Штам молочнокислих бактерій bifidobacterium breve, штам молочнокислих бактерій bifidobacterium infantis, штам молочнокислих бактерій bifidobacterium longum для покращення кишкової флори, спосіб покращення кишкової флори

1 Штам молочнокислих бактерій Bifidobactenum breve CNCMI-1226 для покращення кишкової флори 2 Штам молочнокислих бактерій Bifidobactenum mfantis CNCMI-1227 для покращення кишкової флори 3 Штам молочнокислих бактерій Bifidobactenum longum CNCMI-1228 для покращення кишкової флори 4 Спосіб покращення кишкової флори, який передбачає введення молочнокислих бактерій, що вибрані за їх здатність колонізувати кишечник, за здатність конкурентного вилучення патогенних бактерій і за здатність до імуномодуляцм, який відрізняється тим, що як штам молочнокислих бактерій використовують штам біфідобактерій, вибраний з групи, яка складається з Bifidobactenum breve CNCMI-1226, Bifidobactenum infants CNCMI1227 та Bifidobactenum longum CNCMI-1228, за їх здатність прилипати до клітин кишечнику О Цей винахід належить до біологічно чистих культур штамів молочнокислих бактерій, які забезпечують покращення кишкової флори шляхом змагального виключення хвороботворних бактерій, а також до способу, який їх використовує Документ ЕР 199535 (Горбах і Гольдин) пропонує штам бактерій, ідентифікований в першій інстанці як Lactobacillus (L) acidophilus, але потім, як більш схожий на L casei підвид ramnosus (див М Silva та ш в журналі "Антимикробные агенты и хемотерапия", 31, № 8, 1231-1233, 1987), який демонструє добру адгезію до клггин слизової оболонки мукусу тонких кишок та який підходить для терапевтичного застосування Цей штам, названий "штам СС" та депонований в АТСС (American Type Culture Collection) під номером 53 103, може використовуватись в комбінації з фармацевтично прийнятним носієм, особливо в харчових продуктах, перш за все в кисломолочних продуктах типу йогурта Інші штами того жтипу давно вже використовувались в аналогічних продуктах та з аналогічною метою Однак, існує потреба в особливо ефектив ю них штамах цього типу, які можна було б легко ідентифікувати, та які мали б безперечну перевагу і збагатили б вибір штамів, що є Завдання винаходу полягає в тому, щоб задовольнити вказану потребу Для цього винахід пропонує біологічно чисті культури штамів молочнокислих бактерій, що вибрані за їх здатність проникати в кишкову флору, за їх адгезію (здатність приставати) до кишкових клггин, за їх здатність до змагального витіснення хвороботворних бактерій з кишкових клітин та за здатність до імуномодуляцш та/або зниження фекальної ензимної активності Ці штами особливо придатні для призначення людям та тваринам для терапевтичного і профілактичного лікування розладу шлунково-кишкового тракту, а саме як засобу проти діареї Ці штами можуть призначатись в формі біологічно чистих культур, наприклад, як таких або після їх заморожування або висушування при низькій температурі Такі культури можуть містити, наприклад 10—10° cfu живих мікробів (cfu - одиниця, названа за першими буквами англійського виразу о 42092 "colony fornmg units" - колонієутворюючих одиниць на 1 грам рідкої або замороженої культури) та 10 9 10 10 cfu/r для висушеної заморожуванням культури Ці штами можуть також призначатися в формі композиції, яка містить культуру та істивний носій, конкретніше, фармацевтично прийнятний носій або харчовий продукт, такий, наприклад, як кисле молоко, або краще йогурт, або порошкова композиція на основі молока Таким чином, винахід пропонує культуру штамів кисломолочних бактерій, вибраних через їх здатність змагального витіснення хвороботворних бактерій, збудників діареї, з кишкових клітин та через здатність приставати до кишкових клітин Серед різних штамів вибраних таким чином бактерій, виділених, зокрема, з кисломолочних продуктів, особливо з комерційного йогурту, або з комерційних культур, призначених для приготування таких молочних продуктів, або, наприклад, з екскрементів немовлят, декілька було зареєстровано, згідно з Будапештським договором (ЗО 06 92), в Національній колекції культур мікроорганізмів (CNCM) Пастерівського інституту (28 Rue de Dr Roux, 75 724, Pans Cedex 15), Франція, де кожен з них одержав ВІДПОВІДНИЙ номер CNCM Зокрема, були зареєстровані штами Bifidobactenum breve (CNCMI-1226), Bifidibectenum mfantis (CNCMI-1227), Bifidobactenum longum (CNCMI-1228) Морфологія та загальні характеристики цих штамів наводяться нижче Цей винахід також стосується способу покращення кишкової флори, який передбачає введення до неї біфідобактерій Згідно з винаходом, використовувані в цьому способі біфідобактерм вибирають через їх здатність прилипати до клітин кишечнику, колонізувати кишечник, витісняти патогенні бактерії з клітин кишечнику, а також за здатність до імуномодуляцм Переважно, в способі за винаходом використовують указані штами, детально описані в цьому описі В breve CNCMI-1226, D mfantis CNCMI1227 та В longum CNCMI-1228 Морфологія - Грам-позитивні мікроорганізми, нерухомі, не утворюють спор - Короткі палички з закругленими кінцями та "V" і "Y''-подібними відгалуженнями Метаболізм - Анаеробні мікроорганізми з гетероферментативним метаболізмом, що викликає утворення молочної та оцтової кислоти - Інші характеристики каталаза (-), виділення СОг (-), гідроліз аргініну (-) Ферментація цукрів Профіль ферментації цукру цих видів дуже нестабільний і неповторний, лише невелика КІЛЬКІСТЬ цукрів завжди ферментується, зокрема, Dрибоза, лактоза та рафіноза Подробиці окремих властивостей, за якими ці штами були вибрані, наводяться нижче Адгезія (прилипання) до клггин кишечнику За винаходом вивчали адгезію (прилипання) різних штамів кисломолочних бактерій до клггин кишечнику, конкретно до епггеліальних клггин Сасо-2 людського кишечнику (див М Pinto та ін ВюІ Cell , 47, 323, 1983) та до клггин слизової оболонки кишечнику людини НТ29-МТХ (Lesuffleur та ш , журнал "Cancer Res", 50, 6334-6343) на одношаровій культурі in vitro Для цього клггини культивували в пластмасових пляшечках 25 см 2 фірми Корнінг для підтримання лінії клітин та на знежирених і стерилізованих скляних пластинках (22 х 22 мм), розміщених на шестичашкових піддонах (Корнінг) для випробування на прилипання Для культивування клггин Сасо-2 та НТ29МТХ, середовище, починаючи з другого дня після пересіву, приходилось замінювати кожен день Середовище готували з мінімально необхідного сухого середовища фірми Eagle, модифікованого Dulbecco (DMEM) Молочнокислі бактерії культивували в анаеробних умовах на середовищі MRS з заморожених культур Використовували бактерії з другої субкультури Змішане середовище для інкубації на клітинах готували змішуванням 50% середовища DMEM без антибіотика та 50% середовища MRS, в якому бакрерм вирощувались, це середовище містило 10 cfu молочнокислих бактерій або біфідобактерій (див Шовьер Г та ш , FEMC Microbiol Lett 91, 213-218, 1992) Для проведення випробування на прилипання, змішане середовище, що містить бактерії, поміщали на тканини клггин кишечнику та шкубували на протязі 1 години при доступі повітря Багаточашкові піддони промивали п'ять разів, кожен раз двадцятьма круговими помішуваннями, щоб вилучити бактерії, які не прилипали, промиванням Тканину клггин в вигляді смужок потім фіксували в послідовних ваннах з метанолоном, 10 хв при 70%, 10 хв при 95% та 15 хв при 100%, і забарвлювали по Граму або Гімзе Рівень прилипання визначали за підрахунком прилиплих бактерій під мікроскопом Серез численних перевірених на прилипання штамів, чотири штами, зареєстрованих для прикладу для цього винаходу, показали хороший рівень прилипання до клггин кишечнику, за даними цих випробувань на клггинах Сасо-2 Для порівняння використовували штам L Acidophilus CNCMI-1225, який прилипав до клггин Сасо-2 на рівні близько 150 + 23 бактерій на 100 клггин Сасо-2 Такий результат позначали п'ятьма хрестиками "+++++" Прилипання В breve CNCMI1226 склало ++++++, прилипання В mfantis CNCMI-1227 склало ++++, а прилипання В longum CNCMI-1228-++++ Несподівано було виявлено, що прилипання цих штамів до клггин кишечника пояснюється секретом, який вони виділяють в своєму середовищі культивування (наприклад, в MRS або молоці) Таким чином, коли процес інкубації на протязі 1 години на Сасо-2 був проведений на штамах В breve CNCMI-1226 або В Longum CNCMI-1228 без середовища їх культивування, то спостерігалось значне зменшення прилипання Окрім того, коли процес інкубації проводили на Сасо-2 з цими штамами та їх середовищем культивування, які попередньо піддавалися дії трипсину, то знову спостерігалось значне зменшення прилипання Це, мабуть, доказує те, що 42092 секретом, який виділяється цими штамами та який є фактором прилипання, є протеїн Змагальне вилучення патогенних бактерій За цим винаходом було досліджено різні штами молочнокислих бактерій на їх здатність змагального вилучення з кишкових клітин патогенних бактерій, особливо бактерій ВІДПОВІДНИХ за діарею Зокрема вивчали вилучення деяких сапрофітних штамів Е соїі з кишкового тракту людей та тварин, що можуть розмножитися і стати хвороботворними, а саме, ентеротоксиногенної Е соїі (ЕТЕС), ентеропристаючої Е coh (OAEC) та ентеропатогенної Е coh (EPEC), і виключення штаму Salmonella typhimunum Штами, що використовувались в цих дослідженнях такі - для ЕТЕС - штам Н10407, який виражає CFA/1 (Колекція професора Жолі, лабораторія мікробіологи, факультет медицини та фармакологи, університет Клермон-Ферана 1, 63003, Клермон-Феран, Франція), - для DAEC - штам С1845 (Колекція доктора наук С Білджа, кафедра мікробіологи, медичний інститут, Дж 3111 Будинок науки здоров'я, Вашінгтонський університет, Сіетл, Вашінгтон 98195, США), - для ЕРЕС - штамJPN 15 Р MAR7, який виражає EAF та еае (Колекція професора Дж Кейпера, Центр розроблення вакцин, Мерілендський університет, медичний факультет, 10 Саут Пайн Стріт, Балтімора, Меріленд 21201, США), - для Salmonella Typhi-monum штам SL 1344 (Докток Б Стокер, Стенфордський університет, медичний факультет, кафедра мікробологп та імунологи, Шерман Сейрчайльд Сайенс БІЛДІНГ, 0 333 Стенфорд, Каліфорнія 94305-5402, США) Штам (CNCM N). 1-1226 1-1226 Концентрація cfu/мл 10 9 8 ю 9 Прилипання бактерій до клггин Сасо-2 визначали таким чином Коротко, моношари клггин Сасо-2 ДВІЧІ промивали сольовим фосфатним буферним розчином (ФБР) Мічені ізотопом С14 Е coh або ізотопом S Salmonella диспергували в середовищі культури в КІЛЬКОСТІ 108 cfu/мл і по 2 мл суспензії додавали в кожну чашку, що мала скельце з культурою клітин Для Е coh всі інкубації проводили в присутності 1%-ноі D-манози Для визначення рівня (або "фактора") вилучення, тобто пропорцій патогенних бактерій, яким завадили прилипнути до клггин Сасо-2 молочнокислі бактерії, що зайняли їх місце, додавали 1 мл суспензії, яка містить 108 cfu/мл мічених патогенних бактерій та 1 мл суспензії, яка містить або 108 або 109 cfu/мл штаму молочнокислих бактерій, до кожної чашки, що має скляну пластинку, на яку нанесено культуру клггин Пластинки шкубували на протязі 1 години при 37°С в атмосфері з 10% СОг та 90% повітря Моношари клггин промивали 5 разів стерильним ФБР Бактерії, які прилипли, та кишкові клггини розчиняли в 0,2 Н розчині їдкого натру КІЛЬКІСТЬ мічених прилиплих бактерій оцінювали за підрахунком сцинтиляцій в рідині Серед різних штамів молочнокислих бактерій, що випробувані таким чином, за їх властивостями або за їх здатністю до змагального вилучення (витіснення) патогенних бактерій, штами вибрані і зареєстровані, як приклади для цього винаходу, дали прекрасні результати, які наведено в нижчеподаній таблиці, де показано у відсотках рівні вилучення, досягнуті штамами, випробуваними на їх здатність до пригнічення різних патогенних штамів, що використані в цьому випробуванні Загальний фактор вилучення в % відносно ЕТЕС DAEC ЕРЕС Сальмонелла 80 68 83 88 55 53 55 41 46 1-1227 ю 58 1-1227 ю8 18 1-1228 1-1228 9 ю 8 ю 47 47 11 Тираж 50 екз Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м Ужгород, вул Гагаріна, 101 (03122) 3 - 7 2 - 8 9 (03122) 2 - 5 7 - 0 3