Амперометричний мультибіосенсор для визначення лактату, етанолу та глюкози

Амперометричний мультибіосенсор для визначення лактату, етанолу та глюкози, що містить електрохімічну вимірювальну комірку, призначену для досліджуваного розчину, чотири амперометричні робочі електроди з активними мембранами, нанесеними на поверхню кожного з них, що складаються з ферментів лактатоксидази, алкогольоксидази та глюкозооксидази, селективних до лактату, етанолу та глюкози, відповідно, один робочий електрод з неактивною референтною мембраною із сироваткового альбуміну бика, електрод порівняння, призначений для контролю прикладеного U 2 (19) 1 3 нестача поживних речовин, накопичення токсичного ацетальдегіду, зниження синтезу білків, посилення синтезу ліпідів, зміни обміну нейромедіаторів і нейромодуляторів, порушення гормональної та імунної систем організму [8]. Молочна (лактатна) кислота - універсальний метаболіт живих організмів, кінцевий продукт утилізації цукрів у молочнокислих бактерій та важливий компонент багатьох харчових продуктів. Вона існує у формі двох оптичних ізомерів - L- і D-форм, причому саме L-стереоізомер утворюється при нормальному молочнокислому бродінні під дією Streptococcus thermophilus і є продуктом гліколізу в м'язах. D-ізомер лактату присутній в харчових продуктах у невеликій кількості завдяки наявності особливої мікрофлори, наприклад, Lactobacillus lactis, Lb. bulgaricus і Leuconostoc cremoris [9, 10] або при внесенні синтетичного рацемату молочної кислоти. Обидва ізомери метаболізуються людиною, проте D-форма - набагато повільніше. Визначення вмісту лактату має важливе значення в клінічній діагностиці, в бродильному виробництві та контролі якості харчових продуктів. Рівень молочної кислоти в крові служить важливим клініко-діагностичним індикатором гіпоксії, молочнокислого ацидозу, шокового стану, гострого інфаркту міокарду і має значне прогностичне значення в реанімаційній терапії [11]. Моніторинг рівня цього метаболіту в крові спортсменів є важливим засобом контролю за тренувальним процесом атлетів і використовується для оцінки ефективності відповідних тренажерів і тренувальних режимів [12]. Важливими аналітичними об'єктами при визначенні лактату є харчові продукти, передусім, молочнокислі, а також алкогольні напої (вина, пиво), продукти із добавкою лактату калію, натрію або кальцію як рН-стабілізуючих та протимікробних агентів (зокрема, як добавок до м'ясних продуктів для пригнічення росту патогенних бактерій Listeria monocytogenes), косметичні, фармацевтичні препарати та побутові миючі і антисептичні засоби. В організмі людини та тварин глюкоза є основним та найбільш універсальним джерелом енергії для забезпечення метаболітичних процесів. В тканинах (мозок, серце) та біологічних рідинах (кров, цереброспінальна рідина) рівень глюкози визначається гомеостатичним балансом, що регулює його рівень у визначених, строго детермінованих межах. Зміна рівня глюкози в організмі може мати місце, наприклад, при таких патологіях як діабет [13]. В зв'язку з виключною важливістю підтримки стабільного рівня глюкози в крові у людини та багатьох інших тварин існує складна система гормональної регуляції параметрів вуглеводного обміну. Також, глюкоза грає важливу роль у формуванні органолептичних якостей вина, вони пом'якшують і збагачують смак, покращують аромат та колір вин [14]. Аналіз концентрації глюкози має істотне значення у процесі виноробства не лише через її вплив на смак вина, але й тому, що глюкоза є джерелом вуглецю для дріжджів, які здійснюють ферментацію, та субстратом, що лімітує їх ріст [15]. 48155 4 Таким чином, на сьогодні, в усьому світі, а особливо в нашій країні, дуже актуальним є питання постійного контролю якості харчових продуктів та ранньої медичної діагностики захворювань. Сучасні стандартні методи високоточного визначення вищеназваних речовин, а саме газова та рідинна хроматографії, спектрофотометрія, різноманітні хімічні та фізичні методи потребують наявності складного та дорогого обладнання, яке обслуговує кваліфікований персонал [16]. Також значним недоліком вищезгаданих методів є необхідність у складній попередній підготовці проб, що впливає на час та вартість аналізу. Альтернативою для вирішення вказаних вище проблем є використання біосенсорів - недорогих, чутливих аналітичних приладів. Це реальний шлях для забезпечення як промислового, так і індивідуального контролю продуктів харчування, стану здоров'я людини, та є необхідними для покращення якості життя в цілому. На сьогоднішній день розроблено ряд лабораторних біосенсорів для аналізу лактату, етанолу та глюкози у вині [17-27]. Основна кількість розроблених біосенсорів є моносенсорами, тобто за їх допомогою можна визначити тільки одну речовину. Але, у той же час, необхідно одночасне визначення декількох аналітів за одне вимірювання, яке досягається хроматографічними методами. Застосування більше, ніж одного каналу датчиків веде до розвитку мультисенсорів [28]. Використання багатоканальних електрохімічних перетворювачів дозволяє створити біосенсори для трьох чи більше компонентів, що аналізуються одночасно. Це веде до покращення селективності та надійності сенсорів у порівнянні з одноканальними сенсорами [29]. Також значною перевагою є те, що у аналізаторів на основі мультисенсорів завжди йде автоматизований контроль за процесом. Відомий мультибіосенсор для визначення гербіцидів у річній воді на основі друкованих електродів, зібраних в загальний масив [30], та мультиелектрод, модифікований карбоновими нанотрубками, для амперметричного визначення дегідроксибензен ізомерів [31]. Під час досліджень автори не виявили розробок амперометричних мультибіосенсорів для одночасного контролю лактату, глюкози та етанолу. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу створення такого амперометричного мультібіосенсора, який би дозволив визначати лактат, етанол та глюкозу. Поставлена задача вирішується запропонованим амперометричним мультібіосенсором для визначення лактату, етанолу та глюкози, що містить електрохімічну вимірювальну комірку, призначену для досліджуваного розчину, чотири амперометричних робочих електроди з активними мембранами, нанесеними на поверхню кожного з них, що складаються з ферментів лактатоксидази, алкогольоксидази та глюкозооксидази, селективних до лактату, етанолу та глюкози, відповідно, один робочий електрод з неактивною референтною мембраною із сироваткового альбуміну бика, електрод порівняння, призначений для контролю 5 прикладеного до робочого електроду потенціалу та допоміжний електрод, а також вимірювальнокеруючий модуль з потенціостатом, призначений для підтримування заданого рівня потенціалу на електродах у вимірювальній комірці, вимірювання й перетворення у цифрову форму струмових інформативних сигналів, реєстрації отриманих результатів та керування процесом вимірювання, який здійснює формування заданих напруг живлення та генерування аналогових та логічних сигналів управління вимірювальними перетворювачами і включає в себе мікропроцесорний контролер з відповідним програмним статком нижнього рівня, призначений для виконання вимірювальних операцій, цифрової обробки сигналів та обміну даними з персональним комп'ютером, при цьому робочі електроди підключені до відповідних входів потенціостату, інформаційні виходи і входи керування потенціостату підключені до відповідних входів і виходів вимірювально-керуючого модуля, який підключається через стандартний інтерфейс до персонального комп'ютера. Поставлена задача вирішується за рахунок створення умов для селективної оцінки вмісту лактату, етанолу та глюкози у досліджуваному зразку. Для створення біоселективних елементів мультибіосенсора експериментально було вивчено оптимальний склад ферментів, а саме: лактатоксидази з Pediococcis sp. з активністю 20 од.акт./мг фірми "Sigma", алкогольоксидази з Hansunela sp. з активністю 7,7 од.акт./мг фірми "Sigma", та глюкозооксидази з Aspergillus niger з активністю 271 од.акт./мг фірми "Genzyme". Використання вказаних ферментних систем дозволяє визначити вміст в реальних зразках таких речовин як лактат, етанол та глюкоза. Використання ферментів ЛОД, АОД та ГОД у запропонованій конструкції забезпечило підвищення стабільності та точності вимірювань за рахунок того, що ферментативні реакції на їх основі не потребували екзогенного кофактору, є необоротними, і число аналітичних реакції, які необхідні для отримання сенсорного відгуку, різко скорочується. Для створення селективного мультисенсора, який можна було б використовувати для роботи з реальними зразками, вирішено було застосовувати амперометричний метод вимірювання, тому що дослідження роботи саме амперометричних біосенсорів показали, що зміна концентрації фонового електроліту в буфері та концентрації буфера не впливає на характеристики амперометричного біосенсору. Це, в свою чергу, є великою перевагою, так як фізіологічні, культуральні рідини та харчові продукти, в більшості своїй, мають високу іонну силу та буферну ємність, що, в значній мірі, ускладнює використання кондуктометричних та потенціометричних сенсорів для таких аналізів. У складі мультисенсора використано 4 робочі електроди з чутливими ферментними мембранами, яких вистачає для більш селективного визначення. За рахунок малих розмірів перетворювача є можливість його підключення до портативного амперометричного апаратно-програмного комплексу, розробленого в рамках науково-технічної програми 48155 6 НАН України "Сенсорні системи для медикоекологічних та промислово-технічених потреб". В основі роботи пропонованого мультибіосенсору лежать наступні ферментативні реакції. ГОД Глюкоза + О Глюконолактон + 2 Н2О2; Етанол + О2 АОД ЛОД Ацетальдегід + Н2О2; L-Лактат +О2 Піруват + Н2О2. У присутності кисню (косубстрату ферментативної реакції) іде окислення субстратів з утворенням продуктів реакції ацетальдегіду (етанол), пірувату (лактат), глюконолактону (глюкоза) та пероксиду водню, який можна визначити за допомогою амперометричного перетворювача. Це дозволяє використовувати матрицю амперометричних перетворювачів чи мультисенсорів для перетворення біохімічного сигналу в електричний і реєструвати відгуки мультисенсора на додавання специфічних субстратів. Оптимальне співвідношення компонентів в ферментних мембранах було отримано авторами експериментально за умов оцінки оптимальних характеристик окремих моно елементів мультибіосенсору, таких як чутливість та стабільність при зберіганні, а також мінімальна собівартість. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється за допомогою графічних матеріалів: На Фіг. 1 схематично зображено конструкцію амперометричного мультибіосенсору. На Фіг.2 показано блоксхему амперометричного мультібіосенсору для визначення лактату, етанолу та глюкози. На Фіг. 3 показано відгук мільтибіосенсора на основі амперометричного перетворювача на додавання суміші субстратів. На Фіг. 4 схематично зображено калібрувальні криві мільтибіосенсору на основі амперометричного перетворювача на додавання суміші субстратів. Амперометричний мультібіосенсор (AM) складається з чотирьох амперометричних електродів 1, 2, 3, 4 (РЕ). Амперометричні електроди 1, 2, 3 забезпечені робочими мембранами, відповідно 5, 6, 7, що сформовані із 20 мМ фосфатного буфера, рН 7.2, розчинів ферментів (ЛОД, ГОД та АОХ) та 5 % сироватковим альбуміном бика у співвідношенні 1:1. На амперометричний електрод 4 нанесено референтну мембрану 8 з сироватковим альбуміном бика, сформовану у тому ж буфері. AM має допоміжний електрод 9 (ДЕ) та електрод порівняння - 10 (ЕП). Електрод порівняння 10 призначений для контролю за прикладеним до робочого електроду потенціалом. До складу AM входить також електронно вимірювальний блок 11 (ЕВБ) та триелектродна електрохімічна вимірювальна комірка 12 (ВК). Електронний вимірювальний блок 11 складається з двох частин: базового вимірювально-керуючого модуля 13 (БВКМ) та потенціостату 14 (П), які отримають живлення від автономного джерела живлення 15 (ДЖ) за допомогою блоку живлення 16 (БЖ), що входить до складу БВКМ. AM зв'язаний з персональним комп'ютером 17 (ПК). За допомогою потенціостату 14 підтримують необхідні потенціали електродів у комірці 12, а також знімається і перетворюється вихідний сиг 7 нал з електродів. Базовий вимірювально-керуючий модуль 13 виконує функції, властиві широкому класу вимірювальної апаратури: формує напругу для живлення блоку 11, вимірює та перетворює в цифрову форму вхідні інформативні сигнали (Ux), виробляє аналогові (Uyп) та логічні сигнали управління (СУ) вимірювальними перетворювачами. В даному випадку таким вимірювальним перетворювачем, який формує сигнал Ux, є потенціостат 14. До складу вимірювально-керуючого модуля 13 входить мікропроцесорний контролер 18 з відповідним програмним статком, який забезпечує виконання вимірювальних операцій, необхідну обробку сигналів та обмін даними з персональним комп'ютером 17 через інтерфейс 19. Для сполучення потенціостату 14 з мікропроцесорним контролером 18, базовим вимірювально-керуючим модулем 13, останній містить аналого-цифровий перетворювач 20 (АЦП), цифроаналоговий перетворювач 21 (ЦАП) та блок керування 22 (БК) для формування логічних сигналів управління. При цьому мембрани 5, 6, 7, 8 електродів 1, 2, 3, 4 підключені до відповідних входів потенціостату 14. Кожний електрод 1, 2, 3, 4 забезпечений контактними площадками, призначеними для його підключення до відповідного входу електронно вимірювального блоку 11. Виходи потенціостату 14 підключені до відповідних входів базового вимірювально-керуючого модуля 13, вихід якого призначений для підключення через інтерфейс 19 до входу персонального комп'ютеру 17. Робота згаданого приладу ґрунтується на формуванні багатовимірного масиву електрохімічних сенсорів на основі амперометричного мультиперетворювача. Функціонування мультибіосенсора відбувається шляхом реєстрації струму, який утворюється в результаті окислення електрохімічноактивної речовини - перекису водню на поверхні робочих електродів. Перекис водню утворюється в результаті ферментативної реакції. Пропонований амперометричний мультибіосенсор для визначення вмісту лактату, етанолу та глюкози працює таким чином. Попередньо на робочі поверхні амперометричного перетворювача (Фіг.2) на робочі електроди 1, 2, 3 наносили біоселективні мембрани 5, 6, 7 та на 4 - неактивну референтну мембрану 8, які формували із 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,2 з 10 % гліцерином, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас %): мембрана 5: лактатоксидаза (ЛОД) 5 сироватковий альбумін бика (БСА) у співвідношенні 1:1 5 мембрана 6: алкогольоксидаза (АОД) 24 сироватковий альбумін бика (БСА) у співвідношенні 1:1 5 мембрана 7: глюкозооксидаза (ГОД) 5 сироватковий альбумін бика (БСА) у співвідношенні 1:1 5 мембрана 8: сироватковий альбумін бика (БСА) 10 48155 8 Гліцерин у складі мембран використовували для стабілізації ферменту при іммобілізації та запобігання передчасного підсихання розчину, нанесеного на поверхню перетворювача. В свою чергу, БСА, в складі робочих мембран, відігравав роль стабілізуючого агенту для ферментів. Іммобілізацію проводили в парах глутарового альдегіду протягом 20 хвилин. Після чого біосенсор підсушували на повітрі 10 хвилин. Амперометричний мультібіосенсор для визначення лактату, етанолу та глюкози підключали до ЕВБ в режимі амперометричних вимірювань, поміщали до вимірювальної комірки ВК об'ємом 5,0 мл, заповненої 100 мМ фосфатним буфером, рН 7,2 (на схемі не показано) та витримували декілька хвилин для отримання стабільної базової лінії. Потім додавали певну аліквоту модельних розчинів чи реальних зразків та отримували амперометричний сигнал з робочих електродів 1, 2, 3 та 4 (Фіг. 3). Концентрація лактату, етанолу та глюкози у реальних зразках визначали за калібрувальними кривими, побудованими на основі модельних розчинів лактату, етанолу та глюкози (Фіг. 4). За рахунок використання у якості селективної мембрани ЛОД, АОД та ГОД стабільність і точність пропонованого пристрою була високою. Запропонований амперометричний мультібіосенсор для визначення лактату, етанолу та глюкози показав лінійну залежність величини відгуку від концентрації лактату 0,0005-0,64 мМ, етанолу 0,16,4 мМ та глюкози 0,0005-1,6 мМ, незалежність величини відгуку від параметрів вимірювального середовища та достатньою стабільністю при зберіганні. Після 32 діб амперометричний мультибіосенсор зберіг свої основні аналітичні характеристики, що дозволяло проводити повномірні виміри. Джерела інформації: 1. Marcela A. Segundo, Jose L.F.C. Lima, Antonio O.S.S. Rangel Automatic flow systems based on sequential injection analysis for routine determinations in wines // Analytica Chimica Acta 513 (2004) 3-9. 2. Christiane Ziegler, Wolfgang Gopel Biosensor development // Chemical Biology. - 1998. - V. 2, Issue 5. - P. 585-591. 3. Нужный В.П. Токсикологическая характеристика этилового спирта, алкогольных напитков и содержащихся в них примесей // Вопр. наркологии. - 1995. - N 3. - с. 65- 74. 4. Philip О. Ettinger, Chia F. Wu, Catalino De La Cruz Jr., Allen B. Weisse, S. Sultan Ahmed, Timothy J. Regan Arrhythmias and the "Holiday Heart": Alcoholassociated cardiac rhythm disorders // Am. Heart J. - 1978. - Vol. 95, N5. - P. 555-562. 5. Нужный В.П. Катехоламины в патогенезе алкогольного поражения сердца // Вопр. наркологии. - 1993. - N 4. - с. 90-96. 6. Mallov S. // In: Stress and Alcohol Use, N.Y.e.a. - 1983. - P. 369-386. 7. Videla L.A. Assessment of the scavenging action of reduced glutathione, (+)-cyanidanol-3 and ethanol by the chemiluminescent response of the xanthine oxidase reaction. // Experienta. - 1983. - Vol. 39, N 5. - P. 500-502. 9 8. Харченко О., Гавриш Л., Остапченко Л. Токсична дія етанолу та його продуктів на організм // Вісн. HAH України, 2006, № 3 с. 57-67. 9. Syrnons H. Nutritional value of yogurt and fermented milks // Danone World Newsletter. 1993, N2 P. 1-4. 10. Saloff-Coste C.J., Kefir. Nutritional and Health Benefits of yoghurt and fermented milks // Danone World Newsletter 1996, N 11 P. 1-7. 11. Artiss J.D., Karcher R.E., Cavanagh K.T., Collins S.L., Peterson V.J., Varma S., Zak В. А liquidstable reagent for lactic acid levels. Application to the Hitachi 911 and Beckman CX7 // Am. J. Clin. Pathol. 2000. 114, N 1. P. 139-143. 12. Jones A.M., Carter H. The effect of endurance training on parameters of aerobic fitness // Sports Med. 2000. 29, N 6. P. 373-386. 13. Norberg K. Changes in the cerebral metabolism induced by hyperventilation at different blood glucose levels // J. Neurochem. - 1979. - V. 26. - P. 353-359. 14. Alkasrawi M., Popescu I.C., Laurinavicius V., Mattiassona В., Csöregi E. A redox hydrogel integrated PQQ-glucose dehydrogenase based glucose electrode // Anal. Commun. - 1999. - Vol. 36. - P. 395-398. 15. Niculescu M., Mieliauskiene R., Laurinavicius V., Csöregi E. Simultaneous detection of ethanol, glucose and glycerol in wines using pyrroloquinoline quinone-dependent dehydrogenases based biosensors // Food Chemistry. - 2003. - Vol. 82. - P. 481 - 489. 16. Lucilene Dornelles Mello, Lauro Tatsuo Kubota Review of the use of biosensors as analytical tools in the food and drink industries // Food Chemistry. - 2002. - V 77. - P. 237-256. 17. Rhemrev-Boom M.M., Jonker M.A., Venema K., Jobst G., Tiessen R. On-line continuous monitoring of glucose or lactate by ultraslow microdialysis combined with a flow-through nanoliter biosensor based on poly(m-phenylenediamine) ultrathin polymer membrane as enzyme electrode // Analyst. - 2001. - Vol. 126, № 7. - P. 1073-1079. 18. Palmisano F., Rizzi R., Centonze D., Zambonin P.G. Simultaneous monitoring of glucose and lactate by an interference and cross-talk free dual electrode amperometric biosensor based on electropolymerized thin films // Biosensors and Bioelectronics. - 2000. - Vol. 15, № 9 - 10. - P. 531539. 19. Moser I., Jobst G., Urban G.A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine // Biosensors and Bioelectronics. - 2002. - Vol. 17, № 4. - P. 297-302. 20. Badea M., Curulli A., Palleschi G. Oxidase enzyme immobilisation through electropolymerised films to assemble biosensors for batch and flow 48155 10 injection analysis // Biosensors and Bioelectronics. Vol. 18, № 5-6. - 2003. - P. 689-698. 21. Esti M, Volpe G., Micheli L., Delibato E., Compagnone D., Moscone D., Palleschi G. Electrochemical biosensors for monitoring malolactic fermentation in red wine using two strains of Oenococcus oeni // Analytica Chemica Acta - 2004. Vol. 513, № 1. - P. 357-364. 22. Serra В., Reviejo A.J., Parrado C, Pingarron J.M. Graphite-Teflon composite bienzyme electrodes for the determination of L-lactate: Application to food samples // Biosensors. Bioelectron. - 1999. - Vol. 14, № 4-6. - P. 505-513. 23. Vijayakumar A.R., Csöregi E., Heller A., Gorton L. Alcohol biosensors based on coupled oxidase-peroxidase systems // Anal. Chim. Acta. 1996. - Vol. 327, № 3. - P. 223-234. 24. Lidén H., Vijayakumar A.R., Gorton L., Marko-Varga G. Rapid Alcohol Determination in Plasma and Urine by Column Liquid Chromatography with Biosensor Detection // J. Pharm. Biomed. Anal. 1998. - Vol. 17, № 6-7. - P. 1111-1128. 25. Künnecke W., Schmid R.D. Gas-diffusion dilution flow-injection method for the determination of ethanol in beverages without sample pretreatment // Anal. Chim. Acta. - 1990. - Vol. 234. - P. 213-220. 26. Xie X., Suleiman A.A., Guilbault G.G., Yang Z., Sun Z. Flow-injection determination of ethanol by fiber-optic chemiluminescence measurement // Ana. Chim. Acta. - 1992. - Vol. 266, № 2. - P. 325-329. 27. Morales A., Céspedes F., Martínez-Fàbregas E., Alegret S. Ethanol amperometric biosensor based on an alcohol oxidase-graphite-polymer biocomposite // Electrochimica Acta. - 1998. - Vol. 43, № 23. - P. 3575-3579. 28. Silber A., Bräuchle C, Hampp N. Derhydrogenase-based thick-film biosensors for lactate and malatate // Sensors and Actuators B. 1994. - Vol. 18, № 1-3. - P. 235-239. 29. Otto V., Thomas J.D.R. Model studies on multiple channel analysis of free magnesium, calcium, sodium and potassium at physiological concentration levels with ion-selective electrodes // Anal. Chem. 1985. - Vol. 57, № 13. - P. 2647-2651. 30. E. Touloupakisa,l, L. Giannoudib, S.A. Piletskyb, L. Guzzellac, F. Pozzonic, M.T. Giardia, A multi-biosensor based on immobilized Photosystem II on screen-printed electrodes for the detection of herbicides in river water// Biosensors and Bioelectronics 20 (2005) 1984-1992. 31. Dongdong Zhang, Yage Peng, Honglan Qi, Qiang Gao, Chengxiao Zhang Application of multielectrode array modified with carbon nanotubes to simultaneous amperometric determination of dihydroxybenzene isomers // Sensors and Actuators В 136 (2009) 113-121. 11 48155 12 13 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков 48155 Підписне 14 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601