Спосіб очищення ліпопептидів

Реферат: Даний винахід належить до поліпшеного способу очищення даптоміцину, за яким елююючий буфер, на стадії аніонообмінної хроматографії, є розчином хлориду натрію, а елююючим буфером оберненофазової хроматографії є водний спирт. UA 105785 C2 (12) UA 105785 C2 UA 105785 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Обдасть винаходу Даний винахід відноситься до поліпшеного способу очищення даптоміцину, представленого хімічним найменуванням Н-деканоіл-Ь-триптофіл-О-аспарагініл-Ь-аспартил-Ь-греонілглщил-Ьорнітил-Ь-аспартил-В-аланіл-Ь-аспартилгліцил-О-серил-трео-З-метил-Ь-ілутаміл-З-антранілоілЬ-аланін εΐ-лактон. Даптоміцин можна представити формулою І: Попередній рівень техніки Даптоміцин є ліпопептидним антибіотиком з активністю проти грампозитивних організмів. Даптоміцин одержують у ході ферментації Strepromyces roseosporus і потім очищенім ферментативного бульйону. Механізм дії даптоміцину полягає в тому, що він зв'язується з мембранами бактерій і викликає швидку деполяризацію мембранного потенціалу. Це зниження мембранного потенціалу викликає інгібування синтезу білка, ДНК і PHK, що приводить до загибелі бактеріальної клітини. Даптоміцин схвалений для складних інфекцій шкіри і шкірних структур (cSSSI від complicated skin and skin structure infections) та інфекцій кровотоку Staphylococcus aureus (Золотистого стафілокока) (бактеріемія). Cubist Pharmaceuticals продає даптоміцин під торговою маркою Кубіцин®. Вперше даптоміцин було описано в середині 1980-х років у деяких патентах і журналах; US 4,537,717 та Debono M. et al, Journal of Antibiotics, 1986, Vol. XL, No 6, 761-777. Після цього було декілька публікацій щодо поліпшених способів ферментації і способів очищення. У US 4,885,243 описаний поліпшений спосіб ферментації для одержання даптоміцину. Даний спосіб описує введення деканової жирної кислоти або її ефіру, або солей до ферментативного бульйону Strepromyces roseosporus. У ході ферментації деканова жирна кислота вбудовується в молекулу з утворенням деканового бічного ланцюга даптоміцину. У попередньому рівні техніки описано декілька способів очищення даптоміцину. У US 4,874,843 описаний спосіб очищення даптоміцину, згідно з яким ферментативний бульйон фільтрують і додають у хроматографічну колонку, що містить смолу НР-20. Після елюювання частково очищений даптоміцин пропускають через колонку, що містить смолу HP-20ss, і потім додають в іншу колонку, що містить смолу НР-20. На додаток до цих стадій описані спроби збільшити чистоту за допомогою деяких додаткових хроматографічних стадій без будь-якого успіху. Крім того, в патенті 4,874,843 зазначено, що при використанні смоли без функціональних груп і водного розчину і включенні стадії, на якій воду видаляють фізичним чином, і потім смолу повторно зволожують полярним органічним розчинником, чистота продукту збільшується від 80 % до 93 %. Даний спосіб потребує багато часу і не дуже придатний для промислового виробництва. Патент US RE 39071 описує дві основні домішки, виявлені під час виробництва даптомщину, ангідро-даптоміцин і бета-ізомер даптоміцину. Крім того, в US RE 39071 •заявлено, що, використовуючи спосіб, описаний в прикладах 1-3, можна одержати продукт даптоміцину, що містить менше 6 % двох згаданих домішок. Приклад 3 описує спосіб, згідно з яхим даптоміцин проміжного рівня якості потім очищають способом, що включає чотири хроматографічні стадії і додаткові стадії демінералізації, концентрування і ліофілізації. На стадіях хроматографування для промивки і елюювання використовується ацетонітрил і, крім того, цей спосіб потрібно виконувати з охолодженими розчинами і в охолоджуваній кімнаті. Патент US 6,696,412 розкриває спосіб очищення даптоміцину, при якому використовують стадію аніонообмінної хроматографії, де застосовують модифікований буфер для елюювання, і 1 UA 105785 C2 5 10 15 20 25 30 використовують стадію мікрофільтрації, на якій даптоміцин утворює міцели. У даному патенті описано декілька способів, які є комбінацією двох зазначених вище стадій у поєднанні з іншими стадіями очищення, відомими кваліфікованому фахівцеві в даній області техніки. Високоочищений продукт даптоміцину визначений у патенті як даптоміцин з рівнем чистоти 9597 %. Суть винаходу Згідно з даним винаходом створено поліпшений спосіб очищення даптоміцину, який дає в результаті продукт з чистотою щонайменше 95 %. Описаний спосіб простіший ніж ті способи, що описані в попередньому рівні техніки, і як описано нижче, виключає надмірне використання модифікованих буферів і позбавляє від застосування ацетонітрилу, що сприятливо для навколишнього середовища. Згідно зі способом за винаходом застосовуються стадії аніонообмінної хроматографії і обернено-фазової хроматографії. Крім того, можна здійснювати стадії звичайної фільтрації і ліофілізацію кінцевого продукту. Згідно з одним здійсненням, розчином одновалентної солі, використовуваним як елююючий буфер на стадіях аніонообмінної хроматографії, є розчин хлориду натрію у воді. Елююючим буфером стадії б) обернено-фазової хроматографії у даному винаході є водний спирт. Краще, водним спиртом є водний етанол. Згідно з одним здійсненням даного винаходу даптоміцин елююють на стадії обернено-фазової хроматографії, використовуючи елююючий буфер, що містить 40-70 % етанолу у воді. Даний винахід може бути проілюстрований стадіями, наведеними на реакційній схемі 1. Даний винахід дає в результаті продукт даптоміцину з підсумковою чистотою 95 % або більше. Кількість ангідро-даптоміцину змінюється між 0,5-1,5 % і кількість бета-ізомеру складає менше ніж 0,5 %. Згідно з даним винаходом створено спосіб очищення, який простіший ніж способи, відомі в даній області, відносно використовуваних буферів і стадій, що дозволяє уникнути застосування розчинників, які є токсичними для навколишнього середовища. Крім того, це приводить до дуже хорошого відділення і низьких рівнів двох найважливіших домішок: ангідро-даптоміцину і бетаізомеру даптоміцину. Спосіб за винаходом дає простий процес очищення, що забезпечує продукт, який щонайменше такий же чистий, як і продукти, описані в попередньому рівні техніки. 2 UA 105785 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Докладний опис винаходу Початкова речовина для способу за даним винаходом може бути одержана способом, описаним у US 4,885,243, де жирна кислота, яку вводять, є декановою кислотою. Згідно з даним винаходом даптоміцин очищають, використовуючи як першу стадію аніонну хроматографію і потім, як другу стадію обернено-фазову хроматографію. Ферментативний бульйон, використовуваний як початкова речовина за даним винаходом, може бути заздалегідь оброблений до зазначених хроматографічних стадій для видалення великих частинок і біомаси. Як спосіб попередньої обробки ферментативний бульйон, використовуваний як початкова речовина за даним винаходом, може бути пропущений через одну або більше стадій просвітлення. Кваліфікованому фахівцеві в даній області відомі різні придатні стадії просвітлення. Необмеженими прикладами стадій просвітлення, придатних для попередньої обробки ферментативного бульйону за даним винаходом, є зворотний осмос, центрифугування, ультрафільтрація, мікрофільтрація, нанофільтрація і діафільтрація. Для просвітлення можливо використовувати навіть стадію аніонного обміну з високопористою смолою. Слід розуміти, що різні поєднання способів просвітлення, добре відомих кваліфікованому фахівцеві, можуть бути використані згідно з даним винаходом для попередньої обробки ферментативного бульйону перед подальшим очищенням даптоміцину за допомогою аніонообмінної хроматографії і обернено-фазової хроматографії. Просвітлений ферментативний бульйон додають в аніонообмінну колонку. Згідно з даним винаходом можна використовувати як сильні аніонообмінні смоли, такі як Capto Q, Q Sepharose XL, Q Sepharose FF, Source 15 Q, Source 30 Q або Macroprep High Q, або еквіваленти, так і слабкі аніонообмінні смоли, такі як наявні у продажу смоли DEAE Sepharose FF (діетиламіноетил сефароза), ANX Sepharose FF, Source 15 Q. Кращою смолою є у високому ступені поперечно-зшита агарозна смола з декстрановим поверхневим наповнювачем, подібна до наявної у продажу смоли Capto Q. Після завантаження освітленого розчину колонку промивають водою. Елююючим буфером стадії а) аніонообмінної хроматографії в даному способі є розчин одновалентної солі. Зазначеною одновалентною сіллю може бути, наприклад, хлорид, такий як NaCl або KCl. Також можуть бути використані інші одновалентні солі, такі як одновалентні солі ацетату, такі як ацетат натрію. Згідно з одним здійсненням даптоміцин може бути елюйований з колонки за допомогою градієнта NaCl у воді з градієнтом від 0,1 M NaCl до 1,5 M NaCl, краще від 0,2 M NaCl до 1,0 M NaCI. Частково очищений даптоміцин потім додають в обернено-фазову колонку. Кращою обернено-фазовою смолою є пориста смола однорідного розміру, одержана з полістиролу і дивінілбензолу, подібна до наявної у продажу смоли Source PRC 30, SP20ss, HP20ss або еквівалентних типів смол на основі полістиролу. Потім розчин даптоміцину вводять у колонку, колонку промивають водою, що містить 15 % спирт, такий як 15 % етанол. Даптоміцин може бути елюйований водним спиртом, наприклад С1-СЗ алкільним спиртом, таким як метанол, етанол або ізопропанол. Згідно з одним здійсненням даного винаходу даптоміцин елююють з обернено-фазової колонки, використовуючи етанол як елююючий розчинник. Даптоміцин згідно з одним здійсненням елююють з обернено-фазової колонки за допомогою градієнта етанолу у воді. Градієнт складає 5-80 % етанолу і краще 40 % - 70 % етанолу. В одному кращому здійсненні винаходу існує додаткова стадія обернено-фазової хроматографії. Краще здійснення винаходу полягає у пропусканні через дві обернено-фазові колонки при разних рН для поліпшення чистоти продукту. В одному кращому здійсненні першу колонку проходять при нейтральному рН і другу колонку проходять при кислому рН. Не є Істотним порядок проходження двох обернено-фазових хроматографічних стадій щодо рН. Перша колонка може бути пройдена при кислому рН і друга при нейтральному рН, або навпаки. Згідно з одним здійсненням винаходу першу обернено-фазову хроматографічну колонку елююють при рН 6,5-8,5, краще при рН 7,5-8,0. Згідно з іншим здійсненням винаходу другу обернено-фазову хроматографічну колонку елююють при рН 2,5-3,5, краще при рН 3,0-3,1. Колонка, яка використовується на стадії обернено-фазової хроматографії у способі за даним винаходом, може бути смолою на основі стиролу, такою як наявна у продажу смола Source 30RPC. Також можуть бути використані інші еквівалентні смоли для обернено-фазової хроматографії, такі як SP20ss, HP20ss або еквівалентні типи смол на основі полістиролу, відомі кваліфікованому фахівцеві. 3 UA 105785 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Очищений даптоміцин потім фільтрують і ліофілізують за стандартних умов. Кінцевий очищений даптоміцин має чистоту щонайменше 95 %. Експериментальна частина Приклад 1 Після просвітлення розчин частково очищеного даптоміцину завантажували в аніонообмінну колонку. Початкову речовину просвітлювали діафільтрацією. Очищення за допомогою іонообмінної хроматографії: Діафільтрований даптоміцин завантажували в аніонообмінну колонку, смола Capto Q. Буфери наступного складу готували в окремих посудинах: Буфері: ДІ-вода Буфер 2: 0,2 M NaCl Буфер 3: 0,4MNaCl Буфер 4: 1,0MNaCl Доводили рН початкового розчину до 6-8 за допомогою розбавленого NaOH перед завантаженням. Даптоміцин зв'язувався зі смолою при максимальній ємкості 20 г/л смоли. Після зв'язування зі смолою зв'язані з ферментацією домішки спочатку вимивали буфером 1, а потім буфером 2. Елюювання і повторне одержання даптоміцину проводили в ізократичному режимі з буфером 3. Після елюювання колонку десорбували з буфером 4, щоб видалити даптоміцин, що залишився, або сильно зв'язані домішки. Даптоміцин збирали, виходячи з об'єму близько 5-10 BV (об'єм пропущеного розчину, віднесений до об'єму сорбенту). Обернено-фазова хроматографія І (ОФХ І): Даптоміцин очищали за допомогою ВЕРХ, використовуючи смолу Source 30RPC на основі стиролу. Буфери для цієї стадії готували в окремих посудинах: Буфер 1: ДІ-вода Буфер 2: 12-16 % етанол Буфер 3: 55-65 % етанол Даптоміцин очищали при нейтральному рН (рН 7,5-8,0). Спочатку колонку зрівноважували з буфером 1. Даптоміцин завантажували в колонку (максимальний ступінь завантаження < 30 г/л смоли) перед тим, як менш гідрофобні домішки вимивали (головним чином продукти розпаду), використовуючи буфер 2. Потім даптоміцин повторно витягали за допомогою градієнтного елюювання від 15 до 60 % етанолу (градієнтне змішування буфера Із 2) по 12-16 BV. Даптоміцин збирали, виходячи з УФ сигналу. Обернено-фазова хроматографія II: Виходячи з чистоти, фракції збирали і об'єднували з одержаними на першій стадії оберненофазової хроматографії (ОФХ І) і доводили рН до 3,0-3,1 з оцтовою кислотою при швидкому перемішуванні для запобігання випадання в осад даптоміцину в посудині. Буфери для цієї стадії готували в окремих посудинах: Буфер 1: ДІ-вода, рН 3,0-3,1 досягали з оцтовою кислотою Буфер 2: ЗО - 35 % етанол, рН 3,0-3,1 досягали з оцтовою кислотою Буфер 3: 65-75 % етанол, рН 3,0-3,1 досягали з оцтовою кислотою Розчин даптоміцину з досягнутим рН завантажували у колонку (максимальний ступінь завантаження < 30 г/л смоли) і менш гідрофобні домішки вимивали буфером 1. Елюювання і повторне витягання даптоміцину проводили, використовуючи градієнт етанолу від 35 % до 70 %, змішуючи буфер 2 і 3, по 8-12 BV. Даптоміцин збирали, виходячи з УФ сигналу. Приклад 2 Щоб просвітлити ферментативний бульйон використовували декілька способів просвітлення. По-перше, ферментативний бульйон центрифугували для видалення великих частинок і біомаси. рН ферментативного бульйону складав 6,4, а сухий матеріал (CM) складав близько 6-7 %. Після центрифугування надосадова рідина містила тільки 3 % CM. Потім надосадову рідину додатково заздалегідь фільтрували через 25-100 мкм фільтр, щоб видалити частинки більші, ніж 25-100 мкм. Центрифугований і заздалегідь фільтрований розчин потім ультрафільтрували через фільтр РеШсоп 2, 500 кДа (МШіроге) для видалення великих молекул. Після ультрафільтрації розчин надконцентрували в ході нанофільтрування. Використовували фільтр DL-cepiї, 350 Да (GE Osmonics). Концентрат містив 5 г/л даптоміцину і мав рН 6. 4 UA 105785 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Потім концентрат очищали на аніонообмінній хроматографічній колонці згідно з даним винаходом. Використовували смолу Capto Q (90 мкм) від GE Healthcare. За необхідності рН концентрату доводили до 6 з NaOH перед завантаженням його у колонку. Потім концентрат завантажували у колонку, колонку промивали водою і даптоміцин елюювали ступінчастим градієнтом NaCl. Елююючі розчини містили 0,2 M, 0,4 M і 1,0 M NaCl у воді. Об'єднані фракції з аніонообмінної колонки містили близько 2,5 г/л даптоміцину. Об'єднані фракції з аніонообмінної колонки потім завантажували в першу обернено-фазову хроматографічну колонку (ОФХ І). Використовували смолу Source 30RPC (30 мкм) від GE Healthcare. Після завантаження колонку промивали водою і елюювали градієнтом 20-50 % етанолу при рН 7-8. Пул фракцій на цій стадії містив близько 6 г/л даптоміцину. Потім цей пул фракцій завантажували в другу обернено-фазову колонку з тією ж смолою. Після завантаження розчину даптоміцину з попередньої обернено-фазової колонки колонку промивали водою і даптоміцин елюювали градієнтом 20-50 % етанолу при рН 3,0. Пул фракцій на цій стадії містив близько 8 г/л даптоміцину. Потім розчин даптоміцину піддавали стадії нанофільтрації з 350 Да мембраною DL-серії від GE Osmonics. Після нанофільтрації розчин даптоміцину ліофілізували за стандартних умов. Чистота кінцевого продукту знаходиться в межах 95-97 %. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб очищення даптоміцину, що включає стадії, на яких а) завантажують розчин, що містить частково очищений даптоміцин, у аніонообмінну хроматографічну колонку; б) завантажують розчин зі стадії а) у оберненофазову хроматографічну колонку; в) можливо, завантажують розчин зі стадії б) у ще оберненофазову хроматографічну колонку щонайменше один раз; у якому елююючим буфером в а) є розчин одновалентної солі та елююючим буфером у б) є водний спирт. 2. Спосіб за п. 1, у якому одну або декілька стадій просвітлення здійснюють до стадії а) аніонообмінної хроматографії. 3. Спосіб за пп. 1, 2, у якому продукт стадії б) оберненофазової хроматографії додатково очищають в ході однієї або декількох стадій фільтрації. 4. Спосіб за п. 3, у якому продукт оберненої фази додатково піддають стадії ліофілізації. 5. Спосіб за п. 1, у якому елююючим розчином в а) є NaCl. 6. Спосіб за п. 2, у якому елююючим буфером є 0,1-1,5 М NaCl. 7. Спосіб за п. 1, у якому елююючим буфером у б) є водний етанол. 8. Спосіб за п. 7, у якому елююючим буфером є 5-80 % етанол. 9. Спосіб за п. 1, у якому стадію аніонообмінної хроматографії здійснюють, використовуючи у високому ступені поперечнозшиту агарозну смолу з декстрановим поверхневим наповнювачем. 10. Спосіб за п. 1, у якому стадію оберненофазової хроматографії здійснюють, використовуючи колонку зі смолою на основі стиролу. 11. Спосіб за п. 1, у якому стадію б) повторюють один раз. 12. Спосіб за п. 11, у якому першу оберненофазову хроматографічну колонку елююють при рН 6,5-8,5. 13. Спосіб за п. 11, у якому другу оберненофазову хроматографічну колонку елююють при рН 2,5-3,5. 14. Спосіб очищення даптоміцину, що включає стадії, на яких а) піддають ферментативний бульйон, що містить даптоміцин, одній або декільком стадіям просвітлення; б) завантажують розчин зі стадії а) у аніонообмінну хроматографічну колонку; в) завантажують розчин зі стадії б) у оберненофазову хроматографічну колонку; г) можливо, завантажують розчин зі стадії в) у ще оберненофазову хроматографічну колонку щонайменше один раз; д) піддають одержаний в результаті розчин зі стадії г) одній або декільком стадіям фільтрації; е) піддають фільтрат д) ліофілізації, одержуючи в результаті очищений порошок даптоміцину; у якому елююючим буфером в стадії в) та, можливо, в стадії г) є водний спирт. 15. Спосіб за п. 14, у якому стадіями просвітлення в а) є одна або комбінація наступних методик: зворотний осмос, центрифугування, фільтрація, ультрафільтрація, нанофільтрація, аніонообмінна хроматографія. 5 UA 105785 C2 5 16. Спосіб за п. 14, у якому елююючим розчином у б) є NaCl. 17. Спосіб за п. 16, у якому елююючим буфером є 0,1-1,5 М NaCl. 18. Спосіб за п. 14, у якому елююючим буфером у в) є водний етанол. 19. Спосіб за п. 18, у якому елююючим буфером є 5-80 % етанол. 20. Спосіб за п. 14, у якому стадію в) повторюють один раз. Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6