1. Белова Н.В. Базидиомицеты - источник биологически активных веществ // Растительные ресурсы.-1991. - № 2. - С. 8-17. 2. Белова Н.В., Ефремова И.Я. Препараты из высших грибов - объект патентно-правовой охраны //Микология и фитопатология.-1992. - Т. 26, вып. 4. - С. 321-324. 3. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. - К.: Наукова думка, 1973.-592 с. 4. Дроздова Т.Н., Федорова Л. И. Влияние различных источников углеродного питания на молокосвертывающую активность микоризного гриба // Микология и фитопатология, 1982. - Т. 11, № 2. - С. 133-138. (найближчий аналог) 5. Приседський Ю.Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів / Ю.Г. Приседський. - Донецьк: Кассиопея, 1999.-210 с. 6. Kawai M., Mukai N. Studies on milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes. I. Screening test of Basidiomycetes for the production of milk clotting enzymes. - P. 159-163. 7. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Milk-clotting enzyme from Irpex lacteus as a calf substitute for cheddar cheese manufacture // Agric. Biol. Chem.-1985. - V. 49, № 6. - P. 1605-1609. 8. Kikuchi E., Kobaesoshi H., Kusakobe I., Muracami K. Fiber-structured cheese making with Irpex lacteus milk-clotting enzyme / // Agr. Biol. Chem. 1988. - Vol. 52, № 5. - P. 1277-1278. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Живильне середовище для культивування штаму С-06 Irpex lacteus Fr. - продуцента молокозсідального ферменту, на основі компонентів - мальтози, пептону, KН2РО4, K2НРО4, MgSO4×7H2O, CaCl2, ZnSO4×7H2O, дистильованої води до 1 л, яке відрізняється тим, що з метою підвищення виходу молокозсідального ферменту в культуральну рідину беруть мальтозу, пептон, MgSO4×7H2O, СаСl2, KН2РО4, K2НРО4, ZnSO4×H2O, дистильовану воду при наступному співвідношенні, г/л: мальтоза 14 пептон 1 MgSO4×7H2O 0,3 СаСl2 0,05 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 ZnSO4×7H2O 0,001 дистильована вода (решта) 1 л. Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4