Ліофілізований препарат, що містить грипозну вакцину, і спосіб його одержання

1. Ліофілізований препарат, який містить грипозну вакцину, одержаний ліофілізацією водного розчину, що містить (і) грипозну вакцину, (іі) гідрофобну амінокислоту і (ііі) аргінін, і його кислотноадитивну сіль; причому пропорція компонента (ііі) аргініну і його кислотно-адитивної солі відносно загальної кількості ліофілізованого препарату становить від 20 до 85 % мас.; і відношення аргініну до його кислотноадитивної солі знаходиться в такому діапазоні, що рН водного розчину становить від 8 до 10. 2. Ліофілізований препарат за п. 1, де грипозна вакцина зазнає процесу знесолення. 3. Ліофілізований препарат за п. 1, де (іі) гідрофобна амінокислота представляє фенілаланін або комбінацію фенілаланіну щонайменше з одним з валіну, лейцину й ізолейцину. 4. Ліофілізований препарат за п. 1, де пропорція (іі) гідрофобної амінокислоти становить від 14 до 75 % мас. загальної кількості ліофілізованого препарату. 5. Ліофілізований препарат за п. 1, де (ііі) аргінін і його кислотно-адитвна сіль представляють відповідно аргінін і його гідрохлорид. 6. Ліофілізований препарат за п. 1, де пропорція кислотно-адитивної солі аргініну становить від 1 2 (19) 1 3 97391 4 користовуваному на першій стадії, становить від 1 до 20 частин за масою відносно 1 частини за масою аргініну. 17. Спосіб за п. 11, де загальний вміст компонентів (і)-(ііі) у водному розчині, використовуваному на першій стадії, еквівалентний від 80 до 100 % мас. відносно загальної кількості одержаного ліофілізованого препарату. Даний винахід стосується ліофілізованих препаратів, що містять грипозну вакцину. Конкретніше, даний винахід стосується ліофілізованого препарату, в якому грипозна вакцина виявляє підвищену стійкість. Даний винахід також стосується способу одержання ліофілізованого препарату. Грип являє собою захворювання, що викликається вірусами грипу, які інфікують дихальні органи. Загалом, у індивідуума, інфікованого вірусом грипу, вірус після латентного періоду приблизно від 1 до 2 днів, викликає лихоманку до 38°С або вище, яка супроводжується загальними симптомами, такими як головний біль, загальне нездужання, і суглобові і м'язові болі. За ними ідуть респіраторні симптоми, такі як кашель і мокрота, але стан зазвичай поліпшується в межах тижня. Однак коли грипозна інфекція вражає таких індивідуумів як немолоді люди, маленькі діти, вагітні жінки, пацієнти з хронічними захворюваннями органів дихання або серцево-судинної системи, цукровим діабетом або пацієнтів, що страждають хронічною ниркоподібною недостатністю, можуть розвинутися важкі і іноді смертельні ускладнення, такі як пневмонія і бронхіт. Крім того, грип, який викликає серйозні проблеми зі здоров'ям, є також високо заразними, і за короткий період часу стає інфікованими множина людей, призводячи до величезних соціальних і економічних втрат. Введення грипозних вакцин є найефективнішим способом запобігання шкоди здоров'ю, викликаної грипозними інфекціями, і зниження соціальних і економічних втрат. Препарати грипозної вакцини, такі як рідкі препарати для застосування у вигляді ін'єкцій, і заморожені препарати для застосування у вигляді носових крапель, були відомі в минулому; однак поки не випускалися сухі препарати із задовільною стійкістю (див., наприклад, непатентний документ 1). Коли грипозні вакцини розподіляються в формі рідких препаратів, вони повинні завжди підтримуватися при низьких температурах під час поширення і зберігання для запобігання інактивації вакцини; тобто, необхідні ланцюжки холодових впливів. Крім того, коли вакцини розподіляються в формі заморожених препаратів, необхідно підтримувати вакцини в замороженому стані під час поширення і зберігання для підтримки стійкості препаратів. Таким чином, грипозні вакцини, виготовлені у вигляді рідких або заморожених препаратів, вимагають довершеного контролю температури під час транспортування і зберігання (див. непатентний документ 2), ускладнюючи поширення цих препаратів в областях з недостачею електроенергії або підтримку активності грипозних вакцин без наявності транспортних засобів, що забезпечують умови низької температури. Для подолання таких нестач рідких або заморожених препаратів, було б ефективно розподіляти грипозні вакцини в формі сухих препаратів. Хоча недавно була запропонована методика, що стосується ліофілізованих препаратів грипозних ' вакцин, при якій грипозні вакцини виготовляються у вигляді препаратів з додаванням лактози або трегалози, ніде не вказана стійкість таких препаратів (див. непатентний документ 3). Подібно іншим вакцинам, грипозні вакцини високо сприйнятливі до тепла і, як відомо, втрачають активність при високих температурах або при температурах нижче їх точки замерзання (див. непатентний документ 2). Навіть якщо грипозні вакцини просто висушені або ліофілізовані, їх активність проблематично знижується згодом під час виробництва або зберігання. Ще не знайдена методика подолання цієї проблеми, і до даного часу не повідомлялося про успішні приклади впровадження в практику сухих препаратів грипозних вакцин. Проблеми, що вирішуються винаходом Даний винахід був створений з урахуванням вказаних вище методик попереднього рівня техніки. Завданням даного винаходу є надання ліофілізованого препарату, в якому грипозна вакцина виявляє значно підвищену стійкість. Засоби для розв'язання проблем Автор винаходу провів широке дослідження для подолання вказаних вище проблем і виявив, що ліофілізований препарат, в якому грипозна вакцина виявляє значно підвищену стійкість, може бути одержаний ліофілізацією водного розчину, який відповідає наступним умовам (А) до (C) при одержанні ліофілізованого препарату, що містить грипозну вакцину: (А) включені (і) грипозна вакцина, (іі) гідрофобна амінокислота і (ііі) аргінін і його кислотноадитивна сіль; (C) пропорція компонента (ііі) становить від 20 до 85% мас. відносно загальної кількості одержаного в результаті ліофілізованого препарату; і (C) рН доводиться до рівня від 8 до 10 шляхом регулювання відношення аргініну до його кислотно-адитивної солі, які утворюють компонент (ііі). Даний винахід був здійснений внесенням додаткових удосконалень на основі цих даних. У результаті, даний винахід надає ліофілізований препарат, що містить грипозну вакцину, як викладено нижче. Абзац 1. Ліофілізований препарат, що містить грипозну вакцину, одержаний ліофілізацією водно 5 го розчину, що містить (і) грипозну вакцину, (іі) гідрофобну амінокислоту і (ііі) аргінін або його кислотно-адитивну сіль; причому відношення компонента (ііі) до загальної кількості ліофілізованого препарату становить від 20 до 85% мас; і відношення аргініну до його кислотно-адитивної солі знаходиться в такому діапазоні, що рН водного розчину становить від 8 до 10. Абзац 2. Ліофілізований препарат згідно з абзацом 1, де грипозна вакцина зазнає процесу знесолення. Абзац 3. Ліофілізований препарат згідно з абзацом 1, де (іі) гідрофобна амінокислота представляє фенілаланін або комбінацію фенілаланіну щонайменше з одним з валіну, лейцину і ізолейцину. Абзац 4. Ліофілізований препарат згідно з абзацом 1, де пропорція (іі) гідрофобної амінокислоти становить від 14 до 75% мас. загальної кількості ліофілізованого препарату. Абзац 5. Ліофілізований препарат згідно з абзацом 1, де (ііі) аргінін і його кислотно-адитивна сіль представляють відповідно аргінін і його гідрохлорид. Абзац 6. Ліофілізований препарат згідно з абзацом 1, де пропорція кислотноадитивної солі аргініну становить від 1 до 20 частин за масою відносно 1 частини за масою аргініну. Абзац 7. Ліофілізований препарат згідно з абзацом 1, де загальна кількість компонентів (і)-(ііі) становить від 80 до 100% мас. відносно загальної кількості ліофілізованого препарату. Абзац 8. Ліофілізований препарат згідно з абзацом 1, який розчиняється для одержання ін'єкційного розчину перед застосуванням. Абзац 9. Ліофілізований препарат згідно з абзацом 1, який представляє фармацевтичний препарат для транспульмонального введення. Абзац 10. Ліофілізований препарат згідно з абзацом 1, який являє собою фармацевтичний препарат для інтраназального введення. Крім того, даний винахід також надає спосіб одержання ліофілізованого препарату, що містить грипозну вакцину, як викладено нижче. Абзац 11. Спосіб одержання ліофілізованого препарату, що містить грипозну вакцину, що включає: першу стадію одержання водного розчину, що містить (і) грипозну вакцину, (іі) гідрофобну амінокислоту і (ііі) аргінін і його кислотно-адитивну сіль; причому вміст (і) грипозної вакцини у водному розчині еквівалентний 20 до 80% мас. відносно загальної кількості одержаного ліофілізованого препарату; і рН водного розчину становить від 8 до 10; і другу стадію ліофілізації одержаного водного розчину. Абзац 12. Спосіб згідно з абзацом 11, де (і) грипозна вакцина зазнає процесу знесолення. Абзац 13. Спосіб згідно з абзацом 11, де (іі) гідрофобна амінокислота представляє фенілаланін або комбінацію фенілаланіну щонайменше з одним з валіну, лейцину і ізолейцину. Абзац 14. Спосіб згідно з абзацом 11, де вміст (іі) гідрофобної амінокислоти у водному розчині, що використовується на першій стадії, еквівалент 97391 6 ний від 14 до 75% мас. відносно загальної кількості ліофілізованого препарату. Абзац 15. Спосіб згідно з абзацом 11, де (ііі) аргінін і його кислотно-адитивна сіль представляють відповідно аргінін і його гідрохлорид. Абзац 16. Спосіб згідно з абзацом 11, де пропорція вказаної кислотноадитивної солі аргініну у водному розчині, що використовується на першій стадії, становить від 1 до 20 частин за масою відносно 1 частини за масою аргініну. Абзац 17. Спосіб згідно з абзацом 11, де загальний вміст компонентів (і)-(ііі) у водному розчині, що використовується на першій стадії, еквівалентний від 80 до 100% мас. відносно загальної* кількості одержаного ліофілізованого препарату. Ефекти винаходу Ліофілізований препарат за винаходом може стійко підтримувати активність грипозної вакцини під час зберігання, таким чином, полегшуючи поширення і зберігання. У порівнянні з попередніми препаратами. Крім того, ліофілізований препарат може застосовуватися у вигляді ін'єкційного розчину розчиненням його в розчині для ін'єкцій перед застосуванням, або у вигляді препарату для транспульмонального введення або інтраназального введення в тому вигляді як він є; отже, інша перевага ліофілізованого препарату полягає в тому, що його можна застосовувати з різними способами введення. Опис переважних варіантів здійснення В описі, рН означає величину, виміряну при 25°С. Ліофілізований препарат за винаходом містить (і) грипозну вакцину, (іі) гідрофобну амінокислоту і (ііі) аргінін і його кислотно-адитивну сіль; в який включена певна пропорція компонента (ііі), і відношення аргініну до його кислотно-адитивної солі, складових компонент (ііі), укладається в певний діапазон. Грипозні вакцини, придатні як грипозна вакцина, що використовується в ліофілізованому препараті за винаходом (що далі іноді позначаються просто як «компонент (і)»), включають субодиничні вакцини, одержані після очищення вірусних частинок, вирощених в курячих ембріонах, і грипозні НА (гемагглютинінові) вакцини, які являють собою один тип розщепленої вакцини. Можуть також використовуватися грипозні вакцини, одержані з тканинних культур. Альтернативно, можуть також використовуватися живі вакцини, одержані з послаблених вірусів грипу, компонентні вакцини, одержані з детоксифікованих вірусів грипу при їх інтактній імуногенності, або суцільні вірусні частинки, одержані з інактивованих суцільних вірусних частинок. Грипозна вакцина для застосування в даному винаході може бути одержана з будь-якого або з обох з штамів А і В, але переважно може бути одержана з грипозних вакцин і А, і В штамів. Як грипозна вакцина для застосування у винаході може використовуватися грипозна вакцина, одержана відповідно до відомого способу, або грипозна вакцина, що випускається промисловістю. Коли одержана грипозна вакцина або грипозна 7 вакцина, що випускається промисловістю, представлена в формі розчину або порошку і містить сіль, таку як буфер або консервант, грипозна вакцина бажано зазнає попереднього процесу знесолення для видалення солі. Коли грипозна вакцина зазнає таким чином попереднього процесу знесолення, то можна більш ефективно підвисити стійкість грипозної вакцини в ліофілізованому препараті за винаходом. Спосіб знесолення грипозної вакцини конкретно не обмежений, і його приклади включають ультрафільтрацію, осадження, іонний обмін, діаліз і їм подібні. Для запобігання зниженню активності грипозної вакцини під час процесу знесолення, знесолення бажано проводиться з використанням водного розчину, рН якого доводиться до рівня від 8 до 10, а переважно, від 8 до 9, лужною речовиною, такою як гідроксид натрію, гідроксид калію, аргінін, або їй подібною. Зокрема, розчин з таким самим складом як склад розчину, підданого ліофілізації при одержанні ліофілізованого препарату, за винятком грипозної вакцини, підходить як розчин для використання в процесі знесолення. Пропорція компонента (і), що використовується в ліофілізованому препараті за винаходом, може бути визначена згідно зі способом застосування ліофілізованого препарату, і тому подібним. Наприклад, пропорція компонента (і) відносно загальної кількості ліофілізованого препарату становить від 0,3 до 60% мас, переважно, від 1 до 50% мас, переважніше, від 2 до 40% мас, ще переважніше, від 3 до 30% мас, а особливо переважно, від 3 до 20% мас. Певні приклади гідрофільної амінокислоти, що міститься в ліофілізованому препараті за винаходом (що далі іноді позначаються просто як «компонент (іі)»), включають амінокислоти, що складають білок, такі як валін, лейцин, ізолейцин, фенілаланін і їм подібні. У винаході, ці гідрофобні амінокислоти можуть використовуватися окремо або в комбінації. У винаході, наприклад, фенілаланін або комбінація фенілаланіну щонайменше з одним з валіну, лейцину і ізолейцину, можуть переважно використовуватися як гідрофобні амінокислоти. Пропорція компонента (іі), що використовується в ліофілізованому препараті за винаходом, може бути визначена відповідно до типу компонента (іі), зі способом застосування ліофілізованого препарату, і тому подібним. Наприклад, пропорція компонента (іі) відносно загальної кількості ліофілізованого препарату становить від 14 до 75% мас, переважно, від 20 до 75% мас, переважніше, від 20 до 70% мас, ще переважніше, від 25 до 65% мас, а особливо переважно, від 30 до 60% мас Ліофілізований препарат за винаходом, крім того, містить аргінін і його кислотно-адитивну сіль (що далі іноді позначаються просто як «компонент (ііі)»). Іншими словами, ліофілізований препарат по суті містить комбінацію аргініну і його кислотноадитивну сіль. Кислотно-адитивна сіль аргініну для використання у винаході конкретно не обмежена, поки вона фармакологічно прийнятна, і її приклади включають неорганічні кислотно-адитивної солі, 97391 8 такі як гідрохлориди, нітрат і сульфати; і органічні кислотно-адитивної солі, такі як ацетат. Аргінін гідрохлорид вказується як переважний приклад кислотно-адитивної солі аргініну для використання у винаході. У винаході, кислотно-адитивна сіль аргініну може використовуватися окремо або дві або більше кислотно-адитивні солі аргініну можуть використовуватися в комбінації. У ліофілізований препарат за винаходом, загальна кількість компонента (ііі) (тобто, загальна кількість аргініну і його кислотно-адитивної солі) включається в пропорції від 20 до 85% мас. відносно загальної кількості ліофілізованого препарату. Така пропорція компонента (ііі) запобігає зниженню активності грипозної вакцини під час зберігання, за допомогою цього забезпечуючи препарат з чудовою стійкістю. Пропорція компонента (ііі) відносно загальної кількості ліофілізованого препарату становить переважно від 20 до 80% мас, переважніше, від 20 до 75% мас, ще переважніше, від 25 до 70% мас, а особливо переважно, від 30 до 65% мас. Компонент (ііі) задовольняє будь-яку з цих пропорцій, і також є таким, що відношення аргініну до його кислотно-адитивної солі підбирається так, щоб рН водного розчину, підданого ліофілізації, складав від 8 до 10. Іншими словами, аргінін є лужним, а кислотно-адитивна сіль аргініну є кислотною, так що рН водного розчину, підданого ліофілізації, регулюється в межах цього діапазону шляхом регулювання відношення аргініну до кислотао-адитивної солі аргініну, за умови, що кількість компонента (ііі), що використовується, укладається в будь-який з вказаних вище діапазонів. Шляхом такого регулювання рН водного розчину, підданого ліофілізації, у вказаному вище діапазоні з використанням аргініну і його кислотно-адитивної солі, можна підвисити стійкість при зберіганні грипозної вакцини. Переважніше, відношення аргініну до його кислотно-адитивної солі підбирається так, щоб рН водного розчину, підданого ліофілізації, складав від 8 до 9. Використовуваний в даному описі термін «водний розчин, підданий ліофілізації», означає, водний розчин, підданий ліофілізації, при одержанні ліофілізованого препарату, тобто, водний розчин, одержаний додаванням всіх компонентів ліофілізованого препарату за винаходом до очищеної води. Водний розчин, підданий ліофілізації, регулюється так, щоб, наприклад, загальна кількість ліофілізованого препарату (загальна кількість всіх компонентів) на 1 мл водного розчину складала від 0,2 до 20 мг, переважно, від 0,4 до 20 мг, переважніше, від 0,4 до 15 мг, ще переважніше, від 0,6 до 12,5 мг, особливо переважно від 1 до 10 мг, хоча винахід конкретно не обмежується цими кількостями. Відношення аргініну до його кислотноадитивної солі в компоненті (ііі) конкретно не обмежується, поки рН водного розчину, підданого ліофілізації, може бути в межах вказаного вище діапазону, і воно може визначатися відповідно до типу кислотно-адитивної.солі, типу компонента (іі), що використовується і тому подібного. Зокрема, пропорція кислотно-адитивної солі аргініну відносно 1 частини за масою аргініну може, наприклад, 9 складати від 1 до 20 частин за масою, переважно, від 1 до 15 частин за масою, переважніше, від 1,25 до 12,5 частин за масою, ще переважніше, від 1,5 до 12,5 частин за масою, а особливо переважно, від 2 до 10 частин за масою. Ліофілізований препарат за винаходом може містити, в доповнення до компонентів (і)-(ііі), гідрофільні амінокислоти, крім аргініну (що далі іноді позначаються просто як «компонент (Iiv)»), в такому діапазоні, щоб не порушувати ефекти винаходу. Гідрофільна амінокислота може являти собою будь-яку амінокислоту з гідрофільним бічним ланцюгом, незалежно від того, чи є вона амінокислотою, що складає білок, чи ні. Певні приклади гідрофільних амінокислот включають основні амінокислоти, такі як лізин, гістидин і їм подібні; нейтральні гідроксіамінокислоти, такі як серин, треонін і їм подібні; кислотні амінокислоти, такі як аспарагінова кислота, глутамінова кислота і їм подібні; амінокислоти, що містять амідну групу, такі як аспарагін, глутамін і їм подібні; гліцин, аланін, цистеїн, тирозин і інші амінокислоти. Переважними серед цих гідрофільних амінокислот є аланін і гліцин. Такі гідрофільні амінокислоти можуть використовуватися окремо, або дві або більше з них можуть використовуватися в комбінації. Коли така гідрофільна амінокислота міститься в ліофілізованому препараті за винаходом, то пропорція гідрофільної амінокислоти також конкретно не обмежується; але, наприклад, пропорція гідрофільної амінокислоти відносно загальної кількості ліофілізованого препарату може складати від 5 до 50% мас, переважно, від 5 до 40% мас, переважніше, від 5 до 30% мас, ще переважніше, від 5 до 25% мас, а особливо переважно, від 10 до 25% мас. Крім того, для того, щоб зробити ефект стабілізації грипозної вакцини більш значущим в ліофілізованому препараті за винаходом, загальна кількість компонентів (і)-(ііі), в яку не включений компонент (iv), або загальна кількість компонентів (i)-(iv), в яку включений компонент (iv), становить від 80 до 100%) мас, переважно, від 85 до 100% мас, переважніше від 90 до 100% мас, ще переважніше, від 95 до 100% мас, і особливо переважно, 100% мас відносно загальної кількості ліофілізованого препарату. Ліофілізований препарат за винаходом може також містити наступні компоненти, поки не порушуються ефекти винаходу: моносахариди, такі як глюкоза; дисахариди, такі як сахароза, мальтоза, лактоза і трегалоза; цукрові спирти, такі як манить; олігосахариди, такі як циклодекстрин; полісахариди, такі як декстран 40 і пулулан; багатоатомні спирти, такі як поліетиленгліколь; солі жирних кислот, такі як капрат натрію; людський сироватковий альбумін; неорганічні солі; желатин; поверхневоактивні речовини; буфери; і т.д. Поверхневоактивна речовина може бути або аніонною, катіонною або не іонною, поки вона являє собою поверхнево-активну речовину, що зазвичай використовується в фармацевтичних продуктах. Крім того, ліофілізований препарат за винаходом необов'язково містить ад'ювант. Ліофілізований препарат за винаходом вихо 97391 10 дить додаванням заданих кількостей компонентів (і)-(ііі) до очищеної води^ додаванням компонента (iv) і, за необхідності, інших компонентів, і впливом на суміш процесу ліофілізації. Конкретніше, ліофілізований препарат за винаходом може бути одержаний за допомогою наступних першої і другої стадій: перша стадія: одержання водного розчину, що містить: (і) грипозну вакцину, (іі) гідрофобну амінокислоту і (ііі) аргінін і його кислотно-адитивну сіль, де кількість (ііі) аргініну і його кислотно-адитивної солі еквівалентна 20-85% мас. відносно загальної кількості одержаного ліофілізованого препарату, і рН становить від 8 до 10; і друга стадія: ліофілізіація водного розчину, одержаного на першій стадії, для одержання ліофілізованого препарату. Цільовий ліофілізований препарат може бути одержаний впливом на водний розчин, одержаний на першій стадії, процесу ліофілізації. Тому, на першій стадії, водний розчин - водний розчин, підданий ліофілізації, виходить також, що співвідношення у водному розчині компонентів, відмінних від компонента (компонентів), видалених ліофілізіацією, таке ж, як співвідношення компонентів в одержаному препараті. Крім того, рН водного розчину, одержаного на першій стадії, доводиться шляхом регулювання відношення аргініну до кислотно-адитивної солі аргініну, як описано вище. Сам ліофілізований препарат за винаходом може являти собою висушену тверду речовину (ліофілізований коржик), одержану процесом ліофілізації, або може являти собою порошок, одержаний з висушеної твердої речовини. Спосіб введення ліофілізованого препарату за винаходом конкретно не обмежується. Наприклад, препарат може бути розчинений в розріджувачі (розчині для ін'єкцій) перед застосуванням і підшкірно введений у вигляді ін'єкції. Ліофілізований препарат може бути також розчинений в розріджувачі для утворення рідкого препарату і введений транспульмонально або інтраназально у вигляді фарацевтичного препарату для введення через легені або введення у вигляді носових крапель. Крім того, ліофілізований препарат може бути виготовлений у вигляді порошку впливом повітряного удару; тому, коли ліофілізований препарат застосовується як фармацевтичний препарат для введення через легені або введення у вигляді носових крапель, він може вводитися транспульмонально або інтраназально в тому вигляді як він є з використанням пристрою для інгаляції сухого порошку, в якому може докладатися повітряний удар. Спосіб введення ліофілізованого препарату можна визначити, залежно від віку і інших параметрів піцієнта, але препарат може вводитися, наприклад, в кількості, еквівалентній 3-300 мкг грипозної вакцини однократно або двічі з інтервалом приблизно від 1 до 4 тижнів. Коли ліофілізований препарат вводиться в тому вигляді, як він є, без розчинення в розріджувачі перед застосуванням, він переважно поміщений в контейнер для кожної однієї дози (кількості, що вводиться за один раз) з урахуванням зручності 11 97391 застосування. Коли ліофілізований препарат вводиться розчиненням в розріджувачі перед застосуванням, він може бути поміщений в контейнер для кожної однієї дози, або множинні дози препарату можуть бути поміщені разом в один контейнер. Ліофілізований препарат містить зменшену кількість наповнювача, в порівнянні з препаратами, що містять грипозні вакцини, які раніше використовувалися у вигляді ін'єкцій. Тому, одна ознака препарату полягає в тому, що кількість препарату на контейнер невелика. У даному винаході, кількість ліофілізованого препарату, поміщеного в контейнер, конкретно не обмежується, але становить, наприклад, від 0,1 до 10 мг, переважно, від 0,15 до 8 мг, переважніше, від 0,2 до 6 мг, ще переважніше, від 0,25 до 5 мг, а особливо переважно, від 0,3 до 5 мг. Приклади Даний винахід буде більш детально описаний нижче з посиланням на приклади і їм подібні, які не призначені для обмеження винаходу. Довідковий приклад 1: Дослідження умов знесолення для грипозних вакцин Досліджували умови процесу знесолення для розчинів грипозних НА вакцин. Зокрема, грипозну НА вакцину "Seiken" (назва продукту, що випускається компанією Denka Seiken, Лот № 308-А) використовували як розчин грипозної НА вакцини, і відповідну кількість цього розчину виливали в кожний концентратор Vivaspin місткістю 4 мл (що випускається компанією Sartorius) і центрифугували при 3000 об/хв протягом 30 хвилин. Кожний з розчинів складів, показаних в таблиці 1, потім додавали в кожний концентратор Vivaspin, і суміші центрифугували при 3000 об/хв протягом 30 хвилин. Цю процедуру повторювали усього три рази. Активність одержаних знесолених грипозних НА вакцин (величину НА) вимірювали відповідно до описаного нижче способу. 12 Вимірювання активності грипозних НА вакцин Одержання 5 об % суспензій курячих еритроцитів Консервовану курячу кров (Nippon, що постачається Biotest Labo.) помішували в пробірку і центрифугували протягом 5 хвилин при 900 g з подальшим видаленням надосадової рідини і лейкоцитарного шару. Потім до еритроцитів в пробірці додавали розріджувач композиції, показаний нижче (розчин 1/200 моль/л хлориду натрію, забуферений фосфатом (рН 7,2)). Суміш перемішували і в подальшому центрифугували для видалення супернатанту. Процедуру повторювали три рази. Еритроцити в пробірці відстоювали піпеткою і вміщували в контейнер, що містить розріджувач, і змішували для одержання 5 об % суспензій курячих еритроцитів. Композиція розріджувача NaCl 8,5 г Na2HPO4'12H2O 1,425 г KH2PO4 0,135 г Очищена вода 1000 мл 2. Вимірювання величин НА Кожну з порцій по 50 мкл грипозної НА вакцини з різними факторами розведення додавали в мікропіпетку, і потім в неї додавали 50 мкл 5 об % суспензій курячих еритроцитів (спосіб двоетапного розведення). Зразки в мікропланшеті ретельно змішували і залишали стояти при кімнатній температурі протягом години, і потім оцінювали найвищий фактор розведення середовищ зразків кожної грипозної НА вакцини при повній аглютинації еритроцитів як його величини НА. Результати показані в таблиці 1. Результати підтвердили, що відбувається зниження активності грипозних НА вакцин, підданих процесу знесолення розчином з рН 7 або нижче; однак грипозні НА вакцини, піддані процесу знесолення розчином з рН від 8 до 9, були здатні зберігати стабільну активність. Таблиця 1 № Умова 1 Умова 2 Умова 3 Умова 4 Умова 5 Умова 6 Умова 7 Умова 8 Склади і рН розчинів 0,5 мг Phe доданого в 0,5 мл очищеної води; рН доведене NaOH до 3,0 0,5 мг Phe доданого в 0,5 мл очищеної води; рН доведене NaOH до 4,0 0,5 мг Phe доданого в 0,5 мл очищеної води; рН доведене NaOH до 5,7 0,5 мг Phe доданого в 0,5 мл очищеної води; рН доведене NaOH до 7,0 Без додавання Phe в 0,5 мл очищеної води; рН доведене NaOH до 7,0 0,5 мг Phe доданого в 0,5 мл очищеної води; рН доведене NaOH до 8,0 Без додавання Phe в 0,5 мл очищеної води; рН доведене NaOH до 8,0 0,5 мг Phe доданого в 0,5 мл очищеної води; рН доведене NaOH до 9,0 Залишкова активність 12,5% 6,3% 12,5% 50% 50% 100% 100% 100% #»Залишкова активність» в таблиці 1 означає частку (%) величини НА після процесу знесолення відносно величини НА перед процесом знесолення. Приклад випробування 1:% Оцінка стійкості грипозних вакцин Грипозну НА вакцину "Seiken" (назва продукту, що випускається компанією Denka Seiken, Лот № 308-А) використовували як розчин грипозної НА вакцини, і 1 мл (еквівалентний 90 мкг грипозної НА вакцини) цих розчини виливали в кожний концент ратор Vivaspin місткістю 4 мл (що випускається компанією Sartorius) і центрифугували при 3000 об/хв протягом 30 хвилин. Кожний з розчинів складів, показаних в таблиці 2, потім додавали в кожний концентратор Vivaspin, і суміші центрифугували при 3000 об/хв протягом 30 хвилин. Цю процедуру повторювали усього три рази. Кінцеві 13 97391 розчини, одержані після такої концентрації і знесолення (буферного обміну), мали склади, показані в таблиці 2, і їх об'єм був доведений до первинного об'єму (1 мл). Скляний флакончик заповнювали 14 0,5 мл кожного з одержаних розчинів, і розчини ліофілізували для одержання ліофілізованих продуктів. Таблиця 2 № Приклад 1 Приклад 2 Приклад 3 Приклад 4 Приклад 5 Приклад 6 Приклад 7 Порівняльний приклад 1 Порівняльний приклад 2 Порівняльний приклад 3 Порівняльний приклад 4 Склади і величини рН розчинів, використаних в прикладах і порівняльних прикладах 0,5 мг Phe, 0,5 мг Arg-HCl і 0,075 мг Arg, доданих в 0,5 мл очищеної води; рН 8 0,5 мг Phe, 0,3 мг Arg-HCl і 0,050 мг Arg, доданих в 0,5 мл очищеної води; рН 8 0,5 мг Phe, 0,2 мг Не, 0,3 мг Arg-HCl і 0,057 мг Arg, доданих в 0,5 мл очищеної води; рН 8 0,5 мг Phe, 0,2 мг VaI, 0,3 мг Arg-HCl і 0,055 мг Arg, доданих в 0,5 мл очищеної води; рН 8 0,5 мг Phe, 0,2 мг Leu, 0,3 мг Arg-HCl і 0,052 мг Arg, доданих в 0,5 мл очищеної води; рН 8 0,5 мг Phe, 0,2 мг Ala, 0,3 мг Arg-HCl і 0,052 мг Arg, доданих в 0,5 мл очищеної води; рН 8 0,5 мг Phe, 0,2 мг GIy, 0,3 мг Arg-HCl і 0,052 мг Arg, доданих в 0,5 мл очищеної води; рН 8 0,5 мг Phe і відповідна кількість NaOH, доданих в 0,5 мл очищеної води; рН 8 0,5 мг Phe і 0,060 мг Arg, доданих в 0,5 мл очищеної води; рН8 0,3 мг Arg-HCl і 0,030 мг Arg, доданих в 0,5 мл очищеної води; рН 8 0,5 мг Phe, 0,5 мг His і 0,30 мг Arg, доданих в 0,5 мл очищеної води; рН 8 # рН розчинів, використаних в прикладах 1-7, і Порівняльних прикладах 2-4 доводили до 8, використовуючи задані кількості і компонентів без використання інших регулювальників рН. NaOH додавали до розчину, використаного в Порівняльному Прикладі 1 так, щоб рН було 8 після додавання заданої кількості його компонента. Кожний з одержаних ліофілізованих препаратів був герметично закупорений в скляний флакончик і зберігався протягом 4 тижнів в темному місці при 25°С і відносній вологості 60%. Відразу після одержання і через 1, 2 , 3 і 4 тижні після збереження, грипозну НА вакцину в кожному ліофілізованому препараті проводили вимірювання величини НА, відповідно до того ж способу, який описаний в Довідковому прикладі 1. Результати показані в таблиці 3. В випадках використання розчинів, що містять фенілаланін, рН яких доводився до 8 тільки гідроксидом натрію і аргініном, було неможливо запобігти зниженню активності грипозних НА вакцин під час зберігання (Порівняльні приклади 1 і 2). Також у випадку використання розчину, рН якого доводилося до 8 за допомогою додавання аргініну і аргініну гідрохлориду без додавання фенілаланіну, який являє собою гідрофобну амінокислоту, було неможливо запобігти зниженню активності грипозної НА вак цини (Порівняльний приклад 3). Крім того, у випадку використання розчину, рН якого доводилося до 8 з використанням комбінації фенілаланіну, гістидину, який являє собою основну амінокислоту, і аргініну, було неможливо запобігти зниження активності грипозної НА вакцини. Навпаки, було виявлено, що коли розчин для використання при одержанні ліофілізованого препарату відповідає умовам (І)-(3), викладеним нижче, то можна стійко підтримувати активність грипозної НА вакцини в кінцевому ліофілізованому препараті: (1) включені гідрофобна амінокислота, аргінін і кислотно-адитивна сіль аргініну; (2) відношення аргініну до кислотно-адитивної солі аргініну підібране так, що рН розчину становить 8; (3) загальна кількість аргініну до кислотно-адитивної солі аргініну підібрана так, що щоб вона дорівнювала або перевищувала задану концентрацію в ліофілізованому препараті. 15 97391 16 Таблиця 3 Залишкова активність № Склади ліофілізованих препаратів Приклад 1 Приклад 2 Приклад 3 Приклад 4 Приклад 5 Приклад 6 Приклад 7 Порівняльний приклад 1 Порівняльний приклад 2 Порівняльний приклад 3 Порівняльний приклад 4 4,0% НА вакцини, 44,6% Phe, 51,4% Arg і Arg-hcl 5,0% НА вакцини, 55,9% Phe, 39,1% Arg і Arg-hcl 4,1% НА вакцини, 45,4% Phe, 18,1% Не, 32,4% Arg і Arg-hcl 4,1% НА вакцини, 45,4% Phe, 18,2% VaI, 32,3% Arg і Arg-hcl 4,1% НА вакцини, 45,6% Phe, 18,2% Leu, 32,1% Arg і Arg-hcl 4,1% НА вакцини, 45,6% Phe, 18,2% Ala, 32,1% Arg і Arg-hcl 4,1% НА вакцини, 45,6% Phe, 18,2% GIy, 32,1% Arg і Arg-hcl Приблизно 8,3% НА вакцини, приблизно 91,7% Phe кількість, що підходить, Naoh 7,4% НА вакцини, 82,7% Phe, 9,9% Arg 7,8% НА вакцини, 92,2% Arg і Arg-hcl 4,2% НА вакцини, 46,5% Phe, 46,5% His, 2,8% Arg Одразу після одержання Через 1 гиждень Через 2 тижні Через 4 тижні 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 25% 63% 31% 100% 50% 25% 25% 100% 25% 100% 50% 12,5% 6,3% # «Залишкова активність» у таблиці 3 позначає частку (%) величини НА ліофілізованого препарату після збереження відносно величини НА ліофілізованого препарату відразу після одержання. У таблиці 3 одиниця % у колонці «Композиція ліофілізованих складів» позначає % за масою. У таблиці 3 «-» позначає «не вимірялося» Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601