Індолпохідна сіль лимонної кислоти та її фармацевтичне застосування

1. Сіль, котрою є 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4ілметил)піридин-2-іл]-1Н-індол-5-карбонітрилу цитрат. 2. Сіль за п. 1 по суті у кристалічній формі. 3. Сіль за будь-яким з пп. 1, 2, котра має форму А, яку характеризують d-проміжки та відносна інтенсивність 12,7(дс), 6,8(дс), 6,3(с), 4,38(с), 4,23(с) та 3,41(п) Å у рентгенодифрактограмі порошку. 4. Спосіб отримання 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4ілметил)піридин-2-іл]-1Н-індол-5-карбонітрилу цитрату за пп. 1-3, в якому здійснюють реакцію 2гідрокси-3-[5-(морфолін-4-ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрилу з лимонною кислотою у розчиннику. 5. Спосіб за п. 4, де застосовуваний розчинник вибирають з групи: етери, спирти, кетони, ацетати або органічні кислоти чи їх суміші, застосовуючи необов'язково воду як добавку. 6. Спосіб за п. 5, де розчинником є суміш етанолу та води або оцтової кислоти. 7. Спосіб за будь-яким з пп. з 4 до 6, де вказаний спосіб виконують при температурі між -5 °С та +100 °С. C2 2 (19) 1 3 94251 4 індол-5-карбонітрил цитрат, способу її отримання, al., PNAS 93:2719-2723, 1996). Ацетил-Со-А є крифармацевтичної композиції з вмістом вказаної солі тичним для синтезу ацетилхоліну, нейротрансміта застосування вказаної активної солі у терапії. теру з когнітивними функціями. Накопичення амі2-Гідрокси-3-[5-(морфолін-4-ілметил)піридинлоїду- є ранньою подією у ХА. Миші GSK Tg 2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил як вільна основа та її показують збільшені рівні амілоїду-Р у мозку. Тагідрохлорид є описаними у WO 03/082853. Ця спокож, миші PDAPP, годовані літієм, показують знилука є корисною, оскільки виявляє фармакологічну жені рівні амілоїду- у гіпокампі та знижену площу активність інгібувальною дією на GSK3 (WO амілоїдних бляшок (Su et al., Biochemistry 2004, 03/082853). Цю сполуку можна було б застосову43:6899-6908). Таким чином, інгібування GSK3 вати для лікування хвороби Альцгеймера, деменможе мати корисну дію у перебігу, а також когнітицій, хронічних та гострих нейродегенеративних вній недостатності, пов'язаній з хворобою Альцхвороб, біполярних розладів, шизофренії, діабету, геймера та іншими вищезгаданими хворобами. втрати волосся, пов'язаних з кістками розладів та Хронічні та гострі нейродегенеративні хвороби усіх перерахованих розладів, описаних у WO Опосередковане фактором росту активування 03/082853, що уведено тут як довідку. РІ3К /Akt провідного шляху, як показано, грає клюГлікоген-синтаза-кіназа-3 (GSK3) є сечову роль у виживанні нейронів. Активування цьорин/треонін-протеїн-кіназою, що складається з го провідного шляху призводить до інгібування двох ізоформ ( та ), котрі є кодованими відмінGSK3. Нещодавні дослідження (Bhat et. al., PNAS ними генами, але є високо гомологічними у межах 97:11074-11079 (2000)) свідчать, що GSK3 активкаталітичного домену. GSK3 дуже експресується у ність є збільшеною у клітинних та тваринних моцентральній та периферійній нервовій системі. делях нейродегенерації, як-то церебральна ішемія GSK3 фосфорилує кілька субстратів, охоплюючи або депривація після фактору росту. Наприклад, тау, -катенін, глікоген-синтазу, піруватактивна ділянка фосфорилування була збільшедегідрогеназу та фактор ініціації елонгації трансною у нейронах, уразливих відносно апоптозу, ляції 2b (elF2b). Інсулін та фактори росту активутипу загибелі клітин, що, як звичайно вважають, ють протеїн-кіназу В, котра фосфорилує GSK3 на відбувається у хронічних та гострих дегенеративзалишку 9 серину та інактивує її. них хворобах, як-то когнітивні розлади, хвороба Деменція при хворобі Альцгеймера (ХА) та таАльцгеймера, хвороба Паркінсона, бічний аміотупатії. рофічний склероз, хвороба Хантингтона та ВІЛХА характеризують когнітивним занепадом, деменція та травматичне поранення мозку; та як холінергічною дисфункцією та нейронною загипри ішемічному ударі. Літій був нейрозахисним в беллю, нейрофібрилярними вузлами та сенільниінгібуванні апоптозу у клітинах та у мозку у дозах, ми бляшками, що складаються з відкладень амілощо призводили до інгібування GSK3. Таким чиїду-. Наслідок цього у ХА неясний, але, можна ном інгібітори GSK3 могли б бути корисними у думати, є пов'язаним. Глікоген-синтаза-кіназа-3 послаблення перебігу нейродегенеративних хво(GSK3) або Тау-фосфорилувальна кіназа селекроб. тивно фосфорилує пов'язаний з мікротрубочками Біполярні розлади (BD) білок Тау у нейронах на ділянках, що є гіперфосБіполярні розлади характеризуються маніакафорилованими у мозках ХА. Гіперфосфориловальними приступами та приступами депресії. Літій ний тау має нижчу афінність стосовно мікротрубозастосовано для лікування BD на основі його стачок та накопичується як спарені спіральні волокна, білізувальної дії на настрій. Завадою літію є обмекотрі є головними компонентами, що складають жене терапевтичне вікно та небезпека передозунейрофібрилярні вузли та нейропільні нитки у мозвання, що може призводити до інтоксикації літієм. ках ХА. Це призводить до деполімеризації мікротВідкриття, що літій інгібує GSK3 при терапевтичній рубочок, що призводить до згасання аксонів та концентрації надає можливість, що цей фермент нейритної дистрофії. Нейрофібрилярні вузли є представляє ключову ціль дії літію у мозку постійно виявленими у хворобах, як-то ХА, бічний (Stambolic et al., Curr. Biol. 6:1664-1668, 1996; Klein аміотрофічний склероз, паркінсонізм-деменція та Melton; PNAS 93:8455-8459, 1996; Gould et al., Гаума, кортикобазальна дегенерація, деменція Neuropsychopharmacology, 1:32-8, 2004). Інгібітор боксерів та травма голови, синдром Дауна, постеGSK3, як показано, зменшує час іммобілізації у нцефалітний паркінсонізм, прогресуючий супранутесті примусового плавання, моделі для оцінки клеарний параліч, хвороба Найманна-Піка та хводепресивної поведінки (O'Brien et al., J Neurosci роба Піка. Добавка амілоїду- до первинних 2004, 24:66791-6798) GSK3 пов'язаний з поліморгіпокампальних культур призводить до гіперфосфізмом, виявленим у біполярному розладі II форилування тау та стану типу спарених спіраль(Szczepankiewicz et al., Neuropsychobiology. 2006;5 них волокон індукцією активності GSK3, а потім 3(1):51-6). Інгібування GSK3 може тому бути теруйнуванням транспорту аксону та нейронною рапевтично важливим у лікуванні BD, а також у загибеллю (Imahori та Uchida., J. Biochem 121:179пацієнтів з ХА, що мають афективні розлади. 188, 1997). GSK3 переважно мітить нейрофібриШизофренія лярні вузли та показаний як активний у преСвідоцтва накопичення припускають анормавузлових нейронах у мозках ХА. Рівні білку GSK3 є льну активність GSK3 у розладах настрою та шитакож збільшеними на 50% у тканині мозку від пазофренії. GSK3 приймає участь у каскадах перетворення сигналу багатьох клітинних процесів, цієнтів з ХА. Більш того, GSK3 фосфорилує піруособливо при нервовому розвитку. Kozlovsky et al ват-дегідрогеназу, ключовий фермент у гліколітич(Am J Psychiatry 2000 May; 157(5):831-3) виявили, ному провідному шляху та попереджає перетворення пірувату до ацетил-Со-А (Hoshi et що рівні GSK3 були на 41% нижчі у пацієнтів з 5 94251 6 шизофренією, ніж у порівнюваних осіб. Це досліня кісток. Більшість ліків, що зараз є на ринку, для дження свідчить, що шизофренія охоплює патололікування остеопорозу діють на збільшення мас гію нервового розвитку, та що анормальна регулякісток інгібуванням остеокластного розсмоктуванція GSK3 могла б грати роль у шизофренії. Більш ня кісток. Виявлено, що ліки зі здатністю до збільшення утворення кісток могли б мати велике знатого, зменшені рівні -катеніну знайдені у пацієнтів чення у лікуванні остеопорозу, а також мати з шизофренією (Cotter et al., Neuroreport 9:1379потенціал для посилення загоєння переломів у 1383 (1998)). Атипові антипсихотичні агенти, як-то пацієнтів. оланзапін, клозапін, кветіапін, та зипазидон, інгіЗастосування інгібіторів GSK3 при первинному бують GSK3 збільшенням фосфорилування ser9, та вторинному остеопорозі, де первинний остеовказуючи, що антипсихотичні агенти можуть виявпороз охоплює остеопороз після менопаузи та ляти їх корисну дію інгібуванням GSK3 сенільний остеопороз у чоловіків та жінок, а вто(Rosborough et al., Int J Neuropsychopharmacol, 4:1ринний остеопороз охоплює індукований кортизо13 2006). ном остеопороз, а також будь-який інший тип індуДіабет кованого вторинного остеопорозу. На додаток до Інсулін стимулює синтез глікогену у скелетних цього, інгібітори GSK3 можна також застосовувати м'язах дефосфорилуванням та таким чином актиу лікуванні мієломи. Інгібітори GSK3 можна застовування глікоген-синтази. В умовах спокою GSK3 совувати локально або системно, у різних режифосфорилує та інактивує глікоген-синтазу дефосмах композицій, для лікування цих станів. форилуванням. GSK3 також надекспресується у Запальні хвороби м'язах пацієнтів з діабетом типу II (Nikoulina et al., Відкриття, що інгібітори GSK3 забезпечують Diabetes 2000 Feb; 49(2):263-71). Інгібування GSK3 анти-запальну дію, надає можливість застосуванзбільшує активність глікоген-синтази, таким чином ня інгібіторів GSK3 для терапевтичного втручання знижуючи рівні глюкози її перетворенням у глікоу запальних хворобах. (Martin et al., Nat Immunol ген. У тваринних моделях діабету, інгібітори GSK3 2005, 6:777-784; rev. y Jope et al., Neurochem Res знижували рівні глюкози у плазмі до 50 % (Cline et 2006, Aug 30). Запалення є загальною особливістю al., Diabetes, 2002, 51:2903-2910; Ring et al., широких меж станів, охоплюючи хворобу АльцDiabetes 2003, 52:588-595). Інгібування GSK3 може геймера та розлади настрою. тому бути терапевтично важливим у лікуванні діаОб'єктом заявленого винаходу є забезпечення бету типу І та типу II та діабетичної невропатії. солі сполуки 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4Полисіння ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрилу GSK3 фосфорилує та розкладає -катенін. (сполука (І)), а саме 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4катенін є виконавцем провідного шляху для синтеілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил цитзу кератоніну. Стабілізація -катеніну може призрату, водити до посилення розвитку волосся. Миші, що експресують стабілізований -катенін мутацією ділянок, фосфорилованих GSK3 зазнають розвиток, схожий на морфогенез волосся заново (Gat et al., Клітин 1998 Nov 25;95 (5):605-14)). Нові фолікули утворювали сальні залози та шкіряний сосочок, нормально створювані тільки у ембріогенез. Таким чином інгібування GSK3 може лікувати облисіння. Пов'язані з кістками розлади та умови Інгібітори GSK3 можна було б застосовувати що має селективну інгібувальну дію на GSK3, для лікування пов'язаних з кістками розладів або гарну біозасвоюваність, гарну розчинність та низьінших станів, що викликає необхідність в утворенні ку гігроскопічність, що робить її придатною до фонових та посилених кісток. Реконструкція скелету є рмування у фармацевтичні композиції. постійним процесом, контрольованим системними Цитрат сполуки формули (І) згідно з заявлегормонами, як-то паратиреоїдний гормон (РТН), ним винаходом, як несподівано виявлено, поліплокальними факторами (наприклад, простагланшує хімічну стабільність порівняно з гідрохлоридином Е2), цитокінами та іншими біологічно активдом 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4-ілметил)піридинними речовинами. Два типи клітин мають ключову 2-іл]1Н-індол-5-карбонітрилу, отриманим, як опиважливість: остеобласти (відповідні за утворення сано у WO 03/082853, що робить її особливо прикісток) та остеокласти (відповідні за розсмоктувандатною до формування у фармацевтичні композиня кісток). За допомогою RANK, RANK-ліганду та ції. остеопротегринової регуляторної системи ці два У фармацевтичній композиції для фармацевтипи клітин взаємодіють для підтримування нортично прийнятної сполуки (активні ліки) важливо мального колообігу речовини кісток (Bell NH, бути у формі, у котрій її можна зручно обробляти. Current Drug Targets -Immune, Endocrine & Це є важливим не тільки з точки зору отримання Metabolic Disorders, 2001, 1:93-102). комерційно життєздатного процесу виробництва, Остеопороз є скелетним розладом, у котрому але також з точки зору наступного виробництва низька маса кісток та ушкодження мікроструктури фармацевтичних композицій, що містять активну кісток призводять до збільшеної ламкості кісток та сполуку ліків. ризику перелому. Для лікування остеопорозу, є дві Хімічна стабільність, стабільність твердого головні стратегії для будь-якого інгібування розсстану та "період напіввиведення" активних інгредімоктування кісток або для стимулювання утворен 7 94251 8 єнтів є також дуже важливими факторами. Ліки та містити від 0,05 до 99 мас.%, наприклад, від 0,10 композиції з їх вмістом повинні ефективно зберігадо 50 мас.%, активного інгредієнту, усі проценти є тися протягом довгого часу, без значних змін у за загальною масою композиції. фізико-хімічних характеристиках активного компоРозріджувач або інертний носій охоплюють ненту, наприклад, його хімічного складу, густини, воду, водний полі(етиленгліколь), магній карбонат, гігроскопічності та розчинності. магній стеарат, тальк, цукор (як-то лактоза), пекТермін "хімічна стабільність" означає, що спотин, декстрин, крохмаль, трагакант, мікрокристалілуку можна зберігати у ізольованій формі, або у чна целюлоза, метилцелюлоза, натрійформі композиції, у котрій її запропоновано у сукарбоксиметилцелюлоза або масло какао. міші з фармацевтично прийнятними носіями, розКомпозиція винаходу може бути у формі табріджувачами або ад'ювантами (наприклад, у перолетки або для ін'єкцій. Таблетка може додатково ральній дозованій формі, як-то таблетка, капсула, містити дезинтегратор та/або може бути покритою тощо), у нормальних умовах зберіганні, зі слабким (наприклад ентеросолюбільним покриттям або хімічним розкладанням або без нього. гідроксипропілметилцелюлозою). Таким чином, у виробництві комерційно життєВинахід крім того забезпечує спосіб отримання здатних та фармацевтично прийнятних композицій фармацевтичної композиції винаходу, котрий поліків важливим є, чи можливе отримання сполуки лягає у змішуванні фармацевтично прийнятної ліків по суті у кристалічній та стабільній формі. солі сполуки формули (І) з фармацевтично прийнЯк застосовано тут, термін "по суті кристалічятним розріджувачем або інертним носієм. ний" означає принаймні 50% кристалічності та до Прикладом фармацевтичної композиції вина100% кристалічності. Заявлений винахід забезпеходу є розчин для ін'єкцій з вмістом сполуки виначує 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4-ілметил)піридин-2ходу, або фармацевтично прийнятної солі та стеіл]1Н-індол-5-карбонітрил цитрат, що є принаймні рильної води, а якщо необхідно, натрій гідроксиду на 50% кристалічним, принаймні на 60% кристаліабо хлоридної кислоти для доведення рН кінцевої чним, принаймні на 70% кристалічним, принаймні композиції до рН приблизно 5, та необов'язково на 80% кристалічним, принаймні на 90% кристаліПАР для допомоги розчиненню. чним, принаймні на 95% кристалічним, принаймні Прикладом придатної композиції є рідкий розна 98% кристалічним, або приблизно на 100% кричин, що містить 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4сталічним. ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил цитФармацевтичні композиції рат 5,0% мг/мл у чистій воді до 100%. В одному аспекті заявленого винаходу запроМедичні застосування поновано фармацевтичні композиції, що містять Несподівано, виявлено, що новий 2-гідрокси-3цитрат сполуки (І), 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4[5-(морфолін-4-ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил, для карбонітрил цитрат, визначений у заявленому визастосування у попередженні та/або лікуванні станаході, є добре придатними для інгібування гліконів, пов'язаних з глікоген-синтаза-кіназою-3. ген-синтаза-кінази-3 (GSK3). Відповідно, вказана Композиція може бути у формі, придатній для сполука заявленого винаходу, як очікують, є кориперорального застосування, наприклад, як таблетсною у попередженні та/або лікуванні станів, пока, як стерильний розчин або суспензія для паренв'язаних з активністю глікоген-синтаза-кінази-3, теральних ін'єкцій, для локального застосування у тобто сполуки можна застосовувати для продукупорожнині тіла або у порожнині кісток, наприклад, вання інгібіторної дії GSK3 у ссавці, охоплюючи як стерильний розчин або суспензія для ін'єкцій. людину, при необхідності такого попередження Загалом композицію можна отримувати звита/або лікування. чайним чином, застосовуючи фармацевтично приGSK3 дуже експресується у центральній та йнятні носії або розріджувачі. Придатні добові допериферійній нервовій системі та в інших тканизи солі сполуки формули (І) у лікуванні ссавця, нах. Таким чином, очікують, що сполук винаходу є охоплюючи людину, приблизно 0,01 - 250 мг/кг мас добре придатною для попередження та/або лікутіла при оральному застосуванні та приблизно вання станів, пов'язаних з глікоген-синтаза0,001 - 250 мг/кг мас тіла при парентеральному кіназою-3 у центральній та периферійній нервовій застосуванні. Типова добова доза активних інгресистемі. Зокрема, сполук винаходу, як очікують, є дієнтів варіює у широких межах та залежить від придатними для попередження та/або лікування різних факторів, як-то важливе показання, шлях станів, пов'язаних з когнітивними розладами та застосування, вік, маса та стать пацієнта та може переддеменційних станів, особливо деменції, хвобути визначена лікарем. роби Альцгеймера (ХА), когнітивної недостатності Для ветеринарного застосування кількості різу шизофренії (КНШ), помірному когнітивному погіних компонентів дозована форма та доза медикаршенню (ПКП), погіршенню пам'яті, пов'язаному з менту можуть варіювати та залежати від різних віком (ПППВ), когнітивному занепаду, пов'язаному факторів, як наприклад, індивідуальні потреби з віком (КЗПВ) та когнітивному погіршенню без тварини, що лікують. деменції (КПБД), хвороб, пов'язаних з патологіями Фармацевтично прийнятну сіль сполуки форнейрофібрилярних вузлів, лобно-скроневій деменмули (І), можна застосовувати саму, але її звичайції (ЛСД), лобно-скроневій деменції типу Паркінсоно застосовують у формі фармацевтичної компона (ЛСДП), прогресуючому супрануклеарному пазиції, у котрій сіль сполуки формули (І) (активний раліч (ПСП), хворобі Піка, хворобі Найманна-Піка, інгредієнт) є в асоціації з фармацевтично прийняткортикобазальній дегенерації (CBD), травматичним розріджувачем або носієм. Залежно від режиному пораненню мозку (ТПМ) та деменції боксерів. му застосування, фармацевтична композиція може 9 94251 10 Одне втілення винаходу стосується попереТерміни "терапевтичний" та "терапевтично" слід дження та/або лікування хвороби Альцгеймера, розуміти відповідно. особливо застосування у затримуванні прогресії Винахід також забезпечує спосіб лікування хвороби Альцгеймера. та/або попередження станів, пов'язаних з глікогенІнші стани є вибраними з групи: синдром Даусинтаза-кіназою-3, який полягає у застосуванні до на, судинна деменція, хвороба Паркінсона (ХП), ссавця, охоплюючи людину або тварину, при непостенцефалітний паркінсонізм, деменція з тілами обхідності такого лікування та/або попередження Леві, ВІЛ-деменція, хвороба Хантингтона, бічний терапевтично ефективної кількості 2-гідрокси-3-[5аміотрофічний склероз (БАС), хвороби моторних (морфолін-4-ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5нейронів (ХМН), хвороба Крейцфельда-Якоба та карбонітрил цитрату. пріонні хвороби. Спосіб утворення солі Інші стани вибрані з групи: розлад з недостатСіль сполуки формули (І), 2-гідрокси-3-[5ністю уваги (РНУ), розлад з гіперактивністю та (морфолін-4-ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5недостатністю уваги (РГНУ) та афективні розлади, карбонітрил цитрат, можна отримувати змішуванде афективними розладами є біполярний розлад, ням 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4-ілметил)піридинохоплюючи гостру манію, біполярна депресія, бі2-іл]1Н-індол-5-карбонітрилу з лимонною кислотою полярне підтримування, глибокі депресивні розлау присутності розчиннику. Еквівалент лимонної ди (ГДР), охоплюючи депресію, глибоку депресію, кислоти може варіювати між 1 та 3 мольстабілізацію настрою, шизоафективні розлади, еквівалентами. охоплюючи шизофренію, та дистимія. Реакцію можна проводити у розчиннику, приІнші стани вибрані з групи: діабет типу І, діабет датними розчинниками є етери, як-то 1,4-діоксан, типу II, діабетична невропатія, полисіння та западіетил-етер або спирти, як-то метанол, етанол, льні хвороби. пропанол, або кетони, як-то ацетон, ізобутилметиОдне втілення винаходу стосується поперелкетон, або ацетати, як-то етилацетат, бутилацедження та/або лікування пов'язаних з кістками ротат, або органічні кислоти, як-то оцтова кислота, зладів у ссавців. або їх суміші, необов'язково застосовуючи воду як У ще одному аспекті винахід стосується застодобавку. Розчинник, котрим є суміш етанолу та сування 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4води або оцтової кислоти, є придатним. ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил цитЗагальний застосовуваний об'єм розчинників рату у попередженні та/або лікуванні остеопорозу може варіювати між 1 (за об'ємом/масою) до 100 у ссавців. (за об'ємом/масою) об'ємних частин на масу вихіВ одному аспекті винахід стосується застосудного матеріалу, переважно між 10 (за об'євання 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4мом/масою) та 45 (за об'ємом/масою) об'ємних ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил цитчастин на масу вихідного матеріалу. Температура рату для сприяння та/або збільшення утворення реакції може бути між -30 та +150°С, переважно кісток у ссавців. між -5°С та +100°С. В одному аспекті винахід стосується застосуЧисту сполуку формули (І), 2-гідрокси-3-[5вання 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4(морфолін-4-ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил циткарбонітрил цитрат, можна отримувати кристалірату для збільшення мінеральної густини кісток у зацією з добавкою або без неї у придатних розссавців. чинниках для отримання кристалічного твердого У ще одному аспекті винахід стосується застоматеріалу, що має чистоту приблизно 95% та песування 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4реважно приблизно 98% ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил цитЩе одним об'єктом заявленого винаходу є рату для зменшення частоти переломів та/або спосіб утворення солі, яку описано вище. збільшення швидкості загоєння переломів у ссавРобочий приклад ців. Наступні приклади описують, але не обмежуУ ще одному аспекті винахід стосується застоють винахід. сування 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4Приклад 1 ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил цит2-Гідрокси-3-[5-(морфолін-4-ілметил)піридинрату для збільшення утворення спонгіозних кісток 2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил цитрат та/або утворення нових кісток у ссавців. 2-Гідрокси-3-[5-(морфолін-4-ілметил)піридинДоза, потрібна для терапевтичного або попе2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил (5,14 кг, 15,4 моль) реджувального лікування конкретної хвороби або суспендували в етанолі (54 л) при кімнатній темконкретного стану обов'язково залежатиме від пературі. Суспензію нагрівали до внутрішньої темхазяїна, якого лікують, шляху застосування та суператури 70°С та розчин лимонної кислоти (3,424 ворості захворювання або поранення, що лікують. кг, 17,82 моль) у воді (103 л) додавали, тримаючи Заявлений винахід стосується також застосувнутрішню температуру вище 65°С. Суміш нагрівання 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4вали до кипіння під зворотним холодильником. ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил цитПісля цього утворений розчин змішували із актирату у виробництві медикаменту для попередженвованим вугіллям (0,412 кг) та нагрівання до кипіння та/або лікування станів, пов'язаних з глікогення під зворотним холодильником продовжували синтаза-кіназою-3. протягом 3,5 годин, після чого реакційну суміш У контексті опису, термін "терапія" також охопфільтрували до прозорості при 83°С, а потім охолює "попередження", якщо не визначене інше. лоджували до кімнатної температури протягом 20 годин. Після фільтрування осад промивали двічі 11 94251 12 холодною сумішшю етанол/вода (6,9 л/13,7 л). York; Bunn, C. W. (1948), Chemical Crystallography, Сушка під вакуумом при 50°С дала 6,648 кг, 82,2% Clarendon Press, London or Klug, H. P. & Alexander, виходу 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4L. E. (1974), X-ray Diffraction Procedures, John Wiley ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил цитand Sons, New York. рату, що мав чистоту принаймні 98%. Вміст палаФармакологія -1 дію був менше, ніж 1 млн , а вміст цинку був нижВизначення конкуренції АТФ в аналізі сцинтиче, ніж 10 млн-1. 1Н ЯМР (d6-ДМСО, 400 МГц)  ляційної схожості GSK3. 14,7 (br s, 1 Н), 11,55 (s, 1 Н), 10,98 (s, 1H), 8.31 (s, GSK3-аналіз сцинтиляційної схожості. 1 Н), 8,08 (br d, J= 1,84 Гц, 1Н), 8,02 (s, 1H), 7,90 (br Дослідження конкуренції проводили у подвоd, J = 8,92 Гц, 1Н), 7,31 (d, J = 8,0 Гц, 1 Н), 7,02 (d, єнні з 10 різними концентраціями інгібітору у мікJ= 8,0 Гц), 4,28 (s, 2 Н), 3,97 (m, 2 Н), 3,94 (m, 2Н), ротитрувальних планшетах з прозорим дном 3,35 (m, 9Н), 3.32 (m, 2Н) млн.-1; 13С ЯМР (d6(Wallac, Finland). Біотинілований пептидний субДМСО, 400 МГц)  168,9, 148,5, 142,7, 139,8, страт, Біотин-Ala-Ala-Glu-Glu-Leu-Asp-Ser-Arg-Ala137,5,126,4, 124,9, 124,8, 120,9, 119,4, 118,4, 113,3, Gly-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu (AstraZeneca, Lund), 109,0, 101,6, 85,7, 63,1, 55,5, 50,3, 40,1, 39,9, 39,7, додавали при кінцевій концентрації 1 мкМ у буфері 39,2, 39,0, 38,8 млн-1; МС (ЕР) m/z [M++1] 335. для аналізу з вмістом 1 мкод рекомбінантного Кристали аналізували рентгенодифракцією від GSK3 людини (Dundee University, UK), 12 мМ порошку (РДП). Дифрактограма форми А показує морфолінпропансульфонової кислоти (MOPS), pH наступні d-проміжки в ангстремах та відносні інте7,0, 0,3 мМ ЕДТА, 0,01% -меркаптоетанол, 0,004 нсивності: 12,7(дс), 7,6(сл), 6,8(дс), 6,3(с), 5,9(сл), % Brij 35 (природна ПАР), 0,5 % гліцерину та 0,5 5,7(п), 5,1 (п), 4,87(сл), 4,57(п), 4,38(с), 4,23(с), мкг альбумін коров'ячої сироватки/25 мкл. Реакцію 4,16(сл), 4,07(п), 3,80(сл), 3,69(п), 3,65(сл), 3,41(п), ініціювали добавкою 0,04 мкКі [-33Р]АТФ 3,37(сл), 3,32(п), 3,17(п), 3,12(п), 2,88(сл), 2,86(п), (Amersham, UK) та неміченого АТФ при кінцевій 2,78(сл), 2,65(сл), 2,50(сл), 2,45(сл). концентрації 1 мкМ та об'ємі аналізу 25 мкл. Після Значущі d-проміжки в ангстремах та відносні інкубування протягом 20 хвилин при кімнатній теінтенсивності: 12,7(дс), 6,8(дс), 6,3(с), 4,38(с), мпературі, кожну реакцію припиняли добавкою 25 4,23(с), 3,41 (п). мкл стоп-розчину з вмістом 5 мМ ЕДТА, 50 мкМ Кристалічність 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4АТФ, 0,1 % Triton X-100 та 0,25 мг покритих стрепілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил циттавідином кульок для аналізу сцинтиляційної схорат аналізували, застосовуючи рентгенодифракжості (SPA) (Amersham, UK). Через 6 годин радіоацію від порошку (РДП) як описано нижче: ктивність визначали у рідинному сцинтиляційному Піки, ідентифіковані за d-проміжками, розралічильнику (1450 MicroBeta Trilux, Wallac). Криві ховані за формулою Брегга та інтенсивностями, інгібування аналізували за нелінійною регресією, отримано з дифрактограми кристалічного цитрату. застосовуючи програму GraphPad Prism, USA. Тільки головні піки, що є найхарактеристичними, Значення Km АТФ для GSK3, застосовуване для значними, відмінними та/або відтворюваними, розрахунку констант інгібування (Кі) сполуки, було протабульовані, але додаткові піки можна отриму20 мкМ. вати, застосовуючи звичайні способи, з дифрактоЗастосовані наступні скорочення: грами. Присутність цих головних піків, відтворюваMOPS Морфолінпропансульфонова кислота них та у межах похибки, є для більшості випадків ЕДТА Етилендіамінтетраоцтова кислота достатньою для встановлення присутності вказаАТФ Аденозин трифосфат ної кристалічної солі. Відносні інтенсивності (відн. SPA Аналіз сцинтиляційної схожості інт.) є менш надійними та замість чисельних знаGSK3 Глікоген-синтаза-кіназа-3 чень застосовують наступні визначення: Результати дс (дуже сильна): >60% відн. інт. Значення Кі для 2-гідрокси-3-[5-(морфолін-4с (сильна): 23-60% відн. інт. ілметил)піридин-2-іл]1Н-індол-5-карбонітрил цитп (помірна): 9-23% відн. інт. рату заявленого винаходу є у межах 0,001 нМ сл (слабка): 4-9% відн. інт. 300 нМ. дсл (дуже слабка):