Спосіб визначення проникності мембран сперматозоїдів коропа до молекул води

Реферат: Винахід стосується способу визначення проникності мембран сперматозоїдів коропа до молекул води, згідно з яким при інкубації сперматозоїдів у гіпотонічних сольових розчинах реєструють залежність світлопропускання суспензії клітин від часу, проводять її апроксимацію і UA 104809 C2 (12) UA 104809 C2 визначають швидкість зміни світлопропускання, яка обернено пропорційна характерному часу проникнення молекул води до клітини, звідки визначають проникність мембран сперматозоїдів до молекул води. UA 104809 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до галузі кріобіології, зокрема кріобіології репродуктивних клітин риб, і може бути використаний для оцінки функціональних характеристик сперматозоїдів коропа та розробки середовищ кріоконсервування клітин з метою подальшого використання у сільському господарстві для збереження генофонду промислових риб. Зміна проникності мембран сперматозоїдів коропа може бути визначена за допомогою спектрофлуореметричного методу, у якому вимірюють інтенсивність флуоресценції пропідій йодиду, який зв'язується з ДНК сперматозоїдів [1]. Проникність мембран сперматозоїдів до молекул води може бути розрахована, якщо відома динаміка клітинного об'єму в неізотонічних умовах. Відомий спосіб визначення динаміки об'єму за допомогою електронного лічильника частинок, який дозволяє обчислити діаметри клітин. Зокрема, цим методом визначають проникність до води мембран сперматозоїдів кабана [2,3], мавпи [4], мишей [5], биків [6]. Внутрішньоклітинний об'єм води сперматозоїдів можна визначити з використанням техніки побудови спектрів ЕПР. Згідно з цим способом до суспензії клітин додають водяну спінову метку (темпон) та мембранонепроникний агент ((К3[Сr(С2О4)3]·3Н2О), який усуває позаклітинний сигнал. Вимірюючи сигнал інтенсивності внутрішньоклітинного темпона, можна обчислити внутрішньоклітинний об'єм води клітин. Уживання цього способу не обмежується формою клітин. Зокрема, внутрішньоклітинний об'єм води сперматозоїдів мишей розраховують цим способом [7]. Відомий спосіб визначення проникності мембран клітин до води [8], який включає оцінку критичної осмолярності та часу проникнення. Критична осмолярність визначається як осмолярність, при якій 50 % клітин набухають через осмос до величини, за якої відбувається пошкодження плазматичних мембран. Час проникнення - це час, необхідний для клітин, щоб збільшити об'єм до значення, при якому відбувається пошкодження мембран, коли клітини переміщують у розчин з осмолярністю, меншою за критичну. Проникність мембран до води визначають з цих параметрів разом з оцінкою площі поверхні та вмісту осмотично активної клітинної води. Цей спосіб, зокрема, використовують для визначення проникності до води мембран сперматозоїдів півнів та биків [8]. Відомий спосіб визначення проникності мембран сперматозоїдів до води з використанням диференційної скануючої калориметрії, який базується на тому, що різниця у тепловіддачі пов'язана зі змінами клітинного об'єму. Зокрема цей спосіб використовують для визначення проникності до води мембран сперматозоїдів коней [9], мишей [10], биків [11], людини [12]. Існує спосіб визначення об'єму клітин за допомогою світлової мікроскопії, який базується на фотореєстрації клітин і розрахунку об'єму клітин за величиною площі перерізу клітин (метод волюмометрії). Цей спосіб використовують для визначення проникності мембран до води клітин СПЕВ [13], ембріонів тварин, зокрема ембріонів зебрафіш [14] і мишей [15]. Недоліком цього способу є велика похибка визначення площі перерізу клітин малих розмірів (близько 2 мкм у діаметрі), якими є сперматозоїди коропа, а значить і розрахунку проникності мембран до молекул води. Відомий також спосіб вимірювання клітинного об'єму, і як результат проникності клітин, з використанням конфокальної мікроскопії, що базується на вимірюванні інтенсивності флуоресценції барвників [16]. Недоліком всіх зазначених способів визначення проникності мембран до молекул води є складність операцій, що виконуються, та залежність від спеціального стаціонарного лабораторного обладнання, що обумовлює труднощі у використанні цих способів у польових умовах, на рибних господарствах. Відомо, що зміна оптичної щільності або світлопропускання корелює зі змінами клітинного об'єму. Цей факт використовується, наприклад, для визначення змін об'єму мітохондрій або ліпосом [17]. За прототип нами вибрано спектрофотометричний метод вивчення об'єму клітин, зокрема сперматозоїдів риб [18]. Згідно з цим методом сперматозоїди інкубують у гіпотонічних сольових розчинах відомої осмолярності та за допомогою колориметра реєструють зміну оптичної щільності суспензії, яка свідчить про набухання або стискання клітин. Отримані цим методом дані дозволяють судити про час та інтенсивність набухання. Для характеристики набухання визначають відносну зміну оптичної щільності, яка визначається як різниця оптичної щільності в початковий момент (D0) та після закінчення набухання (Dlim), віднесена до значення у початковий момент. Також використовують часову характеристику набухання - час напівнабухання, тобто час досягнення екстинції, що дорівнює половині різниці між значеннями на початку та в кінці процесу набухання. 1 UA 104809 C2 5 10 15 20 25 Недоліком цього способу є те, що зазначені вище характеристики мають низький рівень достовірності. Це пояснюється тим, що вони залежать від концентрації клітин, тобто за умови різної концентрації клітин, що інкубуються в одному і тому ж середовищі, значення відносної оптичної щільності може відрізнятись в 2 та більше разів (табл.), що робить неприпустимим порівняння об'ємних характеристик сперматозоїдів різних самців лише цим способом. Згідно з визначенням час напівнабухання також залежить від концентрації сперматозоїдів у середовищі інкубації. В основу винаходу поставлено задачу створити такий спосіб визначення здатності сперматозоїдів до набухання, який би забезпечив можливість підвищити рівень достовірності отриманих значень за рахунок використання іншої характеристики зміни клітинного об'єму швидкості зміни світлопропускання суспензії клітин. Ця задача вирішується тим, що в відомому способі, який включає інкубацію сперматозоїдів у гіпотонічному сольовому розчині відомої осмолярності та реєстрацію оптичної характеристики суспензії за допомогою фотоелектроколориметра, згідно з винаходом, при інкубації сперматозоїдів у гіпотонічному сольовому розчині реєструють залежність світлопропускання суспензії клітин від часу, проводять її апроксимацію і визначають швидкість зміни світлопропускання, яка обернено пропорційна характерному часу проникнення молекул води до клітини, звідки визначають проникність мембран сперматозоїдів до молекул води. Суть способу обумовлює наступне. Як відомо, при зануренні клітини в гіпотонічне середовище непроникної речовини, клітина збільшує свій об'єм за рахунок позаклітинної води. Величина зміни об'єму визначається in out різницею між осмолярністю (π та π ) внутрішньоклітинного та позаклітинного середовища. Величина збільшення об'єму клітини залежить від видових та індивідуальних особливостей самця. Відносну зміну об'єму клітини з часом після занурення клітини в гіпо- або гіпертонічний розчин непроникної у клітини речовини можна описати наступним співвідношенням [19]:     V  V0 1   in  out  0   out 1  exp  L p out t V0  (1) 30 де V0 та V - значення об'єму клітини в фізіологічному розчині та в момент часу t відповідно, α - частка осмотично неактивного об'єму клітини, γ - поверхнево-об'ємне співвідношення клітини, Lp - проникність клітинної мембрани для води. 1  out При цьому вираз    є величина максимальної зміни об'єму (закон Вант-Гоффа), 1  exp L  t  визначає як швидко ця зміна відбувається, тобто in 0  out out p а експоненційний множник описує швидкість зміни клітинного об'єму. Тому можна записати:  35 1 40 45 50   V  V0  1  exp  L p  out t  1  exp kt  Vmax  V0 , (2)   out 1 де k  Lp  - характерний час проникнення молекул води до клітини. В основі способу лежить використання зміни об'єму сперматозоїдів, яка не зумовлює їхнє пошкодження. При цьому швидкість зміни об'єму клітини визначається структурою клітинної мембрани і буде тим вище, чим вищою є проникність мембрани для молекул води. Гіпотонічні середовища є природними для сперматозоїдів прісноводних риб в тому значенні, що ініціація їхнього руху відбувається також при зниженні осмолярності зовнішнього середовища, тобто при попаданні клітин у воду. Реакція сперматозоїдів на контакт з гіпотонічними середовищами характеризує стан клітин і може бути показником їх функціонального стану. З точки зору оптики розсіяння світла суспензією визначається розміром, формою, орієнтацією та показником заломлення частинок. Незалежно від стану поляризації падаючого світла послаблення падаючого пучка розраховується за формулою (a, N - радіус та концентрація частинок): 2 χ=Nπa Qnocл (3) Функція послаблення Qпocл дорівнює [20]: Qпосл   2  4 4 sin   2 1  cos    . (4) 2 UA 104809 C2 У виразі прийняті   2xm  1 , 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 x 2a m  m1 m 2 , де λ - довжина хвилі світла у вакуумі, m  , відносний показник заломлення світла, m1 - показник заломлення світла клітини, m2 - показник заломлення світла розчину. Формула (4) в теорії Мі визначає характерні особливості кривої послаблення при значеннях m, які відповідають сперматозоїдам риб. Головки сперматозоїдів коропа уявляються великими шароподібними частинками (а>λ) з показниками заломлення, більшими за показник заломлення світла води. З часом зростає радіус клітини, одночасно з цим відбувається зменшення показника заломлення клітини, що відбувається за рахунок притока води і розбавлення внутрішнього вмісту клітин. На послаблення, а, отже, і на світлопропускання впливає як збільшення розміру частинок, так і зміна показника заломлення, при цьому основний вклад у зміну світлопропускання вносить саме зниження показника заломлення, яке характеризує набухання клітини. Отже, світлопропускання суспензією клітин збільшується одночасно зі збільшенням клітинного об'єму. Світлопропусканню суспензії клітин розміром, характерним для сперматозоїдів коропа, властива незначна чутливість до форми клітин, тобто частинок, що розсіюють світло. Спосіб здійснюють таким чином. Сперматозоїди переносять у кювету з гіпотонічним розчином непроникної у клітини речовини, наприклад NaCl, відомої осмолярності. За допомогою магнітної мішалки суспензію постійно перемішують. Зміну світлопропускання з часом реєструють за допомогою фотоелектроколориметра та фіксують на папері самописцем. Потім проводять її апроксимацію і визначають швидкість зміни світлопропускання, яка обернено пропорційна характерному часу проникнення молекул води до клітини, звідки визначають проникність мембран сперматозоїдів до молекул води. Приклад. Сперму коропа (Cyprinus carpio) отримували у чистий сухий посуд. Під час проведення досліджень зберігали при температурі 15-18 °C у закритому посуді. Вимірювання проводили при температурі 18-20 °C. Водний розчин NaCl доводили до осмотичності 240 мОсмоль/кг, тобто до концентрації 7,540±0,001 г/л. Розчини з осмотичністю 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 мОсмоль/кг отримували розведенням вихідного розчину дистилятом. В процесі вимірювання кювету (внутрішній розмір 10×10×44) за допомогою мікродозатора заповнювали одним з розчинів NaCl (3,6 мл) та занурювали мішалку, виставляли значення світлопропускання на відмітці 100 %, потім вмикали самописець. Сперму за допомогою мікродозатора (36 мкл) додавали у кювету, швидко розмішували протягом 1-2 с та переміщували у кюветне відділення фотоелектроколориметра. Вимірювання проводили при довжині хвилі світла 610 нм. Як тільки зміна світлопропускання припинялась, вимірювання закінчували та ретельно промивали кювету. Обробку результатів проводили наступним чином. Вводили значення світлопропускання суспензії у таблицю на ПК через кожні 10 с. За допомогою пакету програм OriginPro проводили апроксимацію отриманих значень функцією виду T=A-Bexp(-kt), у якій в даному випадку коефіцієнти А і В мають зміст граничного значення світлопропускання та діапазону його зміни, а оut коефіцієнт k - швидкості зміни світлопропускання. Далі будували графік залежності k/π від out out π , де k/π відповідає значенню γLp, тобто служить оцінкою проникності мембран сперматозоїдів для води. Як видно з рисунку, у достатньо широкому діапазоні осмотичності гіпотонічного розчину out -1 -1 NaCl значення k/π є майже постійним і складає в середньому 0,144±0,002 с Осмоль (n=7, р