Спосіб стандартизації листя маслинки вузьколистої (elaeagnus angustifolia l.) в багатокомпонентних рослинних сумішах

Реферат: UA 82228 U UA 82228 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі фармації, зокрема до фітохімії, і може бути використана для стандартизації лікарської рослинної сировини та рослинних сумішей. Листя маслинки вузьколистої має різноманітну фармакологічну дію, що зумовлює її широке використання у медичній практиці. Даній лікарській сировині притаманні протизапальні, антиоксидантні та аналгезуючі властивості [1, 5-7]. За літературними даними анальгезуюча та протизапальна дія листя маслинки пов'язана з вмістом флавоноїдів [8]. Виходячи з того, що одним із мажоритарних представників флавоноїдів у листі маслинки вузьколистої є кемпферол-3-0--D-глюкопіранозид (астрагалін) [2], вважалось за доцільне дослідити можливість використання цієї сполуки як маркера для визначення маслинки вузьколистої в рослинних сумішах. За прототип нами вибрано спосіб стандартизації листя маслинки вузьколистої за кількісним вмістом суми флавоноїдів, у перерахунку на рутин, що проводиться за допомогою методу УФспектрофотометрії [9]. Недоліком існуючого способу стандартизації сировини є те, що найближчий аналог передбачає стандартизацію моносировини маслинки вузьколистої. Об'єкт, який підлягає удосконаленню - спосіб ідентифікації та визначення вмісту біологічно активних речовин, що містяться в сировині листя маслинки вузьколистої в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входять листя маслинки вузьколистої, корені алтеї лікарської, насіння льону та корені цикорію дикого. Зазначена лікарська сировина широко використовується для виготовлення як монопрепаратів, так і полікомпонентних фітозасобів, що представлені на фармацевтичному ринку України [3, 4]. В основу корисної моделі поставлено задачу - удосконалити ідентифікацію сировини листя маслинки вузьколистої в багатокомпонентних рослинних сумішах шляхом підтвердження наявності флавоноїду астрагаліну та визначення його вмісту і, таким чином, забезпечити можливість стандартизації багатокомпонентних рослинних сумішей, до складу яких входить сировина листя маслинки вузьколистої. Поставлена задача вирішується тим, що запропонована ідентифікація та кількісне визначення астрагаліну як компонента маслинки вузьколистої за допомогою методу ВЕРХ в присутності біологічно активних речовин інших рослин. Це досягається застосуванням твердофазної екстракції для очищення досліджуваних розчинів від заважаючих речовин. При цьому використовується градієнтне елюювання з використанням водно-ацетонітрильної рухомої фази, застосування якої дозволяє домогтися розділення піків астрагаліну маслинки вузьколистої та біологічно активних речовин інших рослин. Як зазначалося, у сировині листя маслинки вузьколистої міститься біологічно активна речовина флавоноїд астрагалін [2]. Виходячи з цього, із застосуванням методу високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), нами було розроблено хроматографічну методику визначення астрагаліну в сировині маслинки вузьколистої. За розробленою методикою було ідентифіковано та кількісно визначено флавоноїд астрагалін. Його вміст у досліджуваній сировині становив 0,091±0,004 % в перерахунку на висушену сировину. Процес ідентифікації та кількісного визначення флавоноїду астрагаліну, як компонента сировини маслинки вузьколистої в багатокомпонентних рослинних сумішах, полягає в знаходженні умов для хроматографічного розділення астрагаліну як компонента маслинки вузьколистої та біологічно активних речовин інших рослин. Приклади конкретного виконання. Приклад 1. Приготування досліджуваного розчину: до 1 г рослинної суміші наступного складу: листя маслинки вузьколистої -1 г, коренів алтеї лікарської -1 г, насіння льону -1 г, коренів цикорію дикого - 1 г вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному нагрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 15 %, та пропускають отриманий зразок через патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США), який попередньо активують, пропускаючи 5 мл метанолу. Далі пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. По 5 мкл досліджуваного розчину та розчину стандарту астрагаліну поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі, обладнаному УФ-детектором в наступних умовах: колонка Phenomenex Luna С 18(2), розміром 150 мм  4,6 мм, розмір частинок 5 мкм; 1 UA 82228 U температура колонки -35 °C; довжина хвилі детектування - 350 нм; швидкість потоку рухомої фази - 1 мл/хв.; об'єм проби, що вводився - 5 мкл; рухома фаза: Час хроматографування, хв. 0-1 1-26 26-33 33-48 48-50 50-55 55-70 Елюент А, % 100 10080 80 8050 5020 20 100 Елюент Б, % 0 020 20 2050 5080 80 0 5 10 Елюент А: 0,1 % розчин трифтороцтової кислоти в 5 % розчині ацетонітрилу в воді; Елюент Б: 0,1 % розчин трифтороцтової кислоти в ацетонітрилі. Вміст астрагаліну в досліджуваній багатокомпонентній рослинній суміші (в %) обчислюється за наступною формулою: A p  Cs  100  100  100 , X A s  mp  100  W  де A p - площина піку астрагаліну на хроматограмі досліджуваного розчину; A s - площина піку астрагаліну на хроматограмі розчину порівняння астрагаліну; Cs - концентрація астрагаліну в розчині порівняння астрагаліну, г/мл; mp - наважка досліджуваної суміші, г; 15 20 25 30 35 40 45 W - втрата в масі при висушуванні досліджуваної рослинної суміші. Приготування розчину порівняння астрагаліну: 0,005 г (точна наважка) стандартного зразку астрагаліну вміщують в мірну колбу місткістю 50 мл, розчиняють в 15 мл 50 % етилового спирту, доводять до мітки тим же розчинником та перемішують. На хроматограмі досліджуваного розчину повинен бути присутній пік, час виходу якого відповідає часу виходу піку астрагаліну на хроматограмі розчину порівняння астрагаліну. На підставі експериментальних даних для сировини маслинки вузьколистої нами рекомендований наступний граничний вміст астрагаліну: не менше 0,091 % в перерахунку на висушену сировину. За вказаних вище умов було проаналізовано досліджувані розчини, приготовлені наступним чином: Приклад 2. Приготування модельної суміш без вмісту листя маслинки вузьколистої: до 1 г рослинної суміші наступного складу: коренів алтеї лікарської - 1 г, коренів цикорію дикого - 1 г, насіння льону - 1 г, вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному нагрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 15 %, та пропускають отриманий зразок через патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США), який попередньо активують, пропускаючи 5 мл метанолу. Далі пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Приклад 3. Приготування екстракту листя маслинки вузьколистої: 0,5 г листя маслинки вузьколистої вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному нагрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 15 %, та пропускають отриманий зразок через патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США), який попередньо активують, пропускаючи 5 мл метанолу. Далі пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. 2 UA 82228 U 5 10 15 Хроматограми розчину порівняння астрагаліну, екстракту листя маслинки вузьколистої, досліджуваного розчину та модельної суміші без вмісту листя маслинки вузьколистої представлені на фіг. 1, фіг. 2, фіг. 3 та фіг. 4 відповідно. За даних умов аналізу пік астрагаліну має час виходу близько 25 хвилин (фіг. 1). На хроматограмах екстракту листя маслинки вузьколистої та досліджуваного розчину присутній пік астрагаліну (фіг. 2 та фіг. 3 відповідно), на хроматограмі модельної суміші без вмісту листя маслинки вузьколистої (фіг. 4) - даний пік відсутній. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що у рослинній суміші, до складу якої входять листя маслинки вузьколистої, корені алтеї лікарської, корені цикорію дикого та насіння льону, присутність та вміст листя маслинки вузьколистої можна визначати за наявністю та кількісним вмістом флавоноїду астрагаліну. Корисна модель обумовлює можливість ідентифікації та визначення кількісного вмісту сировини листя маслинки вузьколистої у багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входять: листя маслинки вузьколистої, корені алтеї лікарської, корені цикорію дикого та насіння льону за наявністю та вмістом флавоноїду астрагаліну, як біологічно активного компонента, що присутній у листі маслинки вузьколистої. Порівняння способів ідентифікації у прототипі та корисній моделі наведено в таблиці. Таблиця Характеристика способів стандартизації листя маслинки вузьколистої № п/п 1 2 20 25 30 35 Об'єкт Найближчий аналог Корисна модель Компонент Об'єкти дослідження Сума флавоноїдів, в Моносировина листя перерахунку маслинки вузьколистої на рутин Астрагалін Багатокомпонентні рослинні суміші, до складу яких входять: листя маслинки вузьколистої, корені алтеї, корені цикорію дикого та насіння льону Метод визначення Метод УФспектрофотометрії Можливість кількісної стандартизації моносировини листя маслинки вузьколистої; неспецифічне визначення Метод ВЕРХ Можливість кількісної стандартизації сировини та багатокомпонентних рослинних сумішей листя маслинки вузьколистої; специфічне визначення Джерела інформації: 1) Абизов Е.А. Применение лоха узколистного в народной медицине / Е.А. Абизов, B.C. Бабаскин, Е.И. Барабанов. // Медицин. помощь. - 2007. - № 5. - С. 45-48. 2) Абизов Ε. А. Химическое изучение листьев Elaeagnus angustifolia L. / Е.А. Абизов, О.Н. Толкачев, // Вопр. биол. мед. фарм. хим. - 2008. - № 4. - С. 40-42. 3) Компендиум. Лекарственные препараты, 2007. - Т. 1. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К.: Моріон, 2007. - 1128 с. 4) Компендиум. Лекарственные препараты, 2007. - Т. 2. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К.: Моріон, 2007. - 1126 с. 5) Лекарственные растения. Самая полная энциклопедия / А.Ф. Лебеда, Н.И. Джуренко, А.П. Исайкина, В.Г. Собко. - М.: ACT-ПРЕСС КНИГА, 2010. - 496 с. 6) Лушпа В.І. Родина маслинкові у медицині та в інших галузях діяльності людини / B.I. Лушпа // Фітотерапія. Часопис. - 2004. - № 3. - С. 49-63. 7) Универсальная энциклопедия лекарственных растений / И. Путырский, В. Прохоров. Книжный Дом; М.: Махаон, 2000. - 656 с. 8) The effect of Elaeagnus angustifolia L. leaves extract on pain of male rats M. Sofiabadi, H. Esmaeili, H. Haghdost, N. Ghaibi. // J. Yafteh. - 2008. - Vol. 10 (1). P. 23-29. 9) Yan-fang M. Determination of total flavonoids in leaf of Elaeagnus angustifolia L. / M. Yan-fang // J. Southwest Univer. National. - 2006. - Vol. 6. - P. 113-119. 3 UA 82228 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб стандартизації листя маслинки вузьколистої (Elaeagnus angustifolia L.) в багатокомпонентних рослинних сумішах з використанням методу високоефективної рідинної хроматографії, який відрізняється тим, що листя маслинки вузьколистої в рослинних сумішах, що містять в своєму складі листя маслинки вузьколистої, корені алтеї лікарської, корені цикорію дикого та насіння льону, визначають хроматографуванням в градієнтному режимі з використанням водно-ацетонітрильних рухомих фаз та оберненофазної колонки, з попередньою очисткою проби, із застосуванням твердофазної екстракції за наявністю та вмістом астрагаліну, вміст якого повинен бути не менше ніж 0,091 % у перерахунку на висушену сировину. 4 UA 82228 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5