Комбінація антагоніста pd-1 та потенціюючого агента для стимулювання т-клітинної відповіді

Реферат: Описані способи лікування раку й інфекційних захворювань із застосуванням схеми лікування, що включає себе введення сполуки, яка зменшує передачу інгібіторного сигналу в Т-клітини, в UA 106050 C2 (12) UA 106050 C2 поєднанні з потенціювальним агентом, як-от циклофосфамід, для отримання ефективних Тклітинно-опосередкованих відповідей. Також розкриті композиції, що включають у себе антагоністи PD-1 та потенціювальні агенти, застосовні в способах за винаходом. UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дана заявка посилається на пріоритет попередніх заявок США № 61/211697, зареєстрованої 2 квітня 2009, 61/091694, зареєстрованої 25 серпня 2008, 61/091709 зареєстрованої 25 серпня 2008, і 61/091705 зареєстрованої 25 серпня 2008, розкриття яких включені за допомогою посилання в даному описі в усій повноті. Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується терапевтичних композицій, що містять сполуку, яка перешкоджає передачі інгібіторного сигналу на Т-клітини в комбінації з потенціювальними агентами, і застосування вказаних компонентів разом або окремо для індукції Т-клітинних відповідей, важливих для лікування захворювання. Рівень техніки винаходу Відповідь Т-лімфоцитів на хворобливі стани, такі як інфекція й хронічні захворювання, подібні до раку, є складною й включає міжклітинні взаємодії і продукцію розчинних медіаторів (називаних цитокінами або лімфокінами). Активація Т-клітин зазвичай залежить від антигенспецифічного сигналу в результаті контакту Т-клітинного рецептора (TCR) з антигенним пептидом, представленим за допомогою головного комплексу гістосумісності (MHC), тоді як міра вказаної реакції контролюється позитивними й негативними незалежними сигналами, що випускаються низкою костимуляторних молекул. Вказані молекули зазвичай є членами сімейства CD28/B7. Навпаки, білок програмованої загибелі клітин-1 (PD-1) є членом сімейства рецепторів CD28, який передає негативну імунну відповідь, коли він індукований, на Т-клітини. Контакт між PD-1 і одним з його лігандів (B7-H1 або B7-DC) індукує інгібіторну відповідь, яка зменшує розмноження Т-клітин і силу і тривалість Т-клітинної відповіді. Таким чином, Т-лімфоцитарна відповідь регулюється різними чинниками, що включають молекули клітинної поверхні, які працюють як рецептори, де рецептори включають комплекс TCR, а також інші молекули клітинної поверхні. В цілому, антигенспецифічна Т-клітинна відповідь опосередкується двома сигналами: 1) взаємодія TCR з антигенним пептидом, представленим в оточенні HC (сигнал 1), і 2) другий антигеннезалежний сигнал, передаваний за допомогою контакту між різними парами рецептор/ліганд (сигнал 2). Вказаний "другий сигнал" є критичним для визначення типу Тклітинної відповіді (активація або толерантність), а також для сили й тривалості вказаної відповіді, й регулюється позитивними й негативними сигналами від костимуляторних молекул, таких як сімейство білків B7. Найдетальніше охарактеризованим T-клітинним шляхом є B7-CD28, в якому B7-1 (CD80) і B7-2 (CD86), кожен, можуть залучати стимулюючий рецептор CD28 та інгібуючий рецептор CTLA-4 (CD152). У поєднанні з передачею сигналу за допомогою Т-клітинного рецептора, зв'язування CD28 збільшує антигенспецифічну проліферацію Т-клітини, збільшує продукцію цитокінів, стимулює диференціювання й ефекторну функцію, й сприяє виживаності Т-клітини (Lenshow, et al., Annu. Rev. Immunоl., 14:233-258 (1996); Chambers і Allison, Curr. Opin. Immunоl., 9:396-404 (1997); і Rathmell і Thompson, Annu. Rev. Immunol., 17:781-828 (1999)). Навпаки, вважають, що передача сигналу через CTLA-4 служить для передачі негативного сигналу, який інгібує T-клітинну проліферацію, продукцію IL-2 і розвиток клітинного циклу (Krummel і Allison, J. Exp. Med., 183:2533-2540 (1996); і Walunas, et al., J. Exp. Med., 183:2541-2550 (1996)). Інші члени сімейства B7 костимуляторних молекул включають B7-H1 (Dong, et al., Nature Med., 5:1365-1369 (1999); і Freeman, et al., J. Exp. Med., 192:1-9 (2000)), B7-DC (Tseng, et al., J. Exp. Med., 193:839846 (2001); і Latchman, et al., Nature Immunol., 2:261-268 (2001) ), B7-H2 (Wang, et al., Blood, 96:2808-2813 (2000); Swallow, et al., Iммunity, 11:423-432 (1999); і Yoshinaga, et al., Nature, 402:827-832 (I999)), B7-H3 (Chapoval, et al., Nature Immunоl., 2:269-274 (2001)) і B7-H4 (Choi, et al., J. Immunol., 171:4650-4654 (2003); Sica, et al., Immunity, 18:849-861 (2003); Prasad, et al., Immunity, 18:863-873 (2003); і Zang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100:10388-10392 (2003)). B7-H5 (описаний у WO 2006/012232) є нещодавно відкритим членом сімейства B7. Молекули сімейства B7 мають мембранний проксимальний домен і мембранний дистальний домен IGV (варіабельний) IGC (константний). Сімейство CD28-подібних рецепторів указаних лігандів має загальний позаклітинний IgV-подібний домен. Взаємодії пар рецептор-ліганд опосередкують, головним чином, через залишки IgV-доменів лігандів і рецепторів (Schwartz, et al., Nature Immunоl., 3:427-434 (2002)). В цілому, IgV-домени, описують як такі, що містять два аркуші, кожен з яких містить шар β-тяжів (Williams і Barclay, Annu. Rev. Immunol., 6:381-405 (1988)). Передній і задній аркуші CTLA-4 містять ланцюги A'GFC'C і ABEDC, відповідно (Ostrov, et al., Science, 290:816-819 (2000)), тоді як передній і задній аркуші IgV-доменів B7 утворені з ланцюгів AGFCCC» і BED, відповідно (Schwartz, et al., Nature, 410:604-608 (2001); Stamper, et al., Nature, 410:608-611 (2001); і Ikemizu, et al., Immunity, 12:51-60 (2000)). Кристалографічний аналіз показав, що поверхня зв'язування CTLA-4/B7 має вирішальну роль при взаємодії CDR3 1 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аналогічної петлі CTLA-4, що складається з мотиву MYPPPY, з поверхнею B7, утвореною переважно ланцюгами G, F, C, C" і C" (Schwartz, et al., Nature, 410:604-608 (2001); і Stamper, et al., Nature, 410:608-611 (2001)). Дані, отримані на основі амінокислотної гомології, мінливості й комп'ютерного моделювання, підтверджують концепцію, що вказаний мотив також є головним B7-зв'язуючим сайтом для CD28 (Bajorath, et al., J. MOI. Graph. Model., 15:135-139 (1997)). Хоча мотив MYPPPY не є консервативним в ICOS, досліджений рецептор B7-H2 показав, що родинний мотив, що містить послідовність FDPPPF і розташований в аналогічному положенні, є головною детермінантою для зв'язування ICOS з B7-H2 (Wand, et al., J. Exp. Med., 195:10331041 (2002)). B7-DC (називаний також PD-L2 або CD273) є відносно новим членом сімейства B7, і має амінокислотну послідовність, яка приблизно на 34 % ідентична послідовності B7-H1 (званого також PD-L1). Ортологи B7-DC людини й миші характеризуються приблизно 70 %-ною ідентичністю за амінокислотною послідовністю. Попри те, що транскрипти B7-H1 і B7-DC виявлені в різних тканинах (Dong, et al., Nature Med., 5:1365-1369 (1999); Latchman, et al., Nature Immunol., 2:261-268 (2001); і Tamura, Blood, 97:1809-1816 (2001)), профілі експресії білків абсолютно різні. B7-H1 широко експресуються на багатьох типах тканин і клітин, тоді як експресія B7-DC обмежується, головним чином, активованими дендритними клітинами (DC) і макрофагами. Показано, що B7-H1 і B7-DC зв'язуються з PD-1 (Freeman, et al., J. Exp. Med., 192:1027-1034 (2000)), віддаленим членом сімейства CD28 з імунорецепторним тирозиновим інгібуючим мотивом (ITIM) у цитоплазматичному домені (Ishida, et al., EMBO J., 11:3887-3895 (1992)). PD-1, член сімейства рецепторів CD28, індукований експресується на активованих Т-клітинах, Bклітинах, натуральних кілерних (NK) клітинах, моноцитах, DC і макрофагах (Keir, et al Curr. Opin. Immunol. 19:309-314 (2007)). Основним результатом зв'язування PD-1 з його лігандами є інгібування передачі сигналу після Т-клітинного рецептора (TCR). Отже, сигнальна трансдукція за допомогою PD-1 зазвичай надає супресивний або інгібіторний сигнал Т-клітині, що приводить до зменшення T-клітинної проліферації або іншого зменшення T-клітинної активації. B7-H1 є основним лігандом PD-1, що викликає передачу інгібіторного сигналу в Т-клітини. Даний винахід вирішує проблему небажаного T-клітинного інгібування за допомогою надання агентів, які зв'язуються з PD-1 і, таким чином, запобігають передачі інгібіторного сигналу, або інакше зв'язуються з лігандами PD-1, такими як B7-H1, тим самим, запобігаючи зв'язуванню ліганду з PD-1 для передачі інгібіторного сигналу. І в тому і в іншому випадку стимулюються Т-клітинні відповіді, такі як Tклітинна проліферація або активація. B7-H1 є головним лігандом PD-1, ймовірно унаслідок його ширшого поширення й вищих рівнів експресії. Інгібування PD-1 відбувається, лише якщо PD-1 і TCR тісно зв'язані один з одним в контексті імунного синапсу. PD-1 і його ліганди були предметом обговорення декількох оглядових статей. Підвищена експресія B7-H1 також спостерігається при багатьох видах раку (включаючи рак молочної залози, колоректальний рак, рак стравоходу, рак шлунку, гліому, лейкемію, рак легенів, меланому, множинну мієлому, рак яєчників, рак підшлункової залози, нирковоклітинну карциному й рак уротелію), і пов'язана з несприятливим прогнозом. B7-H1 експресується багатьма лініями пухлинних клітин, особливо після стимуляції інтерфероном гамма (IFN-г), і також активується на інфільтруючих пухлину мієлоїд-залежних супресорних клітинах (MDSC). Наприклад, PD-1 активується на специфічних для пухлини Т-клітинах CD8 і асоціюється з функціональною недостатністю, анергією, виснаженням і апоптозом. Підвищення експресії PD-1 також асоційовано з дисфункціональними й супресивними фенотипами додаткових типів клітин, таких як регуляторні Т-клітини (Treg) і натуральні кілерні T-клітини (NKT). Даний винахід використовує вказані молекулярні функції шляхом надання схем лікування захворювань за допомогою збільшення T-клітинної активності, зокрема лікування раку й інфекційних захворювань. Суть винаходу У одному аспекті даний винахід відноситься до способу збільшення Т-клітинних відповідей, наприклад, на антиген, у ссавця, який потребує такого збільшення, що включає введення вказаному ссавцеві сполуки, яка зменшує передачу інгібіторного сигналу в імунні клітини, особливо в Т-клітини, і потенціювального агента, де вказана схема лікування є ефективною для збільшення Т-клітинної відповіді в указаного ссавця. Сполуки, застосовні в схемі лікування винаходу, включають сполуки, які зв'язуються й блокують рецептори PD-1 на Т-клітинах без ініціації передачі інгібіторного сигналу, сполуки, які зв'язуються з лігандами PD-1 для запобігання їх зв'язуванню з PD-1, сполуки, які виконують обидві вказані функції, й сполуки, які запобігають експресії генів, які кодують або PD-1, або 2 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 природні ліганди PD-1. Вказані сполуки позначають в описі як "антагоністи PD-1». Сполуки, які зв'язуються з природними лігандами PD-1, включають сам PD-1, а також активні фрагменти PD1, і в разі ліганду B7-H1 білки й фрагменти B7.1. Вказані антагоністи включають білки, антитіла, антисмислові молекули й невеликі органічні сполуки. В переважному втіленні вказана Тклітинна відповідь перевищує відповідь, вироблювану окремо вказаним антагоністом PD-1 або вказаним потенціювальним агентом, коли один з них вводять без іншого. В іншому варіанті здійснення винаходу сполуками, використовуваними в способах винаходу, є сполуки, які зв'язуються з молекулами Т-клітинної поверхні, такими як CTLA4, щоб запобігти інгібіторним сигналам, запущеним за допомогою зв'язування їх природних лігандів, або сполуки, які зв'язуються з вказаними природними лігандами. Такі антагоністи включають білки, антитіла, антисмислові молекули й малі органічні молекули. У загальному варіанті здійснення винаходу сполуки, вживані у схемах лікування і композиціях даного винаходу, включають сполуки, які зв'язуються з PD-1 без ініціації, індукції, збільшення, полегшення й/або дозволу співзв'язування PD-1 з TCR. Переважні сполуки, які запобігають передачі інгібіторного сигналу через PD-1 і, таким чином, діють як антагоністи PD-1 включають у себе, але без обмеження, поліпептиди B7-DC, особливо їх розчинні частини, що містять їх активні фрагменти, їх варіанти і гомологи, а також гібридні білки, що включають будь-яке з вищепереліченого, які зв'язуються з PD-1 без ініціації передачі інгібіторного сигналу. В переважних втіленнях B7-DC включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, 2, 3 або 4. Переважними є сполуки, що включають розчинний домен B7-DC (тобто, без трансмембранної послідовності). Відповідні фрагменти поліпептидів B7-DC включають фрагменти, що містять домени IGV і/або IGC або фрагменти, що містять лише домен IGV, причому домен IGV є переважним втіленням і амінокислоти 20-121 SEQ ID NO: 1 є переважним прикладом домену IGV. Переважні антагоністи PD-1 також включають, але без обмеження активні фрагменти природних лігандів PD-1, такі як поліпептиди B7-H1 (розкриті в патенті США No. 6803192, який включений в опис у всій повноті за допомогою посилання), особливо їх розчинні частини, включаючи їх варіанти й гомологи, а також гібридні білки, що включають будь-яке із згаданого вище, які зв'язуються з PD-1 без ініціації передачі інгібіторного сигналу. Переважні сполуки винаходу також включають, але без обмеження, сполуки, включаючи їх активні фрагменти, варіанти і гомологи, які зв'язуються з природними лігандами PD-1, наприклад, фрагменти B7-1, які зв'язуються з B7-H1, а також гібридні білки, що містять будь-яке з вищепереліченого, які зв'язуються з лігандами PD-1 для запобігання їх зв'язуванню з PD-1 з ініціацією передачі інгібіторного сигналу. В іншому втіленні композиції й способи їх застосування включають комбінацію антагоніста рецептора PD-1, який зв'язується з рецептором PD-1 і блокує його, і окремий антагоніст рецептора PD-1, який зв'язується з лігандами рецептора PD-1 і блокує їх. Інше втілення даного винаходу представляє антагоністи рецептора PD-1, які зв'язуються з рецептором PD-1 без ініціації передачі інгібіторного сигналу через рецептор PD-1 і також мають здатність зв'язуватися і виступати як антагоністи лігандів рецептора PD-1, таких як B7-H1, які інакше ініціювали б передачу інгібіторного сигналу через рецептор PD-1. Інші передбачені антагоністи рецептора PD-1 включають біспецифічні антитіла, які можуть зв'язуватися як з рецептором PD1, так і з лігандами рецептора PD-1. Переважні втілення сполук, уживаних в даному винаході, також включають антитіла, які зв'язуються з PD-1 або CTLA4, тим самим, зменшуючи або припиняючи передачу інгібіторного сигналу, опосередкованого вказаними джерелами. Переважні сполуки для застосування в способах винаходу також включають, але без обмеження, активні фрагменти лігандів CTLA4 (такі як B7-1 і B7-2), які зв'язуються з CTLA4, для зменшення подальших інгібіторних сигналів, але не зв'язуються з CD28 або інакше вони інгібуватимуть позитивну сигнальну трансдукцію, передавану за допомогою CD28. Переважні сполуки, які запобігають передачі інгібіторного сигналу через PD-1 і, таким чином, діють як антагоністи PD-1 включають, але без обмеження, антагоністи B7-DC, особливо їх розчинні частини, включаючи їх активні фрагменти, їх варіанти і гомологи, а також гібридні білки, що включають будь-яке з вищепереліченого, які зв'язуються з B7-DC. У одному варіанті здійснення поліпептиди B7-DC, їх фрагменти або варіанти сполучають з іншими поліпептидами з утворенням гібридних білків, які антагіністично взаємодіють з рецептором PD-1 шляхом зв'язування з рецептором PD-1, не викликаючи передачі інгібіторного сигналу через PD-1, тим самим зменшуючи або перешкоджаючи зв'язуванню ліганду з PD-1, особливо зв'язуванню B7-H1, і перешкоджаючи таким чином передачі інгібіторного сигналу через рецептор PD-1. Прикладами вказаних гібридних білків є поліпептиди, що містять 3 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 9, 10, 12 або 13, а також їх гомологи. В одному переважному варіанті здійснення, весь або частина позаклітинного домену (ECD) B7-DC є частиною гібридного білка, в якому вказана частина сполучена з другим поліпептидом, що містить Fc-частину імуноглобуліну. Переважним прикладом вказаного білка є B7-DC-Ig, особливо в тих випадках, коли вказана структура є частиною гомодимеру, в якому дві молекули B7-DC-Ig сполучено один з одним, наприклад, за допомогою дисульфідного зв'язку. У конкретних втіленнях фрагменти, використовувані в сполуках винаходу складаються щонайменше з 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200 або більш розташованих рядом амінокислот поліпептиду, що має бажану антагоністичну активність. Вказані фрагменти зазвичай також є частиною гібридних білків, призначених для застосування у винаході. У іншому аспекті даний винахід відноситься до способу збільшення Т-клітинних відповідей у ссавця, який цього потребує, що включає введення вказаному ссавцеві ефективної схеми лікування, що містить антитіло анти-PD-1 і потенціювальний агент, де вказана схема лікування є ефективною для збільшення Т-клітинного відповіді в указаного ссавця. У іншому аспекті даний винахід відноситься до способу збільшення Т-клітинних відповідей у ссавця, який цього потребує, що включає призначення вказаному ссавцеві ефективної схеми лікування, що включає імуномодулятор і потенціювальний агент, де вказана схема лікування є ефективною для збільшення Т-клітинної відповіді в указаного ссавця. Вказані імуномодулятори включають молекули, які є антагоністами інших рецепторів сімейства CD28 (наприклад, CTLA4), які інгібують Т-клітинні відповіді. У переважному варіанті здійснення використовують антитіло анти-CTLA4 і потенціювальний агент. Додаткові імуномодулятори включають: молекули, які є антагоністами рецепторів сімейства CD28 (такі як CD28 і ICOS), які активують Т-клітинні відповіді; молекули, які є антагоністами лігандів сімейства B7 (такі як B7-H1, B7-DC, B7-H4), які інгібують Т-клітинні відповіді; й молекули, які є антагоністами лігандів сімейства B7 (такі як B7.1 і B7.2), які активують Т-клітинні відповіді. У додаткових втіленнях будь-якого зі способів винаходу, схема лікування сполукою антагоніста PD-1 і потенціювальним агентом далі включає щонайменше один додатковий терапевтичний агент. Передбачені додаткові терапевтичні агенти включають імуномодулювальні агенти. Типові імуномодулювальні агенти для вказаних способів включають антитіла анти-PD-1 і анти-CTLA4. У одному варіанті здійснення потенціювальний агент вибраний з циклофосфаміду й аналогів циклофосфаміду, сунітинібу (сутент), анти-TGFβ й іматинібу (глівак), інгібітору мітозу, такого як паклітаксел, інгібітору ароматази, такого як летрозол, антагоніста аденозинового рецептора A2a (A2AR), інгібітору ангіогенезу, антрацикліни, оксаліплатин, доксорубіцин, антагоністів TLR4 і антагоністів IL-18. Деякі з указаних агентів зменшують кількість Treg (тобто, регуляторних Tлімфоцитів або T-reg) в мікрооточенні пухлини. В іншому варіанті здійснення способи й композиції винаходу розглядають, зокрема, застосування відповідного ад'юванта як частина вказаного способу і композиції. Відповідно до винаходу Т-клітини можуть контактувати з антагоністом рецептора PD-1 і з його композиціями, що містять потенціювальний агент in vitro, ex vivo або in vivo. Контакт Тклітин із застосуванням антагоністів рецептора PD-1 і їх композицій, що містять потенціювальний агент, може відбуватися до, під час або після активації T-клітини. У конкретному варіанті здійснення молекулу, яка запобігає або зменшує передачу інгібіторного сигналу через PD-1, і потенціювальний агент вводять у різні моменти часу, наприклад, коли потенціювальний агент вводять перед уведенням антагоніста PD-1. Вказане введення може відбуватися в поєднанні з уведенням додаткового терапевтичного агента. У конкретних втіленнях будь-якого зі способів винаходу схема лікування включає введення потенціювального агента щонайменше за 1 годину, або щонайменше за 2 години, або щонайменше за 3 години, або щонайменше за 5 годин, або щонайменше за 10 годин, або щонайменше за 15 годин, або щонайменше за 20 годин, або щонайменше за 24 години, або щонайменше за 30 годин або ще більше до введення будь-якого одного або всіх з числа антагоніста PD-1, антитіла анти-PD-1, антитіла анти-CTLA4 і додаткових терапевтичних агентів. Введення потенціювального агента може також відбуватися після введення одного або всіх сполук з числа антагоніста PD-1, антитіла анти-PD-1, антитіла анти-CTLA4 і додаткових терапевтичних агентів, наприклад, не більше, ніж через 1 годину, 2 години, 3 години, 5 години, 10 години, 15 години, 20 години, 24 години або аж до 30 годин після введення антагоніста PD-1, або може відбуватися в поєднанні з введенням антагоніста PD-1. Підвищена Т-клітинна відповідь, отримана в результаті способів винаходу, є достатньою для лікування захворювання, що включає один або більш за види раку, вірусну інфекцію, бактерійну інфекцію й паразитарну інфекцію. При цьому захворюванням є рак, указаним раком є один вид 4 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 раку або більше, вибраний з раку сечового міхура, раку мозку, раку молочної залози, раку шийки матки, раку прямої кишки, раку стравоходу, раку нирок, раку печінки, раку легенів, раку носоглотки, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, раку шкіри, раку шлунку, раку матки, раку яєчників, раку яєчка або гематологічного раку. У іншому аспекті даний винахід включає композиції антагоністів, вживаних у способах винаходу, у фармацевтично прийнятному носієві, і де вказана молекула, зв'язуюча PD-1, і вказаний потенціювальний агент, представлені кожен у кількості оптимальній, щоб викликати підвищену T-клітинну стимуляцію. В одному переважному варіанті здійснення винахід включає медичні набори, що містять контейнери для зберігання одного або більш агентів для застосування у винаході разом з фармацевтичними носіями для їх розведення й інструкціями із застосування. Крім того, вказані антагоніст рецептора PD-1 і потенціювальний агент можуть бути представлені у вигляді компонентів в одному контейнері у фармацевтично прийнятному носієві, якщо вказані компоненти є компонентами, які потрібно ввести одночасно. Короткий опис фігур На фігурі 1 показано, що B7-DC-Ig зв'язується з PD-1. Мічені B7-DC-Ig інкубували в різних концентраціях з клітинами лінії CHO, конститутивно експресуючими PD-1, або з батьківськими клітинами CHO, які не експресують PD-1. Зв'язування аналізували за допомогою проточної цитометрії. Середнє значення інтенсивності флуоресценції (MFI) B7-DC-Ig (вісь в) представлене у вигляді функції від концентрації зонда (вісь x). B7-DC-Ig зв'язується з клітинами CHO.PD-1 (темний кружок), але не з нетрансфікованими клітинами CHO (сірий трикутник). На фігурі 2 показано, що B7-DC-Ig конкурує з B7-H1 за зв'язування з PD-1. Немічений B7-DCIg у різних концентраціях спочатку інкубували з клітинами лінії CHO, конститутивно експресуючими PD-1, перед додаванням міченого B7-H1-Ig до клітинної суміші. Середнє значення інтенсивності флуоресценції (MFI) B7-H1-Ig (вісь y) показане у вигляді функції від концентрації доданого конкурента неміченого B7-DC-Ig (вісь x). У міру того, як зростає концентрація неміченого B7-DC-Ig, кількість міченого B7-H1-Ig, що зв'язався з клітинами CHO, зменшується, що показує, що B7-DC-Ig конкурує з B7-H1 за зв'язування з PD-1. На фігурі 3 представлені результати експериментів, у яких комбінація циклофосфаміду (CTX або Цитоксан®) і димерний мишачі B7-DC-Ig викликали в результаті знищення прищеплених 3 пухлин CT26 (карцинома товстої кишки) у мишей. На графіці A показаний об'єм пухлини (мм ) проти днів після щеплення пухлини у мишей, що отримували 100 мг/кг CTX на 10-й день, тоді як 3 на графіці B показаний об'єм пухлини (мм ) проти днів після щеплення пухлини у мишей, що отримали CTX на 10-й день, наступного дня після першого введення B7-DC-Ig. Кожна лінія на кожному графіку відповідає одній миші. Чорна стрілка позначає введення B7-DC-Ig. На графіці C показані середні значення об'єму пухлини. На фігурі 4 показані результати експериментів, у яких комбінація CTX і димерного мишачого B7-DC-Ig знищувала прищеплені пухлини CT26 (карцинома товстої кишки) у мишей і захищала при повторному введенні CT26. Мишам, які отримали CTX і B7-DC-Ig і в яких не виявили пухлинного зростання на 44-й день після щеплення пухлини, повторно щепили пухлину. Пізніше мишам знову проводили повторне введення пухлинних клітин на 70-й день. В жодної з мишей не спостерігали пухлинного зростання до 100-го дня. На фігурі 5 показано, що лікування CTX і B7-DC-Ig приводило до формування специфічних для пухлини CTL пам'яті. Мишам зі знищеними підшкірними пухлинами CT26, що прижилися, після лікування CTX і B7-DC-Ig повторно щепили клітини CT26. Опісля сім днів виділяли спленоцити й активували або яєчним альбуміном, іррелевантним пептидом, або AH1, CT26специфічним пептидом. Клітини забарвлювали спочатку антитілом анти-CD8 подальшим внутріклітинним фарбуванням антитілом анти-IFNγ перед аналізом FACS. На фігурі 6 показані ефекти різних доз B7-DC-Ig в комбінації з CTX на знищення прищеплених пухлин CT26 у мишей. Мишам породи Balb/C у віці 9-11 тижнів щепили підшкірно 1 E05 клітин CT26. На 9-й день мишам вводили IP 100 мг/кг CTX. Через двадцять чотири години, на 10-й день, миші отримували 30, 100 або 300 мкг B7-DC-Ig з подальшими 2 ін'єкціями кожного тижня, всього до 8 введень. Зростання пухлини вимірювали двічі на тиждень. На фігурі 7 представлені результати експериментів, в яких комбінація CTX і антитіла антиPD-1 викликала знищення прищеплених пухлин CT26 (карцинома товстої кишки) у мишей. На 3 графіці A показаний об'єм пухлини (мм ) залежно від днів після щеплення пухлини у нелікованих мишей (тобто мишей, що отримували лише середовище для ліків), на графіці B 3 представлений об'єм пухлини (мм ) залежно від днів після щеплення пухлини у мишей, що отримували лише анти-PD-1, починаючи з 11-го дня, по 300 мкг на ін'єкцію, 3 рази на тиждень, 3 до 12 ін'єкцій, і на графіці C показаний об'єм пухлини (мм ) залежно від днів після щеплення 5 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пухлини у мишей, отримуючих CTX на 11-й день і перше введення анти-PD-1 на 12-й день, по 300 мкг на ін'єкцію, 3 рази на тиждень, до 12 ін'єкцій. Кожна лінія на кожному графіку позначає одну мишу. Чорна стрілка вказує введення анти-PD-1. На фігурі 8 представлені результати експериментів, у яких комбінація CTX і антитіла антиCTLA4 приводила до знищення прищеплених пухлин CT26 (карцинома товстої кишки) у мишей. 3 Тут на графіці A показаний об'єм пухлини (мм ) залежно від днів після введення пухлини у мишей, що отримали 100 мг/кг CTX на 11-й день, тоді як на графіці B показаний об'єм пухлини 3 (мм ) залежно від днів після введення пухлини у мишей, отримуючих CTX на 11-й день і антиCTLA4 на 12-й день, в дозі 100 мкг на ін'єкцію, двічі на тиждень, всього до 8 ін'єкцій. Кожна лінія на кожному графіку позначає одну мишу. Чорна стрілка вказує введення анти-CTLA-4. На фігурі 9 представлені результати експериментів, у яких мишам породи Balb/C у віці 9-11 тижнів прищеплювали 1105 клітин CT26 підшкірно. На 9-й день мишам вводили 100 мг/кг CTX, IP. Через двадцять чотири години, на 10-й день, мишам вводили 100 мкг B7-DC-Ig. У експерименті використовували 5 груп: інтактні миші, яким не вводили яких-небудь пухлинних клітин, миші, яким вводили середовище для ліків, лише CTX, CTX+B7-DC-Ig або лише B7-DC-Ig. Дві інтактні миші і 4 миші з інших груп були видалені з дослідження на 11-й день (2 дні після CTX) і на 16-й день (7 днів після CTX) для аналізу T-клітин. Ліва панель показує, що на 11-й день, через 2 дні після ін'єкції CTX, кількість Treg в селезінці мишей, отримуючих CTX, було значно нижче, ніж кількість Treg у мишей, яким прищеплювали пухлину і вводили середовище для ліків. Права панель показує, що на 16-й день, через 7 днів після введення CTX і через 6 днів після введення B7-DC-Ig, B7-DC-Ig істотно зменшував кількість CD4+Т-клітин, експресуючих високий рівень PD-1. Вказане зниження спостерігали як у мишей, отримуючих B7DC-Ig, так і у мишей, отримуючих CTX+B7-DC-Ig. Передбачали, що миші з прищепленими пухлинними клітинами мало більше PD-1+/CD4+ Т-клітин в дренованому лімфовузлі, в порівнянні з інтактними мишами. На фігурі 10 представлені результати експериментів, у яких комбінація CTX і B7-DC-Ig приводила до збільшення виживаності у мишей при введенні в хвостову вену пухлинних клітин лінії простати мишей. Клітини SP-1 виділяли з легких мишей, у яких розвивалися метастази в результаті ін'єкції клітин пухлини простати TRAMP. Мишам породи B10.D2 спочатку вводили 3105 клітин SP-1 за допомогою ін'єкції в хвостову вену. В дні 5, 12 і 19 мишам вводили 50 мг/кг CTX, де вказано. В дні 6, 13 і 20 мишам вводили 5 мг/кг B7-DC-Ig, де вказано. Тут "NT" позначає "не оброблений". Фігура 11. Мишам породи Balb/C у віці 11-13 тижнів вводили ізольовані печінкові метастази за допомогою ін'єкції в частину селезінки з її подальшим видаленням (hemispleen injection technique). Селезінки анестезованих мишей, ділили на дві половини й накладали на половини дужки. Клітини CT26 (1E05) вводили в одну половину селезінки й через 30 секунд вказану половину селезінки видаляли й накладали дужки на селезінкову дренуючу вену. На 10-й день миші отримували 1 ін'єкцію CTX в дозі 50 мг/кг, IP. Через двадцять чотири години, на 11-й день, мишам вводили рекомбінантний пептид лістерії, що несе AH1, імунодомінантний епітоп CT26, у дозі 0,1 LD50 (1107 КОЄ), потім вводили на 14-й і 17-й дні. Мишам також вводили B7-DC-Ig на 11-й день, і потім на 18-й день. Спостерігали загальну виживаність мишей. Визначення Якщо не вказано інакше, всі технічні й наукові терміни, використовувані в описі, мають ті самі значення, що зазвичай розуміються фахівцем у даній галузі техніки, до якої належить розкритий винахід. Зокрема, наступні терміни й фрази мають наступне значення. Термін "передача інгібіторного сигналу" призначений для позначення будь-якої сигнальної трансдукції, що має ефект відміни, або в інших випадках зменшення Т-клітинних відповідей проти антигену, або за допомогою зменшення T-клітинної проліферації, або за допомогою іншого інгібіторного механізму, внаслідок чого величина або тривалість імуногенної Т-клітинної відповіді зменшується. Вказана передача інгібіторного сигналу може відбуватися внаслідок зв'язування PD-1 з природним лігандом, наприклад, зв'язування PD-1 з B7-H1 або когось іншого члена вказаного класу лігандів, B7-DC, або може відбуватися внаслідок зв'язування CTLA4 з лігандами, такими як B7-1 або B7-2. В цілому, сполуки винаходу зменшують вказану передачу інгібіторного сигналу й включають, але без обмеження, антагоністи PD-1 і антагоністи CTLA4. Термін "антагоніст PD-1» позначає будь-яку молекулу, яка ослабляє передачу інгібіторного сигналу, опосередкованого PD-1, що знаходиться на поверхні Т-клітин, B-клітин, натуральних кілерних (NK) клітин, моноцитів, DC і макрофагів. Вказаний антагоніст включає молекулу, яка перериває будь-який інгібіторний сигнал, що створюється молекулою PD-1 на T–клітині. В конкретних прикладах винаходу антагоніст PD-1 є молекулою, яка інгібує, зменшує, відміняє або іншим способом зменшує передачу інгібіторного 6 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сигналу через PD-1 рецепторний сигнальний шлях. Вказане зниження може відбуватися, у випадку якщо: (i) антагоніст PD-1 винаходу зв'язується з рецептором PD-1 без ініціації сигнальної трансдукції для зменшення або блокування передачі інгібіторного сигналу; (ii) антагоніст PD-1 зв'язується з лігандом (наприклад, з агоністом) рецептора PD-1, запобігаючи його зв'язуванню з рецептором (наприклад, у тих випадках, коли вказаний агоніст є B7-H1); (iii) антагоніст PD-1 зв'язується, або іншим способом інгібує активність молекули, яка є частиною регуляторного ланцюга, який, коли вона не інгібована, в результаті стимулює або іншим способом сприяє передачі PD-1 інгібіторного сигналу; або (iv) антагоніст PD-1 інгібує експресію рецептора PD-1 або експресію його ліганду, зокрема шляхом зменшення або відміни експресії одного або більш генів, кодуючих PDі1, або одного або більше його природних лігандів. Таким чином, антагоніст PD-1 винаходами є молекулу, яка здійснює зменшення передачі PD-1 інгібіторного сигналу, збільшуючи тим самим Т-клітинну відповідь на один або більше антигенів. Використовуваний в описі термін "антагоніст CTLA4» позначає сполуку, яка зменшує CTLA4опосередковане інгібування T-клітинних реакцій. Наприклад, у T-клітині CTLA4 доставляє інгібіторний сигнал після зв'язування лігандів B7, таких як B7-1 і B7-2. Антагоніст CTLA4 є антагоністом, який порушує зв'язування вказаних лігандів з CTLA4 на активованих Т-клітинах. У одному варіанті здійснення антагоніст є антитілом анти-CTLA4, яке зв'язується з CTLA4, щоб запобігти зв'язуванню ліганду. Використовуваний в описі термін "активний фрагмент" стосується частини природного поліпептиду або поліпептиду з високою гомологією послідовностей (наприклад, щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % ідентичності амінокислотної послідовності) з натуральним поліпептидом, і який демонструє активність антагоніста PD-1, наприклад, при зв'язуванні PD-1 або при зв'язуванні з лігандом PD-1. У переважних втіленнях вказаний фрагмент складається з позаклітинного домену (ECD) білка B7-DC, який зв'язується з PD-1, наприклад, SEQ ID NO: 3, переважно з його амінокислот 20-221. В разі поліпептиду PD-1 активним фрагментом є частина вказаного поліпептиду, що включає в себе зв'язуючий домен, який зв'язується з природним лігандом PD-1 для запобігання стимуляції PD-1-опосередкованої передачі інгібіторного сигналу за допомогою вказаного ліганду. Активні фрагменти можуть бути ідентифіковані за їх здатністю конкурувати з молекулою, з якої вони отримані, при зв'язуванні з природним сайтом зв'язування. Наприклад, активні фрагменти конкуруватимуть з B7-DC дикого типу за зв'язування з PD-1. Відносно антитіла термін "активний фрагмент" означає зв'язуючу для антигену частину антитіла, яка є менше ніж цілісний імуноглобулін. Вказані фрагменти включають Fab і F(ab')2 фрагменти, здатні реагувати або зв'язуватися з будь-яким з поліпептидів, розкритих у описі, які є рецепторами або лігандами. Вказані фрагменти Fab і F(ab') 2, позбавлені Fc-частини інтактного антитіла, виводяться швидше з циркуляції, і можуть мати менше неспецифічне тканинне зв'язування, ніж інтактне антитіло (Wahl et al., J. Nuc. Med. 24:316-325 (1983)). Також включені Fv-фрагменти (Hochman, J. et al. (1973) Biochemistry 12:1130-1135; Sharon, J. et al.(1976) Biochemistry 15:1591-1594). Вказані різні фрагменти отримують за допомогою звичайних технологічних прийомів, як-от протеазне розщеплювання або хімічне розщеплювання (див., наприклад, Rousseaux et al., Meth. Enzymol., 121:663-69 (1986)). Використовуваний в описі термін "розчинна частина" антагоніста PD-1 означає частину повнорозмірного поліпептиду, яка не включає яку-небудь частину трансмембранної ділянки або сегменту. Наприклад, відносно B7-DC, розчинна частина включає позаклітинну частину (з Nтермінальною сигнальною послідовністю або без неї), але не включає яку-небудь частину трансмембранної ділянки (або, щонайменше, не достатню, щоб зменшити розчинність). Таким чином, ECD B7-DC людини показана як SEQ ID NO: 3 і складається з IgV-подібного і IgCподібного доменів повнорозмірної молекули (тобто, амінокислоти 20-221 повнорозмірної послідовності (SEQ ID NO: 1). Використовуваний в описі "костимуляторний поліпептид" є поліпептидом, який, при взаємодії з молекулою клітинної поверхні на Т-клітинах модулює активність T-клітини. Таким чином, відповідь T-клітини може бути ефекторною (наприклад, CTL або антитіло-продукуюча Bклітина) відповіддю, хелперною відповіддю, що забезпечує допомогу одному або більш ефекторним (наприклад, CTL або антитіло-продукуюча B-клітина) відповідям, або супресивною відповіддю. Використовуваний в описі термін "схема лікування" відноситься до лікування захворювання або до способу досягнення бажаної фізіологічної зміни, такому як збільшена або понижена відповідь імунної системи на антиген або імуноген, наприклад збільшення або зменшення числа або активності однієї або більш клітин, або типів клітин, які залучені в указану відповідь, де вказане лікування або спосіб включає введення тварині, як-от ссавець, зокрема людині, 7 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 достатньої кількості двох або більше хімічних агентів або компонентів вказаної схеми для ефективного лікування захворювання або для одержання вказаної фізіологічної зміни, де вказані хімічні агенти або компоненти вводять разом, як частину однієї композиції, або вводять окремо й незалежно в той самий час або в різні моменти часу (тобто введення кожного агента або компонента відокремлене обмеженим періодом часу від введення одного або більш за агентів або компоненти) і де введення вказаного одного або більше агентів або компонентів забезпечує результат, більший за результат, що отримується при введенні будь-якого з указаних агентів або компонентів окремо або ізольовано. Використовуваний у описі термін "ізольований" призначений для опису сполуки, що становить інтерес, (наприклад, або полінуклеотиду, або поліпептиду), яка знаходиться в оточенні, яке відрізняється від оточення, в якому сполука присутня природним чином, наприклад, виділений зі свого природного середовища, наприклад, за допомогою концентрації поліпептиду до концентрації, в якій він не зустрічається в природі. "Ізольований" призначений для включення сполук, які знаходяться в зразках, які значно збагачені винаходом, що становить інтерес, і в яких сполуку, що становить інтерес, частково або в основному очищають. Використовуваний в описі термін "поліпептид" стосується ланцюга амінокислот будь-якої довжини, без врахування модифікації (наприклад, фосфорилування або глікозилювання). Поліпептид даного винаходу може бути рекомбінантним поліпептидом, природним поліпептидом або синтетичним поліпептидом, переважно рекомбінантним поліпептидом. Використовуваний в описі "варіантний" поліпептид містить щонайменше одну зміну амінокислотної послідовності в порівнянні з амінокислотною послідовністю відповідного поліпептиду дикого типу. Використовувана в опис"зміна амінокислотної послідовності" може бути, наприклад, заміну, видалення або вставку однієй або більше амінокислот. Використовувані в описі терміни "частина", "сегмент" і "фрагмент", при використанні відносно поліпептидів, стосуються до безперервної послідовності залишків, наприклад, амінокислотних залишків, послідовність яких утворює частина більшої послідовності. Наприклад, якщо поліпептид обробляли будь-якою зі звичайних ендопептидаз, як-от трипсин або хімотрипсин, олігопептиди, отримані в результаті такої обробки, є частини, сегменти або фрагменти вихідного поліпептиду. "Фрагмент" поліпептиду, таким чином, відноситься до будьякої частини поліпептиду, яка є коротшим поліпептидом повнорозмірного білка. В цілому, фрагменти матимуть п'ять або більше амінокислот завдовжки. Похідна, аналог або гомолог поліпептиду (або його фрагменту) винаходу можуть бути (i) поліпептидом, у якому один або більше амінокислотних залишків замінені консервативним або неконсервативним амінокислотним залишком (переважно консервативним амінокислотним залишком) і вказаний заміщений амінокислотний залишок може бути або може не бути залишком, що кодується генетичним кодом, або (ii) поліпептидом, у якому один або більш амінокислотних залишків включають замісну групу, або (iii) поліпептид, у якому зрілий поліпептид сполучають з іншою сполукою, як-от сполука для збільшення часу напівжиття поліпептиду (наприклад, поліетиленгліколь), або (iv) поліпептид, у якому додаткові амінокислоти сполучають із зрілим поліпептидом, таким як лідируюча або секреторна послідовність або з послідовністю, яка застосовується для очищення зрілого поліпептиду або пропротеїнової послідовності. Мається на увазі, що вказані похідні й аналоги входять в обсяг знань фахівців у даній галузі техніки, якщо виходити з ідей цього документа. Використовувана в описі "валентність" належить до доступних сайтів зв'язування в молекулі. Відповідно до даного винаходу термін "відсоткова ідентичність" або "відсоток ідентичності", коли стосується послідовності, означає, що послідовність порівнюють із заявленою або описаною послідовністю після вирівнювання послідовності, яку потрібно порівняти ("порівнювана послідовність") з описаною або заявленою послідовністю ("референсна послідовність"). Потім відсоткову ідентичність визначають за наступною формулою: Відсоткова ідентичність=100[1-(C/R)] де C є числом відмінностей між референсною послідовністю й порівнюваною послідовністю впродовж довжини вирівнювання між референсною послідовністю й порівнюваною послідовністю, де (i) кожна основа або амінокислота в референсній послідовності, яка не має відповідної вирівняної основи або амінокислоти в порівнюваній послідовності і (ii) кожен геп у референсній послідовності й (iii) кожна вирівняна основа або кожна вирівняна амінокислота в референсній послідовності, яка відрізняється від вирівняної основи або амінокислоти в порівнюваній послідовності, являє собою відмінність; і R є числом основ або амінокислот у референсній послідовності впродовж довжини вирівнювання з порівнюваною послідовністю, з будь-яким гепом, створеним у референсній послідовності, який також вважають основою або 8 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотою. Якщо має місце вирівнювання між порівнюваною послідовністю й референсною послідовністю, для яких відсоткова ідентичність, як розраховано вище, приблизно рівна або більше, ніж встановлена мінімальна відсоткова ідентичність, у такому разі порівнювана послідовність має встановлену мінімальну відсоткову ідентичність до референсної послідовності, навіть якщо можуть мати місце вирівнювання, в яких вищезгадана розрахована відсоткова ідентичність є меншою, ніж встановлена відсоткова ідентичність. Використовуваний в описі термін "консервативна заміна амінокислот" означає заміну, при якій замінена амінокислота має схожі структурні або хімічні властивості, й "неконсервативна" заміна амінокислот являє собою заміни, при яких заряд, гідрофобність, або об'єм заміненої амінокислоти істотно відрізняються. Неконсервативні заміни будуть істотніше відрізнятися за їх ефектом на збереження (a) структури пептидного каркаса в області заміни, наприклад, конформації аркуша або спіральної конформації, (b) заряду або гідрофобності молекули в сайтімішені, або (c) об'єму бічного ланцюга. Приклади консервативних замін амінокислот включають такі заміни, в яких заміна відбувається в межах однієї з п'яти наступних груп: 1) малі аліфатичні неполярні або слабко полярні залишки (Ala Ser, Thr, Pro, GIy); 2) полярні, негативно заряджені залишки та їхні аміди (Asp, Asn, Glu, Gln); полярні, позитивні заряджені залишки (His, Arg, Lys); великі аліфатичні неполярні залишки (Met, Leu, Il, Val, Cys); і великі ароматичні залишки (Phe, Tyr, Trp). Прикладами неконсервативних замін амінокислот є заміни, де 1) гідрофільний залишок, наприклад, серил або треоніл, замінюють на гідрофобний залишок, наприклад, лейцил, ізолейцил, фенілаланіл, валіл або аланіл; 2) цистеїн або пролін замінюють на будьякий інший залишок; 3) залишок, що містить позитивно заряджений бічний ланцюг, наприклад, лізил, аргініл або гістидил, замінюють на негативно заряджений залишок, наприклад, глутаміл або аспартил; або 4) залишок, що містить об'ємний бічний ланцюг, наприклад фенілаланін, замінюють на залишок, який не містить бічного ланцюга, наприклад гліцин. Терміни "індивід", "господар", "суб'єкт" і "пацієнт" використовують в описі взаємозамінно, й вони стосуються ссавця, включаючи, але без обмеження приматів, наприклад, людини, а також гризунів, таких як миші й щури, та інші лабораторні тварини. Використовуваний в описі термін "ефективна кількість" або "терапевтично ефективна кількість" означає дозу, достатню для лікування, інгібування або зменшення одного або більше симптомів хворобливого стану, який потрібно вилікувати, або для забезпечення іншим способом бажаного фармакологічного й/або фізіологічного ефекту, зокрема, посилення Тклітинної відповіді до вибраного антигену. Точна доза варіюватиметься відповідно до безлічі чинників, таких як суб'єкт-залежні змінні (наприклад, вік, стан імунної системи тощо), захворювання, й лікування, яке потрібно призначити. Використовуваний в описі термін "фармацевтично прийнятний носій" включає будь-які й усі розчинники, дисперсні середовища, покриття, антибактеріальні й протигрибкові агенти, ізотонічні й затримуючі абсорбцію агенти тощо. Застосування вказаних середовищ і агентів для фармацевтично активних субстанцій добре відоме в даній галузі техніки. Крім випадків, коли загальновживані середовища або агент несумісні з активною сполукою, передбачається їх застосування в терапевтичній композиції. Додаткові активні сполуки також можуть бути включені в композиції. Термін "антитіло" призначений для включення інтактних молекул, а також їх фрагментів, які включають антигензв'язуючий сайт. Структура цілого антитіла часто надається у вигляді H 2L2 і відображає той факт, що антитіла зазвичай містять 2 легких (L) амінокислотних ланцюги й 2 важких (H) амінокислотних ланцюги. Обидва ланцюги містять області, здатні до взаємодії зі структурно комплементарною антигенною мішенню. Області, що взаємодіють з мішенню, позначають як "варіабельні" або "V»-области, і вони характеризуються відмінностями в амінокислотній послідовності від антитіл іншої антигенної специфічності. Варіабельні області Hабо L- ланцюгів містять амінокислотні послідовності, здатні до специфічного зв'язування з антигенними мішенями. В межах указаних послідовностей розташовані менші послідовності, що отримали назву "гіперваріабельних" завдяки їх надзвичайній варіабельності серед антитіл з відмінною специфічністю. Вказані гіперваріабельні області також позначають як "визначальні комплементарність області" або "CDR»-області. Вказані CDR-області відповідають за основну специфічність антитіла відносно певної антигенної детермінантної структури. Областями CDR є неконтактуючі ділянки амінокислот у межах варіабельних областей, але було виявлено, що незалежно від видів, позиційні розташування вказаних критичних амінокислотних послідовностей у межах варіабельних областей важких і легких ланцюгів мають схожі локалізації в амінокислотних послідовностях варіабельних ланцюгів. Варіабельні важкі й легкі ланцюги всіх антитіл, кожен, містять 3 CDR-області, які не стикаються з іншими (L1, що позначаються, L2, L3, H1, H2, H3) для відповідних легких (L) і важких (H) ланцюгів. Поширені 9 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDR-області описані Kabat et al, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977). Антитіла, розкриті відповідно до винаходу, також можуть бути повністю синтетичними, в яких поліпептидні ланцюги антитіл синтезовані й, можливо, оптимізовані для зв'язування з поліпептидами, розкритими в описі як рецептори. Вказані антитіла можуть бути химерними або гуманізованими антитілами й можуть бути повністю тетрамерними за структурою, або можуть бути димерними і включати лише один важкий і один легкий ланцюг. Детальний опис винаходу Даний винахід надає схему лікування або комбінованої терапії для лікування захворювання у ссавців, що включає сполуку, яка зменшує або припиняє передачу інгібіторного сигналу в Тклітини, переважно Т-клітини людини, що вводиться у поєднанні з потенціювальним агентом для збільшення імунної відповіді. Способи винаходу також відносяться до застосування широкого спектру імуномодуляторів і їх композицій. У цілому, підвищена Т-клітинна відповідь, отримана в результаті вказаних способів, є вищою, ніж підвищена Т-клітинна відповідь, отримана в результаті введення аналогічної дози вказаного антагоніста PD-1 або вказаного потенціювального агента окремо. Розкриті композиції й схеми є корисними для стимулювання або посилення імунних відповідей, що залучають Т-клітини. Таким чином, способи винаходу найбільш корисні в лікуванні хворобливого стану, який може покращитися при збільшенні активності Т-клітин, і де підвищена Т-клітинна відповідь необхідна або достатня для лікування вказаного захворювання, навіть якщо захворювання не викликане специфічно або не обтяжене зниженою Т-клітинною відповіддю. В переважному варіанті здійснення тип захворювання, який/-ому потрібно вилікувати або запобігти, є злоякісною пухлиною або хронічним інфекційним захворюванням, викликаним бактерією, вірусом, простим, гельмінтом або іншим внутріклітинним мікробним патогеном, який піддається атаці цитотоксичних T-лімфоцитів. Активація Т-клітин з використанням розкритих композицій також корисна для лікування або запобігання станам, що характеризуються імуносупресією. Відповідно до даного винаходу Т-клітинна відповідь може регулюватися молекулами, які зв'язуються з рецепторами на поверхні T-клітин, і молекулами, які зв'язуються з лігандами вказаних рецепторів. В разі PD-1, молекули, які зв'язують PD-1 щоб зменшити його інгібіторний ефект, і молекули, які зв'язують один або більш за лігандів PD-1, щоб зменшити їх здатність зв'язуватися з PD-1, мають ефект зменшення здатності PD-1 інгібувати Т-клітинну відповідь, збільшуючи, тим самим, вказану відповідь та її імунологічні ефекти. A. Антагоністи рецептора PD-1 Надаються композиції, що містять антагоністи рецепторів PD-1утримують, і вони включають у себе сполуки або агенти, які або зв'язуються з лігандом PD-1 і блокують його, щоб перешкоджати зв'язуванню ліганду з рецептором PD-1 або інгібувати вказане зв'язування, або безпосередньо зв'язуються з рецептором PD-1 і блокують його, не викликаючи передачі інгібіторного сигналу через рецептор PD-1. У іншому варіанті здійснення антагоніст рецептора PD-1 безпосередньо зв'язується з рецептором PD-1 без ініціації передачі інгібіторного сигналу й також зв'язується з лігандом рецептора PD-1, щоб зменшити або інгібувати ініціацію лігандом сигнальної трансдукції через рецептор PD-1. При зменшенні числа й/або кількості лігандів, які зв'язуються з рецептором PD-1 і запускають трансдукцію інгібіторного сигналу, менше число клітин ослабляється негативним сигналом, передаваним за допомогою PD-1-сигнальної трансдукції, і може бути досягнута сильніша імунна відповідь. Відповідно до даного винаходу сигнальна система PD-1 вимагає зв'язування з лігандом PD1 (таким як B7-H1 або B7-DC) у безпосередній близькості з пептидним антигеном, представленим головним комплексом гістосумісності (MHC) (див., наприклад, Freeman Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105:10275-10276 (2008)). Отже, білки, антитіла або малі молекули, які запобігають співзв'язуванню PD-1 і TCR на Т-клітинній мембрані, є ефективними антагоністами PD-1, передбаченими даним винаходом. Типові антагоністи рецептора PD-1 включають, але без обмеження поліпептиди B7-DC, включаючи їх гомологи й варіанти, а також активні фрагменти будь-чого з вищепереліченого, й гібридні білки, які включають будь-яке з вищепереліченого. В переважному варіанті здійснення гібридний білок включає розчинну частину B7-DC, сполучену з Fc-частиною антитіла, такого як IGG людини, і не містить всю трансмембранну ділянку B7-DC людини або його частину. Антагоністи рецептора PD-1 також можуть бути малими молекулами антагоністів або антитілами, які зменшують або порушують PD-1-рецепторну сигнальну трансдукцію шляхом зв'язування з лігандами PD-1 або з самим PD-1, особливо в тих випадках, коли співзв'язування PD-1 з TCR не настає після такого зв'язування, при цьому не запускається передача інгібіторного сигналу через рецептор PD-1. 10 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Антагоністи рецептора PD-1, що надаються в описі, в цілому застосовні in vivo і ex vivo як ліки, стимулюючі імунну відповідь. В цілому, розкриті композиції антагоністів корисні для лікування суб'єкта, що страждає від захворювання або порушення або має схильність до захворювання або порушення, де імунна система суб'єкта збільшує імунну відповідь. 1. Поліпептиди B7-DC У певних втіленнях білки B7-DC можуть бути використані як антагоністи рецептора PD-1. B7DC є природним лігандом PD-1 і зв'язується з PD-1 з вищою афінністю, ніж B7-H1, і може, таким чином, інгібувати взаємодії B7-H1:PD-1. Відповідні поліпептиди B7-DC, включаючи їх варіанти, гомологи й фрагменти, можуть бути отримані з наступних повнорозмірних поліпептидів B7-DC людини з ендогенним сигнальним пептидом (SEQ ID NO:1) або без нього (SEQ ID NO:2). Сімейство молекул B7, що включає B7-DC, експресується на поверхні клітини з мембранним проксимальним константним доменом IGC і мембранним дистальним доменом IGV. Рецептори вказаних лігандів мають загальний позаклітинний IgV-подібний домен. Взаємодії пар рецепторліганд опосередкують головним чином за допомогою амінокислотних залишків у доменах IGV лігандів і рецепторів. В цілому, домени IGV описуються, як такі, що мають два аркуші, кожен з яких містить шар β -тяжів. Вказані β-тяжі позначають як A', B, C, C, C", D, E, F і G. Структура вказаних поліпептидів описана в літературі (див. Molnar et al., Crystal structure of the complex between programmed death-1 (PD-1) і its ligand PD-L2, PNAS, Vol. 105, pp. 10483-10488 (29 July 2008)). Трансмембранний білок, B7-DC, у мономерній формі включає домени IGV і IGC, які складають позаклітинну частину молекули (позаклітинний домен, або ECD), причому IgVподібний домен відповідальний цілком або частково за зв'язування PD-1, а також за інші функції, перераховані в способах винаходу. Відносно людського білка, IgV-домен відрізняється тим, що він має сполучені дисульфідним зв'язком тяжі B і F (як указано вище), що видається характерним для багатьох IgV-доменів, і має тривимірну структуру, схожу з доменами IGV як B7-1, так і B7-2 (див. Molnar et al. (2008), supra). У одному варіанті здійснення варіантні поліпептиди B7-DC містять амінокислотні зміни (тобто, заміни, делеції або вставки) в межах одного або більш вказаних β-тяжів у будь-якій можливій комбінації. У іншому варіанті здійснення варіанти B7-DC містять одну або більше амінокислотних змін (тобто, заміни, делеції або вставки) в β-тяжах A', C, C, C", D, E, F або G. У переважному варіанті здійснення варіанти B7-DC включають одну або більше амінокислотних змін у β-тяжі G. У іншому варіанті здійснення фрагменти варіантного поліпептиду B7-DC включають домени IGC і IGV B7-DC. У іншому варіанті здійснення фрагменти варіантного поліпептиду B7-DC включають IgV-домен B7-DC. Білки B7-DC людини й миші містять короткий внутріклітинний домен, один трансмембранний домен і позаклітинний домен. Позаклітинний домен містить два Ig-домени; мембранний проксимальний IgC-домен і мембранний дистальний IgV-домен. Використовувані фрагменти варіантних поліпептидів B7-DC включають розчинні фрагменти. Розчинними фрагментами B7-DC є фрагменти B7-DC, які можуть бути "злущені”, секретовані або виділені іншим шляхом з продукуючих клітин. У одному варіанті здійснення фрагменти варіантного поліпептиду B7-DC включають повний позаклітинний домен B7-DC. Позаклітинний домен B7-DC включає амінокислоти приблизно 20-221 B7-DC миші або людини або їхні активні фрагменти. В іншому варіанті здійснення фрагменти варіантного поліпептиду 11 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 B7-DC включають домени IGC і IGV B7-DC. У іншому варіанті здійснення фрагменти варіантного поліпептиду B7-DC включають домен IGV B7-DC. Вважають, що сигнальна система PD-1 вимагає зв'язування з лігандом PD-1 (зазвичай B7H1) у безпосередній близькості з пептидним антигеном, представленим головним комплексом гістосумісності (MHC) (Freeman Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:10275-10276 (2008)). Тому білки, антитіла або малі молекули, які запобігають спільному зв'язуванню PD-1 і TCR на T-клітинній мембрані, є ефективними антагоністами PD-1, передбаченими даним винаходом. Антагоніст PD-1, вживаний у способах і композиціях винаходу, включає фрагменти білка B7DC, що містять ECDутримують. Альтернативно фрагменти B7-DC включають частину позаклітинного домену, яка містить IGV- або IgV-подібний домен, переважно амінокислоти 20221, переважніше 20-121, які є достатніми для зв'язування з рецептором PD-1, щоб перешкоджати або запобігти, або іншим способом зменшити передачу інгібіторного сигналу через рецептор PD-1. У переважному варіанті здійснення фрагмент B7-DC конкурує з B7-H1 за зв'язування з рецепторами PD-1. У одному варіанті здійснення фрагменти варіантного поліпептиду B7-DC можуть містити область поліпептиду, яка є важливою для зв'язування з PD-1. Вказані поліпептидні фрагменти можуть бути використані для конкуренції за зв'язування з PD-1 і для запобігання зв'язуванню нативного B7-DC з PD-1. Зважаючи на конкуренцію за зв'язування з PD-1, вказані фрагменти можуть бути корисні для посилення імунної відповіді, оскільки інгібуючі взаємодії B7-H1 і B7-DC з PD-1 інгібують супресію імунних відповідей, яка відбувалася б інакше. Поліпептидний фрагмент мишастого або людського B7-DC, який міг би конкурентно зв'язатися з PD-1, може містити, наприклад, амінокислоти 101-108 або 110-114. Зв'язування B7-DC дикого типу з PD-1 зазвичай інгібується щонайменше на 50 %, на 60 %, на 70 %, на 75 %, на 80 %, на 90 %, на 95 %, або більш ніж на 95 % в порівнянні з рівнем зв'язування B7-DC дикого типу з PD-1 за відсутності фрагмента вказаного B7-DC дикого типу. Типові фрагменти B7-DC, використовувані в способах і композиціях винаходу, включають, але не обмежуються наступними позаклітинними доменами B7-DC: позаклітинний домен (ECD) B7-DC людини: і ECD B7-DC миші: ECD B7-DC яванського макака: 35 40 Багаточисельні послідовності інших приматів, використовувані в способах і композиціях винаходу, представлені в Onlamoon et al., Immunology, Vol. 124, pp. 277-293 (2008). Антагоніст PD-1, використовуваний у композиціях і способах винаходу, також включає гібридний білок (як описано нижчим), який включає першу й другу поліпептидні частини, де вказаний гібридний білок, або щонайменше його перша поліпептидна частина має активність антагоніста PD-1, особливо, якщо вказаний гібридний білок зв'язується з PD-1 і блокує його, або зв'язується з лігандом PD-1 і блокує його. Перша поліпептидна частина вказаного гібридного білка може включати або складатися з будь-якого з поліпептидів-антагоністів PD-1, або їх PD-1зв'язуючих фрагментів, перерахованих тут іншим чином, для застосування як антагоністи PD-1 у способах винаходу. В переважному варіанті здійснення вказаного гібридного білка згадана 12 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перша поліпептидна частина є N-кінцевою по відношенню до згаданої другої поліпептидної частини. В окремому варіанті здійснення згадана перша поліпептидна частина з'єднується із згаданою другою поліпептидною частиною за допомогою олігопептиду на додаток до амінокислот, що складають згадані першу й другу поліпептидні частини, вказані сполучені амінокислоти не знижують істотно PD-1-антагоністичну активність вказаного гібридного білка. У переважному димерному гібридному білку димір отримують у результаті ковалентного зв'язування залишків Cys в CH-областях двох важких ланцюгів Ig, які є тими самими залишками Cys, які сполучені дисульфідним зв'язком в димеризованних нормальних важких ланцюгах Ig. Велика кількість поліпептидних послідовностей, які зазвичай використовують як сполучні партнери гібридних білків, добре відомі в даній галузі техніки. Приклади використовуваних поліпептидних зв'язуючих партнерів включають, але без обмеження, зелений флуоресцентний TM білок (GFP), глутатіон-S-трансферазу (GST), полігістидин, myc, гемаглютинін, FLAG tag (Kodak, New Haven, CT), що мальтоза-зв'язуючий білок E і протеїн A. Інший варіант здійснення надає тетрамерну конструкцію, що містить субстрат BIRA, сполучений з позаклітинним доменом варіантного поліпептиду B7-DC. Способи створення тетрамерної конструкції відомі в даній галузі техніки (див. Pertovas, et al., J. Exp. Med., 203:2281 (2006)). Типові мишачі гібридні білки B7-DC містять амінокислоти 20-221 мишачого B7-DC, сполучені з амінокислотами 237-469 мишачого IgG2a (CAA49868). У одному необмежуючому прикладі людські гібридні білки B7-DC містять амінокислоти 20-221 B7-DC людини, сполучені з амінокислотами 245-476 IGGI людини (AAA02914). Сигнальні пептиди гібридних білків B7-DC включають ендогенні сигнальні пептиди або будь-який інший сигнальний пептид, який сприяє секреції гібридного білка з "господаря". В іншому варіанті здійснення перший поліпептид включає лише IgV-домен. Інші варіанти здійснення можуть включати шарнірний домен і Fcдомен антитіла IGG, такого як IGGI, причому не представлено жодного домену варіабельної області. Інші варіанти здійснення включають застосування шарнірної області й Fc-області IgG2 або IgG4, особливо що містять N297Q або іншу мутацію, яка зменшує ефекторну функцію. Відповідно до способів і композицій винаходу поліпептид, вживаний як антагоніст PD-1, або перша поліпептидна частина гібридного білка, вживаного як антагоніст PD-1, включає амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 60 % або щонайменше 65 %, або щонайменше 70 %, або щонайменше 75 %, або щонайменше 80 %, або щонайменше 85 %, або щонайменше 90 %, або щонайменше 95 %, або щонайменше 99 %-ну ідентичність з амінокислотами 1-221 SEQ ID NO: 1, переважно з амінокислотами 20-221 SEQ ID NO: 1, або з амінокислотами 26-221 SEQ ID NO: 1, або з амінокислотами 1-202 SEQ ID NO: 3 або 4, переважніше з амінокислотами 20-121 SEQ ID NO: 1 або з амінокислотами 1-102 SEQ ID NO: 3 або 4. У одному варіанті здійснення поліпептид, вживаний як антагоніст PD-1, або перша поліпептидна частина гібридного білка, використовуваного як антагоніст PD-1, складається з амінокислот 1-221 SEQ ID NO: 1, або складається з амінокислот 20-221 SEQ ID NO: 1, або складається з амінокислот 26-221 SEQ ID NO: 1, або складається з амінокислот 1-202 SEQ ID NO: 3 або 4. У одному варіанті здійснення (SEQ ID NO: 2), поліпептид не включає амінокислоти 1-19 SEQ ID NO: 1. У інших конкретних прикладах антагоніст поліпептиду PD-1 або перша поліпептидна частина гібридного білка-антагоніста PD-1 включає амінокислотну послідовність 20-121 SEQ ID NO: 1, де переважно він включає амінокислотну послідовність WDYKY в положенні залишків 110-114, або де він включає амінокислоти 1-102 SEQ ID NO: 3, де переважно він включає амінокислотну послідовність WDYKY в положенні залишків 91-95. У переважному варіанті здійснення вказані відсоткові ідентичності досягаються за допомогою вживання консервативних амінокислотних замін, як визначено в іншому місці даного опису. В одному вказаному варіанті здійснення поліпептидний антагоніст PD-1 або перша поліпептидна частина гібридного білка-антагоніста PD-1 не включає амінокислоти 1-19 SEQ ID NO: 1, або не включає яку-небудь частину трансмембранного домену, особливо вказаний повний домен, або не включає яку-небудь частину внутріклітинного (або розчинного) домену, особливо вказаний повний домен, ліганду PD-1 або іншого білкового антагоніста PD-1. У переважному варіанті здійснення вказаний антагоніст або перша поліпептидна частина включає лише позаклітинний домен (ECD) SEQ ID NO:1 і, таким чином, включена в склад лише розчинна частина поліпептиду вказаної послідовності, або фрагмент вказаної розчинної частини. В інших подібних варіантах здійснення поліпептидний антагоніст PD-1 або перша поліпептидна частина гібридного білка-антагоніста PD-1 включає IgV-домен, або IgV-подібний домен або його PD-1-зв'язуючий фрагмент ліганда PD-1, або складається з IgV-домену, або IgV 13 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 подібного домену, або його PD-1-зв'язуючого фрагмента ліганда PD-1. У конкретних прикладах вказаний ліганд PD-1 є молекулою B7-DC або B7-H1 дикого типу, переважно молекулу B7-DC або B7-H1 дикого типу миші або примату, переважно людини. В інших подібних варіантах здійснення поліпептидний антагоніст PD-1, або перша поліпептидна частина гібридного білкаантагоніста PD-1, PD-1-зв'язуючий фрагмент IgV-домену, або IgV-подібного домену, ліганда PD1, особливо в разі IgV-домену, або IgV-подібного домену, складається з амінокислот 20-121 SEQ ID NO: 1 або амінокислот 1-102 SEQ ID NO: 3. Антагоніст PD-1 винаходу також включає PD-1-зв'язуючий фрагмент амінокислот 20-121 SEQ ID NO: 1 (людською повнорозмірною) або амінокислот 1-102 SEQ ID NO: 3 (позаклітинний домен або ECD). У конкретних втіленнях поліпептид або PD-1-зв'язуючий фрагмент також включає амінокислоти WDYKY у положенні залишків 110-114 SEQ ID NO: 1 або WDYKY в положенні залишків 91-95 SEQ ID NO: 3. Як необмежуючі приклади, вказаний фрагмент PD-1-зв'язуючий включає щонайменше 10, або щонайменше 20, або щонайменше 30, або щонайменше 40, або щонайменше 50, або щонайменше 60, або щонайменше 70, або щонайменше 75, або щонайменше 80, або щонайменше 85, або щонайменше 90, або щонайменше 95, або щонайменше 100 розташованих поруч амінокислот послідовності амінокислот 20-121 SEQ ID NO: 1, де в переважному варіанті здійснення кожен PD-1-зв'язуючий фрагмент включав би як підфрагмент амінокислоти WDYKY, що знаходяться в положенні залишків 110-114 SEQ ID NO: 1 або WDYKY в положенні залишків 91-95 SEQ ID NO: 3. Інші переважні поліпептиди і PD-1-зв'язуючі фрагменти, спеціально передбачені винаходом, включають поліпептидну послідовність амінокислот 20-121 SEQ ID NO: 1 (людську повнорозмірну) та їхні РD-1-зв'язуючі фрагменти, де в указаному поліпептиді або PD-1зв'язуючому фрагменті цистеїн представлений у положенні залишків 42 і/або 102, причому цистеїн в обох позиціях є переважним, і де фенілаланін представлений у положенні залишку 21, і/або де глутамінова кислота представлена в положенні залишку 28, і/або де треонін, і/або де глутамін представлений у положенні залишку 60, і/або де глутамінова кислота представлена в положенні залишку 101, і/або де ізолейцин представлений у положенні залишку 103, і/або де ізолейцин представлений у положенні залишку 105, і/або де гліцин представлений у положенні залишку 107, і/або де валін представлений у положенні залишку 108, і/або де триптофан представлений у положенні залишку 110, і/або де аспарагінова кислота представлена в положенні залишку 111, і/або де тирозин представлений у положенні залишку 112, і/або де лізин представлений у положенні залишку 113, і/або де тирозин представлений у положенні залишку 114, за умови що, в разі PD-1-зв'язуючих фрагментів указаний фрагмент є чималим, щоб включати вказані положення амінокислот. Додаткові переважні поліпептиди і PD-1-зв'язуючі фрагменти, спеціально передбачені винаходом, включають поліпептидну послідовність амінокислот 1-102 SEQ ID NO: 3 (ECD людини) або SEQ ID NO: 4 (ECD миші) і їхні PD-1-зв'язуючі фрагменти, де в указаному поліпептиді або PD-1-зв'язуючому фрагменті, цистеїн представлений у положенні залишку 23 і 83, причому цистеїн в обох позиціях є переважним, іполипеп де фенілаланін представлений у положенні залишку 2, і/або де глутамінова кислота представлена в положенні залишку 9, і/або де треонін або аргінін представлений у положенні залишку 37, причому треонін є переважним, і/або де глутамін представлений у положенні залишку 41, і/або де аргінін представлений у положенні залишку 82, і/або де лейцин представлений у положенні залишку 84, і/або де ізолейцин представлений у положенні залишку 86, і/або де гліцин представлений у положенні залишку 88, і/або де аланін представлений у положенні залишку 89, і/або де триптофан представлений у положенні залишку 91, і/або де аспарагінова кислота представлена в положенні залишку 92, і/або де тирозин представлений у положенні залишку 93, і/або де лізин представлений у положенні залишку 94, і/або де тирозин представлений у положенні залишку 95, за умови що, в разі PD-1-зв'язуючих фрагментів, указаний фрагмент є чималим, щоб включати вказані положення амінокислот. У додаткових варіантах здійснення будь-яким з указаних вище поліпептидів також може включати частини або фрагменти, наприклад, з 1 до 10 розташованих поруч амінокислот, що витягують з сигнального, трансмембранного або C-кінцевого доменів поліпептиду B7-DC або B7-H1, наприклад, миші або примату, переважно людини. Вказані поліпептиди і PD-1-зв'язуючі фрагменти також можуть бути представлені в будь-якому з гібридних білків винаходу, наприклад, де вказаний поліпептид або PD-1-зв'язуючий фрагмент є "першим поліпептидом" указаного гібридного білка. У конкретних прикладах молекула, скомбінована з потенціювальним агентом для застосування в схемі лікування винаходу, включає PD-1-зв'язуючий фрагмент амінокислот 20 14 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 221 SEQ ID NO: 1. У одному подібному варіанті здійснення фрагмент складається з амінокислот 20-121 SEQ ID NO: 1, де переважно фрагмент включає амінокислоти 110-114 SEQ ID NO: 1. У деяких варіантах здійснення представлений більш ніж один указаний фрагмент (як описано в іншому місці цього документа) й молекула включає щонайменше 2, 3, 4, 5 або більш за фрагменти білка B7-DC, особливо де фрагмент є частиною або містить частину амінокислот 20221 SEQ ID NO: 1. У переважному варіанті здійснення щонайменше один указаний фрагмент складається з амінокислот 20-121 SEQ ID NO: 1, переважніше, де щонайменше один вказаний фрагмент включає амінокислоти 110-114 SEQ ID NO: 1 (тобто, послідовність WDYKY (SEQ ID NO: 14)). У переважних втіленнях PD-1-зв'язуючий фрагмент включає щонайменше 10, або щонайменше 25, або щонайменше 50, або щонайменше 75, або щонайменше 100 розташованих поруч амінокислот. Ендогенний сигнальний пептид людини має наступну послідовність MIFLLLMLSL ELQLHQIAA (SEQ ID NO:5) і є першими 19 амінокислот SEQ ID NO: 1. У певних втіленнях поліпептидні фрагменти B7-DC можуть включати 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 розташованих поруч амінокислот ендогенного або гетерологічного сигнального пептиду (який може бути використаний для одержання рекомбінантного поліпептиду B7-DC шляхом експресії й експресії з трансформованої клітини). Також слід розуміти, що корисний поліпептид B7-DC може включати 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 розташованих поруч амінокислот трансмембранного домену B7-DC, і/або 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 розташованих поруч амінокислот цитоплазматичного домену, або їх комбінації, за умови, що фрагмент B7-DC зберігає антагоністичну здатність відносно рецептора PD-1. Фенотіпи мишей PD-1-/- надають прямий доказ того, що PD-1 є негативним регулювальником імунних відповідей in vivo. За відсутності PD-1 у мишей на фоні C57BL/6 повільно розвивається волчакоподібний гломерулонефрит і прогресуючий артрит (Nishimura, et al., Immunity, 11:141-151 (1999)). У мишей PD-1-/- на фоні BALB/c нестримно розвивається летальна аутоіммунна дилатаційная кардіоміопатія (Nishimura, et al., Science. 291:319-322 (2001)). Проте важливе свідоцтво вказує, що B7-DC може функціонувати як костимуляційний активатор Т-клітинних відповідей. У присутності субоптимальних сигналів B7-DC TCR викликає збільшення проліферації й продукцію цитокінів in vitro (Tseng, et al., J. Exp. Med. 193:839-846 (2001)). В той же час, дослідження in vitro показали негативну регуляторну роль B7-DC у Т-клітинних відповідях. Представлені, на перший погляд, суперечливі дані можуть бути успішно пояснені експресією додаткових рецепторів для B7-DC на Т-клітинах, інших, ніж PD-1. Отже, білки B7-DC, їх варіанти, фрагменти й гібриди можуть мати перевагу безпосереднього посилення Т-клітинних відповідей при зв'язуванні з невідомим рецептором, який активує Tклітину, на додаток до посилення Т-клітинних відповідей шляхом запобігання PD-1опосередкованої передачі інгібіторного сигналу. 2. Поліпептиди B7-H1 У іншому варіанті здійснення сполука для застосування в комбінації з потенціювальним агентом у схемі лікування винаходу є або включає фрагмент B7-H1 ссавця, переважно миші або примату, переважно людини, де вказаний фрагмент зв'язується з PD-1 і блокує його, але не викликає передачі інгібіторного сигналу через PD-1, і вказаний фрагмент є завдовжки щонайменше 10, або щонайменше 20, або щонайменше 30, або щонайменше 40, або щонайменше 50, або щонайменше 60, або щонайменше 70, або щонайменше 80, або щонайменше 90, або щонайменше 100 розташованих поруч амінокислот. У інших втіленнях фрагмент може бути різної довжини за умови, що він характеризується функцією зв'язування з PD-1, але не викликає передачу інгібіторного сигналу, що приводить до зменшення T-клітинної проліферації. Вказані фрагменти B7-H1 також знайшли вживання як першу поліпептидну частину гібридних білків винаходу. Послідовності B7-H1 є наступними: Поліпептид B7-H1 людини (SEQ ID NO: 16) Поліпептид B7-H1 миші (SEQ ID NO: 17) 15 UA 106050 C2 Поліпептид PD-L1 Macaca mulatta (SEQ ID NO: 18) 5 10 15 20 25 30 Білки B7-H1-Ig описані в WO/2001/014557 (опублікований 1 березня 2001) і в WO/2002/079499 (опублікований 10 жовтня 2002). 3. PD-1 та інші поліпептиди Інші корисні поліпептиди винаходу включають поліпептиди, які зв'язуються з лігандами рецептора PD-1. Вони включають рецепторний білок PD-1 або його розчинні фрагменти, які можуть зв'язуватися з лігандами PD-1, такими як B7-H1 або B7-DC, і запобігати зв'язуванню з ендогенним рецептором PD-1, запобігаючи, таким чином, передачі інгібіторного сигналу. Також показано, що B7-H1 зв'язується з білком B7.1 (Butte et al., Immunity, Vol. 27, pp. 111-122 (2007)). Вказані фрагменти також включають розчинну частину ECD білка PD-1, яка включає мутації, такі як мутація A99L, яка збільшує зв'язування з природними лігандами (Molnar et al., Crystal structure of the complex between programmed death-1 (PD-1) і its ligand PD-L2, PNAS, Vol. 105, pp. 10483-10488 (29 July 2008)). B7-1 або його розчинні фрагменти, які можуть зв'язуватися з лігандом B7-H1 і запобігати зв'язуванню з ендогенним рецептором PD-1, запобігаючи тим самим передачі інгібіторного сигналу, також є корисними. Поліпептиди PD-1, вживані в способах винаходу, є наступними поліпептидами: PD-1 людини (SEQ ID NO: 19) PD-1 яванського макака Cynomolgus monkey (SEQ ID NO: 20) Відповідно до винаходу, оскільки B7-1 і його фрагменти також можуть зв'язуватися з B7-H1 і передавати інгібіторну трансдукцію Т-клітинам через B7-H1, блокування вказаної взаємодії також може зменшити передачу інгібіторного сигналу, яка відбувається через B7-H1. Сполуки, застосовані у винаході, включають молекули, які блокують вказаного типу взаємодії. Дані молекули розкриті в Butte et al (2007) раніше, і включають антитіла анти-B7-H1 з "подвійною" специфічністю, які блокують взаємодію B7-H1:B7-1 і B7-H1:PD-1, а також антитіла, що демонструють моноспецифічність, які блокують взаємодію PD-L1:B7-1. Сполуки, які перешкоджають вказаній взаємодії шляхом блокування B7-1, також є корисними, й включають анти-B7-1 антитіла. 4. Варіантні поліпептиди Поліпептиди, використовувані у винаході, як описано, включають поліпептиди, які змінені таким чином, що містять одну або більш амінокислотних замін, делецій або вставок. Способи 16 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мутагенезу відомі в даній галузі техніки. Мутовані або варіантні поліпептиди інгібують або зменшують передачу інгібіторного сигналу через рецептори PD-1 завдяки зв'язуванню з лігандами PD-1. Альтернативно, варіанти (наприклад, поліпептиди B7-DC) можуть зв'язуватися з рецептором PD-1 й інгібувати, зменшувати або блокувати передачу інгібіторного сигналу через рецептор PD-1. Варіантні поліпептиди можуть бути поліпептидами, отриманими з видів будь-якого походження. В одному варіанті здійснення варіантний поліпептид є поліпептидом, отриманим з видів ссавців. У переважному варіанті здійснення варіантний поліпептид є за походженням поліпептидом миші або примату, переважно людини. У одному варіанті здійснення варіантним поліпептидом є поліпептид B7-DC, який має таку саму зв'язуючою здатність відносно PD-1, як B7-DC дикого типу або неваріантний B7-DC, але не має або має менше за 10 % здатність запускати передачу інгібіторного сигналу через рецептор PD-1, в порівнянні з поліпептидом B7-DC, що не мутував. У інших втіленнях варіантний поліпептид B7-DC має зв'язуючу здатність відносно PD-1 більшу на 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % або 60 %, ніж B7-DC дикого типу, без ініціації інгібіторної PD-1 сигнальної трансдукції. Варіантний поліпептид (наприклад, варіантний поліпептид B7-DC) включає поліпептиди, що характеризуються будь-якою комбінацією амінокислотних замін, делецій або вставок за умови, що антагоністична активність відносно PD-1 не зменшується істотно порівняно з диким типом. Проте в разі, якщо вказане зменшення існує, воно має складати не більше ніж половину значення активності дикого типу, так що вказаний варіант характеризується щонайменше 50 % антагоністичною активністю білка дикого типу відносно PD-1, переважно щонайменше 60 %, переважніше щонайменше 80 %, найпереважніше щонайменше 90 % або 95 %, при цьому щонайменше 100 % антагоністична активність є особливо переважною. Підвищені значення такої активності, отримані в результаті застосування вказаного варіанту, є ще більше бажаними. В одному варіанті здійснення ізольовані варіантні поліпептиди B7-DC мають амінокислотні зміни, такі що їх амінокислотна послідовність характеризується щонайменше 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, 99,5 або 100 % ідентичністю з амінокислотною послідовністю поліпептиду B7-DC дикого типу, особливо з амінокислотною послідовністю дикого типу ссавця, переважно миші, або примату, переважно людини, поліпептиду B7-DC дикого типу. Ідентичність поліпептидної послідовності може бути розрахована за допомогою визначення % ідентичності, наданого вище. Заміни амінокислот у поліпептидах можуть бути "консервативними" або "неконсервативними". Молекули сімейства B7, включаючи B7-DC, експресуються на клітинній поверхні з мембранним проксимальним константним IgC-доменом і мембранним дистальним IgV-доменом. Рецептори вказаних лігандів містять загальний позаклітинний IgV-подібний домен. Взаємодії пар рецептор-ліганд опосередковуються головним чином через залишки в IgV-доменах лігандів і рецепторів. В цілому, IgV-домени описують, як такі, що містять два аркуші, кожен з яких містить шар β-тяжів. Указані β-тяжі позначають A', B, C, C", C", D, E, F і G. У одному варіанті здійснення варіантні поліпептиди B7-DC містять амінокислотні зміни (тобто заміни, делеції або вставки) в одному або більш β-тяжів у будь-якій можливій комбінації. В іншому варіанті здійснення варіанти B7-DC містять одну або більш амінокислотних змін (тобто замін, делецій або вставок) в A', C, C" C", D, E, F або G β-тяжах. У одному варіанті здійснення варіанти B7-DC містять одну або більш амінокислотних змін у β-тяжі G. Що стосується B7-DC миші або примату, переважно людини, варіантний поліпептид B7-DC може містити, без обмеження, заміни, делеції або вставки в положеннях, які не зменшать істотно зв'язування з PD-1 в порівнянні з немутантом B7-DC. Слід розуміти, проте, що заміни в перерахованих положеннях амінокислот можуть бути виконані із застосуванням амінокислоти або аналога амінокислоти. Наприклад, заміни в перерахованих положеннях можуть бути виконані за допомогою однієї з амінокислот, що зустрічаються в природі (наприклад, аланін, аспарагінова кислота, аспарагін, аргінін, цистеїн, гліцин, глутамінова кислота, глутамін, гістидин, лейцин, валін, ізолейцин, лізин, метіонін, пролін, треонін, серин, фенілаланін, триптофан або тирозин). Попри те, що описані тут заміни, є замінами відносно B7-DC миші й примату, переважно людини, вказано, що фахівець у даній галузі техніки може без зусиль виробити аналогічні зміни у відповідних поліпептидах інших видів (наприклад, щура, хом'яка, морської свинки, піщанки, кроля, собаки, кішки, коня, свині, вівці, корови або нижчого примату). Переважні фрагменти включають увесь або частину позаклітинного домену B7-DC, корисного для зв'язування з PD-1. У одному варіанті здійснення фрагментами варіантного поліпептиду B7-DC є фрагменти, які зберігають здатність зв'язуватися з PD-1 без ініціації передачі PD-1 інгібіторного сигналу. Один 17 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіант здійснення надає варіантний поліпептид B7-DC, який є фрагментом повнорозмірного B7-DC і характеризуються зазвичай щонайменше 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 100 % або ще вище ніж 100 % антагоністичною активністю повнорозмірного варіантного поліпептиду B7-DC відносно PD-1. Корисні фрагменти варіантних поліпептидів B7-DC включають розчинні фрагменти. Розчинними фрагментами B7-DC є фрагменти B7-DC, які можуть бути "злущені” з поверхні, секретовані або виділені іншим способом з продукуючих клітин. У одному варіанті здійснення фрагменти варіантного поліпептиду B7-DC включають повний позаклітинний домен B7-DC. Позаклітинний домен B7-DC включає амінокислоти приблизно від 20 до амінокислоти 221 B7DC миші або примату, переважно людини. В іншому варіанті здійснення фрагменти варіантного поліпептиду B7-DC включають домени IGC і IGV B7-DC. У іншому варіанті здійснення фрагменти варіантного поліпептиду B7-DC включають в IgV-домен B7-DC. У одному варіанті здійснення фрагменти варіантного поліпептиду B7-DC містять ділянку поліпептиду, який є важливим для здатності зв'язуватися з PD-1. Вказані поліпептидні фрагменти є корисними для зв'язування й блокування рецептора PD-1, щоб запобігти зв'язуванню природних лігандів з рецептором PD-1, підсилюючи, таким чином, імунну відповідь. Інгібуючі взаємодії нативного B7-H1 або B7-DC з PD-1 інгібують супресію імунних відповідей, яка відбувалася б в протилежному випадку. Фрагмент поліпептиду B7-DC миші або примату, переважно людини, яка зв'язується з PD-1 містить, як необмежуючий приклад, амінокислоти 101-105 або 111-113. Зв'язування B7-H1 з рецептором PD-1 зазвичай інгібується щонайменше на 50 %, або щонайменше 60 %, або щонайменше на 70 %, або щонайменше 75 %, або щонайменше на 80 %, або щонайменше на 90 %, або щонайменше на 95 %, або більше, в порівнянні з рівнем зв'язування B7-H1 з PD-1 за відсутності вказаного фрагмента. Мутант A99L людського PD-1 зв'язує B7-DC і B7-H1 з вищою афінністю, ніж немутований PD1 людини (Lazar Molnar et al PNAS 105 р. 10483-10488 (2008)). У одному варіанті здійснення винаходу сполукою, призначеною для зменшення передачі інгібіторного сигналу, є розчинний білок, такий як ECD PD-1, що включає вказану мутацію. 5. Модифіковані поліпептиди Поліпептиди, застосовані у винаході, як описано, включаючи варіанти, гомологи та їх фрагменти, можуть бути модифіковані за допомогою хімічних функціональних груп, які виявляють в асоціації з поліпептидами в нормальному клітинному середовищі, наприклад, за допомогою фосфорилування, метилування, амідування, сульфатування, ацилування, глікозилювання, сумоїлування й убіквітинування поліпептиду. Вказані поліпептиди також можуть бути модифіковані за допомогою хімічних функціональних груп, які зазвичай не є частиною поліпептидів у клітинному середовищі. Вказані модифікації можуть бути введені в молекулу шляхом реакції амінокислотних залишків-мішеней поліпептиду з органічним агентом, використовуваним для отримання похідних, який здатний реагувати з вибраними бічними ланцюгами або з кінцевими залишками. Інша корисна модифікація є циклізацією білка. Вказані модифікації також включають введення мітки, здатної забезпечити детектований сигнал, прямо або побічно, що включає, але без обмеження радіоактивні ізотопи й флуоресцентні сполуки. Приклади хімічних похідних поліпептидів включають залишок лізину й амінокінцеві залишки, створюючі похідні з сукциновим ангідридом або з іншими ангідридами карбонових кислот. Одержання похідних з циклічним карбоксильним ангідридом має ефект зміни заряду залишків лізину. Інші відповідні реагенти для одержання похідних аміновмісних залишків, включають імідоефіри, такі як метилпіколінімідат; піридоксальфосфат; піридоксаль; хлорборгідрид; тринітробензолсульфонова кислота; O-метилізосечовина; 2,4-пентандіон; і реакція з гліоксилатом, каталізована трансаміназою. Карбоксильні бічні групи, аспартил або глутаміл, можуть бути вибірково модифіковані за допомогою реакції з карбодиїмідами (R-N=C=N-R'), такими як 1-циклогексил-3-(2-морфолініл-(4-етил)карбодиїмід або 1-етил-3-(4-азонію-4,4диметилфеніл)карбодиїмід. Крім того, залишки аспартилу й глутамілу можуть бути перетворені на залишки аспарагінілу й глутамінілу за допомогою реакції з аміаком. Поліпептиди винаходу також можуть включати одну або більш за D-амінокислот, якими замінюють одну або більш за Lамінокислот. У інших втіленнях потенціювальний агент, такий як CTX1 сам може бути частиною сполуки, яка зменшує передачу інгібіторного сигналу, наприклад, у випадку, якщо потенціювальний агент хімічно пов'язаний з антагоністом PD-1 винаходу. 6. Гібридні білки Також надані гібридні поліпептиди, що містять перший гібридний партнер, або поліпептидну частину, що включає весь або частину білкового антагоніста PD-1, наприклад, поліпептид B7DC (включаючи, варіанти, гомологи та їхні фрагменти), сполучений (i) безпосередньо з другим 18 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліпептидом або, (ii) за бажання, сполучений з лінкерною пептидною послідовністю, яка об'єднана з другим поліпептидом. Наявність гібридного партнера може змінювати, наприклад, розчинність афінність і/або валентність поліпептидного антагоніста PD-1. Розкриті гібридні білки включають будь-яку комбінацію змін амінокислот (тобто заміна, делеція або вставка), фрагмента, та/або модифікації пептидного антагоніста PD-1, як описано вище. В одному варіанті здійснення гібридні білки B7-DC включають позаклітинний домен білка B7-DC як перший зв'язуючий партнер. У іншому варіанті здійснення вказані гібридні білки B7-DC включають домен IGV і IGC білка B7-DC як перший зв'язуючий партнер. У іншому варіанті здійснення варіантні гібридні білки B7-DC включають IgV-домен білка B7-DC як перший зв'язуючий партнер. Типові перші гібридні партнери включають поліпептид B7-DC примату, переважно людини, або миші, його фрагменти та їх варіанти, розкриті вище. Переважні фрагменти включають позаклітинний домен B7-DC. Як описано, позаклітинний домен може включати 1-10 розташованих поруч амінокислот сигнального пептиду, трансмембранного домену B7-DC або їх обох. У одному варіанті здійснення композиції й/або продукти, і/або способи винаходу застосовують антагоніст рецептора PD-1, особливо поліпептиди, включаючи варіанти, гомологи та їх фрагменти, які сполучають з іншими поліпептидами для створення гібридних білків, які протидіють рецептору PD-1 шляхом зв'язування ліганду PD-1, такого як B7-H1, тим самим інгібують взаємодію інгібуючого ліганду з PD-1. У іншому варіанті здійснення поліпептидні антагоністи рецептора PD-1 або їх варіанти, сполучають з іншими поліпептидами для створення гібридних білків, які надають антагоністичну дію на рецептор PD-1 шляхом зв'язування й блокування рецептора PD-1 та інгібують або зменшують передачу інгібіторного сигналу через PD-1. Другий поліпептидний зв'язуючий партнер або друга поліпептидна частина, може являти собою N-кінець або C-кінець відносно поліпептидого антагоніста PD-1. У переважному варіанті здійснення другим поліпептидом є C-кінець поліпептидного антагоніста PD-1. У переважному варіанті здійснення гібридний білок, передбачений для застосування в способах і композиціях і/або продуктах винаходу, включає щонайменше частину антитіла. З появою методів молекулярної біології й рекомбінантної технології, тепер можливо виробляти молекули антитіл рекомбінантними способами і створювати, таким чином, нуклеотидні послідовності генів, які кодують специфічні амінокислотні послідовності, виявлені в поліпептидній структурі антитіл. Вказані антитіла можуть бути отримані або за допомогою клонування нуклеотидних послідовностей генів, що кодують поліпептидні ланцюги вказаних антитіл, або за допомогою прямого синтезу вказаних поліпептидих ланцюгів, із збіркою in vitro синтезованих ланцюгів для створення активних тетрамерних (H 2L2) структур з афінністю до специфічних епітопів і антигенних детермінантів. Вказані способи забезпечують легке одержання антитіл, що мають послідовності, типові для нейтралізуючих антитіл, отриманих з різних видів і джерел. Незалежно від джерела антитіл, або їх рекомбінантної конструкції, або того, як вони синтезовані, in vitro або in vivo, з використанням трансгенних тварин, наприклад, корів, кіз і овець, з використанням великих клітинних культур лабораторного або комерційного об'єму, в біореакторах або за допомогою прямого хімічного синтезу без використання живих організмів на якій-небудь стадії процесу, всі антитіла мають схожу загальну 3-мірну структуру. Вказана структура часто представляється у вигляді H2L2 і відображає той факт, що антитіла зазвичай включають 2 легких (L) амінокислотних ланцюги й 2 важких (H) амінокислотних ланцюги. Обидва ланцюги містять області, здатні взаємодіяти зі структурно комплементарною антигенною мішенню. Області, що взаємодіють з мішенню, позначають як "варіабельні" або "V" області, й вони характеризуються відмінностями в амінокислотній послідовності від антитіл іншої антигенної специфічності. У переважних втіленнях поліпептидні антагоністи рецептора PD-1, включаючи фрагменти, мутанти та інші варіанти, мають перший партнер злиття, що має весь або частину білка B7-DC, або його варіант, злитого (i) безпосередньо з другим поліпептидом, або (ii) необов'язково злитого з пептидною лінкерною послідовністю, яка злита з другим поліпептидом. Присутність партнера злиття може змінити розчинність, афінність і/або валентність B7-DC поліпептиду. У переважніших втіленнях поліпептиди B7-DC сполучені з одним або більш доменами константної області важкого ланцюга Ig, переважніше з амінокислотною послідовністю, відповідної шарнірній області, ділянкам CH2 і CH3 ланцюга Cγ1 імуноглобуліну людини, або шарнірній області, ділянкам CH2 і CH3 ланцюга Cγ2a імуноглобуліну миші. В переважному варіанті здійснення константна область переважно включає мутацію (наприклад, N297Q), щоб 19 UA 106050 C2 виключити або зменшити зв'язування Fc-рецептора. Шарнірна область, ділянки CH2 і CH3 ланцюга Cγ1 імуноглобуліну людини мають наступну амінокислотну послідовність: 5 10 15 20 Шарнірна область, ділянки CH2 і CH3 ланцюга Cγ2a імуноглобуліну миші мають наступну амінокислотну послідовність: Типові гібридні білки B7-DC миші містять амінокислоти 20-221 мишачого B7-DC, сполученого з амінокислотами 237-469 мишачого IgG2a (CAA49868). Гібридні білки B7-DC людини можуть містити амінокислоти 20-221 людського B7-DC, сполученого з амінокислотами 245-476 людського IGGI (AAA02914). Сигнальні пептиди гібридних білків B7-DC можуть бути ендогенними сигнальними пептидами або будь-яким іншим сигнальним пептидом, який сприяє секреції гібридного білка з клітини-господаря. Репрезентативний гібридний білок B7-DC-Ig миші кодується послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:8. Слід розуміти, що розкриті послідовності нуклеїнових кислот можуть бути оптимізовані для кодону для збільшення рівнів експресії для синтезу гібридних білків, застосованих у способах і композиціях даного винаходу. Способи оптимізації кодонів відомі в даній галузі техніки. Мишачий гібридний білок B7-DC-Ig, кодований SEQ ID NO:8, має наступну амінокислотну послідовність: SEQ ID NO: 10 надає амінокислотну послідовність мишачого гібридного білка B7-DC-Ig без сигнальної послідовності. 25 У одному варіанті здійснення людський B7-DC-Ig кодується послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:11, що кодує амінокислотну послідовність B7-DC-Ig людини: 20 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Даний винахід, зокрема, передбачає варіант здійснення, де зрілий гібридний білок, використовуваний у способах і композиціях винаходу, характеризується видаленою сигнальною послідовністю. В переважному варіанті здійснення сигнальна послідовність повністю видалена. SEQ ID NO:13 надає амінокислотну послідовність людського B7-DC-Ig без сигнальної послідовності. Даний винахід, зокрема, передбачає варіанти здійснення, де розкриті гібридні білки B7-DCIg, використовувані в розкритих тут способах і композиціях, мають послідовність, ідентичну щонайменше на 80 %, 85 %, 90 %, 99 % або 100 % по відношенню до SEQ ID NO: 9, 10, 12 або 13. У іншому варіанті здійснення винаходу гібридний поліпептид може характеризуватися біспецефічною функцією, відповідно до якої перший гібридний партнер зв'язується з лігандом PD-1, таким як B7-H1, і другий гібридний партнер зв'язується з рецептором PD-1 без ініціації передачі інгібіторного сигналу через рецептор PD-1. Попри те, що поліпептид, застосований у винаході, може бути мономерним або димерним, самі гібридні білки можуть бути представлені в мономерній або олігомерній формі, переважно у вигляді димеру. В конкретних втіленнях гібридні білки, вживані як антагоністи PD-1 в способах і композиціях винаходу, можуть збиратися спонтанно в олігомерних, зокрема, димерні форми або можуть бути хімічно зв'язані для створення вказаних олігомерів за допомогою способів, добре відомих у даній галузі техніки. Наприклад, гібридний білок, застосований у винаході, може включати частину поліпептиду B7-DC, сполучену з частиною антитіла, й указані частини далі можуть бути зібрані в димер. У одному прикладі поліпептид для застосування у винаході гібридизують у вигляді одного амінокислотного ланцюга з Fc-областю антитіла (наприклад, де вказана конструкція експресується з одного рекомбінантного поліпептиду), після чого два таких гібридних продукти сполучають один з одним для створення гомодимеру, наприклад, за допомогою дисульфідного зв'язку між відповідними Fc-областями. Вказані димерні продукти можуть бути гомодимерами (де обидва мономерні гібридні білки ідентичні) або можуть бути гетеродимерами (де два різні гібридні білки зв'язані один з одним). Окремі мономери вказаних димерів можуть бути зв'язані способами, відомими в даній галузі техніки, наприклад, за допомогою ковалентного зв'язку (наприклад, дисульфідний зв'язок) або за допомогою нековалентного зв'язку (такий як іонна взаємодія). B7-DC-Ig, застосований у прикладах винаходу, представлений у формі гомодимеру, що містить 2 копії SEQ ID NO: 10, зв'язаних разом дисульфідним зв'язком. Крім того, гетеродимери винаходу включають біспецифічні білки й гібридні білки, в яких одна мономерна частина зв'язується з PD-1 та інша частина зв'язується з природним лігандом PD-1. Вказані гетеродимери створюють шляхом з'єднання поліпептидів і гібридних білків, повністю описаних в іншій частині цього документа. В іншому корисному варіанті здійснення винаходу антагоніст PD-1 являє собою гетеродимер, де, наприклад, два гібридні білки сполучено разом, але вони не є ідентичними за амінокислотноюій послідовністю. В конкретному прикладі кожен мономер може включати Fc 21 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 частину антитіла, сполучену з активним фрагментом поліпептиду B7-DC, де вказані активні фрагменти є фрагментами з різних частин поліпептиду B7-DC, або де гібридний білок, що включає Fc-частину антитіла, сполучену з повнорозмірним нативним B7-DC поліпептидом, зв'язаний (наприклад, поперечним зв'язком) з гібридним білком, що містить Fc-частину антитіла й активний фрагмент повнорозмірного нативного поліпептиду BY-DC. У кожному вказаному випадку частина антитіла, використана для створення кожного мономерного гібридного білка, може відрізнятися у двох мономерних одиницях. Будь-яка вказана димерна комбінація зокрема передбачена способами й композиціями винаходу. У переважному димерному гібридному білку димер отримують у результаті ковалентного зв'язування Cys-залишків у CH-областях двох важких ланцюгів Ig, які є тими самими Cysзалишками, які сполучені дисульфідним зв'язком у димеризованих важких ланцюгах звичайного Ig. Інше втілення надає тетрамерну конструкцію, що містить субстрат BіrA, сполучений з позаклітинним доменом варіантного поліпептиду B7-DC. Способи створення тетрамерних конструкцій відомі в даній галузі техніки (див. Pertovas, et al., J. Exp. Med., 203:2281 (2006)). 7. Анті-pd-1 та інші антитіла Інші антагоністи PD-1, передбачені способами винаходу, включають антитіла, які зв'язуються з PD-1 або з лігандами PD-1, та інші антитіла. У одному аспекті даний винахід відноситься до способу збільшення Т-клітинної відповіді у ссавця, який цього потребує, що включає призначення вказаному ссавцеві ефективної схеми лікування, що включає антитіло анти-PD-1 і потенціювальний агент, де вказана схема лікування є ефективною для збільшення Т-клітинної відповіді ссавця на вказаний антиген. Антитіла анти-PD-1, застосовні у схемі (схемах) лікування винаходу, включають, але без обмеження, антитіла, описані в наступних публікаціях: PCT/IL03/00425 (Hardy et al., WO/2003/099196) PCT/JP2006/309606 (Korman et al., WO/2006/121168) PCT/US2008/008925 (Li et al., WO/2009/014708) PCT/JP03/08420 (Honjo et al., WO/2004/004771) PCT/JP04/00549 (Honjo et al., WO/2004/072286) PCT/IB2003/006304 (Collins et al., WO/2004/056875) PCT/US2007/088851 (Ahmed et al., WO/2008/083174) PCT/US2006/026046 (Korman et al., WO/2007/005874) PCT/US2008/084923 (Terrett et al., WO/2009/073533) Berger et al., Clin. Cancer Res., Vol. 14, pp. 30443051 (2008). Конкретним прикладом антитіла анти-PD-1, застосовного у способах винаходу, є MDX-1106 (див. Kosak, патент США 20070166281 (опубліковано 19 липня 2007), абзац 42), людське антитіло анти-PD-1, що переважно вводиться в дозі 3 мг/кг. У іншому аспекті даний винахід відноситься до способу збільшення Т-клітинної відповіді у ссавця, який цього потребує, що включає призначення вказаному ссавцеві ефективної схеми лікування, що включає антитіло анти-PD-1 ліганду, наприклад антитіло анти-B7-H1, і потенціювальний агент, де вказана схема лікування є ефективною для збільшення Т-клітинної відповіді вказаного ссавця на вказаний антиген. Антитіла анти-B7-H1, застосовні у схемі (схемах) лікування винаходу, включають, але без обмеження антитіла, описані в наступних публікаціях: PCT/US06/022423 (WO/2006/133396, опублікований 14 грудня 2006) PCT/US07/088851 (WO/2008/083174, опублікований 10 липня 2008) US 2006/0110383 (опублікований 25 травня 2006). Конкретним прикладом антитіла анти-B7-H1, застосовного в способах винаходу, є MDX-1105 (WO/2007/005874, опублікований 11 січня 2007)), людське антитіло анти-B7-H1. Для антитіла анти-B7-DC див. патентні заявки США 7411051, 7052694, 7390888, 20060099203. Інший варіант втілення винаходу включає біспецифічне антитіло, яке включає антитіло, яке зв'язується з рецептором PD-1, сполучене місточковим зв'язком з антитілом, яке зв'язується з лігандом PD-1, таким як B7-H1. У переважному варіанті здійснення частина, що зв'язує PD-1, зменшує або інгібує сигнальну трансдукцію через рецептор PD-1. Антитіло для застосування у винаході не обов'язково має бути антитілом анти-PD-1 або антитілом анти-PD-1 ліганду, але може бути іншим антитілом, використовуваним в опосередкуванні ефектів Т-клітини в імунній відповіді. В указаному аспекті даний винахід відноситься до способу збільшення Т-клітинної відповіді на антиген у ссавця, який цього потребує, що включає введення вказаному ссавцеві ефективної схеми лікування, що включає 22 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіло анти-CTLA4 і потенціювальний агент, де вказана схема лікування є ефективною для збільшення Т-клітинної відповіді вказаного ссавця на вказаний антиген. Приклад антитіла антиCTLA4, передбаченого для застосування в способах винаходу, включає антитіло, яке описане в PCT/US2006/043690 (Fischkoff et al., WO/2007/056539). Конкретні приклади антитіла анти-CTLA4, застосованого в способах винаходу, являють собою іпілімумаб, також відомий як MDX-010 або MDX-101, людське антитіло анти-CTLA4, що переважно вводиться в дозі 10 мг/кг, і тремелімумаб людське антитіло анти-CTLA4, що переважно вводиться в дозі 15 мг/кг. 8. Малі молекули антагоністів PD-1 Антагоністи рецептора PD-1 також можуть являти собою малі молекулярні антагоністи. Термін "мала молекула" стосується невеликих органічних сполук з молекулярною вагою більше 100 і менше 2500 дальтон, переважно від 100 до 2000, переважніше приблизно від 100 до 1250, переважніше приблизно від 100 до 1000, переважніше приблизно від 100 до 750, переважніше від 200 до 500 дальтон. Малі молекули часто включають циклічний вуглець або гетероциклічні структури і/або ароматичні або поліароматичні структури, заміщені однією або більше функціональними групами. Малі молекулярні антагоністи зменшують або перешкоджають сигнальній трансдукції через рецептор PD-1 шляхом зв'язування з лігандами PD-1, такими як B7-H1 і B7-DC і запобігання взаємодії ліганду з PD-1 або шляхом зв'язування й блокування безпосередньо рецептора PD-1 без ініціації сигнальної трансдукції через рецептор PD-1. У одному варіанті здійснення вказана мала молекула може бути введена в комбінації з іншим антагоністом PD-1 або з антагоністом CTLA4, таким як антитіло, специфічне до PD-1, або один з його лігандів або як антитіло, специфічне до CTLA4, або один з його лігандів. Таким чином, вказані малі молекули можуть бути введені як сполуки в один або більше способи винаходу або можуть бути введені в комбінації з іншими сполуками, вживаними в способах винаходу. Наприклад, показано, що серії малих органічних сполук зв'язуються з лігандом B7-1 для запобігання зв'язуванню з CTLA4 (див. Erbe et al., J. Biol. Chem., Vol. 277, pp. 7363-7368 (2002). Вказані малі органічні сполуки можуть бути введені окремо або разом з антитілом антиCTLA4, в комбінації з уведенням CTX, для зменшення передачі інгібіторного сигналу Т-клітин. У одному варіанті здійснення антагоністи PD-1 або антагоністи CTLA4, передбачені для застосування в способах винаходу, включають антисмислові нуклеїнові кислоти, як ДНК, так і РНК, а також молекули siРНК. Вказані антисмислові молекули запобігають експресії PD-1 на Тклітинах, а також продукцію T-клітинних лігандів, таких як B7-H1, PD-L1 і PD-L2. Наприклад, siРНК (наприклад, завдовжки приблизно 21 нуклеотид, яка специфічна для гена, кодуючого PD1, або кодуючого ліганд PD-1, і олігонуклеотиди якого можуть бути без зусиль придбані комерційно) об'єднаний з носіями, такими як поліетиленімін (див. Cubillos-Ruiz et al., J. CHn. Invest. 119(8): 2231-2244 (2009), легко поглинається клітинами, які експресують PD-1, а також ліганди PD-1 і зменшує експресію вказаних рецепторів і лігандів, щоб забезпечити зниження передачі інгібіторного сигналу в Т-клітини, активуючи, тим самим, Т-клітини. B. Потенціювальні агенти Відповідно до винаходу, активність антагоніста PD-1 збільшується, переважно синергічно, завдяки присутності потенціювального агента. Потенціювальний агент впливає на збільшення ефективності антагоніста рецептора PD-1, можливо за допомогою більш ніж одного механізму, хоча точний механізм дії не є істотно важливим для широкої лікувальної практики даного винаходу. У переважному варіанті здійснення потенціювальний агент являє собою циклофосфамід. Циклофосфамід (CTX, Цитоксан®, або Неосар®) являє собою ліки оксазафосфорин і аналоги і включає іфосфамід (IFO, Іфекс), перфосфамід, трофосфамід (трофосфамід; іксотен) і фармацевтично прийнятні солі, сольвати, проліки та їх метаболіти (патентна заявка США 20070202077, яка включена в усій повноті). Іфосфамід (Мітоксана®) є структурним аналогом циклофосфаміду й механізм його дії вважають ідентичним або в основному схожим з механізмом дії циклофосфаміду. Перфосфамід (4-гідропероксициклофосфамід) і трофосфамід також є алкілуючими агентами, які структурно пов'язані з циклофосфамідом. Наприклад, перфосфамід алкілує ДНК, інгібуючи тим самим реплікацію ДНК і РНК і синтез білка. Нові похідні оксазофосфоринів були створені й оцінені як спроба поліпшити селективність і отримати відповідь з меншою цитотоксичністю для господаря (Liang J, Huang M, Duan W, Yu XQ, Zhou S. Design of new oxazaphosphorine anticancer drugs. Curr Pharm Des. 2007;13(9):963-78. Review). Вказані похідні включають мафосфамід (NSC 345842), глуфосфамід (D19575, бета-Dглікозилізофосфорамід гірчиці), S-(-)-бромофосфамід (CBM-11), NSC 612567 (альдофосфамід пергідротіазин) і NSC 613060 (алдофосфамід тіазолідин). Мафосфамід є аналогом оксазафосфорину, який є хімічно стабільною сіллю 4-тіоетансульфонової кислоти 4-гідрокси 23 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CPA. Глуфосфамід є похідною IFO, де ізофосфорамід гірчиці, алкілуючий метаболіт IFO, зв'язаний глікозидним зв'язком з молекулою бета-D-глюкози. Додаткові аналоги циклофосфаміду описані в патенті США 5190929 під назвою "Аналоги циклофосфаміду, застосовні як протипухлинні агенти", який включений в опис за допомогою посилання в усій своїй повноті. У інших втіленнях потенціювальний агент являє собою агент, який зменшує активність і число регуляторних Т-лімфоцитів (T-reg), переважно сунітиніб (SUTENT®), анти-TGFβ або іматиніб (GLEEVAC®). Описана схема лікування також може включати введення ад'юванта. Придатні потенціювальні агенти також включають інгібітори мітозу, такі як паклітаксел, інгібітори ароматази (наприклад, летрозол) і інгібітори ангіогенезу (інгібітори VEGF, наприклад, авастин, VEGF-Trap) (див., наприклад, Li et al., Vascular endothelial growth factor blockade reduces intratumoral regulatory Т-cells and enhances the efficacy of а GM-CSF-secreting cancer immunotherapy. Clin Cancer Res. 2006 Nov 15;12(22):6808-16.), антрацикліни, оксаліплатин, доксорубіцин, антагоністи TLR4, і антагоністи IL-18. C. Фармацевтичні композиції У одному аспекті винахід відноситься до терапевтичної композиції, що містить молекулу, яка запобігає передачі інгібіторного сигналу через PD-1, або антагоніст CTLA4, і потенціювальний агент, у фармацевтично прийнятному носієві. Компоненти вказаної композиції представлені в кількості, ефективній для збільшення Т-клітинної відповіді у ссавця. В конкретних втіленнях, потенціювальний агент являє собою циклофосфамід або аналог циклофосфаміду, приклади таких аналогів перераховані вище. У інших конкретних прикладах потенціювальний агент являє собою агент, який зменшує активність регуляторних Т-лімфоцитів (T-reg), де переважно активність знижується внаслідок зменшення числа вказаних T-reg. У переважних необмежуючих варіантах здійснення, агент являє собою сунітиніб (SUTENT®), анти-TGFβ або іматиніб (GLEEVAC®). Потенціювальний агент, застосовний у складанні композиції винаходу, також включає інгібітори мітозу, такі як паклітаксел, інгібітори ароматази (наприклад, летрозол), інгібітори ангіогенезу (інгібітори VEGF, наприклад, авастин, VEGF-Trap), антрацикліни, оксаліплатин, доксорубіцин, антагоністи TLR4 і антагоністи IL-18. Терапевтична композиція винаходу також за бажанням включає щонайменше один додатковий агент, який може бути одним або більше антитіло анти-PD-1, антитіло анти-CTLA4, інгібітор мітозу, інгібітор ароматази, антагоніст рецептора аденозину A2a (A2AR) або інгібітор ангіогенезу. Будь-яка з терапевтичних композицій винаходу також може містити один або більш ад'ювантів, які описані в цьому документі. Антагоніст PD-1, застосовний як компонент терапевтичної композиції винаходу, включає будь-який з антагоністів PD-1, перерахованих в описі для застосування в будь-якому зі способів винаходу. Наприклад, вказаний антагоніст PD-1 включає будь-який з гібридних білків, перерахованих в описі. Вказаний антагоніст також може бути будь-яким з поліпептидів або PD1-зв'язуючих фрагментів, перерахованих у описі для застосування як першої поліпептидної частини будь-якого з гібридних білків, описаних для застосування в будь-якому зі способів винаходу. Такий антагоніст може далі бути антитілом, таке як будь-яке з відомих антитіл антиPD-1, анти-B7-DC або ант-B7-H1, згаданих в описі. Терапевтична композиція винаходу також включає на додаток або замість вищезазначеного антагоніста PD-1 антитіло анти-CTLA4. Така композиція, відповідно, містить вказане антитіло анти-CTLA4 і потенціювальний агент з числа вже описаних тут. Терапевтична композиція винаходу знаходить застосування в будь-якому зі способів винаходу, розкритих у описі. Вказана композиція, попри те, що призначена для застосування як активне лікування стану хвороби, також може знайти застосування як профілактична композиція для запобігання будь-якому із захворювань, перерахованих в описі. У одному аспекті даний винахід передбачає терапевтичну композицію, що містить антагоніст PD-1 і потенціювальний агент у фармацевтично прийнятному носієві, де антагоніст PD-1 і потенціювальний агент представлені в кількості, ефективній для збільшення Т-клітинної відповіді у ссавця. Терапевтичні композиції в обсязі винаходу включають композиції, що містять будь-яку й усі комбінації антагоністів PD-1 і антитіл, розкритих в описі, з будь-яким з перерахованих потенціювальних агентів. Як необмежуючі приклади терапевтична композиція винаходу включає композицію, що містить ефективну кількість одного або більше антагоністів PD-1, наприклад, комбінацію будь-якого або всіх повнорозмірних поліпептидів, наведених тут у вигляді конкретних SEQ ID NO або їх гомологів, разом з одним або більш фрагментами будь-якого з 24 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 указаних поліпептидів, включаючи комбінації, де будь-яке або всі з них сполучені з іншими білками, наприклад, сполучені з одним або більш імуноглобулінами, перерахованими тут, або не сполучені, й комбінації містять один або більше потенціювальних агентів, таких як циклофосфамід окремо, або циклофосфамід плюс один або більше його аналоги, лише один або більше аналогів циклофосфаміду, або потенціювальний агент може складатися з циклофосфаміду й агента, який зменшує число T-reg у ссавця, одержуючого композицію, або може складатися з аналога циклофосфаміду плюс агент, який зменшує число T-reg, або потенціювальний агент може складатися лише з одного або більше агентів, які зменшують число T-reg або іншу активність T-reg. Усі вказані комбінації передбачені винаходом, якщо лише композиція включає щонайменше один антагоніст PD-1 і антитіло, що опосередковує T-клітинну активність, і щонайменше один потенціювальний агент. Композиції винаходу також можуть включати додаткові активні агенти. В переважних утіленнях будь-якої композиції винаходу фармацевтична або терапевтична композиція далі включає щонайменше один додатковий агент, вибраний з групи, що включає антитіло анти-PD1, антитіло анти-CTLA4, інгібітор мітозу, такий як паклітаксел, інгібітор ароматази, такий як летрозол, антагоніст A2AR, інгібітор ангіогенезу, антрацикліни, оксаліплатин, доксорубіцин, антагоністи TLR4, і антагоністи IL-18. Антагоніст PD-1 і потенціювальний агент можуть бути введені за допомогою будь-яких відповідних засобів. У переважному варіанті здійснення антагоніст PD-1 і потенціювальний агент вводять у водному розчині, за допомогою парентеральної ін'єкції. Композиція також може бути у формі суспензії або емульсії. В цілому, надають фармацевтичні композиції, що включають ефективні кількості пептиду або поліпептиду, й додатково включають фармацевтично прийнятні розчинники, консерванти, солюбілізатори, емульгатори, ад'юванти й/або носії. Вказані композиції включають розчинники: стерилізовану воду, забуферений фізіологічний розчин з різним буферним складом (наприклад, Tris-HCl, ацетат, фосфат), різними значеннями pH та іонної сили; і за бажанням, добавки, такі як детергенти і солюбілізуючий компонент (наприклад, TWEEN 20, TWEEN 80, Polysorbate 80), антиоксиданти (наприклад, аскорбінова кислота, матабісульфіт натрію), і консерванти (наприклад, тимерсол, бензиловий спирт) і об'ємотвірні субстанції (наприклад, лактоза, манітол). Прикладами неводних розчинників або середовищ для ліків є пропіленгліколь, поліетиленгліколь, рослинні олії, такі як оливкове масло і кукурудзяне масло, желатин, і органічні ефіри для ін'єкцій, такі як етилолеат. Композиції можуть бути ліофілізовані й повторно розчинені/ресуспендовані безпосередньо перед вживанням. Композиції можуть бути простерилізовані, наприклад, шляхом фільтрування через фільтри, затримуючі бактерії, зі шляхом включення в композиції стерилізуючих агентів, шляхом опромінення композиції або шляхом нагрівання композиції. Фармацевтичні композиції винаходу можуть бути введені парентеральним (внутрішньом'язова, внутрішньоочеревинна, внутрішньовенна (IV) або підшкірна ін'єкція), трансдермальним (або пасивно, або з використанням електрофорезу або електропорації), або трансмукозальним (назальним, вагінальним, ректальним або сублінгвальним) способом введення. Способи винаходу не виключають введення антагоніста PD-1 і потенціювального агента окремими й різними шляхами (наприклад, місцево). Антагоніст PD-1 і потенціювальний агент можуть бути введені в той самий або в різні моменти часу, при цьому потенціювальний агент уводять до або після введення антагоніста PD1. У одному варіанті здійснення потенціювальний агент вводять як до так і після введення антагоніста PD-1. У одному такому варіанті здійснення той самий потенціювальний агент вводять до і після введення антагоніста PD-1. У іншому варіанті здійснення потенціювальний агент вводять до введення антагоніста PD-1. Використовуваний в описі термін "ефективна кількість" або "терапевтично ефективна кількість" означає дозу, достатню для лікування інгібування або полегшення одного або більше симптомів порушення, яке лікують, або для надання іншим чином бажаного фармакологічного й фізіологічного ефекту. Точне дозування варіюватиметься залежно від ряду чинників, таких як суб'єкт-залежні змінні (наприклад, вік, стан імунної системи тощо), захворювання, й вироблюване лікування. Терапевтично ефективні кількості антагоністів рецепторів PD-1 і антитіл разом з потенціювальними агентами викликають імунну відповідь, яка має бути досягнута або підтримана. Вибрана доза залежить від бажаного терапевтичного ефекту, від шляху введення, і від тривалості необхідного лікування. Зазвичай рівні доз 0,001-50 мг/кг маси тіла вводять ссавцям щодня. Переважно, вказана доза складає 1-50 мг/кг, переважніше 1-40 мг/кг, або навіть 1-30 мг/кг, при цьому доза 2-20 мг/кг є також переважною дозою. Приклади інших доз включають 2-15 мг/кг, або 2-10 мг/кг або навіть 3-5 мг/кг, при цьому доза 4 мг/кг являє собою конкретний 25 UA 106050 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приклад. У схемах лікування із застосуванням потенціювального агента й антитіла, такого як антитіло анти-PD-1 або антитіло анти-CTLA4, дози зазвичай відповідають інтервалу 0,1-100 мг/кг, при цьому вужчі інтервали від 1 до 50 мг/кг є переважними, і діапазони від 10 до 20 мг/кг є переважнішими. Відповідна доза для суб'єкта людини складає 5-15 мг/кг, при цьому доза антитіла 10 мг/кг (наприклад, людське антитіло анти-PD-1, аналогічне MDX-1106) є найбільш переважною (плюс відповідна доза циклофосфаміду або іншого потенціювального агента, введена приблизно за 24 години перед введенням антитіла). В цілому, лише як приклад, лікарські форми на основі ваги тіла для будь-якого з антагоністів сигнальної трансдукції, застосовного в способах винаходу, включають дози в діапазоні 5-300 мг/кг або 5-290 мг/кг, або 5-280 мг/кг, або 5-270 мг/кг, або 5-260 мг/кг, або 5-250 мг/кг, або 5-240 мг/кг, або 5-230 мг/кг, або 5-220 мг/кг, або 5-210 мг/кг, або 20-180 мг/кг, або 30-170 мг/кг, або 40160 мг/кг, або 50-150 мг/кг, або 60-140 мг/кг, або 70-130 мг/кг, або 80-120 мг/кг, або 90-110 мг/кг, або 95-105 мг/кг, причому дози 3 мг/кг, 5 мг/кг, 7 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 50 мг/кг і 100 мг/кг є конкретними прикладами переважних доз. Указані дози, зрозуміло, можуть бути введені повторно. Доза, зрозуміло, корелюватиме з виглядом ссавця, одержуючого вказану дозу. Дози перерахованих вище інтервалів мг/кг є придатними для ссавців, включаючи гризунів, таких як миші й щури, і для приматів, особливо для людини, дози, що складають приблизно 5 мг/кг, 10 мг/кг і 15 мг/кг, є особливо переважними для лікування людини. Відповідно до схеми лікування винаходу потенціювальний агент, наприклад, циклофосфамід вводять у нетоксичних дозах, які варіюють залежно від вигляду тварини. В конкретних втіленнях потенціювальний агент вводять за допомогою будь-якого відповідного способу введення, включаючи парентеральний або пероральний, перший спосіб, з двох згаданих вище, включає системне введення, таке як внутрішньовенне введення. Наприклад, потенціювальний агент, подібний циклофосфаміду, зазвичай вводять перорально. Вказане введення може відбуватися в будь-якій зручній дозі, залежній від потенціювального агента. Доза в кожному випадку може бути заснована на масі тіла або доза може бути введена у вигляді одиничної дози. Попри те, що CTX сам по собі не токсичний, деякі з його метаболітів є цитотоксичними алкілуючими агентами, які індукують утворення перехресних зв'язків у ДНК і, у високих дозах, розриви ланцюга. Багато клітин є стійкими до CTX, тому що вони експресують високі рівні детоксикуючого ферменту альдегіддегідрогенази (ALDH). CTX впливає на проліферуючі лімфоцити, оскільки лімфоцити (але не гемопоетичні стволові клітини) експресують низькі рівні ALDH, і клітини, що діляться, є найбільш чутливими до ДНК-алкілуючих агентів. Низькі дози CTX (