N-(фенілаліліден) -n’-хіназолін -4-іл-гідразин, що проявляє антиоксидантну, протиішемічну, протисудомну та антиамнестичну активність

М-(фенілаліліден)-М'-хіназолін-4-іл-гідразин формули Корисна модель відноситься до біологічно активних сполук і може бути використаною у фармації та медицині. Відомий ряд лікарських препаратів (циннарізин (І) та флунарізин (II)), які в своїй структурі містять залишок циннамоїлу і застосовуються у медичній практиці як препарати, що покращують мозковий кровообіг. Наведені препарати, за механізмом дії відносяться до антагоністів інонів кальцію (Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух томах. Т.1. - Изд. 13-е, новое. - Харьков: "Торсинг", 1998. -560с). R що проявляє антиоксидантну, протиішемічну, протисудомну та ноотропну активність. антиоксидантну, протисудомну та ноотропну активність. Відомий структурний аналог: похідні 4-Rбензиліденгідразинохіназолінів, що проявляють антиоксидантну, протисудомну (Україна, Ліки.2004.-№1-2.-С.65-69), формули: CD О R—Н, CHg, C2H5, СдП7, GgHgJ R,=H, СН 3 , ОСН3, ОН, Hal, NO2, COOH I - Cinnarisine; R=H, R.,=H II - Flunarisine; R=F, R.,=F Необхідно відмітити, що дані лікарські препарати не застосовуються для лікування гострих порушень мозкового кровообігу, не проявляють Недоліком відомого аналогу є те, що він не проявляє протиішемічну та антиамнестичну активності. Найбільш близькою до сполуки, що заявляється, є Ь1-[3-(2-нітрофеніл)-аліліден]-І\Г-хіназолін-4-ілгідразин (А.С. 725417 СССР, МКИ2 С07Д239/94, С07Д405/12, А61К31/505. Производные 4гидразинохиназолина, обладающие антибактериальной активностью и фунгицидной активностью по отношению к Candida albicans /Р.С.Синяк, И.А.Мазур, Н.М.Туркевич и др. (СССР).№2692899/23-04; Заявлено 06.12.76.), формулы: 4706 Недоліком прототипу є те, що він не проявляє антиоксидантну, протиішемічну, протисудомну та антиамнестичну активність В основу корисної моделі поставлена задача створення нової біологічно активної сполуки серед похідних 4-пдразинохіназоліну, що проявляє антиоксидантну, протиішемічну, протисудомну та антиамнестичну дію на мозкову тканину Вирішення даної задачі забезпечує похідне 4пдразинохіназоліну, а саме Ы-(фен1лал1Л1ден)-Ы'хіназолін-4-іл-пдразин (НН-103), який проявляє антиоксидантну, протиішемічну, протисудомну та ноотропну активність, формули N На відміну від інших широковідомих біологічних аналогів (а-токоферол ацетат, дибунол, метіонін, унітюл, сечовина, N-ацетилцистеін (N-АЦЦ), фенобарбітал, мідокалм, пірацетам) досліджувана сполука (НН-103) проявляє значну антиоксидантну дію на всіх етапах розвитку ішемії, підвищує активність супероксиддисмутази (СОД), знижує рівень накопичення малонового діальдепду (МДА), витрати АТФ, зберігає ЦІЛІСТНІСТЬ мембран (ВВ-КФК) Крім того, ефективно гальмує розвиток клонічної і тонічної фази судом, зменшує активацію реакцій ВРО і генерацію N0 у корі головного мозку щурів на піку судомного припадку, попереджає розвиток у тварин антероградної та ретроградної амнезії УРНИ, яку викликали коразоловими судомами, ппоксичною травмою або атропіном Одержують наведену сполуку (НН-103) взаємодією 4-пдразинохіназоліну з ко-річним альдегідом у середовищі ізопропілового спирту (схема) Схема N Приклад 1,64г (0,01 моль) 4пдразинохіназоліну розчиняють у 20мл ізопропілового спирту при нагріванні, до отриманого розчину додають 1,32г (0,01 моль) корічного альдегіду і реакційну суміш кип'ятять протягом 60 хвилин Розчин охолоджують, утворений осад відфільтровують і сушать Одержують цільовий продукт з виходом 78,5% Синтезована сполука - жовта кристалічна речовина з Т плав 174-176°С (визначали відкритим капілярним методом), розчинна у спирті, діоксані, диметилформаміді, нерозчинні у воді Для аналізу очищена кристалізацією із ізопропілового спирту Знайдено, % N 20,36, Вирахувано, % N20,43 C17H14N4 Будова сполуки НН-103 також доведена ІЧ-, ПМР-спектрами та хромато-мас-спектрометрично Індивідуальність підтверджена методом тонкошарової хроматографії на пластинках "Сорбфіл" у системах розчинників хлороформ-бутанол (92 8) Значення Rfx100-49,2 Проявлення хроматограм проводили за допомогою хроматоскопа УФ-354 ІЧ-спектри зняті на спектрофотометрі UR-20 "Specord" у таблетках калію броміду В ІЧ-спектрах сполуки НН-103 спостерігаються характеристичні смуги поглинання азаметинового зв'язку (N=CH) у ДІЛЯНЦІ 1680-1640см 1 ПМР-спектри знімались на спектрофотометрі ядерного магнітного резонансу "Vanan VXR-300", розчинник DMSO-D6, внутрішній стандарт - тетраметилсилан ПМР-спектр Ы-(фен1лал)Л1ден)-Ы'хіназолін-4-ш-пдразину (НН-103) характеризується наявністю сигналів азометинового зв'язку (N=CH-) з ВІДПОВІДНИМ розщепленням (8 352м д ) Сигнал протону NH-групи внаслідок квадрупольної взаємодії з атомом азоту, проявляється в слабкому полі у вигляді широкого синглету (12 035м д ) Сигнали хіназолшових та ароматичних протонів спостерігаються у вигляді складного мультиплету, що не дозволяє зробити їх однозначну інтерпретацію Для однозначного доведення будови сполуки НН-103 нами проведена хромато-масспектроскопія Хромато-мас-спектральні дослідження синтезованих сполук проводили з використанням газорідинного хроматографу Hewlett Packard, колонка Hewlett Packard HP 5MS (30мх0,2мм), товщина шару фази О.ЗЗмкм, газносій - гелій (1мл/хв), дільник потоку 110, температура випарника 280°С, градієнт температури від 150 до 280°С (25°С/хв ) Mac-спектральний детектор HP 5890/5972 (Hewlett Packard), іонізація електронний удар, 70ев Хромато-масс-спектр сполуки НН-103 характеризується часом виходу 14,47сек та елімінацією з наступними m/z 274, 258, 246, 197, 171, 145, 129, 115, 103, 90, 76, 63, 51, 39, що однозначно підтверджує будову ВІДПОВІДНОГО ІЛІДЄНПОХІДНОГО На першому етапі проведений первинний фармакологічний скринінг методами in vitro для оцінки антиоксидантної активності Оцінку антиоксидантної (АОА) та антирадикальної (АРА) активності сполук у дослідах in vitro проводили на чотирьох моделях ініціювання вільно-радикального окислювання (ВРО) оцінка АОА при ферментативному і неферментативному ініціюванні та оцінка АРА по інгібуванню супероксид- та пероксинітритрадикалу Перша модель (ферментативне ініціювання) характеризує АОА сполук на всіх етапах розвитку ВРО (Методи оцінки антиоксидантних властивостей фізіологічне активних речовин при ініціюванні вільно-радикальних процесів у дослідах in vitro "/ Губський Ю І, Дунаев В В , Бєленічев І Ф та ін // Метод реком - Київ Державний Фармакологічний центр МОЗ України, 2002 - 26с) Вільнорадикальні процеси запускали ферментативним шляхом, додаванням нікотинамідаденіндинуклеотидфосфату 4706 відновленого (НАДФ-НҐ) у гомогенат тканин головного мозку щурів лінії Вістар. Друга модель (Ре2+-залежного ВРО) проводиться у суспензії яйцевих ліпопротеїдів (Методи оцінки антиоксидантних властивостей фізіологічне активних речовин при ініціюванні вільнорадикальних процесів у дослідах in vitro"/ Губський Ю.І., Дунаев В.В., Бєленічев І.Ф. та ін.// Метод, реком. - Київ: Державний Фармакологічний центр МОЗ України, 2002.- 26с). Ця модель характеризує антиоксидантні властивості речовин на кінцевому етапі ВРО, де вільнорадикальні процеси відбуваються неферментативним шляхом. АОА в обох випадках визначали спектрофотометричне по вмісту кінцевого продукту ВРО - малонового діальдегіду (МДА) після його взаємодії з тіобарбітуровою кислотою. Антиоксидантну активність (АОА) розраховували за формулою: АОА=СкСо/Ск-100, де Ск - концентрація МДА у контрольному досліді; Со - концентрація МДА у основному досліді. Третя модель - модель оцінки АРА синтезованих сполук по інгібіюванню активної форми кисню (супероксидрадикал), яка моделюється у реакціях аутоокислення адреналіну в адренохром у лужному середовищі (Методи оцінки антиоксидантних властивостей фізіологічне активних речовин при ініціюванні вільно-радикальних процесів у дослідах in vitro"/ Губський Ю.І., Дунаев В.В., Бєленічев І.Ф. та ін.// Метод, реком. - Київ: Державний Фармакологічний центр МОЗ України, 2002.- 26с). Ця модель дає можливість пошуку антиоксидантів, діючих на початкових етапах ВРО. АОА визначали спектрофотометрично по гальмуванню утворення супероксид-радикалу досліджуваними речовинами та розраховували за формулою: АРА=Дх До/ДхЮ0, де Дх - оптична густина контрольного досліду; До - оптична густина, що відображає швидкість аутоокислення адреналіну в адренохром при наявності синтезованої сполуки. Четверту модель - оцінку АРА синтезованих сполук оцінювали використовуючи метод in vitro по інгібіюванню активних форм NO (Методи оцінки антиоксидантних властивостей фізіологічне активних речовин при ініціюванні вільно-радикальних процесів у дослідах in vitro"/ Губський Ю.І., Дунаев В.В., Бєленічев І.Ф., Левицький Е.Л., Літвінова Н.В., Коваленко С.І., Бухтіярова Н.В., Афанасенко О.В.// Метод, реком. - Київ: Державний Фармакологічний центр МОЗ України, 2002.- 26с). Індукцію NO здійснювали при дії на проби з нітропрусидом натрію світла від джерела потужністю ЗООВт з довжиною хвилі 425нм. Опромінення водних розчинів нітропрусиду натрію проводили протягом ЗО хвилин при 20°С у кварцовій кюветі товщиною 10мм. Досліджувані речовини додавали до опромінення в концентраціях, кратних їх молярним масам. Ефективність гальмування утворення NO тестували по інгібіюванню окиснення аскорбінової кислоти, виміряючи оптичну густину розчину при 265нм. АРА виражали у відсотках інгібіювання окиснення аскорбату та розраховували за формулою: АОА=Дх-До/ДхЮ0, де Дх - оптична густина контрольного досліду; До - оптична густина, що відображає інгібіювання окиснення аскорбату при наявності синтезованої сполуки. Дослідження АОА на на моделях in vitro при ферментативному та неферментативному ініціюванні - показало (табл.1), що сполука НН-103 проявляє високу активність, яка перевищує активність еталонів порівняння, дибунола на 44,8%; унітіолу 31,4%. Таблиця 1 Антиоксидантна та антирадикальна активність у дослідах in vitro №№ сполук Неферментативне ініціювання* Ферментативне ініціювання* МДА, ммоль/мл АОА, % МДА, ммоль/мл АОА, % 70,0 25,2 0,30±0,01 2,00±0,02 1,00±0,01 1,23±0,04 50,0 10,16 Інтакт 0,56±0,005 Контроль 3,81±0,01 НН-103 1,12±0,01 Контроль 4,92±0,14 Дибунол 3,68±0,05 а -токоферолу аце4,42±0,12 тат Метіонін Унітюл Сечовина N-АЦЦ Інгібування супероксидрадикала* Оптична густина АРА, % 45,0 0,20±0,005 0,11 ±0,001 0,20+0,002 1,03±0,042 1,00±0,066 16,2 18,6 Інгібіювання пероксинітритрадикалу Оптична густина АРА, % 66,6 20,0±0,05 10,8±0,55 18,0±0,01 1,2±0,0 0,1310,001 35,0 0,555±0,022 62,2 Примітка * - вірогідність розходжень стосовно контролю (р0,05 по відношенню до контролю; ° - р>0,05 по відношенню до фенобарбіталу; 1 - р>0,05 по відношенню до мідокалму. Введення тваринам сполуки НН-103 в умовах коразолових судом також достовірно знижувало накопичення МДА на 58,0%, ДК - 34,5% та NO 46,6% по відношенню до контролю та референспрепаратів у досліджуваних відділах кори мозку щурів. Таблиця 7 Вплив сполуки НН-103 на вміст продуктів ВРО у тканинах головного мозку щурів на піку судомного припадку при епілептоїдних коразолових судомах № сполук МДА, мкмоль/г ткани- ДК, мкмоль/г тканини ни ТК, мкмоль/г тканини NO*', нмоль/г тканини 0,307±0,064 0,720±0,167 Контроль 1,41±0,153 3,56±0,34 1,395±0,176 0,65+0,129 7,7±1,17 18,6±2,76 НН-103 Мідокалм 1,50±0,206*01 3,00±0,16 0,91510,169*°' 1,12±0,091 0,443+0,085* 0,54±0,04 10,0±1,56*° 15,8±1,18 2,87±0,12 1,10±0,06 0,53±0,02 16,4+1,04 Інтакт Фенобарбітал Примітка : * - р>0,05 по відношенню до контролю; ° - р>0,05 по відношенню до фенобарбіталу; ' - р>0,05 по відношенню до мідокалму. 13 14 4706 Слід зазначити, що сполука НН-103, яка проявляла високу антирадикальну (інгібування супероксид-1 пероксинітритрадикалу) і антиоксидантну активність in vitro ефективно гальмувала розвиток клонічної і тонічної фази судом, зменшувала активацію реакцій ВРО і генерацію N0 у корі головного мозку щурів Необхідно визнати, що в основі механізму дії досліджуваної сполуки лежить прямий антиоксидантний ефект і сила протисудомної дії залежить від ступеню інгібування АФК (табл 1) Ноотропну активність оцінювали по ЗМІНІ умовної реакції пасивного уникання (УРПУ) до та після дії ушкоджуючих факторів ппоксичною травмою як за ЗО хвилин до навчання, так і безпосередньо після навчання (Експериментальне вивчення ноотропної активності фармакологічних сполук / М Я Головенко // Метод, реком - Київ ДФЦ МОЗ України, 2002 - 26с , Green R L Spasing effects in memory Ewidence for a two-process accout // J Exp Physiol Learning Memory Cognition -1989-Vol15, №3-P 371-377 ), судомного припадку, введення коразолу, 60мг/кг внутрішньочеревинно безпосередньо після навчання (Воронина Т А Гипоксия и память Особенности применения ноотропных препаратов // Весн РАМН - 2000 -№9 -С 27-63 , Kim J Modality-specific retrograde amnesia of fear // Science - 1998 - Vol 256, №1 -P 675-686 ) та внутрішньочеревинного введення атропіну в дозі 40,0мг/кг за ЗО хвилин до навчання (Експериментальне вивчення ноотропної активності фармакологічних сполук / М Я Головенко // Метод, реком Київ ДФЦ МОЗ України, 2002 -26с , Search for substances with antioxidant and antiamnestic activities among 2-substituted 4-(3H)-quinazolones / S Kovalenko, I Belemchev, V Nikitin, A Karpenko // Acta Poloniae - Drug Research - 2003 -Vol 60, №4 P 275-279) Досліджувану сполуку НН-103 вводили per os за 60 хвилин до навчання у вигляді суспензії, стабілізованої твіном 80, пірацетам - в мінімальній КІЛЬКОСТІ води Показано, що моделювання судомних припадків коразолом відразу після навчання УРПУ у контрольних тварин викликає забування навички при відтворенні через 24 години після навчання, і тварини із коротким латентним періодом заходять у темний ВІДСІК, де вони напередодні одержували ушкодження електрострумом (табл 8) Таблиця 8 Антиамнестична активність сполуки НН-103 при амнезії навички, яку викликали коразоловими судомами (60,0 мг/кг) Відтворення УРПУ № сполук Контроль Ретроградна амнезія НН-103 Пірацетам Доза мг/кг 25 250 Латентний період рефлексу (М±т, сек )* 168,6±17,0 3,4±0,8 154,0±24,4 15,2±2,7 КІЛЬКІСТЬ тварин, які не ввійшли до темної камери (%) 40 0 60 0 Примітка * - достовірність відносно до контролю (р