Живильне середовище для культивування штаму с-06 гриба irpex lacteus fr. – продуцента сичужного ферменту

Реферат: Живильне середовище для культивування штаму С-06 Irpex lacteus Fr. - продуцента молокозсідального ферменту, на основі компонентів - сахарози пептону, KН2РО4, K2НРО4, MgSO4 × 7H2O, CaCl2, ZnSO4 × 7H2O, дистильованої води до 1 л. UA 80393 U (54) ЖИВИЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ ШТАМУ С-06 ГРИБА IRPEX LACTEUS FR. ПРОДУЦЕНТА СИЧУЖНОГО ФЕРМЕНТУ UA 80393 U UA 80393 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології і може бути використана в науково-дослідних і промислових мікологічних лабораторіях для отримання ферментного препарату молокозсідальної (сичужної) дії з культуральної рідини штаму С-06 базидіального дереворуйнівного гриба Іrрех lacteus Fr., дефіцит якого відмічається в багатьох країнах Світу [1]. Базидіальний гриб Irpex lacteus Fr. - перспективний продуцент молокозсідального ферменту [2]. Сичужні ферменти, отримані з культуральної рідини відповідних базидіоміцетів, за своєю активністю не поступаються ферментним препаратами тваринного або мікробного походження [10, 11]. В лабораторних умовах штами гриба культивують на живильних середовищах певного компонентного складу [3]. Оптимізація умов і способів культивування гриба I. lacteus надасть можливість збільшити вихід сичужного ферменту в культуральну рідину [5]. Відомі живильні середовища, що містять сахарозу і мінеральні компоненти (середовище Білай, Чапека), а також глюкозу і мінеральні солі (середовище Чапека-Докса), а також живильні середовище невизначеного складу сусло-агар, що забезпечують низьку молокозсідальну активність (МЗА) культуральної рідини (КР) базидіальних грибів. Відоме глюкозо-пептонне живильне середовище, до складу якого входять: глюкоза, пептон і ряд мінеральних солей [4], що забезпечують вихід молокозсідального ферменту базидіоміцетів в культуральну рідину. До суттєвих недоліків належить низька молокозсідальна активність культуральної рідини штамів гриба I. lacteus. Найбільш близьким аналогом є живильне середовище з сахарозою як джерело вуглецю, яке широко застосовується у мікологічній практиці [6]. Найближчий аналог містить компоненти в наступному співвідношенні (г/л): сахароза - 7,4988, пептон - 5, MgSO4 ×7Н2О 0,2, СаСl2-0,02, KН2РО4-0,6, K2НРО4-0,4, ZnSO4 × 7H2O 0,001. вода до і л. Приготування живильного середовища за найближчим аналогом дає невисокий вихід молокозсідального ферменту штаму С-06 I. lacteus впродовж усього часу культивування, що свідчить про недостатнє забезпечення продуцента компонентами живильного середовища. Склад живильного середовища для культивування штаму С-06 I. lacteus потребує середовища, яке стимулювало би накопичення корисного продукту. В основу корисної моделі поставлено задачу оптимізувати склад живильного середовища для культивування штаму С-06 базидіоміцету І. lacteus з максимальним виходом молокозсідального ферменту в культуральну рідину шляхом зміни концентрації чотирьох основних компонентів - сахарози, пептону, MgSO4 × 7H2O і СаСl2 за методом повного 4 факторного експерименту ПФЕ-2 , за яким можна виявити вплив і взаємозв'язок кожного фактора на синтез молокозсідального ферменту штаму С-06 гриба I. lacteus [8]. Поставлена задача вирішується за рахунок того, що живильне середовище для культивування штаму С-06 гриба I. lacteus - продуцента молокозсідального ферменту, яке містить сахарозу, пептон, MgSO4 × 7H2О. СаСl2, KН2РО4, K2НРО4, ZnSO4 × 7H2O, дистильовану воду, згідно з корисною моделлю, беруть сахарозу, пептон, MgSO4 × 7H2O, CaCl2, KН2РО4, K2HPO4, ZnSO4 × 7H2O, дистильовану воду у такому співвідношенні, г/л: сахароза 15,5, пептон 6, MgSO4 × 7H2O-0,6, СаСl2-0,06, K2НРО4-0,4, KH2РO4,-0,6, ZnSO4 × 7H2O-0,001, дистильована вода до 1л. Статистичну обробку отриманих результатів експериментів проводили однофакторним дисперсійним аналізом якісних і кількісних ознак, а порівняння середніх арифметичних величин - методом Дункана [8]. За даними статистичної обробки результатів експериментів визначений достовірний вплив фактора. Експериментальні дані з молокозсідальної активності культуральної рідини штаму С-06 гриба I. lacteus наведені у таблиці. Використовували рідке живильне середовище, яке готували шляхом послідовного розчинення кожного компонента з наступним доведенням до 1 л дистильованою водою. Кислотність живильних середовищ доводили 10 %-м розчином НСl до рН 4,0, яке є оптимальним для росту продуцента. Живильне середовище розливали по 50 мл в конічні колби на 100 мл стерилізували при 0,8-1,0 атм впродовж 40 хвилин. Гриб культивували 15 діб за оптимальної температури 32 °C. Молокозсідальну активність культуральної рідини визначали за методом Kawai, Mukai [9]. За одиницю молокозсідальної активності беруть кількість ферменту, яка згортає 100 млмолока за 40 хвилин за температури 35 °C. Результати оптимізації складу живильного середовища для культивування штаму С-06 І. lacteus свідчать про наступне. Максимальні значення молокозсідальної активності культуральної рідини виявлені за культивування штаму С-06 I. lacteus на живильних середовищах № 9 з максимальним вмістом сахарози, пептону і MgSO4 × 7H2O, № 13 - пептону і СаСl2, № 12 - сахарози, пептону і СаСl2 і № 16 - пептону, MgSO4 7H2О і СаСl2 (табл.). Максимальна молокозсідальна активність культуральної рідини штаму С-06 І. lacteus на цих 1 UA 80393 U живильних середовищах становила 3008,97-3280,53 од/мл і достовірно перевищувала контроль. Максимальні значення питомої молокозсідальної активності культуральної рідини виявлені на живильних середовищах № 7, № 14 і № 15, для яких характерний знижений вміст пептону. 5 Таблиця Молокозсідальна активність культуральної рідини штаму С-06 гриба Іrрех lacteus № живильного середовища 1 (контроль) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 10 15 20 25 30 35 Загальна МЗА КР, од/мл 2133,83±123,44 2628,63±42,80 2384,57±123,93 2956,10±251,44 2718,03±151,00 2697,53±42,85 2533,10±221,95 1887,27±132,78 3280,53±307,47 2767,80±488,14 2849,13±83,48 3015,17±334,17 3092,00+66,14 2329,83±113,31 2421,20±97,94 3008,97±370,80 2978,00±78,86 Питома МЗА КР, од/мг білка 1053,23±35,47 1143,23±102,62 1098,77±87,22 1016,7±114,06 839,831±51,24 1110,97±3513 1401,03±148,05 789,031±58,76 1047,531±133,92 1264,471±255,01 1296,201±14,91 1130,601±137,76 1102,23±35,94 1472,571±10948 1493,571±104.73 1140,27±88,50 1033,701±29,41 Приклад конкретного виконання Приклад 1. Живильне середовище наступного складу (г/л): сахароза 15,5, пептон - 6, MgSO4 × 7H2O-0,6, СаСl2-0,06, K2НРО4-0,4, KН2РО4 0,6, ZnSO4 × 7H2O-0,001, дистильована вода -1л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НС1. Живильне середовище розливали по 50 мл в конічні колби на 100 мл. Стерилізували в автоклаві за 0,8-1,0 атм впродовж 40 хв. Після охолодження і контролю стерильності середовище інокулювали шматочком міцелію штаму С-06 розміром приблизно 5 × 5 мм. Гриб вирощували поверхневим способом за температури 32 °C впродовж 15 діб. Загальна МЗА КР 3280,53±307,47 од/мл, питома МЗА КР 1047,53±133,92 од/мг білка. Приклад 2. Живильне середовище наступного складу (г/л): сахароза 11,5, пептон - 6, MgSO4 × 7H2O-0,4, СаСl2-0,08, K2НРО4-0,4, KН2РО4 0.6. ZnSO4 × 7H2O-0,001, дистильована вода -1л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НС1. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Загальна МЗА КР 3015,17±334,17 од/мл, питома МЗА КР 1130,60±137,76 од/мг білка. Приклад 3. Живильне середовище наступного складу (г/л): сахароза 11,5, пептон - 6, MgSO4 × 7H2O-0,6, СаСl2-0,08, K2НРО4-0,4, KН2РО4 0,6, ZnSO4 × 7H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильною середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСІ. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Загальна МЗА КР 3008,97±370,80 од/мл, питома МЗА КР 1140,27±88,50 од/мг білка. Приклад 4. Живильне середовище наступного складу (г/л): сахароза 11,5, пептон - 6, MgSO4 × 7H2O-0,6, СаСl2-0,06, K2НРО4-0,4, KH2PO4-0,6, ZnSO4 × 7H2O-0,001, дистильована вода - 1 л. Кислотність живильного середовища доводили до рН 4,0 10 %-м розчином НСІ. Виконували всі технологічні прийоми, що описані в прикладі 1. Загальна МЗА КР 1887,27±132,78 од/мл, питома МЗА КР 789,03±58,76 од/мг білка. Таким чином, культивування штаму С-06 на живильному середовищі за прототипом і на живильних середовищах зі складом компонент?, що наведені в прикладах 2-4, призводить до зниження молокозсідальної активності культуральної рідини. Отримані дані свідчать про доцільність використання модифікованого живильного середовища, яке містить наступні компоненти у новому співвідношенні (г/л): сахароза 15,5, пептон 6, MgSO4 × 7H2O-0,6, СаСl20,06, K2НРО4-0,4, KН2РО4-0,6, ZnSO4, 7М2О-0,001, що призводить до підвищення молокозсідальної активності культуральної рідини. 2 UA 80393 U 5 10 15 20 25 30 Джерела використаної літератури: 1. Белова Н.В. Базидиомицеты - источник биологически активных веществ //Растительные ресурсы.-1991. - № 2. - С. 8-17. 2. Бойко С.М. Біологічні особливості штамів Irpex lacteus Fr. продуцентів протеїназ молокозсідальної дії: автореф. дис. на здобуття наук, ступеня канд. біол. наук: 03.00.21 "Мікологія" / С.М. Бойко. - К., 2002.-20 с. 3. Бойко С.М. Использование биологически активность добавок для культивирования штаммов Irpex lacteus Fr. - продуцентов протеиназ молокосвертывающего действия / С.М. Бойко // Вісник Донецького Університету, Сер. А: Природничі науки.-2004. - Вип. I. - С. 387 392. 4. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. - К.: Наукова думка, 1973.-592 с. 5. Бухало А.С Влияние различных источников углерода и азота и синтетических средах на рост базидиомицетов / А.С Бухало, Л.II. Пархоменко, М.Н. Марченко // Микология и фитопатология.-1972. - Т. 6. - Вып. 3. - С. 241-244. 6. Пат. 61605 Україна, МПК С12N 1/14 A01G 1/04. Живильне середовище для культивування штаму Р-04 Irpex lacteus Fr продуцента сичужного ферменту / Бойко М.І., Дорошкевич Н.В., Ткаченко Н.П., Терещенко Г.С., Білун О.В., Кузнецова L.A.; заявник і патентоутримувач Донецький нац. ун-т. - № u 2010 15573, заявл. 23.12.2010; опубл. 25.07.2011, Бюл. № 14. (прототип) 7. Пат. 60690 Україна, МПК С12N 1/14 A01G 1/04. Живильне середовище для культивування штаму 4-03 дереворуйнівного гриба Irpex lacteus Fr. - продуцента молокозсідального ферменту / Бойко М.І., Ткаченко Н.П., Терещенко Г.С., Дорошкевич Н.В., Білун OB., Кузнецова L.A.; заявник і патентоутримувач Донецький над. ун-т. № к 2010 14615, заявл. 06.12.2010; опубл. 25.06.2011, Бюл. № 12. 8. Приседський Ю.Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів / Ю.Г. Приседський. - Донецьк: Кассиопея, 1999.-210с. 9. Kawai M., Mukai N. Studies on milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes. I. Screening test of Basidiomycetes for the production of milk clotting enzymes. - P. 159-163. 10.Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Milk-clotting enzyme from frpex lacteus as a calf substitute for cheddar cheese manufacture // Agric. Biol. Chem.-1985. - V. 49, № 6. - P. 1605-1609. 11.Kikuchi E., Kobaesoshi H., Kusakobe I., Muracami K. Fiber-structured cheese making with Irpex lacteus milk-clotting enzyme / // Agr. Biol. Chem, 1988. - Vol. 52, № 5. - P. 1277-1278. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Живильне середовище для культивування штаму С-06 Irpex lacteus Fr. - продуцента молокозсідального ферменту, на основі компонентів - сахарози пептону, KН2РО4, K2НРО4, MgSO4 × 7H2O, CaCl2, ZnSO4 × 7H2O, дистильованої води до 1 л, яке відрізняється тим, що наступні компоненти сахарозу, пептон, MgSO4 × 7H2O, СаС12, KН2РО4, K2НРО4, ZnSO4 × 7H2O, дистильовану воду беруть при наступному співвідношенні, г/л: сахароза 15,5 пептон 6 MgSO4 × 7H2O 0,6 СаСl2 0,06 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 ZnSO4 × 7H2O 0,001 дистильована вода (решта) 1 л. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3