Композиція інгредієнтів для культивування бактерій роду bifidobacterium

Реферат: UA 107738 U UA 107738 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до біотехнологій, харчової та медичної промисловості, може бути використана у виробництві біологічно активних домішок, препаратів і продуктів харчування пробіотичної дії, призначених для корекції мікробіоти шлунково-кишкового тракту. В останній час для корекції дисбактеріозу шлунково-кишкового тракту людини використовують препарати і продукти, які містять мікроорганізми-пробіотики або їх метаболіти. В першу чергу це біфідобактерії та продукти їх життєздатності. Біфідобактерії беруть активну участь у травленні і всмоктуванні. Вони сприяють процесам ферментативного перетравлення їжі, тому що підсилюють гідроліз білків, зброджують вуглеводи, обмилюють жири, розчиняють клітковину, стимулюють перистальтику кишечнику, сприяють нормальній евакуації кишкового вмісту. Антагоністична активність біфідобактерій пов'язана з продукцією органічних кислот і бактеріоцинів з широким спектром антимікробної дії, а також зі здатністю блокувати рецептори на слизовій кишечнику, запобігаючи фіксації на них потенційно небезпечних мікроорганізмів. У зв'язку з цим, підбір дешевого поживного середовища, яке відповідає фізіологічним потребам мікроорганізмів, є однією з основних задач у виробництві бактеріальних препаратів, що нормалізують мікробіоту, тому для приготування поживного середовища, для культивування біфідобактерій, було запропоноване середовище з додаванням стимулятора росту рослинного походження, а саме з додаванням соєвої сироватки. У літературі описана значна кількість виробничих поживних середовищ для культивування і виділення біфідобактерій. Вуглеводна частина поживних середовищ представлена переважно лактозою. До їх складу також входять як амінне харчування пептони і відвари рослинного і тваринного походження. Відоме поживне середовище для культивування біфідобактерій, що містить органічну, мінеральну основу та стимулятори росту (Патент RU 2080376, МПК C12N1/20, опубл. 1995), при наступному спів відношенні компонентів, мас. %: залізо сірчанокисле 0,002-0,1 натрій хлористий 4,0-6,0 глюкоза 8,0-12,0 агар-агар 0,75-1,0 аскорбінова кислота 0,8-1,0 гідролізат молозивної решта. казеїново-сироваткової маси Недоліком даного середовища є те, що воно має слабкі ростові властивості, тому що вміст амінного азоту у такому середовищі доволі низький - 70-110 мг. А також через те, що основа поживного середовища - гідролізат молозивної казеїново-сироваткової маси - є важко доступним, тому його використання у промисловому масштабі є неперспективним для культивування біфідобактерій. У випадках технологічного виробництва використовують кукурудзяно-лактозне середовище, оскільки речовини рослинного походження, будучи природними акумуляторами біологічно активних речовин, у тому числі вітамінів, ферментів, амінокислот, мікро- і макроелементів, в поєднанні з традиційними пробіотичними штамами, надають більший лікувальний ефект. Крім цього рослинна сировина є менш дорогою, ніж сировина тваринного походження. Як найближчий аналог вибрано кукурудзяно-лактозне середовище на основі кукурудзяного екстракту (Методические указания МУК 4.2.577-96. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов: Методические указания. - М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. - 95 с.), при наступному співвідношенні компонентів, мас. %: кукурудзяний екстракт 4,0 лактоза 1,0 пептон 1,0 аскорбінова кислота 0,05 натрій лимоннокислий 0,6 тризаміщений калій фосфорнокислий 0,2 двозаміщений магній сірчанокислий 0,12 агар-агар 0,25 вода дистильована решта до 100. Найближчий аналог і композиція інгредієнтів, що заявляється, мають наступні спільні компоненти: лактозу, пептон, аскорбінову кислоту, натрій лимоннокислий тризаміщений, калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, агар-агар і дистильовану воду. 1 UA 107738 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Наявність у складі середовища нестандартного компонента - кукурудзяного екстракту, забезпечує нестандартність самого середовища, що призводить до короткочасного терміну зберігання кінцевого продукту, а так само супроводжується незадовільними органолептичними властивостями біологічно активних домішок і заквасок. В основу корисної моделі поставлено задачу створити композицію інгредієнтів для культивування бактерій роду Bifidobacterium, і ця задача вирішується шляхом додаванням доступної, екологічно чистої, рослинної сировини, при збільшенні строку зберігання середовища з більш високимититрами біомаси бактерій в процесі зберігання. Поставлена задача вирішена композицією інгредієнтів для культивування бактерій роду Bifidobacterium, що містить стимулятор росту, лактозу, пептон, аскорбінову кислоту, натрій лимоннокислий тризаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, агар-агар і воду дистильовану. Як стимулятор росту композиція містить соєву сироватку, при наступному співвідношенні компонентів, мас. %: соєва сироватка 3-5 лактоза 0,1 пептон 0,1 аскорбінова кислота 0,05 натрій лимоннокислий 0,6 тризаміщений калій фосфорнокислий 0,2 двоозаміщений магній сірчанокислий 0,12 агар-агар 0,25 вода дистильована решта. Після вивчення хімічного складу було встановлено, що найбільш повноцінними і придатними для включення у композицію інгредієнтів для культивування бактерій роду Bifidobacterium є зернобобові культури та продукти їх переробки. Вони містять високоякісний білок і, крім того, є джерелом поліненасичених жирних кислот, вітамінів, макро- і мікроелементів, не містять холестерину і твердих жирів. Крім цього, соя та продукти її переробки є джерелами харчових волокон та ізофлавінів, тому вони самі по собі стимулюють ріст нормальної мікробіоти шлунково-кишкового тракту. Використання запропонованої композиції дозволяє за 16-24 години культивування при 37 °C 9 3 11 отримати біомасу біфідобактерій з вмістом життєздатних клітин від 610 КУО/см до 510 3 КУО/см . Заявлена корисна модель ілюструється фігурами, де: фіг. 1 - динаміка росту B.bifidum на лактозному середовищі з додаванням різної масової частки соєвої сироватки; фіг. 2 - динаміка росту В. longum на лактозному середовищі з додаванням різної масової частки соєвої сироватки; фіг. 3 - динаміка росту В. adolescentis на лактозному середовищі з додаванням різної масової частки соєвої сироватки; фіг. 4 - технологічна схема отримання соєвої сироватки. Було приготовано поживне середовище на основі лактози і соєвої сироватки. Приготування соєвої сироватки для додавання в експериментальні зразки поживного середовища включало в себе наступні етапи - замочування насіння сої (t=50 °C, τ=1 год.) та лущення. На першому етапі при замочуванні насіння сої виникає неприємний бобовий запах, який необхідно усунути при отриманні готової сировини. Проведений аналіз показав, що основну частину ароматичних речовин складають спирти: ізобутанол, ізопентанол, гексазанол, деканол, гептанол і летючі жирні кислоти: оцтова, мурашина, ізомасляна, ізовалер'янова [Ковалев Η.И., Куткина Μ.Η., Кравцова В.А. Технология приготовления пищи: учебник для средних специальных учебных заведений / Под ред. доктора технических наук, проф. Николаевой М. А. – М.: Издательский Дом "Деловая литература", 2008. - 480 с.] Під час обробки сої протягом 5 хвилин при температурі 120 °C в 0,5 % -му розчині Nа2СО3 при гідромодулі 1:6 виникає активація ліпоксигеназного комплексу ферментів сої. При цьому збільшувалась концентрація спиртів: ізобутанолу - в 5 разів, ізопентанолу - в 2,5 рази, гексанол в 2 рази. Під час бланшування відбувалась інактивація ферментів, у тому числі ліпоксигеназного комплексу та часткове видалення легколетючих продуктів розкладання. Масові частки бутанолу, ізопентану і гексанолу зменшувались в 2,5 рази. Після видалення розчину Nа2СО3, провівши дезінтеграцію, здійснювали водну екстракцію при температурі 100 °C і гідромодулі 1:5 протягом 10 хвилин. Після фільтрації пастеризували при температурі 90 °C 2 UA 107738 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 протягом 15 хвилин. Перед початком сквашування соєвий екстракт (соєве молоко) охолоджували до 37 °C. Осадження білків проводили шляхом внесення заквасочної культури при температурі 37 °C протягом 6 годин або за допомогою внесення 30 мас. % розчину лимонної кислоти до рН=4,5 при температурі 90 °C протягом 15 хвилин. На останньому етапі після фільтрації соєвої сироватки нейтралізували її розчином 30 мас. % NaOH, доводячи значення активної кислотності до 6,8-7,0 од. рН (фіг. 4). У невеликій кількості дистильованої води розплавляли агар-агар в кількості 0,25 мас. % на 3 1,0 дм . До решти дистильованої води додавали 0,1 мас. % пептону, 3-5 мас. % соєвої сироватки, 0,6 мас. % натрію лимоннокислого тризаміщеного, 0,2 мас. % калію фосфорнокислого двозаміщеного, 0,12 мас. % магнію сірчанокислого. Суміш нагрівали до температури (80±1)°С, після чого з'єднуючи з розплавленим агаром, додавали 0,1 мас. % лактози і 0,05 мас. % аскорбінової кислоти. У суміш доливали дистильовану воду, доводячи об'єм до 100 мас. %. Встановлювали активну кислотність середовища (7±0,1) од. рН за допомогою 30 %-го розчину NaOH. Середовище розливали в пробірки високим стовпчиком по 10,0 мл і автоклавували при 0,5 атм при температурі (120±1)°С протягом 30 хвилин. Ростові властивості приготованої композиції інгредієнтів перевіряли, використовуючи музейні культури біфідобактерій ОНАХТ Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, які є класичними пробіотичними культурами. Культури біфідобактерій - В. bifidum, В. longum, В. adolescentis - засівали у рідке поживне середовище із різноманітною масовою часткою соєвої сироватки у співвідношенні посівний матеріал і поживне середовище 1:10, для вивчення накопичення біомаси бактерій. Посіви витримували в термостаті при (37±1)°С протягом 48 годин. Динаміку зростання біфідобактерій на пропонованому середовищі порівнювали з динамікою приросту біомаси бактерій на еталонному кукурудзяно-лактозному середовищі. Збільшення вмісту масової частки соєвої сироватки у композиції інгредієнтів для культивування бактерій роду Bifidobacterium стимулювало процес накопичення біомаси мікроорганізмів, які досліджували (фіг. 1-3). В кінці культивування кількість клітин В. bifidum, В. longum, В. adolescentis на запропонованій композиції інгредієнтів з масовою часткою соєвої сироватки 3 мас. % максимально наближалось до значень контролю, в той час, як при використанні композиції інгредієнтів для культивування бактерій роду Bifidobacterium з додавання соєвої сироватки у кількості 1 мас. % і 2 мас. % кількість клітин біфідобактерій була значно нижча, ніж у контролі. З підвищенням кількості соєвої сироватки від 4 мас. % до 5 мас. % кількість клітин бібідобактерій зростала. При подальшому додаванні соєвої сироватки у кількості 6 мас. % спостерігали збільшення приросту біомаси всіх культур роду Bifidobacterium в порівнянні із показниками у композиції інгредієнтів, яка містила 5 мас. % соєвої сироватки. На середовищі з додаванням 6 мас. % соєвої сироватки відбувався активний приріст біомаси бактерій і накопичення продуктів метаболізму, тому ростові фактори середовища виснажувалися, що спричинило внутрішньовидову конкуренцію за споживання поживних речовин. Це і стало причиною зниження кількості клітин після 24 години культивування. Максимальний позитивний ефект на організм людини виявляють препарати і 8 продукти харчування, що містять живі біфідобактерії у кількості від 10 КУО/см і більше. Саме кількісний вміст життєздатних біфідобактерій є основним показником якості препаратів і продуктів харчування пробіотичного призначення (Пребиотики: химия, технология, применение. / Л.В. Капрельянц. - Киев: ЭнтерПринт, 2015. – 252 с.) При використанні композиції інгредієнтів для культивування бактерій роду Bifidobacterium з додавання соєвої сироватки у кількості 3 мас. % показник приросту біомаси бактерій мав необхідне значення для використання в харчовій промисловості і максимально наближався до контролю, тому запропоновано саме таку кількість соєвої сироватки для отримання мікробної біомаси для виробництва продуктів харчування пробіотичної дії. Композиція інгредієнтів з додаванням 4-5 мас. % соєвої сироватки мала більш високі показники приросту біомаси біфідобактерій, що дозволяє рекомендувати цю композицію для виробництва біологічноактивних концентратів, призначених для корекції мікробіоти шлунково-кишкового тракту людини. Проведено мікробіологічне дослідження впливу заявленої композиції інгредієнтів для культивування бактерій роду Bifidobacterium на морфологічні та культуральні властивості пробіотичних бактерій, що досліджувались. Виявлено, що при культивуванні біфідобактерій на запропонованій композиції морфологічні та культуральні властивості біфідобактерій всіх культур відповідали видам Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis. В мазках культивованих мікроорганізмів, що виросли на запропонованій композиції інгредієнтів, всі культури біфідобактерій мали типову морфологію паличок з біфуркацією чи 3 UA 107738 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 потовщенням з одного з кінців, при фарбуванні за методом Грама - фарбувалися як грампозитивні, розташовувалися у вигляді пучків, а також у вигляді окремих особин. Приклад 1 У невеликій кількості дистильованої води розплавляли агар-агар в кількості 0,25 мас. % на 3 1,0 дм . До решти дистильованої води додавали 0,1 мас. % пептону, 3 мас. % соєвої сироватки, 0,6 мас. % натрію лимоннокислого тризаміщеного, 0,2 мас. % калію фосфорнокислого двозаміщеного, 0,12 мас. % магнію сірчанокислого. Суміш нагрівали до температури (80±1)°С, після чого, з'єднуючи з розплавленим агаром, додавали 0,1 мас. % лактози і 0,05 мас. % аскорбінової кислоти. У суміш доливали дистильовану воду, доводячи об'єм до 100 мас. %. Встановлювали активну кислотність середовища (7±0,1) од. рН за допомогою 30 %-го розчину NaOH. Середовище розливали в пробірки високим стовпчиком по 10,0 мл і автаклавували при 0,5 атм при температурі (120±1)°С протягом 30 хвилин. Приклад 2 У невеликій кількості дистильованої води розплавляли агар-агар в кількості 0,25 мас. % на 3 1,0 дм . До решти дистильованої води додавали 0,1 мас. % пептону, 4 мас. % соєвої сироватки, 0,6 мас. % натрію лимоннокислого тризаміщеного, 0,2 мас. % калію фосфорнокислого двозаміщеного, 0,12 мас. % магнію сірчанокислого. Суміш нагрівали до температури (80±1)°С, після чого, з'єднуючи з розплавленим агаром, додавали 0,1 мас. % лактози і 0,05 мас. % аскорбінової кислоти. У суміш доливали дистильовану воду, доводячи об'єм до 100 мас. %. Встановлювали активну кислотність середовища (7±0,1) од. рН за допомогою 30 %-го розчину NaOH. Середовище розливали в пробірки високим стовпчиком по 10,0 мл і автаклавували при 0,5 атм при температурі (120±1)°С протягом 30 хвилин. Приклад 3 У невеликій кількості дистильованої води розплавляли агар-агар в кількості 0,25 мас. % на 3 1,0 дм . До решти дистильованої води додавали 0,1 мас. % пептону, 5 мас. % соєвої сироватки, 0,6 мас. % натрію лимоннокислого тризаміщеного, 0,2 мас. % калію фосфорнокислого двозаміщеного, 0,12 мас. % магнію сірчанокислого. Суміш нагрівали до температури (80±1)°С, після чого, з'єднуючи з розплавленим агаром, додавали 0,1 мас. % лактози і 0,05 мас. % аскорбінової кислоти. У суміш доливали дистильовану воду, доводячи об'єм до 100 мас. %. Встановлювали активну кислотність середовища (7±0,1) од. рН за допомогою 30 %-го розчину NaOH. Середовище розливали в пробірки високим стовпчиком по 10,0 мл і автаклавували при 0,5 атм при температурі (120±1)°С протягом 30 хвилин. Приклад 4 У невеликій кількості дистильованої води розплавляли агар-агар в кількості 0,25 мас. % на 3 1,0 дм . До решти дистильованої води додавали 0,1 мас. % пептону, 1 мас. % соєвої сироватки, 0,6 мас. % натрію лимоннокислого тризаміщеного, 0,2 мас. % калію фосфорнокислого двозаміщеного, 0,12 мас. % магнію сірчанокислого. Суміш нагрівали до температури (80±1)°С, після чого, з'єднуючи з розплавленим агаром, додавали 0,1 мас. % лактози і 0,05 мас. % аскорбінової кислоти. У суміш доливали дистильовану, воду доводячи об'єм до 100 мас. %. Встановлювали активну кислотність середовища (7±0,1) од. рН за допомогою 30 %-го розчину NaOH. Середовище розливали в пробірки високим стовпчиком по 10,0 мл і автаклавували при 0,5 атм при температурі (120±1)°С протягом 30 хвилин. Приклад 5 У невеликій кількості дистильованої води розплавляли агар-агар в кількості 0,25 мас. % на 3 1,0 дм . До решти дистильованої води додавали 0,1 мас. % пептону, 2 мас. % соєвої сироватки, 0,6 мас. % натрію лимоннокислого тризаміщеного, 0,2 мас. % калію фосфорнокислого двозаміщеного, 0,12 мас. % магнію сірчанокислого. Суміш нагрівали до температури (80±1)°С, після чого, з'єднуючи з розплавленим агаром, додавали 0,1 мас. % лактози і 0,05 мас. % аскорбінової кислоти. У суміш доливали дистильовану воду, доводячи об'єм до 100 мас. %. Встановлювали активну кислотність середовища (7±0,1) од. рН за допомогою 30 %-го розчину NaOH. Середовище розливали в пробірки високим стовпчиком по 10,0 мл і автаклавували при 0,5 атм при температурі (120±1)°С протягом 30 хвилин. Приклад 6 У невеликій кількості дистильованої води розплавляли агар-агар в кількості 0,25 мас. % на 3 1,0 дм . До решти дистильованої води додавали 0,1 мас. % пептону, 6 мас. % соєвої сироватки, 0,6 мас. % натрію лимоннокислого тризаміщеного, 0,2 мас. % калію фосфорнокислого двозаміщеного, 0,12 мас. % магнію сірчанокислого. Суміш нагрівали до температури (80±1)°С, після чого, з'єднуючи з розплавленим агаром, додавали 0,1, мас. % лактози і 0,05 мас. % аскорбінової кислоти. У суміш доливали дистильовану воду, доводячи об'єм до 100 мас. %. Встановлювали активну кислотність середовища (7±0,1) од. рН за допомогою 30 %-го розчину 4 UA 107738 U NaOH. Середовище розливали в пробірки високим стовпчиком по 10,0 мл і автаклавували при 0,5 атм при температурі (120±1)°С протягом 30 хвилин. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Композиція інгредієнтів для культивування бактерій роду Bifidobacterium, що містить лактозу, пептон, аскорбінову кислоту, натрій лимоннокислий тризаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, агар-агар, дистильовану воду, стимулятор росту, яка відрізняється тим, що як стимулятор росту вона містить соєву сироватку, при наступному співвідношенні компонентів, мас. %: соєва сироватка 3-5 лактоза 0,1 пептон 0,1 аскорбінова кислота 0,05 натрій лимоннокислий 0,6 тризаміщений калій фосфорнокислий 0,2 двозаміщений магній сірчанокислий 0,12 агар-агар 0,25 вода дистильована решта. 5 UA 107738 U 6 UA 107738 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7