Спосіб визначення рівня іммобілізації олігонуклеотидів на поверхні наночастинок золота

Реферат: Спосіб визначення рівня іммобілізації олігонуклеотидів на поверхні наночастинок золота, який включає в себе процедуру іммобілізації на поверхні наночастинок золота олігонуклеотидів, що містять ковалентно приєднану флуоресцентну мітку, центрифугування суміші наночастинок золота та олігонуклеотидів протягом 20 хв при 13400 об./хв, вимірювання за допомогою спектрофлуорометра рівня флуоресценції вихідного розчину олігонуклеотидів, отриманого супернатанту та стандартних розчинів олігонуклеотидів різної концентрації, побудову калібрувального графіка, визначення за допомогою калібрувального графіка та за результатами показників спектрофлуорометра кількості олігонуклеотидів, іммобілізованих на поверхні наночастинок золота, яка визначається як різниця між концентраціями олігонуклеотидів вихідного розчину та отриманого супернатанту, визначення величини середньої кількості олігонуклеотидів, іммобілізованих на поверхні однієї наночастинки шляхом ділення визначеної молярної концентрації іммобілізованих олігонуклеотидів на молярну концентрацію наночастинок золота, визначення величини поверхневої густини іммобілізації олігонуклеотидів шляхом ділення величини середньої кількості олігонуклеотидів, іммобілізованих на поверхні однієї наночастинки, на середню площу поверхні наночастинки. UA 93555 U (12) UA 93555 U UA 93555 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, біофізики, аналітичної біохімії та медицини, а більш конкретно до способу визначення рівня іммобілізації олігонуклеотидів на поверхні наночастинок золота і може бути використана з метою створення нанобіосенсорних систем для вивчення міжмолекулярних взаємодій та детектування біологічно активних речовин, а також при створенні нанокомпозитних гібридних матеріалів для опто- і мікроелектроніки. У порівнянні з макроскопічним золотом наночастинки золота демонструють унікальні фізикохімічні властивості, пов'язані зі значно більшим співвідношенням між їхніми поверхнею та об'ємом і, відповідно, значно вищою поверхневою концентрацією вільних електронів [1-3]. При взаємодії приповерхневих електронів наночастинок золота з електромагнітними хвилями виникають особливі коливання цих електронів, що отримало назву явища локалізованого поверхневого плазмонного резонансу. В залежності від довжини хвилі та параметрів наночастинок (їх розміру, форми, хімічного складу) світло розсіюється і/або поглинається [4]. Наночастинки золота мають винятково високі коефіцієнти оптичного поглинання, що дозволяє розробку методів оптичного детектування зі значно більш високою чутливістю у порівнянні зі звичайними барвниками. Колоїдний розчин наночастинок золота показує інтенсивний пік поглинання в районі 520 нм, пов'язаний з явищем локалізованого поверхневого плазмонного резонансу. Форма і положення цього піка є чутливими до змін навколишнього середовища. Якщо такі зміни викликають, наприклад, агрегацію наночастинок золота, то завдяки взаємодії поверхневих плазмонів наночастинок, що зближуються, відбувається розширення плазмонної смуги при значному її зміщенні у довгохвильову (червону) частину спектра [5, 6]. Через значну поверхневу енергію наночастинки золота є агрегативно нестійкими [7], тому їх необхідно стабілізувати іонами. Наприклад, цитрат-іонами, які адсорбуються на поверхні наночастинок золота під час процедури їх приготування, і завдяки електростатичному відштовхуванню не дозволяють вандерваальсівським силам зблизити наночастинки і викликати їх агрегацію [8]. Зміна кольору при агрегації наночастинок золота призводить до їх застосування для колориметричного зондування досліджуваної речовини, що прямо або опосередковано викликає агрегацію наночастинок золота [9, 10]. Селективність біосенсорного відгуку забезпечується такими біомакромолекулами, що вибірково взаємодіють з відповідними молекулами-партнерами. Тому створення біоселективного шару біомакромолекул на поверхні наночастинок золота і можливість контролювати їх поверхневу густину є ключовою стадією розробки нанобіосенсорних систем. Відомий спосіб визначення рівня іммобілізації олігонуклеотидів на поверхні наночастинок золота шляхом витіснення олігонуклеотидів, що містять ковалентно приєднану флуоресцентну мітку, з поверхні наночастинок і подальше визначення їх кількості в розчині [11]. В даному способі до наночастинок золота, модифікованих олігонуклеотидами, що містять ковалентно приєднану флуоресцентну мітку, додавали 2-меркаптоетанол до кінцевої концентрації 12 мМ. Після 18 годин перемішування при кімнатній температурі, розчин олігонуклеотидів, що були відокремлені від наночастинок золота витісненням 2-меркаптоетанолом, відділяли від наночастинок золота центрифугуванням. Аліквоти супернатанта розбавляли в 2 рази додаванням 0,3 М PBS, рН 7, щоб величина рН та іонна сила зразка та калібрувальних стандартних розчинів була однаковою. Інтенсивність флуоресценції за допомогою калібрувальної кривої перетворювали в молярну концентрацію олігонуклеотидів. Середнє число олігонуклеотидів на одну наночастинку було отримано діленням виміряної молярної концентрації олігонуклеотидів на молярну концентрацію наночастинок золота. Основним недоліком описаного вище методу є невизначеність ефективності витіснення попередньо іммобілізованих олігонуклеотидів з поверхні наночастинок золота. Це ставить під сумнів можливість більш-менш точного розрахунку поверхневої густини олігонуклеотидів. Крім того, описаний вище метод не є швидким і використовує токсичний і небезпечний для довкілля реагент 2-меркаптоетанол, роботу з яким можна проводити тільки в спеціально обладнаних приміщеннях та з використанням індивідуальних засобів захисту. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити такий спосіб визначення рівня іммобілізації олігонуклеотидів на поверхні наночастинок золота, який дозволяв би надійно визначати кількість іммобілізованого матеріалу та не використовував би токсичні реагенти. Поставлена задача вирішується запропонованим способом визначення рівня іммобілізації олігонуклеотидів на поверхні наночастинок золота, який відповідно до пропозиції, відрізняється тим, що включає в себе процедуру іммобілізації на поверхні наночастинок золота олігонуклеотидів, що містять ковалентно приєднану флуоресцентну мітку, центрифугування суміші наночастинок золота та олігонуклеотидів протягом 20 хв при 13400 об/хв, вимірювання за допомогою спектрофлуорометра рівня флуоресценції вихідного розчину олігонуклеотидів, 1 UA 93555 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 отриманого супернатанту та стандартних розчинів олігонуклеотидів різної концентрації, побудову калібрувального графіку, визначення за допомогою калібрувального графіка та за результатами показників спектрофлуорометра кількості олігонуклеотидів, іммобілізованих на поверхні наночастинок золота, яка визначається як різниця між концентраціями олігонуклеотидів вихідного розчину та отриманого супернатанту, визначення величини середньої кількості олігонуклеотидів, іммобілізованих на поверхні однієї наночастинки шляхом ділення визначеної молярної концентрації іммобілізованих олігонуклеотидів на молярну концентрацію наночастинок золота, визначення величини поверхневої густини іммобілізації олігонуклеотидів шляхом ділення величини середньої кількості олігонуклеотидів, іммобілізованих на поверхні однієї наночастинки на середню площу поверхні наночастинки. Приклади конкретного виконання способу. Приклад 1. Водний розчин 3,25 нМ наночастинок золота, стабілізованих цитрат-іонами, змішували з 10 нМ Р2-Су3 [олігонуклеотиди тіольовані на 5'-кінці та модифіковані флуоресцентною міткою Су3 на 3'-кінці: SH-(CH2)6-ACCCACAAGCGCCGACTGTTG-Cy3] та інкубували цю суміш протягом 1 години в 1,5 мМ цитрату натрію та 15 мМ NaCl при кімнатній температурі в пластикових пробірках Eppendorf об'ємом 0,6 мл. Після інкубування суміш центрифугували протягом 20 хв при 13400 об./хв для осадження наночастинок золота з іммобілізованими на їх поверхні олігонуклеотидами. При цьому в супернатанті залишалися тільки вільні (неіммобілізовані) олігонуклеотиди. Рівень флуоресценції відповідних розчинів визначали за допомогою універсального скануючого спектрофлуорометра "VICTOR3™ 1420" протягом 0,1 с на довжині хвилі 535 нм при довжині хвилі збудження 485 нм. За показниками спектрофлуорометра щодо рівня флуоресценції стандартних розчинів олігонуклеотидів різної концентрації побудовали калібрувальний графік залежності між концентрацією флуоресцентно мічених олігонуклеотидів Р2-Су3 та рівнем їхньої флуоресценції (Фіг. 1). За показниками спектрофлуорометра щодо рівня флуоресценції вихідного розчину олігонуклеотидів (10 нМ Р2-Су3) та супернатанту, отриманого в результаті центрифугування, розрахували різницю між ними (Фіг. 2). Ця різниця визначила концентрацію іммобілізованих олігонуклеотидів, а саме 7,7 нМ, що дорівнювала 2,4 молекули Р2-Су3 на одну наночастинку. 9 Поверхнева густина іммобілізації олігонуклеотидів складала 4,5 10 молекул/мм. Приклад 2. Водний розчин 3,25 нМ наночастинок золота, стабілізованих цитрат-іонами, змішували з 50 нМ Р2-Су3 [олігонуклеотиди тіольовані на 5'-кінці та модифіковані флуоресцентною міткою Су3 на 3'-кінці: SH-(CH2)6-ACCCACAAGCGCCGACTGTTG-Cy3] та інкубували цю суміш протягом 1 години в 1,5 мМ цитрату натрію та 15 мМ NaCl при кімнатній температурі в пластикових пробірках Eppendorf об'ємом 0,6 мл. Після інкубування суміш центрифугували протягом 20 хв при 13400 об/хв для осадження наночастинок золота з іммобілізованими на їх поверхні олігонуклеотидами. При цьому в супернатанті залишалися тільки вільні (неіммобілізовані) олігонуклеотиди. Рівень флуоресценції відповідних розчинів визначали за допомогою універсального скануючого спектрофлуориметра "VICTOR3™ 1420" протягом 0,1 с на довжині хвилі 535 нм при довжині хвилі збудження 485 нм. За показниками спектрофлуорометра щодо рівня флуоресценції стандартних розчинів олігонуклеотидів різної концентрації побудували калібрувальний графік (Фіг. 1). За показниками спектрофлуорометра щодо рівня флуоресценції вихідного розчину олігонуклеотидів (50 нМ Р2-Су3) та супернатанту, отриманого в результаті центрифугування, розрахували різницю між ними (Фіг. 3). Ця різниця визначила концентрацію іммобілізованих олігонуклеотидів, а саме 43,8 нМ, що дорівнювала 13,5 молекули Р2-Су3 на одну наночастинку 10 2 золота. Поверхнева густина іммобілізації олігонуклеотидів складала 2,5 10 молекул/мм . Отже, надійність розробленого метода полягає в тому, що він не спирається на припущення про повне витіснення іммобілізованих олігонуклеотидів з поверхні наночастинок золота, як це має місце у відомому методі [11], а базується на визначенні однозначної різниці між рівнем флуоресценції вихідного розчину та рівнем флуоресценції у супернатанті. Запропонований спосіб визначення рівня іммобілізації олігонуклеотидів на поверхні наночастинок золота є більш простим у порівнянні з відомим методом [11], тому що включає в себе менше стадій. Він здійснюється протягом приблизно 1 години, тоді як виконання відомого методу [11] потребує не менше 18 годин, тобто запропонований спосіб є більш швидким. Запропонований спосіб може використовуватися на доступному обладнанні і без використання токсичних реактивів та дозволяє контролювати поверхневу густину іммобілізованих олігонуклеотидів на наночастинок золота, що несуть на собі від 1-2 олігонуклеотидів на наночастинку до величин, що наближуються до теоретично можливого максимально заповненого моношару олігонуклеотидів. Джерела інформації: 2 UA 93555 U 5 10 15 20 25 1. Thaxton C.S., Georganopoulou D.G., Mirkin С.A. Gold nanoparticle probes for the detection of nucleic acid targets. Clin. Chim. Acta, 2006, 363 (1-2), 120-126. 2. Jain K.K. Applications of nanobiotechnology in clinical diagnostics. Clin. Chem., 2007, 53 (11), 2002-2009. 3. Baptista P., Pereira E., Eaton P. et al. Gold nanoparticles for the development of clinical diagnosis methods. Anal. Bioanal. Chem. 2008, 391 (3), 943-950. 4. Jain P.K., Lee K.S., Ш-Sayed I.H., El-Sayed M.A. Calculated absorption and scattering properties of gold nanoparticles of diferent size, shape, and composition: applications in biological imaging and biomedicine. J. Phys. Chem. В., 2006, 110 (14), 7238-7248. 5. Xiao Q., Gao H., Lu C, Yuan Q., Gold nanoparticle-based optical probes for sensing aminothiols Trends in Analytical Chemistry, Vol. 40, 2012 64-76. 6. Agasti S.S., Rana S., Park M.-H., Kim C.K.,. You C.-C, Rotello V.M. Nanoparticles for detection and diagnosis, Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (2010) 316-328. 7. Yu L. and Andriola A. Quantitative gold nanoparticle analysis methods: A review. Talanta 82, Issue 3, 2010, 869-875. 8. Li H. and Rothberg L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. PNAS USA 2004, 101, no. 39, 14036-14039. 9. Baptista P., Pereira E., Eaton P., Doria G., Miranda A., Gomes I., Quaresma P., Franco R. Gold nanoparticles for the development of clinical diagnosis methods. Anal. Bioanal. Chem. 391 (2008) 943-950. 10. Perez-Lopez В., Merkoci A. Nanoparticles for the development of improved (bio) sensing systemsAnal. Bioanal. Chem. 399 (2011) 1577-1590.]. 11. Demers L.M., Mirkin С A., Mucic R.C., Reynolds R.A., Letsinger R.L., Elghanian R., Viswanadham G. A fluorescence-based method for determining the surface coverage and hybridization efficiency of thiol-capped oligonucleotides bound to gold thin films and nanoparticles.// Anal. Chem. 2000, 72, № 22, 5535-5541. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 40 Спосіб визначення рівня іммобілізації олігонуклеотидів на поверхні наночастинок золота, який відрізняється тим, що включає в себе процедуру іммобілізації на поверхні наночастинок золота олігонуклеотидів, що містять ковалентно приєднану флуоресцентну мітку, центрифугування суміші наночастинок золота та олігонуклеотидів протягом 20 хв при 13400 об./хв, вимірювання за допомогою спектрофлуорометра рівня флуоресценції вихідного розчину олігонуклеотидів, отриманого супернатанту та стандартних розчинів олігонуклеотидів різної концентрації, побудову калібрувального графіка, визначення за допомогою калібрувального графіка та за результатами показників спектрофлуорометра кількості олігонуклеотидів, іммобілізованих на поверхні наночастинок золота, яка визначається як різниця між концентраціями олігонуклеотидів вихідного розчину та отриманого супернатанту, визначення величини середньої кількості олігонуклеотидів, іммобілізованих на поверхні однієї наночастинки шляхом ділення визначеної молярної концентрації іммобілізованих олігонуклеотидів на молярну концентрацію наночастинок золота, визначення величини поверхневої густини іммобілізації олігонуклеотидів шляхом ділення величини середньої кількості олігонуклеотидів, іммобілізованих на поверхні однієї наночастинки, на середню площу поверхні наночастинки. 3 UA 93555 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4