Ліофілізований продукт з клітин бурих водоростей, спосіб його одержання та використання

1. Ліофілізований продукт клітин гаметофітів бурих водоростей, збагачених фукоксантином. 2. Ліофілізований продукт за п. 1, який відрізняється тим, що він включає принаймні 1 % фукоксантину. 3. Спосіб одержання ліофілізованого продукту за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що включає наступні етапи: збір зрілих спорофітів; емісія спор у пробірці; C2 2 (19) 1 3 Всі фотосинтетичні організми використовують пігменти для накопичення світлової енергії, зазвичай у формі хлорофілу "а". Стандартний хлорофіл - хлорофіл "а", що є необхідним для передачі поглинутої світлової енергії до молекул, які використовують цю енергію. Більшість хлорофілових організмів має інші пігменти для поглинання більшої кількості світла, але накопичена енергія завжди має передаватися до молекули хлорофілу "а". Бурі водорості використовують ряд таких "додаткових" пігментів як хлорофіл "с" та каротиноїди. Phaeophyceae мають більшу кількість каротиноїдів у своїх пластидах, які містять бурі та жовті пігменти, що визначають їхній характерний бурий колір. Найважливіший пігмент каротиноїду бурих водоростей - фукоксантин, назва якого походить від Fucus. Фукоксантин поглинає довжини хвиль від 500 до 580 мілімікрон. Пігменти каротиноїду мають аліфатичну або аліциклічну структуру. Вони розчиняються у жирах, що сприяє їхній безпосередній інтеграції в деякі мембрани. Таким чином, їхня розчинність у воді може виникнути тільки у тому випадку, коли вони пов'язані з іншими молекулами. Це також є причиною того, що їхній метаболізм найчастіше знаходиться у прямому зв'язку з метаболізмом ліпідів. Каротиноїди також називаються додатковими пігментами, тому що вони мають передати енергію, накопичену хлорофілом "а". Ці пігменти загалом є відомими через каротин (carotene), що дав свою назву цій родині пігментів. Єдиним джерелом каротиноїдів, зокрема для тварин та людей, є продукти харчування. Каротиноїди виконують функцію антиоксиданту у людській плазмі, зокрема для обміну жирів (ліпідів). Ця функція виражена також на рівні мембрани клітини, до якої вони включені. Каротиноїди беруть безпосередню участь у фарбуванні шкіри (жовто-жовтогарячий колір), імітуючи природну засмагу. Попереднє використання Каротин використовується як харчова добавка, яку слід вживати за кілька днів до початку та протягом знаходження під променями сонячного світла, щоб прискорити загар. Бета-каротин є попередником вітаміну А. Споживання бета-каротину спричинює затримку спалаху сонячної еритеми. Вітамін А збільшує кількість меланіну, що виробляється під дією синього світла. Крім того, вітамін А відіграє антиоксидантну захисну роль. Вітаміни А та Ε запобігають окислювальній денатурації меланіну під дією ультрафіолетового світла. У відомих харчових добавках, каротин пов'язаний з вітаміном С, вітаміном Ε або із флавонідами. Недолік у використанні каротину для фарбування шкіри полягає в тому, що кінцевий колір є значно більш жовтогарячим ніж природна засмага. Крім того, він швидко деградує у вітамін А. Астаксантин (astaxanthin) зарекомендував себе як потужний антиоксидант. Патентна заявка США за номером 6.433.025 описує оральне використання з метою запобігання та затримки засмаги. 94394 4 Кантаксантин (canthaxanthin), ще один пігмент каротиноїду, використовувався як харчова добавка для фарбування шкіри та її захисту проти дії променів ультрафіолетового світла" (GB 1.323.800). Проте, подібне використання кантаксантину заборонене у Франції через небезпеку осліплення, у той час як на ринку США цей продукт знаходиться у продажу (Canthorex, DELTA® Laboratories). Рак шкіри або меланома, у Франції в наступні роки, будуть найчастішими, та вже зараз у США реєструється 800.000 випадків щороку. Найчастіше, це наслідок надмірно швидкого розмноження клітин шкіри під впливом мутацій ДНК, викликаних ультрафіолетовим світлом (UV). Люди стають все більш поінформованими про цю небезпеку та готові захистити себе від сонця. Однак, засмагла шкіра все ще залишається привабливою та бажаною особливістю, що задовольняє існуючим естетичним критеріям. Тому, виробники косметики та фармацевтичних препаратів продовжують досліджувати активні речовини для пігментації та захисту шкіри від шкідливої дії ультрафіолетових променів. Резюме винаходу Заявник випадково та зненацька виявив, що ліофілізований (висушений заморожуванням) продукт клітин бурих водоростей, зокрема гаметофітів (gametophytes) збагачених фукоксантином, дозволяє досягати цієї комбінації бажаних ефектів: він пігментує епідерміс цілковито безпечним способом, стимулюючи меланогенез (melanogenesis), навіть без ультрафіолетового опромінення, при цьому захищаючи шкіру шляхом анти-радикальної дії та стимулювання її регенерації. Фактично, бурі водорості мають комплексний дигенетичний цикл. Для порядку ламінарієвих (Laminariales) (дивіться Фігуру 1) спостерігається чергування між диплоїдним спорофітом, розвиненим у макроскопічному таломі (thallos), та мікроскопічними чоловічими гаметофітами та жіночими гаплоїдами. У цьому випадку, гаметофіти - це тільки сукупність клітин, що є результатом різних мітозів спори. Гаметофіт є лише перехідною стадією утворення гамет. Оскільки він не розвивається у справжній талом, він є слабо фотосинтетичним та містить максимальну кількість захисних пігментів фукоксантину, у порівнянні із справжніми пігментами фотосинтезу, якими є хлорофіли. Таким чином, Заявник вибрав цю стадію гаметофітів для отримання ліофілізованого продукту клітин бурих водоростей із надзвичайним збагаченням на фукоксантин, простим та недорогим способом, порівняно із класичним екстрактом фукоксантину, з біомаси, що наявна в необмеженій кількості протягом цілого року. Детальний опис винаходу Таким чином, першим предметом даного винаходу є ліофілізований продукт клітин бурих морських водоростей, збагачених на фукоксантин, що зокрема містять принаймні 1% фукоксантину. Зазначені клітини бурих водоростей є переважно спорами або гаметофітами, зокрема перевага надається, гаметофітам. 5 Другим предметом даного винаходу є процес отримання ліофілізованого продукту із гаметофітів клітин бурих водоростей, що включає наступні етапи: - збір зрілих спорофітів; - емісія спор у пробірці; - пророщення спор у пробірці; - збір гаметофітних клітин; - ліофілізація отриманих гаметофітних клітин. "Зрілий спорофіт" означає спорофіт, що містить спори у спеціальних вмістилищах, наприклад у сорусах. Третім предметом даного винаходу є косметичний препарат для місцевого застосування, що містить ліофілізований продукт відповідно до винаходу, в якості активного компоненту, переважно в межах від 0.2 до 5% у вазі, більш переважно, від 1 до 2% у вазі. Четвертим предметом даного винаходу є харчова добавка, що включає ліофілізований продукт відповідно до винаходу, в якості активного компоненту. Косметичний препарат відповідно до винаходу може використовуватися для пігментації шкіри, для підготовки шкіри в разі дії на неї ультрафіолетових променів, для захисту шкіри від окислювальної дії, викликаної ультрафіолетовими променями та/або для захисту шкіри проти клітинного старіння. Харчова добавка відповідно до винаходу може використовуватися для підготовки шкіри в разі дії на неї ультрафіолетових променів. Опис фігур Фігура 1: цикл розмноження ламінарієвих (Laminariales); Фігура 2: ділянки епідермісу, оброблені/необроблені, протравлені гематоксиліном/еозином/шафраном (HES hematoxy lin/eosine/safran). Приклад 1: Отримання гаметофітів бурих водоростей - ламінарієвих Гаметофітні клітини були отримані для наступних різновидів: ламінарії цукристої (Laminaria saccharina), ламінарії північної (Laminaria hyperborean), аларії їстівної (Alaria esculenta), ундарії пір'ястої (Undaria pinnatifida). Було зібрано талом родючих зрілих спорофітів, що містив соруси (див. Фігуру 1), у день J0, на французькому узбережжі у Бретані, між жовтнем та лютим. Вони були промиті фільтрованою морською 2 водою та порізані на шматки від 5 до 10 см , які послідовно опускалися у фільтровану морську воду, білизна 0.2% протягом 20-30 секунд, у двох ємкостях з фільтрованою морською водою. Потім, частини талома були висушені на поглинаючому папері, шляхом розкладання по 30 частин на одному аркуші поглинаючого паперу, при чому аркуші поглинаючого паперу скручувалися у рулон. Аркуші скрученого поглинаючого паперу, що містить частини талома, інкубувалися протягом 12 годин при температурі 15°С. Потім вони були поміщені у фільтровану морську воду і згодом, були отримані спори. 94394 6 Спори виведені у визначеному середовищі культури, що містить 0.1% розчину Провасолі (Provasoli) (див. Таблицю 1), у колбі, що до якої проникало світло (1800-2000 люксів цілодобово) та з незначним збовтуванням. Температура підвищувалася на половину градуса щодня до 22°С. Середовище оновлювалося кожних два тижні. Спори проростають протягом 6-20 днів вирощування, а врожай гаметофітів збирають через 10-12 днів після пророщування (див. Таблицю 2). Таблиця 1 Склад розчину Провасолі для 1L EDTA (етилендіамінтетраацетат) Fe(Cl) Mn(CI) Zn(Cl) Co(Cl) Ca(SО4) B(H3BО3) Mo(Na2MoО4) 3г 0.08 г 0.12 г 0.015 г 0.003 г 0.0012 г 0.6 г 0.05 г Таблиця 2 Період проОтримання рощування дні гаметофітів дні Ламінарія цукриста 9 J19-J21 Ламінарія північна 11-20 J21-J32 Аларія їстівна 6-1 J16-J19 Ундарія пір'яста 1 J17-J19 Різновид Приклад 2: Отримання ліофілвованого продукту з клітин гаметофітів бурих водоростей Пригнічення розвитку гаметофітів у канаміцинсульфатному середовищі вільному від двоокису германію з метою запобігання проростанню проростків. Культура фільтрується на решеті, клітини обполіскуються морською водою та ліофілізуються у ліофільній сушарці. З метою введення фукоксантину шляхом рідинної хроматографії високого тиску (HPLC), готується екстракт етанолу при 0.05% ліофілізованого продукту для 10 мл. 70%-ого етанолу, що розмішується протягом 6 годин у темряві, а потім фільтрується. Аналіз HPLC виконується на адсорбційній колоні "Absorbsphere" (компанії Alltech) з розчинником/градієнтом: А = ацетат/метанол амонію (20:80) В = ацетонітрил 90% С = ацетат етилу Приклад 3: Приготування продукту "ВВ" Ліофілізований продукт з гаметофітів морської водорості ундарії пір'ястої (Undaria pinnatifida) (Ламінарієві) готується відповідно до Приклада 2. З метою використання цього ліофілізованого продукту належним чином на шкірі, ліофілізований продукт знову розміщується в середовищі культури гаметофітів. Ця суміш обробляється ультразву 7 94394 ком, а потім фільтрується. Фільтрований продукт, отриманий таким способом, називається "ВВ". Приклад 4: Оцінка слизової толерантності ліофілізованого продукту з гаметофітів клітин бурих водоростей у дослідженнях цитотоксичності на реконструйованій роговій оболонці SKINETHIC® 1. - Опис досліду Використовувалися кератіноцити (Keratinocytes) лінії TR 146, довільно перетворені та посилені клітинною культурою у визначеному модифікованому середовищі MCDB 153. При культивуванні у повітряному/рідкому визначеному середовищі, ці людські кератіноцити формують багатошаровий епітелій без шару роговиці, подібного до людської роговиці. Продуктом, що має досліджуватися, у цьому випадку, є продукт "ВВ" відповідно до Приклада 3, що застосовується в об'ємі 30 мл на поверхні восьми еквівалентних культур з використанням мікропіпетки. Ці культури згодом інкубуються при 37°С, 5% СО2, протягом 10 хвилин, 1 години, 3 годин та 24 годин, за нормою - дві культури за інкубаційний період. Були підготовлені в стерильних умовах негативний (буферізований розчин солі) та позитивний (SDS 0.5% та 1%) контрольні розчини, що застосовувалися однаковим способом до двох культур, відповідно. Ці культури згодом інкубуються при 37°С, 5% СО2, протягом 1 години та 24 годин, за нормою дві культури за інкубаційний період. 2. - Оцінка клітинної життєздатності Клітинна життєздатність надалі обмірювалася якісно після маркування барвником. За допомогою 8 тесту МТТ вимірюється активність мітохондріальної дегідрогенази живих клітин. Ключовим компонентом є 3-[4,5-діметилтіазол-2-y1]-2,5- діфеніл тетразоліум бромід або МТТ. Розчини солі, буферізовані МТТ, за відсутності червоного фенолу, мають жовтий колір. Мітохондріальна дегідрогеназа живих клітин перериває цикл тетразоліуму у такий спосіб призводячи до формування фіолетових кристалів формазану, нерозчинних у водних розчинах. Кристали, сформовані живими клітинами затримуються у полікарбонатних фільтрах, які забезпечують підтримку епітеліальних культур. Культури набувають однорідного інтенсивного синього/фіолетовому кольору, якщо вони життєздатні, але залишаються білими/жовтими у випадку загибелі клітини. Результати порівнюються з негативним та позитивним контрольними розчинами. 0.15 мл середовища культури, що містить 10% об'єму розчину МТТ наноситься піпеткою на кожний фільтр підтримки культури. Після інкубації протягом 30 хвилин в умовах кімнатної температури перевіряється колір різних культур. Негативні контрольні культури повинні мати інтенсивний синій/фіолетовий колір, що є доказом життєздатності слизової оболонки після контакту протягом 24 годин. Позитивні контрольні культури повинні мати білий колір, що є доказом загибелі клітин, починаючи з 1-ої години контакту. 3. - Результати Таблиця 3 Продукт ВВ Негативний контрольний розчин SDS 0.5% SDS 1% 10 хвилин синій синій синій білий Колір обох культур 1 година 3 години синій синій синій синій білий білий білий / Токсичність 24 години білий синій / / N1 N1 І VI N1 = не подразнюючий І = подразнюючий VI = дуже подразнюючий 4. - Висновок В умовах проведення досліду, продукт "ВВ" відповідно до Прикладу 3, досліджений у чистому вигляді, не спричинює подразнення клітин, що формують модель SKINETHIC® у пробірці реконструйованої слизової оболонки. Приклад 5: Оцінка шкірної толерантності ліофілізованого продукту з гаметофітів клітин бурих водоростей у дослідженнях цитотоксичності на реконструйованій епідермічній шкірі SKINETHIC® 1 - Опис досліду Кератіноцити людського походження розміщувалися на полікарбонатних фільтрах розміром 2 0.63 см у визначеному та доповненому середовищі (модифікована MCDB 153). Клітини культивувалися протягом 10 днів у повітряному/рідкому середовищі, при чому середовище культури поновлювалося кожних два дні. Епідерміс, сформований у такий спосіб, використовувався для проведення дослідження, починаючи з 14-ого дня культури. Тест виконувався на трьох екземплярах після інкубації продукту протягом 24 годин за нормою 2 мл епідермісу. Контрольний епідерміс не отримував жодного продукту. Епідерміс, поміщений у 10% формальдегідний розчин, зберігався у парафінових блоках. Вертикальні частки 4 мікронів були протравлені сумішшю HES (гематоксилін/еозин/шафран), та за допомогою оптичного мікроскопу були зроблені фотографії. 9 94394 Якщо продукт є нетоксичним, культури повинні мати базальні, шиповидні, гранульовані шари клітин та неушкоджену ортокератозну роговицю, а стратифікація шкіри повинна бути регулярною та нормальною. Клітини базального шару повинні бути поляризовані вертикально. Численні кератогіалинові зерна мають бути чітко видимі (у фіолетовому кольорі) у гранульованому шарі безпосередньо під шаром роговиці. 2 - Результати Див. Фігуру 2 3. - Висновок В умовах проведення досліду, продукт "ВВ" відповідно до Прикладу 3, досліджений у чистому вигляді, виявився не цитотоксичним для реконструйованої шкіри SKINETHIC®. Приклад 6: Тестування пігментації 1. - Матеріали та методи Продукт "ВВ" розчиняється в етанолі, а потім додається до косметичного складу. Тестувалися наступні продукти: а - продукт "ВВ" включений до складу при 0.05% b - продукт "ВВ" включений до складу при 0.15% 10 с - продукт "ВВ" включений до складу при 0.30% Усі продукти зберігалися при температурі 4°С аж до їхнього використання. 2. - Біохімічна оцінка Наприкінці інкубації, меланін, що міститься в лізатах клітини був обчислений кількісно за допомогою спектроскопічного методу. Вимірювання вмісту меланіну здійснювалося паралельно з аналізом. Результати виражені в мг меланіну на 1 мл лізату захисного шару клітин (середній показник +/стандартне відхилення SD). Статистичне значення спостережуваних розходжень між "обробленими" умовами та "контрольними" умовами оцінювалося шляхом аналізу різниці щодо фактору (One Way ANOVA), що супроводжувався тестом Бонферроні "t-test" (*:р