Спосіб тестування рівня адаптованості рослин до умов зростання за допомогою рослинних екстрактів та бактеріального штаму e.coli ab 259 hfr 3000 (e.coli 3000)

Реферат: Спосіб тестування рівня адаптованості рослин до умов зростання за допомогою рослинних екстрактів та бактеріального штаму Е.соlі АВ 259 Hfr 3000 (E.coli 3000), у якому бактеріальну культуру вирощують на твердому живильному середовищі, знімають з середовища бактеріологічною петлею, ресуспендують у фізіологічному розчині NaCl, розносять по пробірках. До кожної пробірки додають крім контролю 1 %-2 % екстракту у водній формі, а в контрольну пробірку вносять такий же об'єм фізіологічного розчину NaCl. Культури витримують кілька діб при 37 °C без аерації і з інтервалами 1-3 доби висівають на тверде живильне середовище в різних розведеннях для одержання ізольованих колоній. Обчислюють титр культури в кожній точці, знаходять його найвищий показник і починаючи з цієї точки відслідковують швидкість наступного зниження титру і порівнюють здатність окремих екстрактів забезпечувати функції початкової стимуляції росту і кінцевого виживання бактеріальної культури. UA 99239 U (12) UA 99239 U UA 99239 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пропонована корисна модель належить до галузі генетики рослинних популяцій і може бути використана для тестування рівня адаптованості рослин до умов їх зростання за допомогою рослинних екстрактів та бактеріального штаму Е.соlі 3000, а більш конкретно до способу тестування рівня адаптованості рослин до умов зростання за допомогою рослинних екстрактів та бактеріального штаму Е.соlі АВ 259 Hfr 3000 (Е.соlі 3000). Відомий спосіб тестування адаптивного процесу та рівня адаптованості рослин в природних популяціях методом реципрокних пересадок із одного місця в інше з подальшим аналізом їх виживання, успішності репродуктивного процесу та фітоіндикаторних показників в обох місцях [1]. Недоліком методу є те, що він не дозволяє порівнювати адаптованість представників окремих видів або одного і того ж виду, пристосованих до різних умов довкілля з точки зору інтенсивності використання ними власного адаптивного потенціалу і, відповідно, інтенсивності синтезу вторинних метаболітів, необхідних для забезпечення виживання та репродукції рослини в широкому діапазоні селективного тиску, що створюється середньорічною температурою, її сезонними та добовими коливаннями, вологістю, складом ґрунтів, сонячним та УФопроміненням тощо. Відомі приклади використання бактеріальних систем для моніторингу адаптивних реакцій вищих організмів у відповідь на вплив екстремальних умов. Так, Е.соlі використовували для аналізу функції генів, кодуючих білки пізнього ембріогенезу злакових групи LEA-3 [2]. Особливо високий рівень синтезу цих білків спостерігається у рослин в умовах холоду, спеки, підвищених концентрацій солі або під впливом екзогенних гормонів. Рекомбінантна Е.соlі з геном, кодуючим LEA білки, демонструє набагато вищий рівень виживання при 4 °C впродовж 24 годин порівняно з контрольними клітинами. В другій роботі [3] описано клонування нового антифризного білка жука Tenebrio molitor, при додаванні якого до клітин Е.соlі і витримці їх разом з цим білком при 0 °C впродовж 96 годин виживання клітин значно підвищувалось порівняно з клітинами в присутності контрольного білка BSA. Таким чином, продукти метаболізму вищих організмів, напрацьовані в процесі адаптації до екстремальних умов, здатні різко підвищувати виживання мікроорганізмів. Оскільки, визнаною стратегією адаптації на фізіологічному рівні вважається розширення синтезу вторинних метаболітів [4, 5, 6], логічно припустити, що кожному рівню адаптованості відповідає певний склад речовин, який забезпечує виживання конкретного адаптованого організму. У випадку рослин існує можливість ізолювати комплекс цих речовин у вигляді екстрактів, для яких в літературі і нами в попередніх роботах [7, 8, 9] показана наявність цілого ряду біологічних активностей. Не виключено, що присутня в екстрактах сукупність метаболітів здатна забезпечити виживання не тільки своїх продуцентів, але й інших тест-об'єктів, наприклад, мікроорганізмів в несприятливих для них умовах існування. В той же час роботи по дослідженню впливу саме рослинних екстрактів на виживання будь-якого тест-об'єкту ніким не проводились. Під час проведення патентно-інформаційних досліджень авторами не виявлені способи тестування рівня адаптованості рослин до умов зростання за допомогою відповідних рослинних екстрактів та виживання бактеріальних культур в їх присутності. В основу пропонованої корисної моделі поставлена задача, що полягає у розробленні такого способу тестування рівня адаптованості рослин до умов зростання за допомогою рослинних екстрактів та бактеріального штаму Е.соlі АВ 259 Hfr 3000 (E.coli 3000), за допомогою якого можливо виявити зв'язок, між виживанням бактерій в присутності рослинних екстрактів та рівнем адаптованості рослин, що слугували вихідною сировиною для отримання цих екстрактів як показника адаптивних відмінностей не тільки між різними видами або географічно віддаленими представниками одного і того ж виду, але й між незначно віддаленими зразками одного виду. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб тестування рівня адаптованості рослин до умов зростання за допомогою рослинних екстрактів та бактеріального штаму Е.соlі АВ 259 Hfr 3000 (Е.соlі 3000), згідно з корисною моделлю, бактеріальну культуру вирощують на твердому живильному середовищі, знімають з середовища бактеріологічною петлею, ресуспендують у фізіологічному розчині NaCl, розносять по пробірках, додають до кожної пробірки крім контролю 1 %-2 % екстракту у водній формі, а в контрольну пробірку вносять такий же об'єм фізіологічного розчину NaCl, культури витримують кілька діб при 37 °C без аерації і з інтервалами 1-3 доби висівають на тверде живильне середовище в різних розведеннях для одержання ізольованих колоній, обчислюють титр культури в кожній точці, знаходять його найвищий показник і починаючи з цієї точки відслідковують швидкість наступного зниження титру, яке виражають у відсотках до найвищого титру і порівнюють здатність окремих екстрактів 1 UA 99239 U 5 10 15 20 25 30 35 забезпечувати функції початкової стимуляції росту і кінцевого виживання бактеріальної культури, яке пропорціональне рівню адаптованості рослини - джерела відповідного екстракту. Суть запропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де на: - Фіг. 1 схематично показано максимальне виживання бактеріальної культури Е.соlі 3000 на 13-у добу інкубації в присутності 1 % екстрактів D.coespitosa та D.antarctica різного походження: І-D.coespitosa, Київ, Вишгород, II-D.coespitosa, Польща, Бжезина; III-D.antarctica, 1-й зразок; IVD.antarctica, 2-й зразок. - Фіг. 2 схематично показано виживання бактеріальної культури Е.соlі 3000 на 14-у добу інкубації в присутності 2 % екстрактів D.antarctica: 1-1-а морена, 2-1-а перехідна зона, 3-2-а морена, 4-2-а перехідна зона. Запропонована корисна модель вирішує задачу тестування рівня адаптованості рослин до умов зростання на підставі виживання бактеріальної культури Е.соlі АВ 259 Hfr 3000 в присутності рослинних екстрактів, виділених з відповідних тестованих рослин. Для запропонованого способу тестування рівня адаптованості рослин до умов зростання використовували 45 % етанольні екстракти, отримані як настоянки (кінцеве співвідношення спирт/суха тканина становило 10:1). Екстракти деалкоголізували (випаровували за допомогою вакуумно-ротаційного випаровувача при 40 °C майже до сухого залишку) і розчиняли у стерильній дистильованій воді до вихідного об'єму екстракту. Приклад 1. Д Досліджували стимуляцію росту та виживання Е.соlі в присутності 1 % екстрактів D.coespitosa (Київ, Вишгородський полігон та Бжезина, Польща) і D.antarctica (острів Короля Георга, Антарктида, 2 зразки), як представників двох окремих видів роду Deschampsia, що зростають в різко відмінних кліматичних умовах. Бактеріальну культуру вирощували на твердому живильному середовищі, знімали з середовища бактеріологічною петлею, ресуспендували у фізіологічному розчині NaCl, розносили по пробірках, додавали до кожної пробірки крім контролю по 1 % екстрактів D.coespitosa (Київ, Вишгородський полігон та Бжезина, Польща) і D.antarctica (острів Короля Георга, Антарктида, 2 зразки) у водній формі, а в контрольну пробірку вносили такий же об'єм фізіологічного розчину NaCl, культури витримували кілька діб при 37 °C без аерації і з інтервалами 1-3 доби висівали на тверде живильне середовище в різних розведеннях для одержання ізольованих колоній, обчислювали титр культури в кожній точці, знаходили його найвищий показник і починаючи з цієї точки відслідковували швидкість наступного зниження титру (рівень виживання культури), яке виражали у відсотках до найвищого показника титру і порівнювали здатність окремих екстрактів забезпечувати функції стимуляції росту і виживання бактеріальної культури, яке пропорціональне рівню адаптованості рослини - джерела відповідного екстракту. В усіх дослідах за ріст-стимулюючу активність приймали перевищення титру Е.соlі 3000 в присутності екстракту відносно її вихідного титру, а виживання бактеріальної культури оцінювали по сповільненню падіння її титру в присутності екстрактів порівняно з найвищим показником рістстимулюючої активності відповідного екстракту. Результати досліду показані в таблиці 1. 40 2 UA 99239 U Таблиця 1 Стимуляція росту та виживання бактеріальної культури Е.соlі 3000 в присутності 1 % екстрактів D.coespitosa та D.antarctica різного походження Стимуляція росту Е.соli 3000, % по відношенню до вихідного титру Походження № рослинного п/п матеріалу Виживання Е.соlі 3000, % по відношенню до найвищого показника стимуляції росту - 3 доба Доба 3 8 10 13 1 D.coespitosa, І Київ, Вишгород D.coespitosa, II Польща, Бжезина D.antarctica, Антарктида, III о. Короля Георга, 1-й зразок D.antarctica, Антарктида, IV о. Короля Георга, 2-й зразок 5 10 15 20 25 30 3 Доба 8 10 13 7000± 198,30 10000± 499,38 4000± 317,22 2300± 75,83 325± 28,5 100± 5,0 40± 3,17 23± 2,4 3,25± 0,29 12500± 287,23 25000± 791,36 350± 29,58 340± 8,75 20,5± 2,28 100± 3,2 1,40± 0,12 1,36± 0,04 0,08± 0,01 12000± 244,95 23500± 766,08 9000± 473,68 7000± 414,64 1450± 60,21 100± 3,2 38,3± 29,78± 2,02 1,76 6,17± 0,26 8750± 209,16 16000± 636,95 6000± 499,98 3500± 369,14 3350± 91,51 100± 4,0 37,5± 31,25± 20,94± 2,4 2,1 0,57 Як можна бачити з даних, наведених в таблиці 1, для всіх 4-х зразків найвищий показник стимуляції росту припадає на 3-ю добу, після чого титр бактеріальної культури знижується з різною швидкістю для кожного з екстрактів. Для оцінки виживання кожен з цих найвищих показників приймали за 100 % (як відправну точку для підрахунку подальшого виживання на 8-у, 10-у та 13-у добу). Відсоток, отриманий для 13-ї доби, розцінювали як остаточний показник виживання для кожного із зразків. Загалом обидва екстракти антарктичного походження забезпечували вище виживання Е.соlі 3000 порівняно з обома екстрактами Deschampsia, зібраної в помірних зонах (Фіг. 1), що свідчить про набуття вищого рівня адаптованості рослин, які зростають в умовах підвищеного селективного тиску (Антарктида) порівняно з рослинами помірної зони. Показники виживання бактеріальної культури в присутності всіх 4-х екстрактів достовірно відрізняються один від одного, тобто всі 4 зразки Deschampsia мають свій індивідуальний рівень адаптованості. Отриманий результат свідчить про наявність адаптивних відмінностей між різними видами (D. antarctica та D. coespitosa), між географічно віддаленими популяціями одного і того ж виду (D. coespitosa, Київ, Вишгород та D.coespitosa, Бжезина, Польща), а також між близько розташованими популяціями одного і того ж виду (D.antarctica, 1-й та 2-й зразок). Приклад 2. Досліджували виживання Е.соlі 3000 в присутності рослинних екстрактів для оцінки придатності методу визначення рівня адаптованості представників одного виду, розташованих не тільки в географічній близькості, але і в певному порядку, що дозволяє передбачити відповідний градієнт адаптованості. З цією метою досліди були виконані з використанням екстрактів 4-х зразків D.antarctica (о. Короля Георга), зібраних з різних ділянок (морен і перехідних зон), утворених в результаті відступу льодовика і колонізації рослинністю звільненої суші. Бактеріальну культуру вирощували на твердому живильному середовищі, знімали з середовища бактеріологічною петлею, ресуспендували у фізіологічному розчині NaCl, розносили по пробірках, додавали до кожної пробірки крім контролю по 2 % 4-х зразків екстрактів D.antarctica (о. Короля Георга), зібраних з 2-х морен і 2-х перехідних зон, у водній формі, а в контрольну пробірку вносили такий же об'єм фізіологічного розчину NaCl, культури витримували кілька діб при 37 °C без аерації і з інтервалами 1-3 доби висівали на тверде живильне середовище в різних розведеннях для одержання ізольованих колоній, обчислювали титр культури в кожній точці, знаходили його найвищий показник і починаючи з цієї точки 3 UA 99239 U 5 відслідковували швидкість наступного зниження титру (рівень виживання культури), який виражали у відсотках до найвищого показника титру і порівнювали здатність окремих екстрактів забезпечувати функції стимуляції росту і виживання бактеріальної культури, яке пропорціональне рівню адаптованості рослини - джерела відповідного екстракту. В таблиці 2 представлені дані стосовно стимуляції росту Е.соlі 3000 екстрактами D.antarctica (2 %) відносно вихідного титру бактеріальної культури для 2-х морен і 2-х перехідних зон на 3-ю, 7-у та 14-у добу експозиції і виживання культури на 7-у та 14-у добу (кінцевий показник відносно 3-ї доби). Таблиця 2 Стимуляція росту та виживання бактеріальної культури Е.соlі 3000 в присутності 2 % екстрактів D.antarctica (о. Короля Георга) Поход-ження № рослинп/п ного матеріалу І II III IV 1-а морена 1-а перехідна зона 2-а морена 2-а перехідна зона Виживання бактеріальної культури Е.соlі 3000, % відносно 3-ї доби Доба Доба 3 7 14 3 7 14 54800±1480,54 39600±1258,56 20320±901,55 100±2,75 72,26±2,30 37,08±1,65 Стимуляція росту, % відносно вихідного титру, Е.соlі 3000 52600±1450,51 35200±1186,50 18800±867,18 100±2,75 66,92±2,21 35,74±1,65 49000±1399,00 36600±1209,96 15000±774,60 100±2,86 74,69±2,47 30,61±1,58 43440±1318,18 21400±924,34 12800±715,54 100±3,03 49,36±2,13 29,47±1,65 10 15 20 25 30 35 40 Судячи з даних, наведених в таблиці 2, спостерігається зниження стимуляції росту від 1-ї морени до 2-ї перехідної зони на 3-ю, 7-у та 14-у добу, а також зниження цього ж показника від 3-ї до 14-ї доби для кожної зони. Цьому процесу відповідає зниження рівня виживання бактеріальної культури в присутності відповідних екстрактів на 7-у та 14-у добу (остаточний показник) також для кожної зони в порядку їх розташування, визначеного відступом льодовика і поступовою колонізацією звільненої суші. При цьому на 14-у добу відмінності для показників виживання між 1-ю мореною та 2-ю мореною і 2-ю перехідною зоною носять статистично достовірний, а між 1-ю мореною і 1-ю перехідною зоною, 1-ю перехідною зоною і 2-ю мореною, 2-ю мореною і 2-ю перехідною зоною - статистично недостовірний характер. З одного боку це дозволяє виділити 2 групи, перша з яких представлена 1-ю мореною і 1-ю перехідною зоною, а друга - 2-ю мореною і 2-ю перехідною зоною. З іншого боку слід відзначити плавний перехід виживання бактеріальної культури в присутності екстрактів, джерелами для яких були рослини від 1-ї морени до 2-ї перехідної зони, що свідчить про достатньо високу чутливість пропонованого методу визначення порівняльної адаптованості рослин в залежності від умов зростання та тривалості колонізації певної території. Таким чином, пропонований спосіб може бути придатним для тестування рівня адаптованості представників різних видів (D.antarctica та D.coespitosa), географічно віддалених представників одного і того ж виду (D.coespitosa, Київ, Україна та D.coespitosa, Бжезина, Польща), а також географічно близьких представників одного і того ж виду (D.antarctica, о. Короля Георга, табл. 1 і 2), відображаючи при цьому градієнт адаптованості популяцій в залежності від тривалості колонізації ними суші, звільненої від льодовика. Джерела інформації: 1. Leimu R., Fischer M. A meta-analysis of local adaptation in plants // PLoS ONE. - 2008. - vol.3. N12. - e4D10. doi: 101371/journal, pone. 0004010. 2. Zhao P., Liu F., Ma M. et al. Overexpression of AtLEA3-3 confers resistance to cold stress in Escherichia coli and provides enhanced osmotic stress tolerance and ABA sensitivity in Arabidopsis thaliana // Мол. биол. - 2011. - T.45, N5. - С. 851-862. 3. Yan Q-h., Yang Z., Wang Q. et al. Cloning and expression of a novel antifreeze protein AFP72 from the beetle Tenebrio molitor // Мол. биол. - 2012. - Т. 46, N4. - С. 576-583. 4. Weng J.-K., Noel J.P. The remarkable pliability and promiscuity of specialized metabolism // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. - 2012. doi: 10.1101/sqb.2012.77.014787. 5. Weng J.-K., Philippe R.N., Noel J.P. The rise of chemodiversity in plants // Science. - 2012. vol. 336. - P. 1657-1670. 4 UA 99239 U 5 10 6. Kliebenstein D.J. Making new molecules-evolution of structures for novel metabolites in plants // Current Opinion in Plant Biology. - 2012. - vol. 16. - P. 1-6. 7. Перерва Т.П., Дворник А.С., Мирюта А.Ю., Можилевская Л.П., Кунах В.А. Бактериальная тест-система для первичного скрининга веществ с потенциальной противоопухолевой активностью. // Цитология и генетика. - 2007. - Т.41, N4. - С. 59-65. 8. Перерва Т.П. Мирюта А.Ю., Можилевская Л.П. Бактериальная тест-система для первичного скрининга препаратов на антиканцерогенную и антимутагенную активность // Вісник Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. - 2007. - Т.5, N1-2. - С. 55-61. 9. Перерва Т.П., Мирюта А.Ю., Дворник А.С, Можилевская Л.П., Кунах В.А. Оптимизация бактериальных питательных сред экстрактом Ungernia victoris // Біотехнологія. - 2011. - Т4, N4. С. 59-63. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 Спосіб тестування рівня адаптованості рослин до умов зростання за допомогою рослинних екстрактів та бактеріального штаму Е.соlі АВ 259 Hfr 3000 (E.coli 3000), який відрізняється тим, що бактеріальну культуру вирощують на твердому живильному середовищі, знімають з середовища бактеріологічною петлею, ресуспендують у фізіологічному розчині NaCl, розносять по пробірках, додають до кожної пробірки крім контролю 1 %-2 % екстракту у водній формі, а в контрольну пробірку вносять такий же об'єм фізіологічного розчину NaCl, культури витримують кілька діб при 37 °C без аерації і з інтервалами 1-3 доби висівають на тверде живильне середовище в різних розведеннях для одержання ізольованих колоній, обчислюють титр культури в кожній точці, знаходять його найвищий показник і починаючи з цієї точки відслідковують швидкість наступного зниження титру, яке виражають у відсотках до найвищого титру і порівнюють здатність окремих екстрактів забезпечувати функції початкової стимуляції росту і кінцевого виживання бактеріальної культури, яке пропорціональне рівню адаптованості рослини - джерела відповідного екстракту. 5 UA 99239 U Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6