Спосіб кількісного визначення деяких лікарських препаратів за ефектом гасіння люмінесценції комплексної сполуки тербію

Спосіб кількісного визначення деяких лікарських препаратів за ефектом гасіння люмінесценції комплексної сполуки тербію, що передбачає приготування розчину проби, взаємодію його з реагентами при заданому рН та вимірювання інтенсивності люмінесценції реакційного розчину при еміс=545нм, який відрізняється тим, що як реагенти використовують стандартні розчини хлориду тербію та 1-бутил-4-гідроксі-2-оксо-1,2дигідрохінолін-3-карбонової кислоти (4метилпіридин-2-іл)-аміду при рН 7,0-8,0. (19) (21) u201002860 (22) 15.03.2010 (24) 11.10.2010 (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) ЛЕОНЕНКО ІННА ІГОРІВНА, АЛЕКСАНДРОВА ДАР'Я ІГОРІВНА, ЄГОРОВА АЛЛА ВОЛОДИМИРІВНА, УКРАЇНЕЦЬ ІГОР ВАСИЛЬОВИЧ, АНТОНОВИЧ ВАЛЕРІЙ ПАВЛОВИЧ (73) ФІЗИКО-ХІМІЧНИЙ ІНСТИТУТ ІМ. О.В. БОГАТСЬКОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ 3 53414 також інших умов проведення реакції та ефекту гасіння люмінесценції, стає можливим забезпечити високу чутливість визначення ЛП. Поставлена задача вирішена в способі визначення лікарських препаратів за ефектом гасіння люмінесценції комплексної сполуки тербію, що передбачає приготування розчину проби, взаємодію ЛП з реагентами при заданому рН та вимірювання Інтенсивності люмінесценції реакційного розчину при еміс=545нм тим, що в якості реагентів використовують стандартні розчини хлориду тербію і 1-бутил-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін3-карбонової кислоти-(4-метил-пірідин-2-іл)-аміду при рН=7.0-8.0. Новим в заявленій корисній моделі є наявність таких ознак: - взаємодія розчину проби із сумішшю, що містить органічний ліганд - 1-бутил-4-гідрокси-2-оксо1,2-дигідрохІнолін-3-карбонової кислоти-(4-метилпірідин-2-іл)-амід; - умови взаємодії - рН=7.0-8.0. В заявленому способі використаний ефект гасіння ЛП сенсибілізованої флуоресценції іону тербію у комплексі, який характеризується квантовим виходом (Q=0.41) та часом життя збудженого стану іонів тербію ( =850мкс). Досягнення низьких меж виявлення ЛП стало можливим завдяки використанню нового люмінесцентного зонду - комплексу тербію з новим лігандом. Це можна пояснити наступним. Органічний ліганд - 1-бутил-4-гідрокси2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової кислоти-(4метил-пірідин-2-іл)-амід - відноситься до похідних 2-оксо-4-гідрокси-хінолінкарбонової кислоти І має таку структурну формулу (див. І.В. Українець, С.А. Ель Каяль, О.В. Горохова, Л.В. Сидоренко // Фармацевтичний журнал. - 2004. - №4. - С.47-53): CH3 OH O N H N N O C4 H9 (R) Цей реагент має в ультрафіолетовій області спектру смугу поглинання за довжини хвилі =313нм ( =24600л·моль-1·см-1), що обумовлює ефективне поглинання енергії збудження. Ця енергія передається з триплетного рівня ліганду (Е=22150см-1) на енергетичний рівень Тb3+ (Е=20500см-1), що призводить до сенсибілізації люмінесценції тербію. Взаємодія люмінесцентного зонду - комплексу Tb-R з ЛП відбувається при рН 3-11, максимум люмінесценції спостерігається при рН 7.0-8.0. У запропонованому способі для утворення оптимального рН розчину використовується 0.4мл 40%-ного розчину уротропіну. Підвищення чутливості стало можливим завдяки використанню ефекту гасіння сенсибілізованої люмінесценції іонів тербію у комплексі з R. Максимальний ефект гасіння спостерігається при співвідношенні Tb:R=1:1 (СTb=CR=1×105 моль/л). Ілюм тербію в комплексі Tb-R максималь 4 на при опромінюванні утвореного комплексу УФсвітлом з збудж=317нм (див. Фіг.1, де наведено спектри збудження (а) та люмінесценції (b) комплексу Tb-R (СTb=CR=1×10-5моль/л). Встановлено, що додавання до розчину люмінесцентного зонду Tb-R деяких лікарських препаратів призводить до гасіння люмінесценції даного комплексу. Дане явище використано для люмінесцентного визначення ЛП. Для прикладу наведена залежність інтенсивності люмінесценції комплексу від концентрації цитізіну (див. Фіг.2 - де наведено спектри люмінесценції комплексу Tb-R у присутності різних концентрацій цитізіну (СTb=CR=1×10-5моль/л). Також встановлено, що при додаванні різних концентрацій ЛП час життя збудженого стану іонів тербію не змінюється. Для прикладу наведені криві затухання люмінесценції комплексу Tb-R у присутності різних концентрацій цитізіну (див. Фіг.3 - де наведено криві затухання люмінесценції комплексу Тb-R (СTb=CR=1×10-5моль/л).у присутності різних концентрацій цитізіну (мкг/мл): 1-0; 2-5; 3-40; 4100. Висунуто припущення щодо змішаного механізму гасіння: статичному, пов'язаному з утворенням систем Тb(III)-R-ЛП, та динамічному, обумовленому зіткненням молекул зонду та гасників у збудженому стані. При цьому спостерігається характерна в таких випадках особливість графіку ШтернаФольмера - відхилення вгору та вверх и вгнутість по відношенню до осі у (див. Lakowicz J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York:Plenum, 1986). Залежність I0/I від СЛП (градуювальний графік у координатах Штерна-Фольмера) у широкому інтервалі описується поліномінальними рівняннями другого порядку І0/І=А+В1СЛП+В2СЛП2, де А, В1 и В3 - емпірічні коефіцієнти (для етакринової кислоти та прогестерону - лінійні залежності). Також лінійні залежності спостерігаються на вузьких концентраційних Інтервалах для малих концентрацій препаратів, для яких можливо застосування методу стандартного зразку. Для визначення можливо використовувати також модифіковані форми рівняння Штерна-Фольмера у координатах log(I0/I) від концентрації ЛП (мкг/мл), які являють собою лінійні залежності (див. таблиця 1). В табл.1 наведені аналітичні характеристики розроблених методик визначення ЛП. В табл.2 наведені результати визначення цитізіну (X) в таблетках «Табекс», виробництва «Sopharma, Bulgaria» (P=0.95, n=5). В табл. 3 наведені результати визначення ЛП (X) в дозованих лікарських формах (P=0.95, n=5). Приклад Визначення цитІзіну проводили в умовах тесту «Кількісне визначення» для таблеток «Табекс» виробництва «Sopharma, Bulgaria» (цитізіну 1.5мг). Для кількісного визначення використано метод флуориметрії (див. Державна Фармакопея України/Державне підприємство "Науково-експертний фармакопейний центр". - 1-е вид. - Харків: РІРЕГ, 2001. - Доповнення 1. - С.9). 5 53414 Методика основана на порівнянні Ідіом випробовуваного розчину та розчину робочого стандартного зразка (РСЗ). Градуювальний графік будують наступним чином: у мірні колби місткістю 10мл вносять по 0,05; 0.1; 0.3; 0.5; 0.7; 1.0мл робочого розчину цитізіну (100мкг/мл) та 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9; 1.0; 1.5;2.0 робочого розчину цитізіну (1000мкг/мл) (5 паралельних вимірів), в кожну колбу додають по 1.0мл 1×10-4моль/л розчину хлориду тербію, 0.1мл 1×10-3моль/л розчину R, 0.4мл 40%-ного розчину уротропіну. Доводять водою до 10.0мл та перемішують. Паралельно готують розчин контрольної проби, який містить усі компоненти, крім цитізіну. Вимірюють інтенсивність люмінесценції за еміс=545нм ( збудж=317нм) у кожній точці (І) та інтенсивність люмінесценції контрольної проби (І0). За допомогою одержаних результатів будують градуювальний графік залежності І0/І від концентрації цитізіну (мкг/мл) у координатах ШтернаФольмера (див. Фіг.4, а, б) та градуювальний графік залежності log(I0/I) від концентрації цитізіну (мкг/мл) (див. Фіг. 4, в) в інтервалі концентрацій цитізіну 0.5-200.0мкг/мл. На Фіг.4 наведений градуювальний графік у координатах Штерна-Фольмера в інтервалі концентрацій цитізіну 0.5-200.0мкг/мл (а) та 0.540.0мкг/мл (б), градуювальний графік залежності log(I0/I) від концентрації цитізіну (в) в інтервалі Концентрацій цитізіну 0.5-100.0мкг/мл -5 (СTb=СR=1×10 моль/л, рН 7.0-8.0). Методика Випробовуваний розчин. Наважку 0.3000г (m1) порошку 20 розтертих таблеток (середня маса таблетки b=0.1040г) поміщають у мірну колбу місткістю 25.0мл, додають 20.0мл води та перемішують на магнітній мішалці протягом 15хв, доводять водою до 25.0мл і фільтрують крізь мембранний фільтр 0.20мкм (Minisart RC 15, "Sartorius"). Відкидають перші порції фільтрату. Далі 2.0мл фільтрату вносять у мірну колбу об'ємом 10.0мл, далі додають 1.0мл 1×10-3моль/л розчину хлориду тербію, 0.1мл 1×10-3моль/л розчину R, 0.4мл 40%-ного 6 розчину уротропіну. Доводять водою до 10.0мл та перемішують. Вимірюють інтенсивність люмінесценції (Іпр) при еміс=545нм (опромінювання УФ-світлом при збудж=317нм). Паралельно вимірюють інтенсивність люмінесценції розчину робочого стандартного зразка (РСЗ) цитізіну (Іст). Розчин РСЗ цитізіну. 0.025г цитізіну (m0) розчиняють у 25.0мл води (1000мкг/мл). 0.3мл одержаного розчину вносять у мірну колбу об'ємом 10.0мл, а далі додають всі реактиви, як зазначено в приготуванні випробовуваного розчину. Розчин використовують свіжоприготовлений. Паралельно готують розчин контрольної проби, який містить усі компоненти, крім цитізіну. Вимірюють інтенсивність люмінесценції контрольної проби (І0) за зазначених вище умов. При розрахунку І1 та І2 враховують Ілюм контрольної проби за формулами: І1=І0/Іпр і І2=І0/Іcт. Вміст цитізіну (X, мг) в одній таблетці обчислюють за формулою: I m 0,3 25 10 b 1000 X 1 0 I2 m1 25 10 2 I1 m0 0,15 b 1000 , I2 m1 Для кожного з ЛП побудовані градуювальні графіки залежності І0/І від концентрації ЛП (мкг/мл) у координатах Штерна-Фольмера та градуювальні графіки залежності log(I0/I) від концентрації ЛП (мкг/мл). Визначення ЛП проведено аналогічно прикладу (випробовувані розчини, розчини РСЗ та розведення проводять згідно вмісту ЛП в дозованих формах). Точність і достовірність визначення ЛП у розчинах перевірені методом "введено-знайдено". При n=5; Р=0.95 відносне стандартне відхилення (Sr) складає 0.010-0.034. Таким чином, спосіб дозволяє забезпечити достатню чутливість та збіжність визначення деяких лікарських препаратів у дозованих формах. Таблиця 1 Аналітичні характеристики розроблених методик визначення ЛП Визначуваний лікарський препарат 1 N CH2 COOH CH С H3 C Акривастин Рівняння у координатах ШтернаДіапазон визначуваФольмера: полімінальне; лінійне; мо- них концентрацій, дифіковане мкг/мл 2 3 І0/І=2.42-0.160САкр+0.003САкр2 0.1-200.0 (R=0.988) І0/І=1.23+0.081САкр (R=0.989) 0.1-50.0 N CH CH Log(І0/І)=0.17+0.010САкр (R=0.987) 0.1-200.0 7 53414 8 Продовження таблиці 1 1 O 0.5-400.0 Log(І0/І)=0.04+0.04СКар (R=0.0997) OH 2 2 І0/І=1,38-0,009СКар+0.0002СКар (R=0,996) І0/І=0.98+0.022СКар (R=0.995) O N H O 3 0.5-400.0 0.5-90.0 CH3 N H Карведілол O І0/І=1.84-0.114СДид+0.0113СДид2 (R=0.996) І0/І=0.85+0.170СДид (R=0.996) С CH3 CH3 CH3 H H H H 0.5-100.0 0.5-20.0 Log(І0/І)=0.02+0.031СДид (R=0.997) 0.5^0.0 І0/І=1.05+0.008СПрог (R=0.997) O 1.0-500.0 Дидрогестерон CH3 CH3 O С H H CH3 H O Прогестерон (С2H5)2NCH2CH2 О CH2CH2N(C2H5)2 О С .2HO І0/І=1.56-0.002САмік+0.0002САмік2 (R=0.997) І0/І=1.18+0.030САмік (R=0.997) Log(І0/І)=0.14+0.004САмік (R=0.982) 0.1-500.0 0.1-200.0 0.1-300.0 Аміксин І0/І=1.92-0.012СЦит+0.0047СЦит2 (R=0.997) І0/І=0.97 + 0.104СЦит (R=0.995) NH N O 0.5-200.0 0.5-40.0 Log(І0/І)=0.10+0.015СЦит (R=0.996) Цитізін CH2O O O C С H2 OH H3 C C С С H2 Cl Cl 0.5-100.0 І0/І=0.91+0.019СЕК (R=0.996) 1.00-400.0 Етакринова кислота CH3 Cl N N HCl CH3 Хлоропіраміну гідрохлорид І0/І=1.68-0.020CХГ+0.0003СХГ2 (R=0.996) І0/І=1.02+0.022CХГ (R=0.995) Log(І0/І)=0.09+0.004CХГ (R=0.990) 1.00-500.0 1.00-100.0 1.00-500.0; 2 OC2H3 OC2H5 І0/І=2.42-0.086СДГ+0.0014СДГ (R=0.996) І0/І=1.34+0.056СДГ (R=0.995) 0.5-300.0 0.5-100.0 HCl H3C2O NH Log(І0/І)=0.24+0.006СДГ (R=0.995) 0.5-300.0 H3C2O Дротаверіну гідрохлорид _ SO3 OH H2N+(C2H5)2 HO n Етамзилат І0/І=2.11-0.008СЕтам+0.0001СЕтам2 (R=0.973) І0/І=1.19+0.019СЕтам (R=0.992) Log(І0/І)=0.22+0.002CЕтам (R=0.991) 1.00-600.0 1.00-00.0 1.00-600.0 9 53414 10 Таблиця 2 Серія 21008-102010 21009-102010 Х, мг 1.59 1.48 1.47 1.48 1.51 1.55 1.48 1.43 1.49 1.52 Хер± Х 1.51±0.06 Sr 0.033 1.49±0.06 0.0301 Таблиця 3 Результати визначення ЛП (X) в дозованих лікарських формах (Р=0.95, n=5) Об'єкт аналізу КАПСУЛА "Семпрекс" ("СмітКляйн Бічем Фармасьютикалс", Великобританія) - акривастину 8мг ТАБЛЕТКА "Коріол" ("KRKA", Словенія) - карведілолу 3,125мг ТАБЛЕТКА "Дуфастон" ("Solvey Pharma", Нідерланди) - дидрогестерону 10мг КАПСУЛА "Утрожестан" ("Besins Healhtcare", Бельгія) - прогестерону 100мг ТАБЛЕТКА "Аміксин 1C" ("ОАО ІнтерХім", Україна) - аміксину 60мг ТАБЛЕТКА "Табекс" ("Sорhаrmа",Болгарія) - цитізину 1.5мг ТАБЛЕТКА "Урегіт" ("Egis", Угорщина) етакринової кислоти 50мг ТАБЛЕТКА "Супрастин" ("Egis", Угорщина) хлоропіраміну гідрохлорид 25мг ТАБЛЕТКА "Но-шпа" ("Chinoin Chemical Pharmaceutical", Угорщина) - дротаверіну гідрохлорид 40мг ТАБЛЕТКА "Діцинон" ("SANDOZ", Німеччина) - етамзилату 250мг Знайдено, мг 7.94±0.30 Sr 0.030 3.09±0.13 10.14±0.36 0.034 0.028 100.2±1.9( 0.016 60.4±1.3 1.51 ±0.06 50.4±1.3 25.0±0.9 0.018 0.033 0.030 0.029 40.3±1.0 0.021 249.1±3.1 0.010 11 53414 12 13 Комп’ютерна верстка O. Рябко 53414 Підписне 14 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601