Спосіб виробництва бурштинової кислоти з використанням бактеріального штаму з дерегульованою ферментною активністю ендогенної піруват-форміат-ліази

Реферат: Винахід належить до бактеріального штаму, який походить від мікроорганізму родини Pasteurellaceae, здатного використовувати гліцерин як джерело вуглецю для ферментаційного вироблення бурштинової кислоти, причому вищезгадані штами є генетично модифікованими таким чином, щоб включати дерегулювання активності їх ендогенного ферменту піруватформіат-ліази, а також до способу продукування бурштинової кислоти, шляхом використання такого мікроорганізму, та до подальшої обробки виробленої органічної кислоти шляхом катіонообмінної хроматографії. UA 105784 C2 (12) UA 105784 C2 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується бактеріальних штамів, здатних використовувати гліцерин як джерело вуглецю для ферментаційного вироблення бурштинової кислоти, причому вищезгадані штами є генетично модифікованими таким чином, щоб включати дерегулювання активності їх ендогенного ферменту піруват-форміат-ліази, а також способів продукування органічних кислот, зокрема, бурштинової кислоти, шляхом використання такого мікроорганізму. Рівень техніки Ферментаційне вироблення бурштинової кислоти (SA) з біомаси вже привертало серйозну увагу, оскільки вищезгадана кислота представляє важливу складову синтетичних смол або є джерелом інших цінних низькомолекулярних хімічних сполук, зокрема, тетрагідрофурану (THF), 1,4-бутандіол (BDO), гамма-бутиролактону (GBL) та піролідонів (WO-A-2006/066839). Продукуючу бурштинову кислоту бактерію, виділену з рубця великої рогатої худоби, було описано у публікації Lee et al (2002a). Бактерія є нерухливою, неспоротвірною, мезофільною і капнофільною грам-негативною паличкою або кокобацилою. Фітогенетичний аналіз на основі послідовності 16S рРНК та фізіологічний аналіз показали, що штам належить до роду Mannheimia як новий вид і отримав назву Mannheimia succiniciproducens MBEL55E. В умовах 100% CO2 він добре розвивається у діапазоні pH 6,0-7,5 і продукує SA, оцтову кислоту та мурашину кислоту у незмінному співвідношенні 2:1:1. Коли M. succiniciproducens MBEL55E культивували в анаеробних умовах при насиченні CO2 глюкозою як джерелом вуглецю, витрачалося 19,8 г/л глюкози і продукувалося 13,3 г/л SA за 7,5 год інкубації. Крім того у цьому мікроорганізмі продукування SA поліпшувалося через мутацію/делецію метаболічних генів. Комбінована мутація/делеція генів лактатдегідрогенази ldhA, піруват-форміат-ліази pflB, фосфотрансацетилази pta та ацетаткінази ackA в результаті забезпечувала штам, який перетворює вуглець на SA з виходом (YP/S) 0,6 г SA на грам доданого джерела вуглецю. Було виявлено, що об’ємна продуктивність вироблення SA становила 1,8 г/л/год (Lee 2006). У публікації Lin et al 2005 описується мутантний штам E. coli, який має мутації у генах ldh, а також pfl, як описано у SB202. Однак цей штам характеризується повільним ростом та нездатністю до повної ферментації сахариду в анаеробних умовах. Неактивні ldh та pfl не викликали стримування вуглецевого потоку у піруватному вузлі, викликаючи накопичення пірувату як головного продукту. У цьому відношенні було виявлено, що вуглецевий вихід (YP/S) сукцинату на джерелі вуглецю був нижчим за 0,15 г/г SA/вуглецю. У публікації Sanchez et al. 2005 описуються штами E. coli, які мають мутації у генах ldh, adhE, ack-pta та iclR. У цих експериментах клітини вирощують аеробно на складному середовищі, збирають, концентрують і інкубують з джерелами вуглецю в анаеробних умовах. За цих конкретних умов для прямого перетворення вуглеводу на SA виявляли вуглецевий вихід YP/S від 0,98 до 1,13 г SA на грам джерела вуглецю, з об’ємною продуктивністю 0,79 г/л год SA. Використання вуглецю для вироблення біомаси перед фазою анаеробного перетворення прямо не включалося до цього розрахунку і далі не описується. У публікації Hong and Lee (2001) описуються штами E. coli, які мають мутації у генах ldh та pfl. Ці штами для продукування SA від ферментації вуглеводу, але при низькому використанні вуглеводу і низьких об’ємній продуктивності та вуглецевому виході (YP/S) SA з вуглеводного джерела вуглецю глюкози. Крім того, бурштинова, оцтова та молочна кислоти продукувались у співвідношенні 1:0,034:1,6. У цьому аналізі ріст штаму, який має мутації у генах ldh та pfl, уповільнювався порівняно з немутованим батьківським штамом. У публікації Zhu et al. 2005 описано штам E. coli, мутований у гені pfl, який продукує не бурштинову кислоту, а лактат і демонструє слабкий ріст при вирощуванні на глюкозі як єдиному субстраті. Однак значним недоліком організму Mannheimia succiniciproducens є його нездатність метаболізувати гліцерин, який, як складова триацилгліцеринів (TAG), стає легко доступним, наприклад, як побічний продукт у реакції переетерифікації при виробництві біодизельного пального (Dharmadi et al., 2006). Ферментаційне вироблення SA з гліцерину описувалось у науковій літературі (Lee et al., 2001; Dharmadi et al., 2006) і з гліцерином досягався більш високий вихід [маса виробленої SA / маса спожитої сировини], ніж у загальних цукрів, таких, як глюкоза (Lee et al., 2001). Однак об’ємна продуктивність, яка досягалася з гліцерином, була значно нижчою, ніж у разі глюкози (0,14 пор. з 1,0 г SA/[л год]). Лише у деяких випадках описувалась анаеробна метаболізація гліцерину до продуктів ферментації. E. coli може ферментувати гліцерин за дуже специфічних умов, таких, як кислотний рівень pH, уникнення накопичення водню ферментаційного газу та відповідний склад середовища (Dharmadi et al 2006, Yazdani and Gonzalez 2007). Багато мікроорганізмів здатні метаболізувати гліцерин у присутності зовнішніх акцепторів електронів (газовий обмін), але 1 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мало з них здатні це робити ферментативно (тобто, за відсутності акцепторів електронів). Ферментативний метаболізм гліцерину більш детально досліджувався у кількох видів родини Enterobacteriaceae, таких, як Citrobacter freundii та Klebsiella pneumoniae. Дисиміляція гліцерину в цих організмах є чітко пов’язаною з їхньою здатністю до синтезу високовідновленого продукту 1,3-пропандіолу (1,3-PDO) (Dharmadi et al 2006). Повідомлялося про перетворення гліцерину на SA з застосуванням Anaerobiospirillum succiniciproducens (Lee et al. 2001). Це дослідження продемонструвало, що SA може продукуватися з низьким утворенням побічного продукту оцтової кислоти шляхом застосування гліцерину як джерела вуглецю, таким чином, полегшуючи очищення SA. Найвищого виходу досягали шляхом періодичної подачі гліцерину та екстракту дріжджів - методики, яка в результаті забезпечує продукування приблизно 19 г/л SA. Однак було помічено, що існує потреба в нерозпізнаних живильних компонентах, присутніх в екстракті дріжджів, для того, щоб відбувалася ферментація гліцерину. Однак сахариди теоретично можуть бути перетворені на SA зі значно нижчим виходом, ніж гліцерин через нижчий стан відновлення сахаридів порівняно з поліолгліцерином. Було виявлено, що комбінація сахаридів з гліцерином функціонує у продукуючих SA анаеробних організмах (Lee et al. 2001), але без досягнення титрів SA поза межами 29 г/л. Крім того, було виявлено, що вуглецевий вихід YP/S становить лише 92%, і співвідношення SA/AA дорівнює 4,9:1. Щонайбільше лише 4 г/л гліцерину перетворювалося на бурштинову кислоту. У реакціях карбоксилування оксалоацетату, каталізовані ферментами фосфоенолпіруваткарбоксилазою (PEPC), фосфоенолпіруваткарбоксикіназою (PEPCK) та піруваткарбоксилазою (PycA) використовується HCO 3 як джерело CO2 (Peters-Wendisch, PG et al 1996, 1998). Таким чином, джерела гідрокарбонату, такі, як NaHCO 3, KHCO3, NH4HCO3 та ін., можуть застосовуватися для ферментаційних та культиваційних середовищ для поліпшення доступності HCO3 у метаболізації субстратів до SA. На даний час виявлено, що продукування SA з глюкози залежить від додавання HCO3 . Продукування біомаси анаеробними організмами обмежується кількістю ATP, що продукується з ферментаційних шляхів. Вихід з біомаси гліцерину в анаеробних організмах є нижчим за вихід сахаридів, таких, як гексози, такі, як глюкоза, фруктоза, пентози, такі, як ксилоза, арабіноза, або дисахариди, такі, як сахароза або мальтоза (Lee et al. 2001, Dharmadi 2007). У більш ранній патентній заявці PCT/EP2008/006714, зміст якої включено авторами шляхом посилання, описується бактеріальний штам, який належить до родини Pasteurellaceae, первісно виділений з рубця і здатний використовувати гліцерин як джерело вуглецю, і варіантні та мутантні штами, які виникають через збереження вищезгаданої здатності, зокрема, бактеріальний штам, позначений як DD1, який зберігається у Німецькому зібранні мікроорганізмів та клітинних культур (DSMZ) (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Німеччина), який зберігається під номером DSM 18541 (ID 06-614) і має здатність до продукування бурштинової кислоти, і варіантні або мутантні штами, які виникають через збереження принаймні вищезгаданої здатності до продукування бурштинової кислоти. Штам DD1 належить до виду Basfia succiniciproducens та родини Pasteurellaceae, як класифікується у публікації Kuhnert et al., 2010. Таким чином, існує потреба у нових бактеріальних штамах, які здатні продукувати органічні кислоти, зокрема, SA, з гліцерину. Зокрема, такі штами мають з високою продуктивністю продукувати вищезгадані кислоти з гліцерину, особливо, у випадках, коли гліцерин, наприклад, з процесу виробництва дизельного пального, використовується без попереднього очищення. Метою даного винаходу є забезпечення таких нових штамів та способів виробництва. Короткий опис винаходу Авторам даного винаходу, які виділили бактеріальний штам, позначений як DD1, несподівано вдалося досягти вищезгаданої мети шляхом мутації вищезгаданого штаму, таким чином, щоб активність білка PFL була зниженою для того, щоб вищезгаданий штам мав потрібні метаболічні характеристики. Таким чином, вони забезпечили новий тип бактеріального штаму, здатного використовувати гліцерин як джерело вуглецю для ферментаційного вироблення бурштинової кислоти, причому вищезгаданий штам є генетично модифікованим таким чином, щоб включати дерегулювання активності його ендогенного ферменту PFL. Автори даного винаходу несподівано виявили, що такий мутований бактеріальний штам, який має потрібні метаболічні характеристики, виявляє значно поліпшену технічну поведінку при ферментації SA. Короткий опис фігур Фігура 1 показує схематичну карту плазмідного pSacB (SEQ ID NO:3). Фігура 2 показує схематичну карту плазмідного pSacB (дельта pfl) (SEQ ID NO:4). 2 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 3 показує схематичну карту плазмідного pSacB (дельта ldh) (SEQ ID NO:5). Детальний опис винаходу a) Загальне визначення окремих термінів: У контексті даного опису термін “бактеріальна клітина” стосується прокаріотного організму, тобто, бактерії. Бактерії можуть класифікуватися на основі їхніх біохімічних та мікробіологічних властивостей, а також їхньої морфології. Ці критерії класифікації є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі. Термін “кислота” (у контексті органічних моно- або дикарбонових кислот, які вказуються авторами, тобто, оцтової, молочної та SA) слід розуміти у найширшому сенсі, і він також охоплює її солі, наприклад, солі лужних металів, такі, як солі натрію та калію, або солі лужноземельних металів, такі, як солі магнію та кальцію, або амонієві солі; або ангідриди вищезгаданих кислот. “Ідентичність” або ”гомологія” між двома нуклеотидними послідовностями означає ідентичність залишків по всій довжині випрямлених послідовностей, наприклад, ідентичність, розраховану (для достатньо подібних послідовностей) для точного вибору програми з пакету біоінформатичних програм EMBOSS (версія 5.0,0, http://emboss.sourceforge.net/what/) з такими параметрами за замовчуванням: - gapopen (штраф за відкриття гепу): 10,0 - gapextend (штраф за подовження гепу): 0,5 - datafile (файл матриці замін, включений до пакету): EDNAFUL Термін “бактеріальний штам, який містить мутований ген, який кодує фермент піруватформіат-ліазу зі зниженою активністю” охоплює модифіковану бактеріальну клітину, яка має знижену активність або зовсім не має активності PFL, яка піддається виявленню. Способи виявлення та визначення активності PFL можна знайти у публікаціях Knappe et al. 1990 та Knappe 1993 і посиланнях, які в них містяться. Крім того, термін охоплює бактеріальну клітину, яка має значно знижену активність PFL порівняно з бактеріальною клітиною, яка демонструє рівень фізіологічної активності піруват-форміат-ліази. Чи є зниження значним, можна визначити статистичними способами, які є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі. Бактеріальні клітини з дефіцитом активності PFL можуть траплятись у природі, тобто, внаслідок спонтанних мутацій. Бактеріальна клітина може бути модифікованою таким чином, щоб мати значно знижену активність PFL, різними способами. В оптимальному варіанті такі бактеріальні клітини можуть бути одержані шляхом хімічної обробки або опромінення. Для цього бактеріальні клітини обробляють, наприклад, мутагенним хімічним агентом, рентгенівськими променями або ультрафіолетовими променями. На наступному етапі відбирають ці бактеріальні клітини з браком PFL, або такі, що принаймні мають знижену активність PFL. Бактеріальні клітини також можуть бути одержані способами гомологічної рекомбінації, спрямованими на мутацію, переривання або вирізання PFL у геномі бактеріальної клітини або введення мутації, які ведуть до створення мутованого гена, який кодує білок зі зниженою активністю. Оптимальний спосіб рекомбінації, зокрема, для введення мутацій або для видалення послідовностей, описується нижче. Вищенаведене визначення також стосується інших генів, які кодують інший згаданий авторами фермент, який підлягає модулюванню, зокрема, фермент, активність якого маж бути знижена, послаблена або вимкнена. Термін “знижена активність” включає, наприклад, експресію генного продукту (наприклад, піруват-форміат-ліази (pfl), лактатдегідрогенази (ldh) або інших) за допомогою вищезгаданого генетично маніпульованого (наприклад, підданого генній інженерії) мікроорганізму на нижчому рівні порівняно з експресією до маніпуляції з мікроорганізмом. Генетична маніпуляція може включати, крім іншого, зміну або модифікацію регуляторних послідовностей або сайтів, пов’язаних з експресією конкретного гена (наприклад, шляхом видалення сильних промоторів, індуцибельних промоторів або універсальних промоторів), модифікацію хромосомної ділянки конкретного гена, зміну нуклеїновокислотних послідовностей, прилеглих до конкретного гена, таких, як послідовність у промоторній ділянці, яка включає регуляторні послідовності, важливі для промоторної активності, сайт зв’язування рибосом або термінатор транскрипції, зменшення кількості копій конкретного гена, модифікацію білків (наприклад, регуляторних білків, супресорів, енхансерів, активаторів транскрипції і т. ін.), задіяних у транскрипції конкретного гена та/або трансляції конкретного генного продукту, або будь-які інші традиційні засоби зниження експресії конкретного гена, звичні для спеціалістів у даній галузі (включаючи, крім іншого, застосування антисмислових молекул нуклеїнових кислот, або інші способи нокауту або блокування експресії білка-мішені). Зокрема, ген може бути підданий маніпуляції таким чином, щоб один або кілька нуклеотидів 3 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 видалялися з хромосоми або організму-хазяїна. Знижена активність генного продукту, наприклад, молекули піруват-форміат-ліази, також може досягатися шляхом введення однієї або кількох мутацій гена, які ведуть до зниження активності генного продукту. Зниженою активністю може бути зниження ферментної активності на >50% від активності немутованого або незміненого гена або зниження ферментної активності на >90%, або, у ще кращому варіанті, зниження ферментної активності на >95%, або, у ще кращому варіанті, зниження ферментної активності на >98%, або, у ще кращому варіанті, зниження ферментної активності на >99%, або, у ще кращому варіанті, зниження ферментної активності на >99,9%. Термін “рекомбінантний” мікроорганізм включає мікроорганізм (наприклад, бактерії, дріжджові клітини, грибкові клітини і т. ін.), який було генетично змінено, модифіковано або піддано інженерії (наприклад, генній інженерії) таким чином, щоб він демонстрував змінений, модифікований або інший генотип та/або фенотип (наприклад, якщо генетична модифікація впливає на кодуючі нуклеїновокислотні послідовності мікроорганізму) порівняно з природним мікроорганізмом, від якого він походить. Термін “промотор” стосується послідовності ДНК, яка спрямовує транскрипцію структурного гена для продукування мРНК. Як правило, промотор розташовується у 5' ділянці гена, поблизу від старт-кодону структурного гена. Якщо промотор є індуцибельним промотором, то швидкість транскрипції збільшується у відповідь на індукуючий агент. Натомість швидкість транскрипції не регулюється індукуючим агентом, якщо промотор є конститутивним промотором. Термін “енхансер” стосується промоторного елемента. Енхансер може підвищувати ефективність, з якою конкретний ген транскрибується у мРНК незалежно від відстані або орієнтації енхансера відносно сайту ініціації транскрипції. Термін “клонуючий вектор” стосується молекули ДНК, такої, як плазміда, косміда, фагмід або бактеріофаг, що має здатність до самостійної реплікації у клітині-хазяїні і застосовується для перетворення клітин для маніпуляції з геном. Клонуючі вектори зазвичай містять один з небагатьох сайтів розпізнавання ендонуклеази рестрикції, у який можуть бути вставлені чужорідні послідовності ДНК у спосіб, що піддається визначенню, без втрати суттєвої біологічної функції вектора, а також маркерний ген, який є придатним для використання при розпізнаванні та відборі клітин, трансформованих клонуючим вектором. Маркерні гени зазвичай включають гени, які забезпечують резистентність до тетрацикліну або резистентність до ампіциліну. Термін “вектор” стосується молекули ДНК, яка включає клонований структурний ген, який кодує чужорідний білок, що забезпечує ген рекомбінантному хазяїні. Зазвичай у разі вектора, призначеного для включення у геном хазяїна, клонований ген є розташованим або функціонально зв’язаним з певними попередніми або наступними послідовностями, гомоголічними або ідентичними генетичній послідовності хазяїна. Термін “рекомбінантний хазяїн” стосується хазяїна, який може бути прокаріотною або еукаріотною клітиною, яка включає або клонуючий вектор, або вектор експресії. Цей термін також охоплює прокаріотні або еукаріотні клітини, якібуло піддано генній інженерії таким чином, щоб вони містили клонований(і) ген(и) у хромосомі або геномі клітини-хазяїна. Приклади прийнятних хазяїв наведено у публікації Sambrook et al., 1989. Терміни “експресувати”, “експресуючий”, “експресований” та “експресія” стосуються експресії генного продукту (наприклад, біосинтетичного ферменту гена шляху або реакції, як визначено й описано в цій заявці) на такому рівні, що виникаюча в результаті ферментна активність цього кодованого білка, або шляху або реакції, якого він стосується, забезпечує можливість метаболічного потоку через цей шлях або реакції в організмі, в якому експресується цей ген/шлях. Експресія може здійснюватися шляхом генетичної зміни мікроорганізму, який використовується як вихідний організм. У деяких варіантах втілення мікроорганізм може бути генетично змінений (наприклад, підданий генній інженерії) для експресії генного продукту на підвищеному рівні відносно того, який продукується вихідним мікроорганізмом або у порівнянному мікроорганізмі, який не було змінено. Генетична зміна включає, крім іншого, зміну або модифікацію регуляторних послідовностей або сайтів, пов’язаних з експресією конкретного гена (наприклад, шляхом додавання сильних промоторів, індуцибельних промоторів або універсальних промоторів, або шляхом видалення регуляторних послідовностей таким чином, щоб експресія була конститутивною), модифікацію хромосомної ділянки конкретного гена, зміну нуклеїновокислотних послідовностей, прилеглих до конкретного гена, таких, як сайт зв’язування рибосом або термінатор транскрипції, збільшення числа копій конкретного гена, модифікацію білків (наприклад, регуляторних білків, супресорів, енхансерів, активаторів транскрипції і т. ін.), які є задіяними у транскрипції конкретного гена та/або трансляції конкретного генного продукту, або будь-які інші традиційні засоби дерегуляції експресії конкретного гена з застосуванням звичних у даній галузі засобів (включаючи, крім іншого, використання антисмислових молекул 4 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїнових кислот, наприклад, для блокування експресії репресорних білків). Мікроорганізм може бути фізично або під впливом навколишнього середовища “змінений” або ”модифікований” для експресії генного продукту на підвищеному або нижчому рівні відносно рівня експресії генного продукту вихідним мікроорганізмом. Наприклад, мікроорганізм може бути оброблений агентом (хімічним або генетичним), який напевно або гіпотетично підвищує або знижує транскрипцію та/або трансляцію конкретного гена та/або трансляцію конкретного генного продукту, або культивований у присутності такого агента, таким чином, щоб транскрипція та/або трансляція були підвищені або знижені. В альтернативному варіанті мікроорганізм може бути культивований при температурі, вибраній таким чином, щоб підвищувати або знижувати транскрипцію та/або трансляцію конкретного гена та/або трансляцію конкретного генного продукту таким чином, щоб транскрипція та/або трансляція були підвищені або знижені. “Генетично модифікований” означає мікроорганізм, змінений у зазначеному сенсі за допомогою наявних у даній галузі технологій генної інженерії, таких, як, наприклад, трансформація, мутація, гомологічна рекомбінація. Терміни “дерегулювати”, “дерегульований” та “дерегулювання” стосуються зміни або модифікації принаймні одного гена у мікроорганізмі, причому зміна або модифікація в результаті веде до підвищення ефективності SA у мікроорганізмі відносно продукування SA за відсутності зміни або модифікації. У деяких варіантах втілення ген, який є зміненим або модифікованим, кодує фермент у біосинтетичному шляху або транспортний білок, таким чином, щоб рівень активності біосинтетичного ферменту у мікроорганізмі був змінений або модифікований, або таким чином, щоб специфічність або ефективність транспорту була змінена або модифікована. У деяких варіантах втілення принаймні один ген, який кодує фермент у біосинтетичному шляху, є зміненим або модифікованим, таким чином, щоб рівень активності ферменту був посилений або підвищений відносно рівня у присутності незміненого гена або гена дикого типу. Дерегулювання також включає зміну кодуючої ділянки одного або кількох генів для одержання на виході, наприклад, ферменту, який є резистентним за принципом зворотного зв’язку або має вищу або нижчу специфічну активність. Крім того, дерегулювання також охоплює генетичну зміну генів, які кодують транскрипційні фактори (наприклад, активатори, репресори), які регулюють експресію генів, які кодують ферменти або транспортні білки. Більш конкретно дерегулювання може вести до “зниженої” ферментної активності, (причому в результаті ферментна активність є нижчою за 100% ферментної активності, яка спостерігається у недерегульованому стані, “вимикається”, тобто, оборотно або необоротно, перестає бути присутньою або принаймні перестає виявлятися традиційними аналітичними засобами, такими, як аналіз ферментної активності. Термін “здатний використовувати” стосується здатності мікроорганізму згідно з винаходом до перетворення субстрату, такого, як, наприклад, гліцерин, на принаймні один структурно та/або стерично відмінний хімічний продукт. “Ферментна активність, яка бере участь у ферментативному перетворенні гліцерину на сукцинат або є пов’язаною з ним” означає будь-яку каталітичну або регуляторну активність ферменту, який впливає на перетворення гліцерину на сукцинат та/або побічні продукти, як може бути визначено будь-яким з набору визначених нижче параметрів. Різні параметри виходу, як визначено авторами (“вихід” або YP/S; “вихід питомої продуктивності”; або об’ємна продуктивність (STY)) є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі і визначаються, як описано, наприклад, у публікації Song and Lee, 2006. “Вихід” та “YP/S” (кожен виражається у масі виробленого продукту / масі спожитого матеріалу) у контексті даного опису є синонімами. Вихід питомої продуктивності описує кількість продукту, такого, як SA, який виробляється за годину на літр ферментативного бульйону на грам сухої біомаси. Кількість сухої клітинної маси, вказаної як DCW, описує кількість біологічно активного мікроорганізму у біохімічній реакції. -1 -1 Значення представлено як грам продукту на грам DCW за годину (тобто, г/гDCW год ). Термін “ферментаційне вироблення” або “ферментація” стосується здатності мікроорганізму (за сприяння ферментної активності, яка міститься у вищезгаданому мікроорганізмі або виробляється ним) до продукування хімічної сполуки у культурі клітин з використанням принаймні одного джерела вуглецю, яке додається до інкубації. Термін "ферментативний бульйон" слід розуміти як водний розчин, приготовлений на основі ферментативного процесу і підданий або не підданий обробці, наприклад, як визначено авторами. b) Загальне визначення для різних мікроорганізмів “Бактеріальна клітина” або “бактеріальний штам”, вказані згідно з даним винаходом, є вибраними з родини Enterobacteriaceae, Pasteurellaceae, Bacilli або Actinobacteria. 5 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 “Enterobacteriaceae” представляє велику родину бактерій, яка включає багато з більш звичних бактерій, таких, як Salmonella та Escherichia coli. Вони належать до протеобактерій, і для них відведено власний ряд (Enterobacteriales). Представники Enterobacteriaceae мають форму паличок. Як і інші протеобактерії, вони мають грам-негативні штами і є факультативними анаеробами, які ферментують цукри для продукування молочної кислоти та різних інших кінцевих продуктів, таких, як бурштинова кислота. Більшість із них також відновлюють нітрат до нітриту. На відміну від більшості подібних бактерій, Enterobacteriaceae зазвичай не мають цитохром-С-оксидази. Більшість із них мають багато джгутиків, які використовуються для переміщення, але деякі роди є нерухливими. Вони є неспоротвірними і здебільшого є каталазопозитивними. Багато представників цієї родини складають нормальну частину кишкової флори, яка міститься у кишечнику людини та інших тварин, тоді, як інші містяться у воді або ґрунті, або паразитують на різних тваринах та рослинах. Escherichia coli, краще відома як E. coli, є одним з найважливіших модельних організмів, і її генетика та біохімія є добре дослідженими. Багато представників Enterobacteriaceae мають перитрихіальні фімбрії І типу, які задіюються у прилипанні бактеріальних клітин до організмів-хазяїв. Прикладами Enterobacteriaceae є E. coli, Proteus, Salmonella, Klebsiella. “Pasteurellaceae” охоплює велику й різноманітну родину грам-негативних протеобактерій, яка включає представників від бактерій, таких, як Haemophilus influenzae, до симбіонтів слизової оболонки тварин та людини. Більшість представників живуть як симбіонти на поверхнях слизової оболонки птахів та ссавців, зокрема, у верхніх дихальних шляхах. Pasteurellaceae зазвичай мають форму паличок і складають значну групу факультативних анаеробів. Їх можна вирізнити зі споріднених Enterobacteriaceae за присутністю оксидази, і з більшості інших подібних бактерій - за відсутністю джгутиків. Бактерії родини Pasteurellaceae було класифіковано по багатьох родах наоснові метаболічних властивостей та послідовностей 16S та 23SRNA. Більш точне визначення Pasteurellacea представлено у публікації Dousse et al. 2008 і Kuhnert, P. 2008 та посиланнях, які в ній містяться. Багато з Pasteurellaceae містять гени піруват-форміат-ліази і є здатними до анаеробної ферментації джерел вуглецю до органічних кислот. Термін “Bacilli” стосується таксономічного класу бактерій. Він включає два ряди, Bacillales та Lactobacillales. Вид bacillus представляє великі (~4-8 x1.5ìm) циліндричні бактерії, які можуть розвиватися в аеробних умовах при 37 °C. Зазвичай вони є непатогенними; Рід Bacillales включає види Alicyclobacillaceae, Bacillaceae, Caryophanaceae, Listeriaceae, Paenibacillaceae, Planococcaceae, Sporolactobacillaceae, Staphylococcaceae, Thermoactinomycetaceae, Turicibacteraceae. Багато з бацил містять гени піруват-форміат-ліази і є здатними до анаеробної ферментації джерел вуглецю до органічних кислот. Термін “Actinobacteria” або ”Actinomycetes” стосується групи грам-позитивних бактерій з високим співвідношенням G+C. До них належать деякі з найбільш поширених організмів, які живуть у ґрунті і відіграють важливу роль у розщепленні органічних матеріалів. Інші Actinobacteria живуть у рослинах та тваринах, і їх прикладами є Mycobacterium, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus та Streptomyces. Деякі Actinobacteria утворюють розгалужувані філаменти, які є дещо подібними до міцелій неспоріднених грибів, серед яких вони були первісно класифіковані під старішою назвою Actinomycetes. Більшість представників є аеробними, але деякі можуть розвиватись в анаеробних умовах. На відміну від Firmicutes, іншої великої групи грам-позитивних бактерій, вони мають ДНК з високим вмістом GC. Перевагу віддають бактеріальним штамам роду “Pasteurella”. Бактерії роду Pasteurella є грам-негативними і факультативно анаеробними. Види Pasteurella є нерухливими, плеоморфними і найчастіше каталазо- і оксидазопозитивними (Kuhnert and Christensen, 2008, ISBN 978-1-904455-34-9). В оптимальному варіанті бактеріальною клітиною є бактеріальна клітина Pasteurella, у ще кращому варіанті - клітина DD1 штаму Pasteurella. У найкращому варіанті штам Pasteurella DD1 є бактеріальним штамом, який зберігається згідно з Будапештським договором у Німецькому зібранні мікроорганізмів та клітинних культур (DSMZ) (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Німеччина, під реєстраційним номером DSM 18541. Цей штам було первісно виділено з рубця корови німецького розведення. Бактерії Pasteurella можуть бути виділені зі шлунково-кишкового тракту тварин, в оптимальному варіанті - ссавців. Бактеріальний штам DD1, зокрема, може бути виділений з рубця великої рогатої худоби і є здатним використовувати гліцерин (включаючи необроблений гліцерин) як джерело вуглецю. В оптимальному варіанті вищезгаданий штам має здатність до продукування SA з гліцерину (включаючи необроблений гліцерин), зокрема, в анаеробних умовах. Крім того, штам Pasteurella DD1 демонструє принаймні одну з таких додаткових 6 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 метаболічних характеристики: a) продукування SA з сахарози; зокрема, в анаеробних умовах; b) продукування бурштинової кислоти з мальтози; зокрема, в анаеробних умовах; c) продукування SA з D-фруктози; зокрема, в анаеробних умовах; d) продукування SA з D-галактози; зокрема, в анаеробних умовах; e) продукування SA з D-манози; зокрема, в анаеробних умовах; f) продукування SA з D-глюкози; зокрема, в анаеробних умовах; g) продукування SA з D-ксилози; зокрема, в анаеробних умовах; h) продукування SA з L-арабінози; зокрема, в анаеробних умовах; i) без використання ксиліту, інозиту та сорбіту; j) ріст як за аеробних, так і за анаеробних умов; k) ріст при початковій концентрації глюкози 75 г/л або більше; l) стійкість до аміаку. Зокрема, вищезгаданий штам демонструє принаймні 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або всі з вищезгаданих метаболічних характеристик. Штам DD1 піддавали аналізові на здатність до кометаболізму сахариду та поліолгліцерину (PCT/EP2008/006714). Було виявлено, що DD1 здатен кометаболізувати мальтозу та гліцерин з утворенням в результаті біомаси, утворенням SA та одночасним використанням мальтози т гліцерину. c) Оптимальні варіанти втілення Перший варіант втілення винаходу стосується бактеріального штаму, здатного використовувати гліцерин як джерело вуглецю для ферментаційного вироблення SA, причому вищезгаданий штам є генетично модифікованим, таким чином, щоб включати дерегулювання ферментної активності ендогенної піруват-форміат-ліази. Зокрема, вищезгадана ферментна активність піруват-форміат-ліази знижується або вимикається. Вищезгадана мутована бактерія, яка містить піруват-форміат-ліазу зі зниженою активністю, може бути побудована генетичними засобами, а також шляхом викликання мутацій з застосуванням способів мутації, добре відомих з існуючої літератури (приклади та описи модифікації бактеріальних геномів можна знайти у публікаціях Saier, Milton H Jr 2008, Foster, Patricia L, 2007, Witkin, E M 1969, Eisenstark, A 1971, Walker, G C et al. 1983 та 1984, Botstein, D, and Shortle, D 1985, та посиланнях, які в них містяться), є здатною використовувати суміші з різних джерел вуглецю, таких, як сахариди та гліцерин; або з використанням лише гліцерину. Способи виділення штамів з мутаціями у гені pfl можна знайти у публікаціях Varenne S et al.1975, та Pascal, M et al. 1981. В оптимальному варіанті вищезгаданий штам має здатність до продукування SA з різних джерел вуглецю (включаючи гліцерин), зокрема, в анаеробних умовах. В іншому варіанті втілення вищезгаданого штаму принаймні одна додаткова ферментна активність, яка бере участь у ферментативному перетворенні гліцерину на сукцинат або є пов’язаною з ним, є дерегульованою. Зокрема, вищезгаданий штам походить від мікроорганізму, вибраного з-поміж мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae, Pasteurellaceae, Bacilli або Actinobacteria. Зокрема, вищезгаданий штам походить від мікроорганізму родини Pasteurellaceae, який має 16S rДНК з послідовністю SEQ ID NO: 1; або послідовністю, яка має гомологію послідовності принаймні 96, 97, 98, 99 або 99,9 %; і/або має 23S rДНК з послідовністю SEQ ID NO: 2; або послідовністю, яка має гомологію послідовності принаймні 95, 96, 97, 98, 99 або 99,9 %. В іншому варіанті втілення даного винаходу бактеріальний штам походить від мікроорганізму родини Pasteurellaceae і належить до виду Basfia succiniciproducens. Вид Basfia succiniciproducens визначається у публікації Kuhnert et al., 2010, включеній авторами шляхом посилання. Бактеріальний штам згідно з даним винаходом додатково має принаймні одну з таких додаткових метаболічних характеристик: a) продукування бурштинової кислоти з сахарози; b) продукування бурштинової кислоти з мальтози; c) продукування бурштинової кислоти з мальтодекстрину; d) продукування бурштинової кислоти з D-фруктози; e) продукування бурштинової кислоти з D-галактози; f) продукування бурштинової кислоти з D-манози; g) продукування бурштинової кислоти з D-глюкози; h) продукування бурштинової кислоти з D-ксилози; i) продукування бурштинової кислоти з L-арабінози; 7 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 j) продукування бурштинової кислоти з лактози; k) продукування бурштинової кислоти з рафінози; l) продукування бурштинової кислоти з гліцерину; m) ріст при початковій концентрації глюкози 75 г/л або більше; n) ріст при початковій концентрації гліцерину 70 г/л або більше. У цьому прикладі комбінація 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 або всіх з вищезгаданих особливостей з особливістю l) (гліцерин->SA) є обов’язковою складовою кожної з вищезгаданих комбінацій. У ще одному варіанті втілення штам згідно з винаходом перетворює сахарозу, мальтозу, Dфруктозу, D-глюкозу, D-ксилозу, L-арабінозу, D-галактозу, лактозу, D-манозу, рафінозу та/або гліцерин на бурштинову кислоту з коефіцієнтом виходу YP/S принаймні 0,5 г/г, в оптимальному варіанті - до приблизно 1,28 г/г; наприклад, з коефіцієнтом виходу YP/S принаймні 0,6 г/г, принаймні 0,7 г/г, принаймні 0,75 г/г, принаймні 0,8 г/г, принаймні 0,85 г/г, принаймні 0,9 г/г, принаймні 0,95 г/г, принаймні 1,0 г/г, принаймні 1,05 г/г, принаймні 1,07 г/г, принаймні 1,09 г/г, принаймні 1,10 г/г, принаймні 1,11 г/г, принаймні 1,22 г/г або принаймні 1,24 г/г. У ще одному варіанті втілення штам згідно з винаходом демонструє принаймні одну з таких характеристик: a) перетворення принаймні 25 г/л гліцерину на принаймні 25,1 г/л бурштинової кислоти з коефіцієнтом виходу YP/S принаймні 1,01 г/г; b) перетворення принаймні одного джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, мальтодекстрину, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, лактози, D-манози, рафінози та/або гліцерину, на бурштинову кислоту з виходом питомої -1 -1 продуктивності принаймні 0,58 г г DCW год бурштинової кислоти; c) перетворення принаймні одного джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, лактози, D-манози та/або гліцерину на бурштинову кислоту з об’ємною продуктивністю для бурштинової кислоти принаймні 2,2 г/(л год) бурштинової кислоти; d) перетворення принаймні 25 г/л принаймні одного джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, лактози, Dманози та/або гліцерину, на бурштинову кислоту з об’ємною продуктивністю для бурштинової кислоти принаймні 2,2 г/(л год); e) перетворення принаймні одного джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, мальтодекстрину D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, лактози, D-манози, рафінози та/або гліцерину, на бурштинову кислоту з виходом питомої -1 -1 продуктивності принаймні 0,58 г г DCW год бурштинової кислоти і з об’ємною продуктивністю для бурштинової кислоти принаймні 2,2 г/(л год). Згідно з ще одним варіантом втілення бактеріальний штам згідно з винаходом перетворює принаймні 28 г/л гліцерину на принаймні 28,1 г/л SA, з коефіцієнтом виходу YP/S принаймні 1,0 г/г, або >1,0 г/г, або > 1,05 г/г, або >1,1 г/г, або >1,15 г/г, або >1,20 г/г, або >1,22 г/г, або >1,24 г/г, до приблизно 1,28 г/г. Наприклад, 28 г/л гліцерину можуть бути перетворені на SA у кількості до приблизно 40 або до приблизно 35 г/л. Згідно з ще одним варіантом втілення, бактеріальний штам згідно з винаходом перетворює принаймні одне джерело вуглецю, вибране з-поміж сахарози, мальтози, рафінози, мальтодекстрину, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, D-манози та/або -1 -1 гліцерину, на SA з виходом питомої продуктивності принаймні 0,6 г г DCW год SA, або -1 -1 -1 -1 принаймні 0,65, принаймні 0,7 г г DCW год , принаймні 0,75 г г DCW год , або принаймні 0,77 -1 -1 г г DCW год SA. Згідно з ще одним варіантом втілення, бактеріальний штам згідно з винаходом перетворює принаймні одне джерело вуглецю, вибране з-поміж сахарози, мальтози, рафінози, мальтодекстрину, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, D-манози та/або гліцерину, на SA з об’ємною продуктивністю для SA принаймні 2,2 г/(л год) або принаймні 2,5, принаймні 2,75, принаймні 3, принаймні 3,25, принаймні 3,5 або принаймні 3,7 г/(л*год) SA. Згідно з ще одним варіантом втілення, бактеріальний штам згідно з винаходом перетворює принаймні 28 г/л принаймні одного джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, рафінози, мальтодекстрину, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, Dманози та/або гліцерину, на SA з об’ємною продуктивністю для SA принаймні 2,2 г/(л год) або принаймні 2,5, принаймні 2,75, принаймні 3, принаймні 3,25, принаймні 3,5 або принаймні 3,7 г/(л*год). Згідно з іншим варіантом втілення, бактеріальний штам згідно з винаходом перетворює принаймні одне джерело вуглецю, вибране з-поміж сахарози, мальтози, рафінози, 8 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мальтодекстрину, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, D-манози та/або -1 -1 гліцерину, на SA з виходом питомої продуктивності принаймні 0,6 г г DCW год або принаймні -1 -1 -1 -1 0,65 або принаймні 0,7 г г DCW год SA, або принаймні 0,77 г г DCW год SA, і з об’ємною продуктивністю для SA принаймні 2,2 г/(л год) або принаймні 2,5, принаймні 2,75, принаймні 3, принаймні 3,25, принаймні 3,5 або принаймні 3,7 г/(л*год). В оптимальному варіанті вищезгаданий штам згідно з винаходом може походити від штаму DD1, який зберігається у DSMZ під реєстраційним номером DSM 18541, або може походити від варіантного або мутантного штаму DD1, який має здатність продукувати бурштинову кислоту. Окремі штами згідно з винаходом продукують бурштинову кислоту (SA) та побічні продукти (SSP) у пропорції SA/SSP >10:1 або > 12,5:1 або > 15:1 або > 17,5:1 або > 20:1 або > 25:1 або > 30:1 або > 33:1, причому SSP представляє суму побічних продуктів молочної кислоти (LA), мурашиної кислоти (FA), оцтової кислоти (AA) та яблучної кислоти (MA), причому кожна кількість виражається у г/л. Інші окремі штами продукують бурштинову кислоту (SA) та побічний продукт оцтову кислоту (AA) у пропорції SA/AA >10:1 або > 12,5:1 або > 15:1 або > 17,5:1 або > 20:1 або > 25:1 або > 30:1 або > 40:1 або > 50:1 або > 75:1 або > 90:1, і кожна кількість виражається у г/л. Інші окремі штами продукують бурштинову кислоту (SA) та побічний продукт мурашину кислоту (FA) у пропорції SA/FA > 90:1 або > 100:1, і кожна кількість виражається у г/л. Інший варіант втілення винаходу стосується способу ферментаційного вироблення органічної кислоти або її солі або похідної, причому спосіб включає етапи: a) інкубації бактеріального штаму, як визначено в одному з попередніх пунктів, у середовищі, яке містить здатне до асиміляції джерело вуглецю, та культивації вищезгаданого штаму за умов, які сприяють утворенню потрібної органічної кислоти; та b) одержання вищезгаданої органічної кислоти, зокрема SA, або її солі або похідної, з середовища. Згідно з конкретним способом, ферментацію здійснюють при температурі у діапазоні приблизно від 10 до 60 °C, наприклад, від 20 до 50 °C, від 30 до 45 °C або від 25 до 35 °C, і при pH від 5,0 до 9,0, наприклад, від 5,5 до 8, або від 6 до 7, і у присутності діоксиду вуглецю. Рівень pH може регулюватися додаванням NH4HCO3, (NH4)2CO3, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, KHCO3, Mg(OH)2, MgCO3, MgH(CO3)2, Ca(OH)2, CaCO3, Ca(HCO3)2, CaO, CH6N2O2, C2H7N та/або їх сумішей. Зокрема, вищезгадане здатне до асиміляції джерело вуглецю вибирають з-поміж гліцерину, сахарози, мальтози, мальтодекстрину, D-фруктози, D-галактози, D-манози, лактози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, рафінози, продуктів розпаду крохмалю, целюлози, геміцелюлоз та лігноцелюлози; та їхніх сумішей. Зокрема, вищезгаданим джерелом вуглецю є гліцерин або суміш гліцерину та принаймні одного іншого джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, D-фруктози, Dгалактози, лактози, D-манози, D-глюкози, D-ксилози, рафінози та L-арабінози. Згідно з конкретним варіантом втілення вищезгаданого способу, концентрацію здатного до асиміляції джерела вуглецю регулюють до значення у діапазоні від 5 до 80 г/л, наприклад, від 10 до 60. Даний винахід також забезпечує спосіб ферментаційного вироблення бурштинової кислоти або її солі або похідної, причому спосіб включає етапи: a) інкубації бактеріального штаму у середовищі, яке містить принаймні одне здатне до асиміляції джерело вуглецю, та культивації вищезгаданого штаму за умов, які сприяють утворенню потрібної органічної кислоти; b) одержання вищезгаданої органічної кислоти або її солі або похідної з середовища; і додатково характеризується принаймні однією з таких особливостей: c) перетворення принаймні 25 г/л гліцерину на принаймні 25,1 г/л бурштинової кислоти, з коефіцієнтом виходу YP/S принаймні 1,0 г/г d) перетворення принаймні одного джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, D-манози, рафінози та/або гліцерину, на бурштинову кислоту з виходом питомої продуктивності принаймні 0,58 г г -1 -1 DCW год бурштинової кислоти; e) перетворення принаймні одного джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, лактози, D-манози, рафінози та/або гліцерину, на бурштинову кислоту з об’ємною продуктивністю для бурштинової кислоти принаймні 2,2 г/(л год) бурштинової кислоти; f) перетворення принаймні 25 г/л принаймні одного джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, лактози, D 9 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 манози, рафінози та/або гліцерину, на бурштинову кислоту з об’ємною продуктивністю для бурштинової кислоти принаймні 2,2 г/(л год); g) перетворення принаймні одного джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, лактози, D-манози, рафінози та/або гліцерину, на бурштинову кислоту з виходом питомої продуктивності принаймні -1 -1 0,6 г г DCW год бурштинової кислоти і з об’ємною продуктивністю для бурштинової кислоти принаймні 2,2 г/(л год); h) продукування бурштинової кислоти (SA) та побічних продуктів (SSP) у пропорції SA/SSP >10:1 або > 12,5:1 або > 15:1 або > 17,5.1, або > 20:1 або > 25:1 або > 30:1 або > 33:1, причому SSP представляє суму побічних продуктів молочної кислоти (LA), мурашиної кислоти (FA), оцтової кислоти (AA) та яблучної кислоти (MA), причому кожна кількість виражається у г/л; i) продукування бурштинової кислоти (SA) та побічного продукту оцтової кислоти (AA) у пропорції SA/AA >10:1 або > 12,5:1 або > 15:1 або > 17,5:1 або > 20:1 або > 25:1 або > 30:1 або > 50:1 або > 75:1 або > 90:1, причому кожна кількість виражається у г/л. Згідно з конкретним варіантом втілення вищезгаданого способу, вищезгаданий бактеріальний штам є генетично модифікованим штамом, як визначено вище. Спосіб згідно з винаходом може виконуватися переривчасто або безперервно. Процес продукування кислоти може контролюватися традиційними способами, такими, як, наприклад, високоефективна рідинна хроматографія або газова хроматографія. В оптимальному варіанті SA продукується в анаеробних умовах. Анаеробні умови можуть бути встановлені за допомогою традиційних технологій, наприклад, шляхом дегазації складових реакційного середовища та підтримання анаеробних умов шляхом введення діоксиду вуглецю або азоту або їх сумішей та, необов’язково, водню при швидкості потоку, наприклад, від 0,1 до 1 або від 0,2 до 0,5 vvm. Аеробні умови можуть бути встановлені за допомогою традиційних технологій, наприклад, шляхом введення повітря або кисню при швидкості потоку, наприклад, від 0,1 до 1 або від 0,2 до 0,5 vvm. У відповідних випадках може застосовуватися дещо підвищений тиск від 0,1 до 1,5 бар згідно з винаходом. В іншому варіанті втілення винахід забезпечує спосіб продукування бурштинової кислоти та/або амонієвих солей бурштинової кислоти, причому спосіб включає ферментаційне вироблення бурштинової кислоти, як визначено вище, та додаткове регулювання рівня pH основним аміаком або його водним розчином, або NH4HCO3, (NH4)2CO3, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, KHCO3, Mg(OH)2, MgCO3, MgH(CO3)2, Ca(OH)2, CaCO3, Ca(HCO3)2, CaO, CH6N2O2, C2H7N та їх сумішами. Як правило, фізичний стан основи може передбачати водний розчин, водну суспензію, газоподібний або твердий. В іншому варіанті втілення органічну кислоту, зокрема, бурштинову кислоту та/або її солі, продукують одним з вище-або нижчезазначених способів і додатково виділяють та/або очищують, застосовуючи такі етапи: фільтрацію та/або центрифугування, катіонообмінну хроматографію та/або кристалізацію. В оптимальному варіанті органічну кислоту та/або її солі додатково виділяють та/або очищують, застосовуючи такі етапи: фільтрацію з наступною катіонообмінною хроматографією з наступною кристалізацією. Фільтрацію можуть застосовувати для відокремлення бактеріальних клітин від рідини, яка містить бурштинову кислоту. Фільтрація може являти собою діафільтрацію, фільтрацію поперечного потоку та/або ультрафільтрацію. Матеріалом, який застосовують для катіонообмінної хроматографії, може бути катіонообмінна смола сильної кислоти. Катіонообмінна смола сильної кислоти включає, наприклад, групи сульфонової кислоти. Зокрема, матеріалом, який застосовують для катіонообмінної хроматографії, може бути стирол-дивінілбензольний співполімеризат, який + + включає групи сульфонової кислоти у формі H . Форма H означає, що групи сульфонової кислоти є присутніми у кислотній формі. В оптимальному варіанті середній розмір частинок смоли для катіонообмінної хроматографії складає від 0,3 до 1,5, у ще кращому варіанті - від 0,55 до 0,75 мм, і/або об’ємна густина становить від 700 до 800 г/л. Смола для катіонообмінної хроматографії може бути макропористою. Макропориста - це означає, що в оптимальному варіанті середній діаметр пор катіонообмінної смоли становить від 20 до 120 нм, в 10 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 оптимальному варіанті - від 20 до 100 нм, у ще кращому варіанті - від 20 до 40 нм. Розподіл частинок в оптимальному варіанті є монодисперсним. В оптимальному варіанті загальна продуктивність матеріалу для катіонообмінної хроматографії становить від 0,5 до 2,0, у ще кращому варіанті - від 0,8 до 1,7, у ще кращому варіанті - від 1,0 до 1,5, у ще кращому варіанті від 1,4 до 1,9 хв екв/л. x екв/л означає, що катіонообмінна смола включає x моль груп сульфонової кислоти. Відповідно, екв/л розраховують по відношенню до однозарядженої молекули. Сіль бурштинової кислоти, яка підлягає очищенню, може бути сіллю Na, K, Ca, Mg та/або амонію. Наприклад, катіонообмінна смола сильної кислоти може являти собою Type Lewatit Monoplus SP 112 від Lanxess. В оптимальному варіанті катіонообмінну хроматографію здійснюють при температурі від 20 до 60 °C, у ще кращому варіанті - від 45 до 60 °C. Інші оптимальні способи продукування SA описуються нижче: Спосіб 1: В іншому варіанті втілення даний винахід забезпечує спосіб ферментаційного вироблення SA або її солі або похідної, причому спосіб включає етапи: a. інкубації бактеріального штаму у середовищі, яке містить принаймні одне здатне до асиміляції джерело вуглецю, та культивації вищезгаданого штаму за умов, які сприяють утворенню потрібної органічної кислоти; b. одержання вищезгаданої органічної кислоти або її солі або похідної з середовища; причому спосіб додатково характеризується перетворенням принаймні 50 г/л гліцерину на принаймні 50 г/л SA, з коефіцієнтом виходу YP/S принаймні 1,0 г/г, або >1,0 г/г, або > 1,05 г/г, або >1,1 г/г, або >1,15 г/г, або >1,20 г/г, або >1,22 г/г, або >1,24 г/г; до приблизно 1,28 г/г; наприклад, коефіцієнт виходу YP/S складає принаймні 0,6 г/г, принаймні 0,7 г/г, принаймні 0,75 г/г, принаймні 0,8 г/г, принаймні 0,85 г/г, принаймні 0,9 г/г, принаймні 0,95 г/г, принаймні 1,0 г/г, принаймні 1,05 г/г, принаймні 1,1 г/г, принаймні 1,15 г/г, принаймні 1,20 г/г, принаймні 1,22 г/г або принаймні 1,24 г/г. Наприклад, 50 г/л гліцерину можуть бути перетворені до приблизно 65 або до 62,5 г/л SA, або до 60 г/л SA. Спосіб 2: В іншому варіанті втілення даний винахід забезпечує спосіб ферментаційного вироблення SA або її солі або похідної, причому спосіб включає етапи: a) інкубації бактеріального штаму ферментом піруват-форміат-ліазою зі зниженою активністю у середовищі, яке містить принаймні одне здатне до асиміляції джерело вуглецю, та культивації вищезгаданого штаму за умов, які сприяють утворенню потрібної органічної кислоти; b) одержання вищезгаданої органічної кислоти або її солі або похідної з середовища; причому спосіб додатково характеризується перетворенням джерела вуглецю, вибраного зпоміж сахарози, мальтози, мальтодекстрину, рафінози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, Lарабінози, D-галактози, D-манози та/або гліцерину, на SA з виходом питомої продуктивності -1 -1 -1 -1 принаймні 0,42 г г DCW год SA або принаймні 0,45 або принаймні 0,47 г г DCW год SA, або -1 -1 принаймні 0,49 г г DCW год SA. Спосіб 3: В іншому варіанті втілення даний винахід забезпечує спосіб ферментаційного вироблення SA або її солі або похідної, причому спосіб включає етапи: a) інкубації бактеріального штаму ферментом піруват-форміат-ліазою зі зниженою активністю у середовищі, яке містить принаймні одне здатне до асиміляції джерело вуглецю, та культивації вищезгаданого штаму за умов, які сприяють утворенню потрібної органічної кислоти; b) одержання вищезгаданої органічної кислоти або її солі або похідної з середовища; причому спосіб додатково характеризується перетворенням джерела вуглецю, вибраного зпоміж сахарози, мальтози, мальтодекстрину, рафінози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, Lарабінози, D-галактози, D-манози та/або гліцерину, на SA з об’ємною продуктивністю для SA принаймні 2,22 г/(л год) або принаймні 2,5, принаймні 2,75, принаймні 2,9, г/(л*год) SA. Спосіб 4: В іншому варіанті втілення даний винахід забезпечує спосіб ферментаційного вироблення SA або її солі або похідної, причому спосіб включає етапи: a) інкубації бактеріального штаму у середовищі, яке містить принаймні одне здатне до асиміляції джерело вуглецю, та культивації вищезгаданого штаму за умов, які сприяють утворенню потрібної органічної кислоти; b) одержання вищезгаданої органічної кислоти або її солі або похідної з середовища; причому спосіб додатково характеризується перетворенням принаймні 50 г/л джерела, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, мальтодекстрину, рафінози, D-фруктози, D-глюкози, Dксилози, L-арабінози, D-галактози, D-манози та/або гліцерину, на SA з об’ємною продуктивністю 11 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для SA принаймні 2,2 г/(л год) або принаймні 2,5, принаймні 2,75, принаймні 3, принаймні 3,25, принаймні 3,5 або принаймні 3,7 г/(л*год). Спосіб 5: В іншому варіанті втілення даний винахід забезпечує спосіб ферментаційного вироблення SA або її солі або похідної, причому спосіб включає етапи: a) інкубації бактеріального штаму у середовищі, яке містить принаймні одне здатне до асиміляції джерело вуглецю, та культивації вищезгаданого штаму за умов, які сприяють утворенню потрібної органічної кислоти; b) одержання вищезгаданої органічної кислоти або її солі або похідної з середовища; причому спосіб додатково характеризується перетворенням джерела вуглецю, вибраного зпоміж сахарози, мальтози, мальтодекстрину, рафінози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, Lарабінози, D-галактози, D-манози та/або гліцерину, на SA з виходом питомої продуктивності -1 -1 -1 -1 принаймні 0,6 г г DCW год SA або принаймні 0,65 або принаймні 0,7 г г DCW год SA, або -1 -1 -1 -1 принаймні 0,75 г г DCW год SA, або принаймні 0,77 г г DCW год SA із об’ємною продуктивністю для SA принаймні 2,2 г/(л год) або принаймні 2,5, принаймні 2,75, принаймні 3, принаймні 3,25, принаймні 3,5 або принаймні 3,7 г/(л*год). В іншому варіанті втілення вищезазначених способів з 1 по 5 для продукування SA джерелом вуглецю є гліцерин або суміш гліцерину та принаймні одного додаткового джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, рафінози, мальтодекстрину, D-фруктози, Dгалактози, D-манози, D-глюкози, D-ксилози та L-арабінози. Особливо прийнятними умовами для продукування SA є такі: Джерело вуглецю: глюкоза, ксилоза, мальтоза або мальтодекстрин, рафіноза та/або гліцерин (включаючи необроблений гліцерин) Температура: від 30 до 45 °C pH: від 5,5 до 7,0, регульований основою, як описано вище, в оптимальному варіанті джерелом HCO3 , таким, як Na2CO3, NaHCO3, Mg(HCO3)2, Ca(HCO3)2 або Mg(OH)2, MgCO3, Ca(OH)2, CaCO3. газ, який подається: CO2 Утворені SA та/або солі SA можуть бути виділені традиційними способами, відомими спеціалістам у даній галузі, такими, як, наприклад, кристалізація, фільтрація, електродіаліз, хроматографія. Наприклад, вони можуть бути виділені шляхом осадження як продукт сукцинату кальцію у ферментаторі під час ферментації шляхом використання гідроксиду, оксиду, карбонату або гідрокарбонату кальцію для нейтралізації та фільтрації осаду. Потрібний продукт SA видобувають з осадженого сукцинату кальцію шляхом підкислення сукцинату сірчаною кислотою з наступною фільтрацією для видалення сульфату кальцію (гіпсу), який осаджується. Утворений в результаті розчин може піддаватися подальшому очищенню за допомогою іонообмінної хроматографії з метою видалення небажаних залишкових іонів. В іншому варіанті втілення даний винахід забезпечує спосіб продукування тетрагідрофурану (THF) та/або 1,4-бутандіолу (BDO) та/або гамма-бутиролактону (GBL), який включає a) ферментаційне вироблення бурштинової кислоти та/або солей бурштинової кислоти, як визначено вище, та b1) або пряму каталітичну гідрогенізацію одержаної вільної кислоти до THF та/або BDO та/або GBL, або b2) хімічну естерифікацію одержаної вільної бурштинової кислоти та/або солей бурштинової кислоти до відповідного діестеру нижчого алкілу з наступною каталітичною гідрогенізацією вищезгаданого естеру до THF та/або BDO та/або GBL. В іншому варіанті втілення даний винахід забезпечує спосіб продукування піролідонів, який включає a) ферментаційне вироблення амонієві солі бурштинової кислоти, як визначено вище, та b) хімічне перетворення амонієвих солей бурштинової кислоти на піролідони у спосіб, який є відомим per se. У конкретному варіанті втілення способів вищезгаданий гліцерин, який використовують як здатне до асиміляції джерело вуглецю, є необроблений гліцерин, зокрема, такий, що одержується шляхом естерного розщеплення триацилгліцеридів. Наприклад, гліцерин є відходом виробництва біодизельного пального. Даний винахід також стосується застосування бактеріального штаму, як визначено вище, для ферментаційного вироблення хімічної речовини тонкого органічного синтезу, такої, як, наприклад бурштинова кислота або її сіль або похідна. d) Інші конкретні варіанти втілення d1) Генетичні маніпуляції 12 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно з ще одним варіантом втілення, бактеріальний штам згідно з винаходом містить ген, який кодує мутований фермент ферменту піруват-форміат-ліази (pfl), оскільки його ферментна активність визначається номером EC EC 2.3.1.54. Наприклад, ферментна активність pfl зазнає негативного впливу через мутацію у гені pflA або вплив експресійної регуляції гена pflA. Послідовність гена pflA та генного продукту pflA можна знайти під такими номерами доступу GeneID: 6268899, YP_001880903: Гомологи цього гена є відомими під номерами доступу: NCBIGeneID 945514, 945444, 947623, 948454, 3075405, відповідні білки - під номерами доступу: UniProt: P09373, P75793, P42632, P32674, Q65VK2. Обсяг цього винаходу також охоплює гени, які кодують активуючі ферменти піруватформіат-ліази, які визначаються номером EC EC 1.97.1.4 і описуються у публікаціях Knappe et al. 1990 та 1993, зі зниженою або дерегульованою активністю. Це може бути виконано через введення мутацій або делецій генів з застосуванням способів, описаних згідно з цим винаходом. Приклади цього ферменту, активність якого може бути знижена, або кодуючий ген якого може бути мутований або дерегульований, кодуються геном активуючого ферменту pfl pflA та геном yfiD, геном K12 E. Coli, відомим під номером доступу GeneID: 947068, геном ybiY з номером доступу NCBI-GeneID: 945445 та відповідним білком NP_415345, геном Mannheimia succiniproducens, відомим під номером доступу GeneID: AAU37008, відповідними білками під номерами доступу YP_087593, NP_417074 та YP_087564, а також гомологами цього гена. Описуються номери доступу немутованих генних послідовностей, які піддаються мутаціям або делеціям, описаним у цьому винаході. Крім того, обсяг цього винаходу охоплює штами, які мають знижену активність білка arcA, наприклад, під номером доступу: ECK4393 (також відомі під такими описами: cpxC, fexA, sfrA, msp) або fnr через генетичні мутації для відповідного гена, відомого під номером доступу NCBIGeneID: 948874 для arcA або NCBI-GeneID: 945908 для fnr. Відповідні послідовності білків можна знайти під номером доступу P0A9E5. Подібні гени є відомими для інших організмів, таких, як Mannheimia succiniproducens. NCBI-GeneID: 3076294 та відповідний білок YP_088696 для arcA і для fnr NCBI-GeneID: 3075449 та UniProt: Q65TM6. Також обсяг цього винаходу охоплює штами, які мають знижену активність лактатдегідрогенази, яка визначається за номером EC 1.1.1.27 та EC 1.1.1.28, яка кодує ферменти зі специфічністю продукування D-молочної або L-молочної кислоти, або обох з них. Прикладами є гени E. coli NCBI-GeneID: 946315 та відповідний білок NP_415898 або ген M succiniproducens NCBI-GeneID: 3075603 та відповідний білок YP_089271. Згідно з ще одним варіантом втілення, бактеріальний штам згідно з винаходом містить: (1) мутований ген, який кодує фермент піруват-форміат-ліазу, визначений за номенклатурою EC як EC 2.3.1.54, зі зниженою активністю; та/або (2) мутований ген, який кодує активуючий фермент піруват-форміат-ліази, визначений за номенклатурою EC як EC 1.97.1.4 зі зниженою активністю; та/або (3) мутований ген, який кодує білок arcA та/або (4) мутований ген, який кодує лактатдегідрогеназу, визначений за номенклатурою EC як EC 1.1.1.27 або EC 1.1.1.28 зі зниженою активністю. Конкретний спосіб одержання генетично модифікованих бактеріальних штамів згідно з винаходом являє собою спосіб, який також іноді називають “рекомбінацією Кемпбелла” (Leenhouts et al., 1989, Appl Env Microbiol 55, 394-400). “Campbell in” у контексті даного опису стосується приготування трансформанта первісної клітини-хазяїна, в якому вся кільцева дволанцюгова молекула ДНК (наприклад, плазміда) є включеною у хромосому через єдину подію гомологічної рекомбінації (cross in event), і в результаті забезпечується ефективна інсерція лінеаризованого варіанта вищезгаданої кільцевої молекули ДНК у першу послідовність ДНК хромосоми, яка є гомологічною першій послідовності ДНК вищезгаданої кільцевої молекули ДНК. “Campbelled in” означає лінеаризовану послідовність ДНК, яка була включеною у хромосому трансформанта “Campbell in”. “Campbell in” містить дуплікацію першої гомологічної послідовності ДНК, кожна копія якої включає і оточує копію сайту кросовера гомологічної рекомбінації. “Campbell out” у контексті даного опису стосується клітини, яка походить від трансформанта “Campbell in”, у якому відбулася друга подія гомологічної рекомбінації (cross out event) між другою послідовністю ДНК, яка міститься на лінеаризованій вставленій ДНК “Campbelled in” ДНК, та другою послідовністю ДНК хромосомного походження, яка є гомологічною другій послідовності ДНК вищезгаданої лінеаризованої вставки. Друга подія рекомбінації в результаті веде до делеції (викидання) частини включеної послідовності ДНК, але важливим є те, що в результаті також утворюється частина (вона може бути не більшою за одну пару нуклеотидів) включеної “Campbelled in” ДНК, що залишається у хромосомі, таким чином, щоб, порівняно з первісною клітиною-хазяїном, клітина “Campbell out” містила один або кілька спланованих змін у 13 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хромосомі (наприклад, делецію послідовності ДНК, заміщення окремої пари нуклеотидів, заміщення кількох пар нуклеотидів, інсерцію гетерологічного гена або послідовності ДНК, інсерцію додаткової копії або копій гомологічного гена або модифікованого гомологічного гена, або інсерцію послідовності ДНК, яка включає більше одного з цих вищеперелічених прикладів). Клітину “Campbell out” в оптимальному варіанті одержують шляхом контрселекції проти гена, який міститься у частині (частині, яка має бути викинутою) “Campbelled in” послідовності ДНК, наприклад, гена sacB Bacillus subtilis, яка є летальною у разі експресії у клітині, яка вирощується у присутності приблизно від 5% до 10% сахарози. З контрселекцією чи без неї, потрібна “Campbell out” клітина може бути одержана або розпізнана шляхом відбору потрібної клітини з використанням будь-якого придатного для відбору фенотипу, яким, крім інших, може бути морфологія колонії, колір колонії, присутність або відсутність стійкості до антибіотиків, присутність або відсутність даної послідовності ДНК через полімеразну ланцюгову реакцію, присутність або відсутність ауксотрофії, присутність або відсутність ферменту, присутність або відсутність ферментної активності, такої, як активність піруват-форміат-ліази або активності лактатдегідрогенази, гібридизація нуклеїнової кислоти у колонії, відбір антитіл і т. ін. Терміни “Campbell in” та “Campbell out” також можуть вживатись як дієслова у різному часі для вказування на описані вище спосіб або процес. Слід розуміти, що подія гомологічної рекомбінації, яка може вести до “Campbell in” або “Campbell out”, може відбуватись у певному діапазоні основ ДНК у межах гомологічної послідовності ДНК, і оскільки гомологічні послідовності є ідентичними між собою принаймні у частині цього діапазону, зазвичай буває неможливим точно вказати, де відбулася подія кросовера. Іншими словами, неможливо точно вказати, яка послідовність первісно походила від вставленої ДНК, а яка первісно походила від хромосомної ДНК. Крім того, перша гомологічна послідовність ДНК та друга гомологічна послідовність ДНК зазвичай відокремлюються ділянкою з частковою відсутністю гомології, і саме ця ділянка відсутності гомології зберігається у хромосомі “Campbell out” клітини. В оптимальному варіанті перша та друга гомологічні послідовності ДНК мають довжину принаймні приблизно 200 пар нуклеотидів і можуть мати довжину до кількох тисяч пар нуклеотидів. Однак може бути розроблена, яка дозволяє працювати з коротшими або довшими послідовностями. Наприклад, довжина першої та другої гомологічних послідовностей може складати приблизно від 500 до 2000 пар нуклеотидів, і одержанню “Campbell out” з “Campbell in” сприяє впорядкування першої та другої гомологічних послідовностей таким чином, щоб вони мали приблизно однакову довжину, в оптимальному варіанті - з різницею, меншою, ніж 200 пар нуклеотидів, у найкращому варіанті - з коротшою з двох, яка складає принаймні 70% довжини довшої з пар нуклеотидів. Шляхом застосування зазначеного способу генетичної модифікації приготовляли мутантні штами конкретного продукуючого SA штаму (тобто, DD1) шляхом делеції генів ендогенного ферменту піруват-форміат-ліази та/або ферменту лактатдегідрогенази, як детальніше описано у представлених нижче прикладах. d2) Етапи ферментації: Ферментація, яку застосовували згідно з даним винаходом, може здійснюватися, наприклад, у ферментаторах з перемішуванням, барботажних колонах та циркуляційних реакторах. Різнобічний огляд можливих типів способів, включаючи типи та геометричні конструкції мішалок, можна знайти у публікації "Chmiel: Bioprozesstechnik: Einführung in die Bioverfahrenstechnik, Band 1". Згідно з цим способом винаходу типовими доступними варіантами є нижчезазначені варіанти, які є відомими спеціалістам у даній галузі або пояснюються, наприклад, у публікації "Chmiel, Hammes and Bailey: Biochemical Engineering", такі, як періодична, періодична з підживленням, періодична з повторним підживленням або інша безперервна ферментація, з рециркуляцією біомаси або без неї. Залежно від продукуючого штаму, може здійснюватися барботаж повітрям, киснем, діоксидом вуглецю, воднем, азотом або відповідними сумішами газів з метою досягнення належного виходу (YP/S). До здійснення передбаченого хімічного перетворення у ферментативному бульйоні згідно зі способом винаходу ферментативний бульйон може піддаватися попередній обробці; наприклад, біомаса бульйону може бути видалена. Способи видалення біомаси є відомими спеціалістам у даній галузі і включають, наприклад, фільтрацію, осадження та флотацію. Таким чином, біомаса може бути видалена, наприклад, за допомогою центрифуг, сепараторів, декантаторів, фільтрів або у флотаційному пристрої. Для максимального видобутку потрібного продукту часто рекомендується промивання біомаси, наприклад, у формі діафільтрації. Вибір способу залежить від вмісту біомаси у ферментаційному бульйоні та властивостей біомаси, а також взаємодії біомаси з потрібним продуктом. В іншому варіанті втілення ферментативний 14 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бульйон може бути стерилізований або пастеризований. У ще одному варіанті втілення ферментативний бульйон концентрують. Залежно від потреби, ця концентрація може здійснюватися періодично або безперервно. Діапазон тиску та температури має вибиратися таким чином, щоб, по-перше, не відбувалося пошкодження продукту, і, по-друге, вимагалося мінімальне застосування пристрою та енергії. Належний вибір рівня тиску та температури для багатоетапного випарювання, зокрема, дозволяє заощадити енергію. Реактори з перемішуванням, випарні апарати з падаючою плівкою, тонкоплівкові випарні апарати, випарники з примусовою циркуляцією та інші типи випарників можуть застосовуватись у режимі природної або примусової циркуляції. d3) Естерифікація SA та гідрогенізація: Прийнятні експериментальні умови для здійснення хімічної естерифікації з наступною прямою каталітичною гідрогенізацією є добре відомими, і описуються, наприклад, у європейській патентній заявці 06007118.0, включеній авторами шляхом посилання. a) Процес естерифікації: Процес естерифікації, який може включати реакційну дистиляцію, може здійснюватися з застосуванням пристрою, який є відомим per se, у різних конструкціях. Наприклад, може застосовуватись установка для естерифікації, яка функціонує у безперервному режимі, яка включає ректифікаційну колону з відповідною кількістю теоретичних ступенів, які досягаються шляхом установлення тарілок або насадок. Водний завантажуваний матеріал, який включає амонієву сіль SA, подається у верхню частину колони з резервуара відразу після створення рівноважного температурного профілю у колоні в результаті подачі алканолу, який випарюється у випарну петлю, приєднану до відстійника колони. Реакція утворює протилежні потоки: низхідний потік рідини, яка містить амонієву сіль та конденсату, і висхідний потік парової фази, що містить алканол. Для каталізу реакції естерифікації до первісно завантаженої амонієвої солі може додаватися гомогенний каталізатор. В альтернативному варіанті всередину колони можуть подаватися гетерогенні каталізатори. Утворений естер карбонової кислоти є рідким в умовах процесу і проходить через нижній кінець колони у відстійник дистиляційної колони і безперервно видаляється з відстійника. Газоподібні компоненти, наприклад, азеотропні суміші, які включають алканол-воду та/або аміак, видаляються з реакційної колони, а отже, з рівноваги реакції у верхній частині колони. Інші модифікації вищеописаних конкретних варіантів втілення можуть бути здійснені спеціалістами у даній галузі без зайвих зусиль. Прийнятні межі параметрів процесу естерифікації згідно з винаходом можуть бути легко визначені спеціалістами у даній галузі, залежно відконфігурації застосовуваного пристрою, наприклад, застосованого типу внутрішнього устрою колони, типу та кількості реагентів, типу та кількості застосовуваного у відповідному разі каталізатора. Наприклад, окремі параметри можуть бути встановлені у такому необмежувальному діапазоні параметрів: Температура колони: 0-300 °C, зокрема 40-250 °C або 70-200 °C Тиск: від 0,1 до 6 бар, зокрема, стандартний тиск Час утримання: від кількох секунд (наприклад, від 1 до 60) до кількох днів (наприклад, від 1 до 5), зокрема, від кількох хвилин (наприклад, від 1 до 60) до кількох годин (наприклад, від 1 до 15), у ще кращому варіанті - від кількох хвилин (наприклад, від 5 до 20) до 2 год. b) Процес гідрогенізації Естери SA або SA, які приготовляють згідно з винаходом per se, піддають гідрогенізації у спосіб, який є відомим per se, застосовуючи процеси, пристрої та допоміжні речовини, такі, як каталізатори, відомі спеціалістам у даній галузі. Зокрема, безперервну або періодичну гідрогенізацію газової фази здійснюють у присутності гетерогенного каталізатора, прийнятного для гідрогенізації естерів. Оптимальні параметри процесу можуть бути встановлені спеціалістами у даній галузі для конкретного естеру без зайвих зусиль. Наприклад, температура реакції перебуває у діапазоні від приблизно 100 до приблизно 300 °C, в оптимальному варіанті - у діапазоні приблизно від 200 до 280 °C, а тиск становить приблизно від 5 до 100 бар, наприклад, від 10 до 50 бар. Молярне відношення реагента з воднем встановлюють у діапазоні від приблизно 1:100 до приблизно 1:2000, наприклад, від 1:800 до 1:1500. Каталізатори, які можуть застосовуватися для реакції гідрогенізації, є відомими спеціалістам у даній галузі. Наприклад, можуть застосовуватися різні мідні каталізатори. У джерелах відомого рівня техніки описується, наприклад, застосування каталізаторів з відновленого хроміту міді, які можуть бути придбані під назвою 85/1 від Davy Process Technology Ltd., Англія. Однак каталізаторами, які є особливо придатними згідно з винаходом, є каталізатори з оксиду 15 UA 105784 C2 5 10 міді на основі, причому оксид міді наносять на матеріали основи з глинозему або кремнезему. Приклади гідрогенізації естерів бурштинової кислоти до BDO (1,4-бутандіолу) /GBL (гаммабутиролактон) /THF за допомогою мідних каталізаторів також описуються у публікації Schlander, Jan., Feb. 2000, University of Karlsruhe, "Gasphasenhydrierung von Maleinsäuredimethylester zu 1,4Butandiol, gamma-Butyrolacton und Tetrahydrofuran an Kupfer-Katalysatoren". Даний винахід детальніше описується на представлених нижче прикладах. Представлені нижче приклади є лише пояснювальними і не обмежують обсягу винаходу. Приклади - Генетична модифікація та культивування Приклад 1: Загальний спосіб трансформації DD1 Таблиця 1 Номенклатура DD1 дикого типу та мутантів, вказаних у прикладах Штам LU13843 LU15348 LU15050 LU15224 15 20 25 30 35 40 45 50 Опис DD1 дикого типу (номер зберігання DSM18541) DD1 Δpfl DD1 Δldh DD1 Δpfl Δldh Штам Pasteurella LU13843 (DD1 дикого типу) трансформували за допомогою ДНК шляхом електропорації з застосуванням такого протоколу: Для приготування попередньої культури LU 13843 інокулювали з чашок зі свіжовирощеним BHI-агаром у 40 мл BHI (серцево-мозковий екстракт, Difco) у 100 мл струшувачі. Інкубацію здійснювали протягом доби при 30 °C; 200 об/хв. Для приготування головної культури 50 мл BHI поміщали у 100 мл струшувач і інокулювали до кінцевої оптичної густини (610 нм) 0,4 з попередньою культурою. Інкубацію здійснювали протягом приблизно 1,5 год при 30 °C, 200 об/хв. Клітини збирали при оптичній густині приблизно 1,3, осад промивали один раз 10% холодним гліцерином при 4 °C і ресуспендували у 1,7 мл 10% гліцерину (4 °C). 100 мкл компетентних клітин змішували з 5-10 мкг ДНК (10-20 мкл) і тримали на льоду протягом 2 хв у кюветі для електропорації 0,2 см завширшки. Електропорацію здійснювали за таких умов: 800 Ω; 25 мкF; 2 кВ (Gene Pulser, Bio-Rad). Відразу після електропорації додавали 1 мл BHI і інкубацію здійснювали протягом 2 год при 30°C. Клітини поміщали на BHI з 5 мг/л хлорамфеніколу і інкубували протягом 2-5 днів при 30 °C, доки колонії трансформантів не ставали видимими. Клони відокремлювали і повторно наносили смугами на BHI з 5 мг/л хлорамфеніколу до досягнення чистоти клонів. Приклад 2: Утворення делеційних послідовностей Плазміди з мутаціями/делеціями будували на основі вектора pSacB (SEQ ID NO 3). Фігура 1 показує схематичну карту плазмідного pSacB. 5’- та 3’- фланкуючі ділянки хромосомного фрагмента, які мають бути видалені, ампліфікували шляхом ПЛР з хромосомної ДНК LU 13843 і вводили у вищезгаданий вектор з застосуванням стандартних способів. Зазвичай принаймні 80 % ORF були об’єктом делеції. Таким чином, будували делеційні плазміди для піруватформіат-ліази pfl, pSacB (Δpfl)(SEQ ID NO 4) та лактатдегідрогенази ldhA, pSacB (ΔldhA) (SEQ ID NO 5). На Фігурах 2 та 3 схематично показано карти плазмідного pSacB (Δpfl) та pSacB (ΔldhA). У плазмідній послідовності pSacB (SEQ ID NO:3) ген sacB міститься у межах основ 51696590. Ген хлорамфеніколу міститься у межах основ 526-984. Промотор sacB міститься у межах основ 3802-4264. Ген хлорамфеніколу міститься у межах основ 526-984. Джерело реплікації для E. coli (ori EC) міститься у межах основ 1477-2337. У плазмідній послідовності pSacB дельта pfl (SEQ ID NO:4) 3’-фланкуюча ділянка гена pfl, яка є гомологічною геному DD1, міститься у межах основ 65-1533, тоді, як 5’- фланкуюча ділянка гена pfl, яка є гомологічною геному DD1, міститься у межах основ 1534-2956. Ген sacB міститься у межах основ 5256-6677. Промотор sacB міститься у межах основ 6678-7140. Ген хлорамфеніколу міститься у межах основ 3402-3860. Джерело реплікації для E. coli (ori EC) міститься у межах основ 4353-5213. У плазмідному pSacB дельта ldh (SEQ ID NO:5) 5’-фланкуюча ділянка гена ldh, яка є гомологічною геному DD1, міститься у межах основ 2850-1519, тоді, як 3’-фланкуюча ділянка гена ldh, яка є гомологічною геному DD1, міститься у межах основ 1518-63. Ген sacB міститься у межах основ 5169-6590. Промотор sacB міститься у межах основ 6591-7053. Ген 16 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 хлорамфеніколу міститься у межах основ 3315-3773. Джерело реплікації для E. coli (ori EC) міститься у межах основ 4266-5126. Приклад 3: Створення поліпшених продукуючих сукцинат штамів a) LU 13843 трансформували, як описано вище, за допомогою pSacB (Δpfl) і піддавали процедурі “Campbell in” для одержання “Campbell in” штаму. Трансформацію та інтеграцію у геном LU 13843 підтверджували за допомогою ПЛР, одержуючи смуги для події інтеграції плазміди у геном LU 13843. “Campbell in” штам потім піддавали процедурі “Campbelled out”, використовуючи чашки з агаром, які містили сахарозу як середовище для контрселекції, з відбором на втрату (функції) гена sacB. Таким чином, “Campbell in” штами інкубували у 25-35 мл неселективного середовища (BHI без вмісту антибіотиків) при 37°C, 220 об/хв протягом доби. Культивовану протягом доби культуру потім наносили смугами на чашки зі свіжоприготовленим BHI, які містили сахарозу (10%, без антибіотиків) і інкубували протягом доби при 37°C (“перше перенесення на сахарозу”). Окрему колонію, одержану від першого перенесення, знову наносили смугами на чашки зі свіжоприготовленим BHI, які містили сахарозу (10%), і інкубували протягом доби при 37°C (“друге перенесення на сахарозу”). Цю процедуру повторювали до мінімального завершення п’яти перенесень (“третє, четверте, п’яте перенесення на сахарозу”) на сахарозу. Термін “перше-п’яте перенесення на сахарозу” означає перенесення штаму після хромосомної інтеграції вектора, який містить ген sacB левансахарази, на чашки з агаром, які містили сахарозу та середовище для вирощування, з метою відбору штамів з втратою гена sacB та навколишніх плазмідних послідовностей. Окрему колонію з чашок п’ятого перенесення інокулювали на 25-35 мл неселективного середовища (BHI без вмісту антибіотиків) і інкубували при 37°C, 220 об/хв, протягом доби. Культивовану протягом доби культуру піддавали серії розведень і поміщали на чашки з BHI для одержання виділених окремих колоній. “Campbelled out” штами, які містили мутацію/делецію гена pfl, підтверджували через чутливість до хлорамфеніколу. Мутанти з мутацією/делецією з-поміж цих штамів розпізнавали й підтверджували шляхом ПЛР-аналізу. В результаті одержували мутант DD1 з мутацією/делецією pfl дельта pfl LU 15348. b) LU15348 трансформували за допомогою pSacB (Δldh), як описано вище, і піддавали процедурі “Campbell in” для одержання “Campbell in” штаму. Трансформацію та інтеграцію підтверджували шляхом ПЛР. “Campbell in” штам після цього піддавали процедурі “Campbell out”, як описано вище. Мутанти з делецією з-поміж цих штамів розпізнавали й підтверджували шляхом ПЛР-аналізу. В результаті одержували мутант з подвійною делецією pfl ldhA LU15224. c) LU13843 трансформували за допомогою pSacB (Δldh), як описано вище, і піддавали процедурі “Campbell in” для одержання “Campbell in” штаму. Трансформацію та інтеграцію підтверджували шляхом ПЛР. “Campbell in” штам після цього піддавали процедурі “Campbell out”, як описано вище. Мутанти з делецією з-поміж цих штамів розпізнавали й підтверджували шляхом ПЛР-аналізу. В результаті одержували мутант з делецією ldhA LU15050. Приклад 4: Приготування банку клітин 1. Приготування середовищ Склад середовищ для культивування описано у Таблиці 2. Таблиця 2 Склад твердих та рідких середовищ для приготування банків клітин Сполука Концентрація [г/л] a Глюкоза Бактоекстракт дріжджів (Becton Dickinson) Бактопептон (Becton Dickinson) (NH4)2 SO4 CaCl2*2H2O MgCl2*6H2O NaCl K2HPO4 MgCO3 Бактоагар (лише для твердих середовищ) змінюється 5 5 1 0,2 0,2 1 3 b змінюється 12 17 Концентрація основного розчину [г/л] 650 500 20 20 100 500 UA 105784 C2 a Концентрація глюкози становила 15 г/л (у чашках) і 20 або 50 г/л (у рідких середовищах). Концентрація MgCO3 (Riedel-de Haen, номер продукту: 13117 від Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH) становила 5 г/л (у чашках) і 0 або 30 г/л (у рідких середовищах). b 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 5 г екстракту дріжджів, 5 г пептону, MgCO3 та (для твердих середовищ) 12 г бактоагару змішували у 900 мл дистильованої води і піддавали автоклавуванню (20 хв). Після охолодження до приблизно 65 °C додавали відсутні компоненти як стерильні основні розчини. Глюкозу, сульфат амонію та K2HPO4 окремо піддавали автоклавуванню. Хлориди Ca, Mg та Na автоклавували разом. 2. Приготування MCB Головний банк клітин (MCB) для інокуляції окремих експериментів здійснювали, як вказано нижче. Дві чашки з агаром інокулювали потрібним штамом і відразу інкубували при 37 °C в анаеростаті (Anaerocult A, Merck) протягом доби. Біомасу забирали з чашок і ресуспендували у вільному від MgCO3 рідкому середовищі з 20 г/л глюкози для регулювання OD 6001,0. Інокуляцію здійснювали, використовуючи 0,5 мл цієї суспензії клітин. Культивування здійснювали у 100 мл флаконах для сироватки, оснащених герметичними бутилкаучуковими пробками (Ochs GmbH, Bovenden/Lenglern, Німеччина), які містили 50 мл рідкого середовища з 20 г/л глюкози та 30 г/л MgCO3 і з атмосферою CO2 при підвищеному тиску 0,8 бар. Флакони для сироватки (загалом 10) інкубували при 37 °C, з числом обертів 160 об/хв та діаметром струшування 2,5 см. Для контролю за витратою глюкози культивування одного флакона припиняли і здійснювали відбирання зразків та HPLC-аналіз через 0, 3, 4, 5, 7, 8 та 8,5 год. Через 8,5 год (концентрація глюкози становила 3,4 г/л) культивування припиняли. Аліквоти 0,5 мл суспензії клітин та 0,5 мл стерильного гліцерину поміщали у кріопробірки, змішували й зберігали протягом 13 год при -20, а після цього - при -80 °C як MCB. MCB випробували на чистоту шляхом нанесення у формі петлі з останньої кріопробірки на чашки з агаром для контролю забруднення та перевірки у рідкій культурі (середовища, як описано у Таблиці 8) на спектр продукту і на забруднення (шляхом мікроскопії). Витрату глюкози та утворення SA і побічних продуктів кількісно визначали через HPLCаналізи нерозведених безклітинних супернатантів культурального бульйону з застосуванням рефрактометричного виявлення. Зразки бульйону забирали стерильним шприцом крізь бутилкаучукову пробку, відокремлення біомаси здійснювали шляхом фільтрації (0,22 мкм). 300 x 7,8 мм I. D. Column Aminex HPX-87 H (Biorad) та 5 мм H2SO4 застосовували як нерухому та мобільну фазу, відповідно. Температура колони становила 30 °C, швидкість потоку становила -1 0,5 мл хв . Один флакон MCB застосовували для інокуляції 100 мл флакона для сироватки з герметичною бутилкаучуковою пробкою (див. вище), який містив 50 мл рідкого середовища з 50 г/л глюкози. Інкубацію здійснювали протягом 10 год при 37 °C в інкубаторі зі струшуванням (швидкість обертання: 180 об/хв, діаметр струшування: 2,5 см). Наприкінці культивування концентрація глюкози становила 20 г/л, і рівень pH становив приблизно 6,5. Аліквоти 0,5 мл суспензії клітин та 0,5 мл стерильного гліцерину поміщали у кріопробірки, змішували і зберігали при -80°C як WCB. Перевірку чистоти здійснювали так само, як і для MCB. Умови HPLC були такими самими, як описані вище. Приклад 5: Культивування різних штамів DD1 на гліцерині або гліцерині та мальтозі Продуктивність мутантного штаму DD1 Δpfl (LU15348) та DD1 Δpfl Δldh (LU15224) у присутності гліцерину або гліцерину та мальтози як джерела вуглецю піддавали подальшому аналізові, застосовуючи такі умови середовища та інкубації. 1. Приготування середовища Склад та приготування середовища для культивування є такими, як описано нижче у Таблиці 3. 18 UA 105784 C2 Таблиця 3 Склад середовища для культивування DD1 на субстратах з гліцерину або гліцерину та мальтози 1 2 3 4 5 6 7 9 10 5 10 15 20 25 30 Сполука Бактоекстракт дріжджів (Becton Dickinson) (NH4)2 SO4 CaCl2*2H2O MgCl2*6H2O NaCl K2HPO4 MgCO3 (Riedel-de Haen 13117) NaHCO3 субстрат Концентрація [г/л] 10 2 0,2 0,2 1 3 1 г/г субстрату 8,4 змінюється Альтернативне синтетичне середовище для вирощування Сприятливим є застосування синтетичного середовища для вирощування без складних інгредієнтів для ферментації з метою поліпшення подальшої обробки та розробки синтетичного середовища для вирощування для економічної ферментації. Приготування середовища Синтетичне середовище для вирощування розробляли з врахуванням інших синтетичних середовищ для вирощування для бактерій рубця (Nili and Brooker, 1995, McKinlay et al, 2005), на основі попереднього внутрішнього досвіду з іншими бактеріями і зі здійсненням експериментів з окремими пропусками. Остаточне середовище містило 50 г/л глюкози, 1 г/л (NH 4)2SO4, 0,2 г/л CaCl2*2H2O, 0,2 г/л MgCl2*6H2O, 1 г/л NaCl, 3 г/л K2HPO4, 1 мг/л нікотинової кислоти, 1,5 мг/л пантотенової кислоти, 5 мг/л піридоксину, 5 мг/л рибофлавіну, 5 мг/л біотину, 1,5 мг/л тіамін HCl, 0,26 г/л лізину, 0,15 г/л треоніну, 0,05 г/л метіоніну, 0,71 г/л глутамінової кислоти, 0,06 г/л гістидину, 0,07 г/л триптофану, 0,13 г/л фенілаланіну, 0,06 г/л тирозину, 0,5 г/л серину, 0,5 г/л гліцину, 0,5 г/л цистеїну, 0,1 г/л β-аланіну, 0,27 г/л аланіну, 0,19 г/л валіну, 0,23 г/л лейцину, 0,16 г/л ізолейцину, 0,33 г/л аспарагінової кислоти, 0,1 г/л аспарагіну, 0,13 г/л проліну, 0,15 г/л аргініну та/або 0,1 г/л глутаміну. Флакони для сироватки, які містили 50 мл синтетичного середовища для вирощування, автоклавували з водою та 30 г/л MgCO3 як буферною системою. Глюкозу, сульфат амонію та фосфат калію стерилізували окремо. Хлориди Ca, Mg та Na стерилізували разом. Вітаміни та амінокислоти збирали у різних основних розчинах і стерилізували шляхом фільтрації. Після охолодження флаконів для сироватки додавали компоненти як стерильні основні розчини. 2. Культивування та аналізи Для вирощування висіяної культури один флакон WCB застосовували для інокуляції 100 мл флакона для сироватки з герметичною бутилкаучуковою пробкою (див. вище), який містив 50 мл рідкого середовища, описаного у Таблиці 2, але з 20 г/л глюкози і в атмосфері CO2 при підвищеному тиску 0,8 бар. Інкубацію здійснювали протягом відповідної для конкретного мутанта кількості годин (Таблиця 4) при 37 °C і 160 об/хв (діаметр струшування: 2,5 см). Суспензію клітин центрифугували (Biofuge primo R, Heraeus) при 5000 г протягом 5 хвилин і клітинну масу промивали, а потім ресуспендували у 50 мл середовища без джерела вуглецю і без MgCO3 для утворення безглюкозного інокуляту (усі етапи здійснювали при кімнатній температурі і в анаеробній камері). Таблиця 4 Час інкубації різних висіяних культур DD1 мутанта Штам LU 13843 LU 15050 LU 15348 LU 15228 Час інкубації 8 год 10 год 13 год 20 год 35 19 UA 105784 C2 5 10 15 Основні культури вирощували у 100 мл флаконах для сироватки, які містили 10 мл рідкого середовища з 50 г/л гліцерину або 50 г/л гліцерину та 10 г/л D-мальтози, в обох випадках в атмосфері CO2 при підвищеному тиску 0,8 бар. Застосовували високоякісний ‘Glycerol 99 %, puriss.’ (Riedel-de Haen, номер продукту: 15523-1L-R, від Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze, Німеччина) для всіх експериментів. Інокуляцію здійснювали з 1,5 мл безглюкозного інокуляту. Флакони інкубували при 37 °C і 160 об/хв (діаметр струшування: 2,5 см). Витрату джерел вуглецю та продукування карбонових кислот кількісно визначали шляхом HPLC, як описано у прикладі 4, через 24 год. При вимірюванні гліцерину температуру колони доводили до 50 °C для досягнення достатнього відокремлення SA, молочної кислоти та гліцерину, які мають однаковий час утримання. Ріст клітин вимірювали шляхом вимірювання оптичної густини при 660 нм (OD 600) за допомогою спектрофотометра (Ultrospec3000, Amersham Biosciences, Uppsala, Швеція). Концентрацію клітин, яку визначали у грамах сухої клітинної маси (DCW) на літр, розраховували -1 на основі заданої стандартної кривої, яка стосувалася OD600 до DCW (1 OD600 = 0,27 г DCW l ). 3. Результати Результати експериментів культивування з різними штамами DD1 показано у Таблиці 5 для субстрату з гліцерину та Таблиці 6 для субстрату з суміші гліцерину та мальтози. Таблиця 5 Культивування різних штамів DD1 на гліцерині DD1 штам a tc [h] b cГліцерин [г/л] c cSA [г/л] c, h cLA [г/л] c, h cFA [г/л] c, h cAA [г/л] c, h cPA [г/л] c, h cMA [г/л] d Сума побічних продуктів SSP [г/л] e SA/SSP [г/г] f Співвідношення SA/FA f Співвідношення SA/AA g STY [г/(л год)] g Вуглецевий вихід (YP/S) [г/г ] 20 25 30 35 40 LU13843 24 -17,3 19,5 15:1, або >17,5:1, або >20:1, або >25:1, або >30:1, або >40:1, або >50:1, або >75:1, або >90:1, причому кожна кількість виражається у г/л. 11. Штам за одним з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що продукує бурштинову кислоту (SA) та побічний продукт мурашину кислоту (FA) у пропорції SA/FA >90:1 або >100:1, причому кожна кількість виражається у г/л. 12. Спосіб ферментаційного одержання бурштинової кислоти або її солі, або похідної, причому спосіб включає етапи: a) інкубації бактеріального штаму, як визначено в одному з попередніх пунктів 1-11, у середовищі, яке містить здатне до асиміляції джерело вуглецю, як гліцерин або суміш гліцерину та принаймні одного додаткового джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, мальтодекстрину, D-фруктози, D-галактози, лактози, D-манози, D-глюкози, D-ксилози, рафінози та L-арабінози, та культивації вищезгаданого штаму за умов, які сприяють утворенню потрібної органічної кислоти, та b) одержання вищезгаданої органічної кислоти або її солі або похідної з середовища. 13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що ферментацію здійснюють при температурі у діапазоні приблизно від 10 до 60 °С при рН від 5,0 до 9,0 у присутності діоксиду вуглецю. 14. Спосіб за одним з пп. 12 або 13, який відрізняється тим, що концентрацію здатного до асиміляції джерела вуглецю регулюють до значення у діапазоні від 5 до 80 г/л. 15. Спосіб ферментаційного вироблення бурштинової кислоти або її солі, або похідної, причому спосіб включає етапи: 27 UA 105784 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 а) інкубації бактеріального штаму, як визначено у будь-якому з пп. 1-11, у середовищі, що містить принаймні одне здатне до асиміляції джерело вуглецю, як гліцерин або суміш гліцерину та принаймні одного додаткового джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, Dфруктози, D-галактози, лактози, D-манози, D-глюкози, D-ксилози, рафінози та L-арабінози, та культивації вищезгаданого штаму за умов, які сприяють утворенню потрібної органічної кислоти, b) одержання вищезгаданої органічної кислоти або її солі, або похідної з середовища, і додатково характеризується принаймні однією з таких особливостей: с) перетворення принаймні 25 г/л гліцерину на принаймні 25,1 г/л бурштинової кислоти, з коефіцієнтом виходу YP/S принаймні 1,0 г/г; d) перетворення принаймні одного джерела вуглецю, вибраного з-поміж гліцерину або суміші гліцерину та принаймні одного додаткового джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, D-манози, рафінози, на -1 -1 бурштинову кислоту з виходом питомої продуктивності принаймні 0,58 г гDCW год. бурштинової кислоти, e) перетворення принаймні одного джерела вуглецю, вибраного з-поміж гліцерину або суміші гліцерину та принаймні одного додаткового джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, лактози, D-манози, рафінози, на бурштинову кислоту з об'ємною продуктивністю для бурштинової кислоти принаймні 2,2 г/(л год.) бурштинової кислоти, f) перетворення принаймні 25 г/л принаймні одного джерела вуглецю, вибраного з-поміж гліцерину або суміші гліцерину та принаймні одного додаткового джерела вуглецю, вибраного зпоміж сахарози, мальтози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, лактози, D-манози, рафінози, на бурштинову кислоту з об'ємною продуктивністю для бурштинової кислоти принаймні 2,2 г/(л год.); g) перетворення принаймні одного джерела вуглецю вибраного з-поміж гліцерину або суміші гліцерину та принаймні одного додаткового джерела вуглецю, вибраного з-поміж сахарози, мальтози, D-фруктози, D-глюкози, D-ксилози, L-арабінози, D-галактози, лактози, D-манози, -1 рафінози, на бурштинову кислоту з виходом питомої продуктивності принаймні 0,6 г гDCW год. 1 бурштинової кислоти і з об'ємною продуктивністю для бурштинової кислоти принаймні 2,2 г/(л год.), h) продукування бурштинової кислоти (SA) та побічних продуктів (SSP) у пропорції SA/SSP >10:1 або >12,5:1 або >15:1 або >17,5:1 або >20:1 або >25:1 або >30:1 або >33:1, причому SSP представляє суму побічних продуктів молочної кислоти (LА), мурашиної кислоти (FA), оцтової кислоти (АА) та яблучної кислоти (МА), причому кожна кількість виражається у г/л, i) продукування бурштинової кислоти (SA) та побічного продукту оцтової кислоти (АА) у пропорції SA/AA >10:1 або >12,5:1, або >15:1, або >17,5:1, або >20:1, або >25:1, або >30:1, або >50:1, або >75:1, або >90:1, причому кожна кількість виражається у г/л. 16. Спосіб за одним з пп. 12-15, який відрізняється тим, що здійснюють переривчасто або безперервно. 17. Спосіб продукування бурштинової кислоти та/або амонієвих солей бурштинової кислоти, який включає ферментаційне вироблення бурштинової кислоти за одним з пп. 12-16 та регулювання рівня рН аміаком або його водним розчином, або NH 4HCO3, (NН4)2СО3, NaOH, Na2СО3, NaНСО3, KОН, K2СО3, KНСО3, Мg(OН)2, МgСО3, МgН(СО3)2, Са(ОН)2, СаСО3, Са(НСО3)2, СаО, СН6N2О2, C2H7N та їх сумішами. 18. Спосіб за одним з пп. 12-17, який відрізняється тим, що органічну кислоту та/або її солі додатково виділяють та/або очищують шляхом фільтрації, кристалізації, електродіалізу та/або катіонообмінної хроматографії. 19. Спосіб за одним з пп. 12-18, який відрізняється тим, що органічну кислоту та/або її солі додатково виділяють та/або очищують, застосовуючи такі етапи: фільтрацію, з наступною катіонообмінною хроматографією, з наступною кристалізацією. 20. Спосіб за одним з пп. 18, 19, який відрізняється тим, що матеріалом, застосовуваним для + катіонообмінної хроматографії, є катіонообмінна смола у формі Н , яка включає групи сульфонової кислоти, з загальною продуктивністю від 0,5 до 2,0 еквівалентів/л катіонообмінної смоли. 21. Спосіб за одним з пп. 18-20, який відрізняється тим, що катіонообмінну хроматографію здійснюють при температурі від 45 до 60 °С. 22. Спосіб за будь-яким з пунктів 12-21, який відрізняється тим, що вищезгаданий гліцерин, який застосовують як здатне до асиміляції джерело вуглецю, є таким, що одержується шляхом естерного розщеплення триацилгліцеридів. 28