Ензиматичний метод визначення вмісту l-аргініну в крові людини

Реферат: Ензиматично-хімічний метод визначення вмісту L-аргініну в крові (сироватці та плазмі) ґрунтується на використанні аргінази І, уреази та 2,3-бутандіонмонооксиму. Аргіназа І печінки людини виділена із клітин рекомбінантних штамів дріжджів. Ендогенна сечовина гідролізується уреазою до амонію та карбону діоксиду. Генерована в аргіназній реакції сечовина утворює з 2,3-бутандіонмонооксимом продукт, який визначається флуориметрично. UA 107543 U (54) ЕНЗИМАТИЧНИЙ МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ L-АРГІНІНУ В КРОВІ ЛЮДИНИ UA 107543 U UA 107543 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до діагностичних засобів у медицині і може використовуватись у ветеринарії та фармакології. L-Аргінін - напівзамінна амінокислота, яка служить попередником для біосинтезу багатьох біоактивних сполук, включаючи оксид азоту, поліаміни, симетричні та несиметричні диметильовані похідні гуанідину, гомоаргініну, а також пептиди і білки [1]. Як субстрати NOсинтази, L-Arg та його сполуки можуть бути важливими біомаркерами у клінічній діагностиці багатьох захворювань, зокрема гіпераргінінемії (аргінінемії). Аргінінемія - генетичне захворювання, викликане дефіцитом аргінази І (EC 3.5.3.1), останнього ферменту циклу сечовини, що каталізує гідроліз L-Arg до сечовини [2]. На відміну від інших дефектів циклу сечовини, дефіцит аргінази І, зумовлений мутацією в відповідному гені, зазвичай не викликає катастрофічної амоніємії новонароджених. Але цей дефіцит проявляється у прогресуючих неврологічних симптомах, включаючи судоми, в перші роки життя та важкі печінкові патології новонароджених, зокрема холестаз, гостру печінкову недостатність або фіброз печінки. Для виявлення аргінінемії у немовлят, у деяких економічно розвинутих країнах уряди фінансують програми для здійснення моніторингу крові новонароджених на вміст L-Arg. Встановлено, що своєчасна діагностика дозволяє розпочати адекватне лікування і зупинити розвиток цього рідкісного, але вкрай небезпечного генетичного захворювання [3]. Рівень L-Arg в сечі є маркером гомозиготної цистинурії та обструктивної нефропатії новонароджених [4]. Існують дані, що визначення вмісту L-Arg у сироватці крові дозволяє діагностувати та вивчати особливості перебігу таких захворювань, як артеріальна гіпертензія, гестоз вагітних та інші акушерські ускладнення [5], серцево-судинні, нейродегенеративні, легеневі, аутоімунні захворювання, сепсис, астма, обструктивні захворювання дихальних шляхів та муковісцидоз, запалення кишечнику [6-8], також агресивні гепатокарциноми, меланоми шкіри та колоректальний рак [9]. Моніторинг вмісту L-Arg в плазмі крові здійснюють також при довенному введенні L-Arg в процесі діагностики та експериментального дослідження захворювань ендокринної системи [10]. На сьогодні визначення вмісту L-Arg проводиться методами іонообмінної хроматографії, флуориметрії, спектрофотометрії, капілярного електрофорезу, полярографії, проточноінжекційного аналізу, лазерної флуоресцентної спектроскопії та ін. [11]. Однак, найбільшого поширення набули хроматографічні методи кількісного аналізу L-Arg, зокрема високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ). ВЕРХ ґрунтується на попередній обробці зразків дериватизуючими реактивами з подальшим розділенням цих похідних хроматографією та визначенням цих сполук за допомогою тандемної мас-спектрометрії (ТМС) та флуоресцентної детекції (ФЛ). Хоча метод ВЕРХ є достатньо чутливим, відтворюваним і дає змогу визначати весь набір амінокислот (в 15-20 мкл чистої плазми крові), проте він має і низку недоліків, які обмежують його широке використання, насамперед, у експрес-діагностиці. Перш за все, ВЕРХ вимагає дорогого обладнання та реактивів, що робить відповідні аналізи дорогими для рутинного клінічного аналізу. Цей метод потребує значної кількості органічних розчинників високої якості та дорогих дериватизуючих реагентів. По-друге, час підготовки та аналізу зразка є тривалим і складає від моменту дериватизації до одержання кількісних даних 1-2 доби. На основі проведення патентно-інформаційних досліджень авторами роботи встановлено, що на сьогодні в галузі аналітичної біотехнології існує обмежена кількість даних щодо розробки ензиматичних методів визначення L-Arg. При цьому існуючі ензиматичні тест-системи є переважно мультиферментними із спектрофотометричним детектуванням кінцевого продукту реакції. Зокрема, в роботі [12] повідомляється про розробку ензиматичного методу аналізу L-Arg з використанням п'яти ферментів: аргініндеімінази, аргініносукцинатсинтетази, піруватфосфатдикінази, піруват оксидази та пероксидази хрону з утворенням кольорового продукту, який кількісно оцінюється спектрофотометрично за зміною оптичної густини реакційної суміші при 555 нм. В іншій роботі [13] описано спектрофотометричне визначення L-Arg, яке ґрунтується на використанні трьох ферментів - аргінази, уреази та глутаматдегідрогенази. Детекцію проводять при довжині хвилі 340 нм і обрахунок ведеться із врахуванням коефіцієнта молярної екстинції -1. -1 NADH (6,22 мМ см ). Ліміт чутливості мультиферментного методу - 2 мкМ (0,35 мкг/мл) L-Arg, лінійний діапазон визначення - до 0,47 мМ (81,8 мкг/мл). аргіназа L - Аргінін + H2O Сечовина + H2O 55 уреаза Сечовина + L - Орнітин 2NH3 + CO2 2 - Оксоглутарат + NADPH + NH4+ глутамат дегідрогеназа 1 L - Clu + NADP+ + H2O . UA 107543 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На основі наведеної вище схеми розроблено цілу низку серійних аналітичних наборів для визначення L-Arg (Sigma, Enzytec™, Elisa, Megazyme та ін). Аналізуючи існуючі на сьогодні ензиматичні методи визначення L-Arg, можна зробити висновок, що переважна їх більшість виявляє низку недоліків, зокрема використання каскаду із кількох ферментів; неабсолютну селективність до цільового аналіту, спричинену позитивною реакцією на гуанідинові сполуки; необхідність використання екзогенного кофактора, чи ферментів, що додатково підвищує вартість методів та ускладнює процедуру аналізу. Під час підготовки заявки на пропоновану корисну модель авторами не були виявлені ензиматичні методи для визначення концентрації L-Arg в крові із флуориметричною детекцією продукту за використання аргінази І та 2,3-бутандіонмонооксиму (ДМО). Запропонований та опрацьований на сироватці крові людини ензиматичний метод із флуоресцентною детекцією кінцевого продукту реакції має низку переваг порівняно із відомими методами, зокрема це відсутність складного обладнання, висока селективність та широкий діапазон тестованих концентрацій L-Arg. Нові методи визначення L-Arg, що ґрунтуються на використанні аргініно-гідролізуючих ферментів із наступною флуориметричною детекцією продукту реакції, можуть суттєво покращити систему моніторингу рівня L-Arg в крові. Запропоновані методи можуть стати основою при створенні нових скринінгових тест-систем для моніторингу L-Arg в біологічних рідинах, зокрема крові, які на даний час відсутні в арсеналі засобів вітчизняної клінічної діагностики. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу створення такого флуориметричного ензиматично-хімічного методу аналізу вмісту L-Arg в крові, який дозволяє підвищити точність визначення цільового аналіту за рахунок високої чутливості та селективності, суттєво знижує матеріальні затрати, є простим та швидким у виконанні в порівнянні із відомими ензиматичними підходами. Поставлена задача розв'язується шляхом ензиматичного визначення вмісту L-Arg в крові (сироватці та плазмі) за використання високоселективного до L-Arg фермента - аргінази І печінки людини (далі - аргіназа), виділеної із клітин рекомбінантних дріжджів. Широке використання аргінази природного походження із організму ссавців у біоаналітиці гальмується складністю процедури його очищення, з огляду на це, використання рекомбінанантної аргінази, виділеної із клітин мікроорганізмів, є дуже актуальним. Внаслідок досліджень, із безклітинного екстракту генетично модифікованих термотолерантних метилотрофних дріжджів Н. polymorpha NCYC 495 pGAPl-HsARGl (leu2carl:ScLEU2) [14] за одну стадію колонкової хроматографії на афінному сорбенті - аргінінмакропористому склі одержано високоочищений препарат ензиму (немодифікована аргіназа) [11]. Методом афінної хроматографії на сорбенті Ni-NTA-Superflow (Qiagen) із безклітинного екстракту рекомбінантних дріжджів S. cerevisiae 303/pYEX-4-ARG1 (MATa 1еи2-3/112 игаЗ-1 trpl1 his3-ll/15 ade2-l canl-100) одержано препарат (Нis)6-тагованої аргінази (модифікована аргіназа) [15]. Принцип роботи ензиматично-хімічного методу визначення концентрації L-Arg, розробленого нами раніше за використання немодифікованої аргінази і ДМО [11, 16], пояснюється за допомогою фіг. 1. Можливість практичного застосування розробленого ензиматично-хімічного методу "Аргіназа-ДМО" за використання аргінази та ДМО було показано на зразках промислових фармацевтичних препаратів та комерційних вин [11, 16]. Як свідчить порівняльний аналіз результатів різними методами, новий метод дає результати, які добре корелюють з показниками виробника й даними, одержаними за допомогою референтних методів. Метод "Аргіназа-ДМО" не потребує попереднього відокремлення L-Arg з досліджуваних зразків, є простим у виконанні, високоселективним, надійним і комерційно доступним. Розроблений метод може бути перспективним для створення економічно вигідних тест-систем на L-Arg та застосування їх у лабораторіях харчової та фармацевтичної промисловості. Тому наступним логічним кроком на шляху випробування запропонованого методу стало дослідження його придатності для аналізу L-Arg в реальних зразках біологічних рідин [17], зокрема крові людини, за використання обох препаратів аргінази. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється за допомогою графічних матеріалів. На фіг. 1 наведено схему перебігу реакцій ензиматично-хімічного методу. На фіг. 2 представлено калібрувальний графік для визначення L-Arg та діапазон лінійності ензиматично-хімічного методу "Аргіназа-ДМО". На фіг. 3 показано основні етапи приготування зразків сироватки крові для аналізу L-Arg. 2 UA 107543 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Оптимізовані умови проведення визначення L-Arg за використання обох препаратів аргінази забезпечують лінійність методу в діапазоні 0,28-280 мкМ L-Arg. Чутливість методу є близькою 150 нМ L-Arg (фіг. 2). Приготування зразків крові для аналізу L-Arg у сироватці здійснювали за схемою, зображеною на фіг. 3. Перед початком аналізу ендогенну сечовину, яка присутня в сироватці крові, під впливом уреази розщеплюють до амонію та вуглекислого газу. Ендогенний L-Arg за дії аргінази гідролізується до сечовини та орнітину. Сечовина вступає у хімічну реакцію з ДМО з утворенням продукту (2Е)-бутан-2,3-діон-2-семікарбазону, який детектується флуориметрично при хвилі емісії 515 нм та хвилі збудження 360 нм. Хід аналізу сироватки крові на вміст L-Arg запропонованим методом включав наступні стадії. Кров для аналізу відбирають із вени у стандартні пробірки фірми VACUTE (США), які містять гель, що після центрифугування при 4800 об./хв. протягом 15 хв. відділяє сироватку від клітинних компонентів крові. Одержану сироватку фіксованого об'єму депротеїнізують додаванням 40 % водного розчину трихлороцтової кислоти (ТХО) до кінцевої концентрації 4 % (0,1 мл). Утворену суспензію перемішують, витримують 30 хв. при 0 °C та знову центрифугують упродовж 10 хвилин при 10000 об./хв. Для аналізу використовують безбілкову надосадову рідину (БНР). Одержану БНР зберігають до початку аналізу в холодильнику при +4 °C. У разі, якщо аналізована проба не досліджується протягом 24 годин, її зберігають при -20 °C. 0,5 мл БНР нейтралізують до рН 5,5-7,5, додаючи 0,15-0,2 мл розчину 1,5 М NaOH (контролюючи рН та кінцевий об'єм проби), вносять уреазу (К.Ф. 3.5.1.5, тип IX із бобів), з -1 розрахунку 0,075 мл розчину уреази (420 Од…мл ) на 0,6 мл зразка та інкубують упродовж 50 хв при 37 °C. До одержаної проби додають 0,01 мл 1,5 М NaOH (до рН 9-10), вносять 0,05 мл -1 розчину аргінази (60 Од…мл ) та інкубують упродовж 40 хв. До 0,5 мл кінцевої проби (без розведення та розведеної у 2 та 4 рази) додають 3 мл хімічного реагенту, що містить 0,3 % ДМО, 9 % натрій хлорид в 1,2 М розчині H2SO4, перемішують та кип'ятять на водяній лазні протягом 50 хв. Проби аналізують при довжині хвилі емісії 515-520 нм із хвилею збудження 360 нм на флуорометрі ("Thermo Scientific", США) проти "сліпої" проби. "Сліпу" пробу готують додаванням відповідних кількостей уреази і аргінази до 5 % розчину ТХО у воді з наступними кип'ятінням із хімічним реагентом. Концентрацію L-Arg у кінцевому зразку визначали методом порівняння із двома калібрувальними пробами - 0,4 мМ та 0,8 мМ розчинами L-Arg у 30 мМ ТрісНСІ буфері, рН 8,8 за рівнянням: E CArg  досл  Скл Екл , E досл C Arg   С кл Е кл де - концентрація L-Arg у кінцевій пробі, E досл і Екл - показники інтенсивностей випромінювання в дослідній та калібрувальній пробах; Скл - концентрація L-Arg в калібрувальній пробі, мМ. Слід зазначити, що інтенсивність флуоресценції реакційної суміші залишається стабільною протягом доби. Для перерахунку концентрацій L-Arg у дослідних пробах на концентрацію L-Arg у вихідній плазмі/сироватці, необхідно врахувати сумарний фактор розведення (ФР заг), якій є добутком ФР кожного етапу приготування зразка для аналізу. ФР на кожному етапі визначається як величина співвідношення об'ємів зразків - наступного до попереднього. Так, ФР1=V2/V1, ФР2=V3/V2, ФР3=V4/V3. Таким чином, для визначення концентрації L-Arg в плазмі, слід CArg, розраховану за формулою, перемножити на ФРаг=V4/V1. У таблиці наведено результати досліджень по визначенню границь норми та середніх значень концентрацій L-Arg в сироватках крові 20 здорових людей, жінок і чоловіків, віком від 20 до 40 років. Слід зазначити, що одержані значення концентрацій L-Arg добре корелюють із даними літератури [18-20]. 50 3 UA 107543 U Таблиця Границі норми та середні значення концентрацій L-Arg в сироватці/плазмі крові людини, встановлені різними методами Метод "Аргіназа-ДМО" 1 ЕЛІСА 2 ВЕРХ-ФЛ ВЕРХ-ФЛ 3 TMC 4 ВЕРХ-ТМС ВЕРХ-ТМС ЕЛІСА L-Arg, мкМ Інтервал Середнє 67-147 114,9±7,3 70-110 82,4-108,9 95,7 110±24 162±76 52,2-124,7 87±35 41-115 56,4-125,4 Об'єкт дослідження сироватка Плазма Джерела інформації: Поточна заявка [19] [18] [18] [18] [20] [18] ЕЛІСА - ензиматичний метод за використання комерційного набору; 2 ВЕРХ-ФЛ - високоефективна рідинна хроматографія із флуоресцентною детекцією; 3 ТМС - тандемна мас-спектрометрія без попередньої дериватизації; 4 ВЕРХ-ТМС - ВЕРХ із тандемною мас-спектрометрією. 5 10 15 20 25 Таким чином, отримані значення концентрацій L-Arg демонструють, що запропонований ензиматично-хімічний "Аргіназа-ДМО" метод із флуориметричною детекцією є функціонально придатним для точного та селективного аналізу концентрації L-Arg в крові (сироватці та плазмі) і може бути використаний в клінічній діагностиці. Джерела інформації: 1. Yokoro М. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2012. - Vol. 6, № 7. - P. 1334-1342. 2. Wu G. Morris S.M.Jr. J. Biochem. - 1998. - Vol. 336. - P. 1-17. 3. Lee B.H. et al. Pediatr. Neurol. - 2011. - Vol. 44, № 3. - P. 218-220. 4. Lacroix C. et al. Моl. Cell Proteomics. - 2014. - Vol. 13, № 12. - P. 3421-3434. 5. Wang G. et al. J. Clin. Biochem. Nutr. - 2015. - Vol. 57, №1, P. 74-81. 6. Benson R.C. et al. J. Allergy. - 2011. - Vol. 2011. - P. 1-12. 7. Maarsingh H. et. al. Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. - 2008. - Vol. 378, №2. - P.171184. 8. Fritz J.H. Infect Immun. - 2013. - Vol. 81, № 10. - P. 3500-3502. 9. Lam T. L. et al. Pigment Cell Melanoma Res. - 2011. - Vol. 24, № 2. P. 366-376. 10. Rotondo R. et al. Int. J. Cancer. - 2008. - Vol. 123, № 5. - P. 1108-1116. 11. Гайда Г.З. et al. Biotechnologia Acta. - 2014. - Vol. 7, № 1. - P. 31-39. 12. Yasuhisa Asano Masafumi Kameya Enz. Microb. Technol. - 2014. - Vol. 57, №10. - P.36-41. 13. Mira O. R. J. Agric. Food Chem. - 2001. - Vol. 49, № 2. - P. 549-552. 14. Стасюк Н.Є. та ін. Укр. біохім. журн. - 2010. - Vol.82, № 6. - P. 14-21. 15. Zakalskiy A.E. et al. Protein Expression and Purification. - 2012. - Vol.81. - P.63-68. 16. Stasyuk N., Gaida G., Gonchar M. Appl. Biochem. Microbiol. - 2013. - Vol.49, № 5. - P. 529534. 17. Гайда Г.З. та ін. ScienceRise. - 2015. - T. 11/6 (16) - С. 33-38. 18. Aldamiz-Echevarria L., Andrade F. Int. J.Mol.Sci. - 2012. - Vol.13. - P. 11288-11311. 19. Schon T. et al. Eur. Respir. J. - 2003. - Vol. 21, № 3. - P. 483-488 20. El-Khory J.M. et al. Anal. Bioanal. Chem. - Vol. 402, № 2. - P.771-779. 30 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Ензиматично-хімічний метод визначення вмісту L-аргініну в крові (сироватці та плазмі), що ґрунтується на використанні аргінази І, уреази та 2,3-бутандіонмонооксиму, який відрізняється тим, що: - аргіназа І печінки людини виділена із клітин рекомбінантних штамів дріжджів; - ендогенна сечовина гідролізується уреазою до амонію та карбону діоксиду; - генерована в аргіназній реакції сечовина утворює з 2,3-бутандіонмонооксимом продукт, який визначається флуориметрично. 4 UA 107543 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5