Консорціум біфідобактерій bifidobacterium bifidum вкпм ас-1688, bifidobacterium longum вкпм ас-1689, bifidobacterium adolescentis вкпм ас-1690, bifidobacteruim infantis вкпм ас-1692, bifidobacterum breve вкпм

Винахід відноситься до біотехнології, харчової промисловості і може бути використаний для одержання консорціуму бі фідобактерій, у виробництві продуктів функціонального харчування і препаратів-пробіотиків, неферментованих продуктів, при готуванні косметичних і гігієнічних засобів. Препарати і біфідовміщюючі продукти широко використовують для лікування і профілактики дисбактеріозів різної етнології, нормалізації роботи шлунково-кишкового тракту людини і тварин, стресових впливів, тривалої антибіотико-хіміотерапії. Як відомо, у кишечнику дорослої людини з найбільшою частотою в біоценозі переважають види Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, а види Bifidobacterium infantis і Bifidobacterium breve - переважно в дітей грудного віку. Відомі консорціуми штамів біфідобактерій різних комбінацій, що використовують для приготування пробіотиків, продуктів лікувального харчування, кисломолочних продуктів, біологічно активних добавок і біфідовміщюючих ферментованих і неферментованих продуктів закордонних і вітчизняних фірмрозроблювачів (патент США 6335040, 01.01.2002, заявка США 2002015990, 07.02.2002, RU 2109054 С1, 20.04.1998, WO 98/44090, 08.10.1998, RU 2196173 С1, 10.01.2003, RU 2196174 С1, 10.01.2003). Найбільш близьким аналогом заявленого винаходу є консорціум 5-ти штамів біфідобактерій: Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum B379M, Bifidobacterium infantis Г73-15, Bifidobacterium adolescentis Г7513б, Bifidobacterium breve 79-119-МБ, що використовують для приготування кисломолочних, неферментованих харчових продуктів, біологічно активних харчових добавок і бактерійних препаратів. Штами мають близькі культуральні і фізіолого-біохімічні властивості, консорціум активно розмножується в живильних середовищах з накопиченням виробничої біомаси в короткий термін культивування, має специфічну активність. Готовий продукт містить у 1мл 109 живих кліток бактерій. Вміст у 1 дозі препарату не менше 107 живих кліток біфідобактерій (RU 2109054 С1, 20.04.1998). Недоліком відомих консорціумів можна вважати їхню слабку стійкість до ушкоджуючих факторів агресивних середовищ, гастроінтестинального тракту (кислот, протеолітичних ферментів) при проходженні біфідобактерій у шлунково-кишковому тракті, що вказує на недостатню колонізуючу активність, і життєздатність при проходженні травного тракту. Технічним результатом заявленого винаходу є створення консорціуму штамів біфідобактерій, більш стійкого до ушкоджуючих факторів агресивних середовищ гастроінтестинального тракту при проходженні біфідобактерій у шлунково-кишковому тракті і підвищення в такий спосіб його колонізуючої активності при проходженні травного тракту, вираженої антиоксидантної активністі і пробіотичної дії, що виявляється в умовах як in vi vo, так і in vitro. Консорціум отриманий також шляхом поєднання п'яти штамів біфідобактерій Bifidobacterium bifidum 791-МБ, ВКПМ Ас-1688; Bifidobacterium longum В 379М-МБ, ВКПМ Ас-1689; Bifidobacterium adolescentis Г7513-МБ, ВКПМ Ас-1690; Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, ВКПМ Ас-1692; Bifidobacterium breve 79-119-МБ, ВКПМ Ас-1691, характерною рисою яких є висока антибіотико-стійкість з вираженою антиоксидантною активністю: супероксиддисмутазна активність консорціуму не нижче 24,9од/мг білка і пробіотична дія культур, що використовують у виробництві, виявляється при споживанні харчових продуктів і продуктів функціонального харчування. Штам Bifidobacterium bifidum 791-МБ отриманий з колекційного штаму, Bifidobacterium bifidum 791 шляхом послідовного перепасування на тіогліколевому середовищі і знежиреному молоці (50 пасажів), депонований у ВКП М ВИДІ генетика під номером ВКПМ Ас-1688. Штам Bifidobacterium longum В379М-МБ, отриманий з колекційного штаму, Bifidobacterium longum шляхом послідовних циклів ліофілізаційного сушіння і відновлення на тіогліколевому середовищі (50 циклів сушіння-відновлення), депонований у ВКПМ ВНДІ генетика під номером ВКПМ Ас-1689. Штам Bifidobacterium adolescentis Г7513-МБ, отриманий з колекційного штаму, Bifidobacterium adolescentis Г7513 шляхом послідовних циклів ліофілізаційного сушіння і відновлення на тіогліколевому середовищі (50 циклів сушіння-відновлення), депонований у ВКПМ ВНДІ генетика під номером ВКПМ Ас1690. Штам Bifidobacterium infantis 73-15-МБ отриманий з колекційного штаму, Bifidobacterium infantis 73-15 шляхом послідовних циклів ліофілізаційного сушіння і відновлення на тіогліколевому середовищі (50 циклів сушіння-відновлення), депонований у ВКПМ ВНДІ генетика під номером ВКПМ Ас-1692. Штам Bifidobacterium breve 79-119-МБ отриманий з колекційного штаму, Bifidobacterium breve 79-119 шляхом послідовних циклів ліофілізаційного сушіння і відновлення на тіогліколевому середовищі (50 циклів сушіння-відновлення), депонований у ВКПМ ВНДІ генетика під номером ВКПМ Ас-1691. Створений консорціум біфідобактерій показав високу сполучуваність п'яти штамів біфідобактерій між собою, спільне культивування змішаної популяції всіх 5-ти штамів, припустимо, протікає аналогічно роздільному культивуванню штамів. У середньому кількість кліток у порівнянні з вихідною кількістю збільшувалася в сотні разів за 14-16год. культивування при оптимальній температурі. Консорціум зберіг свої специфічні властивості протягом 2-х років. Культуральні-морфологічні ознаки консорціуму Клітки штамів мікроорганізмів являють собою грам+ поліморфні палички з біфуркацією чи стовщенням на 1-2-х кінцях, схильні до утворення скупчень. У рідких живильних середовищах ростуть по всій висоті об’єму, крім зони аеробіозу. Логарифмічна фаза росту закінчується до 24год. Фізіолого-біохімічні ознаки консорціуму Облігатний анаероб. Оптимальна температура вирощування 37,5°С, рН живильних середовищ - 7,2-7,4. Каталазу не утворює, розрідження желатину відсутнє. Ферментує лактозу з утворенням оцтової і L+ молочної кислоти без утворення газу, закислюючи середовище вирощування до рН 3,9-41. Маннозу, целлобіозу, ксилозу, манніт, сорбіт, саліцин, інулін, арабінозу не ферментує. Кислотоутворююча активність: до 24год - 105°Т, до 72год - 160-195°Т (на тіогліколевому середовищі), на гідролізатно-молочному середовищі - до140-160°Т і 200-220°Т, відповідно. Консорціум активно розмножується на середовищах різного складу. Максимальний титр біфідобактерій консорціуму в стерильному знежиреному молоці без ростових факторів до 20год складає 2´108КОЕ/мл. Максимальний титр біфідобактерій на кукурудзяно-лактозному середовищі спостерігається до 16год і складає 2´109КОЕ/мл, на тіогліколевому середовищі до 16год накопичується до 1-3´109КОЕ/мл. Біфідобактерії консорціуму здатні утилізувати вільні амінокислоти в стерильному знежиреному молоці, такі як: валін, метіонін, аланін, аргінін, ізолейцин, гліцин. ДНК відноситься до вираженого Гц-типу з коефіцієнтом специфічності 1,57, молярний відсоток вмісту ГЦ у ДНК дорівнює 61,3. Консорціум виявляє антагоністичну активність стосовно тест-культур, отриманим з ДІСК ім. Л.А. Тарасевича: Е. соІі В-125, Staphilococcus aureus 209-Ρ, шигеллам Зонне, Флекснера. (таблиця 1). Консорціум стійкий до амікоцину, бензилпеніцилліну, гентаміцину, стрептоміцину, канаміцину, тетрацикліну, офлоксаліну (таблиця 2). Здатність консорціуму п'яти штамів біфідобактерій Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В379М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ активно накопичувати мікробну біомасу на різних живильних середовищах за 16-20год вирощування, висока антибіотична і супероксиддісмутазна активність з вираженою антиоксидантною активністю: супероксиддісмутазна активність консорціуму не нижче 24,9од/мг білка мікробної маси, специфічна активність що виявляється дозволили використовува ти його в го туванні кисломолочних, неферментованих продуктів, біологічно активних добавок, біфідовміщуючи х препаратів, косметичних і гігієнічних засобів. Проведені дослідження показали, що при спільному культивуванні на тіогліколевому середовищі при значенні рН 7,0-7,3 і кукурудзяно-лактозному середовищі при значенні рН 6,8-7,0 у стаціонарних умовах досліджувані штами біфідобактерій антагонізму по відношенню друг до друга не виявляють. Відзначено, що при спільному розвитку відзначається кращий розвиток штамів В. adolescentis Г7513-МБ, В. bifidum 791-МБ, В. longum В379М-МБ і найменше - В. infantis 73-15-МБ і В. breve 79-119-МБ. Антагоністичну активність консорціуму штамів біфідобактерій визначали методом змішаних популяцій, що розвиваються, при спільному вирощуванні з патогенними тест-мікроорганізмами по зоні затримки росту тест-мікробів методом штрихових кодів. Таблиця 1 Консорціум заявлений консорціум аналог Е. col 24-24,8 22,7-23,1 Зона затримки росту тест-культур (мм) Sh. Sonne S. aureus 21,7-23,2 17,6-19,2 20,4-21,5 18,4-19,0 Candida albucans 18,8-20,3 18,3-19,9 Найбільшу антагоністичну дію консорціум робить на Staphilococcus aureus і Shigella sonnei, що найбільше часто є причиною харчових отруєнь, що виникають при споживанні кисломолочних продуктів. Визначення рівнів стійкості штамів біфідобактерій до антибіотиків проводили по методу серійних розведень у рідкому живильному середовищі для кожного штаму окремо. Стійкість визначали на стерильному знежиреному молоці. У живильне середовище вводили різні концентрації стерильних розчинів антибіотиків і 16-ти годинні культури біфідобактерій у кількості 5%. У контрольний зразок вносили тільки біомасу досліджуваного штаму біфідобактерій. Стійкість визначали по зміні титруємої кислотності в зразках після 48год інкубування при температурі 37-38°С.Штам стійкий до антибіотиків, коли різниця між титруємою кислотністю в контрольному і дослідному зразках складає не більше 30°Т. Таблиця 2 Антибіотична стійкість штамів біфідобактерій, що складають заявлений консорціум Антибіотики, доза одиниці виміру активності Мкг/см доза Амікоцин сульфат Ампіцилін Бензилпеніцилін, ОД/см 3 Гентаміцин Доксицилін Канаміцин сульфат Левоміцитін Лінкоміцин Оксацилін Олеандоміцин Офлоксалін Рифампіцин Стрептоміцин Сульфадимезін Тетрациклін Фурадонін Фуразолідон Цефазолін 10 250 10000 400 10 20 50 25 10 12,5 20 15 10 50 10 5 5 20 Титруєма кислотність молока після культивування зі штамом, °Τ В. вifidum 791МБ 38-42 68-72 61-67 31-33 36-4,0 95-97 29-31 72-76 29-31 48-52 39-41 38-42 107-116 52-56 52-56 37-39 37-38 38-42 В. longum В379М-МБ 69-71 57-63 68-72 38-42 39-41 129-131 38-42 58-62 32-36 59-61 48-52 38-42 49-51 47-49 43-45 32-36 28-32 44-48 В. В. В. adolescentis infantis 73-15- breve 79-119Г7513-МБ МБ МБ 113-119 68-72 73-79 54-58 57-63 68-72 85-91 84-88 93-95 38-40,0 33-35 42-46 32-36 43-49 47-49 128-132 120-124 115-117 29-31 21-23 26-30 77-83 77-79 91-93 32-36 23-25 31-33 42-46 46-50 55-61 62-66 39-41 32-36 45-51 38-42 39-41 50-53 62-66 105-111 42-46 27-29 40-44 38-40 44-48 39-41 34-38 29-31 34-38 27-29 26-30 32-36 35-37 29-31 39-41 Екстенцилін, ОД/см 3 Еритроміцин Контроль 24000 25 39-41 28-32 93-99 48-52 33-35 77-83 29-31 28-32 52-56 23-25 15-17 81-87 34-38 29-31 103-109 Аналіз отриманих даних свідчить про те, що штами біфідобактерій стійкі до найбільших концентрацій наступних антибіотиків: В.bifidum 791-МБ - до ампіциліну, бензилпеніциліну, канаміцину, линкоміцину, стрептоміцину; B.longum В379М-МБ - до амікоцину, ампіциліну, бензилпеніциліну, канаміцину, линкоміцину, олеандоміцину, о флаксацину, стрептоміцину, екстенциліну. B.adolescentis Г7513-МБ - до амікоцину, ампіциліну, бензилпеніциліну, канаміцину, линкоміцину, олеандоміцину, о флаксацину, стрептоміцину, екстенциліну. B.infantis 73-15-МБ - до амікоцину, ампіциліну, бензилпеніциліну, канаміцину, линкоміцину, стрептоміцину. В.breve 79-119-МБ - до амікоцину, ампіциліну, бензилпеніциліну, канаміцину, линкоміцину, стрептоміцину. Аналогічне дослідження у відношенні заявленого консорціуму біфідобактерій показало, що він має стійкість до, принаймні, 6-ти антибіотиків: амікоцину, тетрацикліну, бензилпеніциліну, гентаміцину, канаміцину, о флаксацину, стрептоміцину. Умови зберігання заявленого консорціуму. Консорціум зберігають на живильному середовищі з масовою часткою сухи х речовин 14-16% з додаванням захисного середовища, що містить сахарозу, желатозу, лимоннокислий натрій, висушують сублімаційним способом в ампулах. Консорціум добре зберігається при 6-8°С без утрати титру активності протягом року. Основною виробнично-корисною ознакою заявленого консорціуму біфідобактерій, що відрізняє його від відомих, варто вважати виражену супероксиддисмутазну активність, що складає 24,9од/мг білка, що утримується в мікробній масі. Виявлена СОД-активність консорціуму біфідобактерій свідчить про його виражену пробіотичну дію, що може виявлятися в умовах як in vivo, так і in vitro. Висока активність кислотоутворення, антибіотикостійкість до широкого спектра основних антибіотиків, сприяє ефективному відновленню нормальної мікрофлори кишечнику вже в процесі антибіотикотерапії. Отриманий консорціум може бути використаний як біологічно активний початок пробіотичної спрямованості при виробництві різних форм бактерійних препаратів, біологічно активних добавок до їжі, кисломолочних продуктів, неферментованих харчови х продуктів, у готуванні косметичних і гігієнічних засобів. При цьому підвищується біологічна цінність продуктів функціонального харчування і препаратів, що готуються на його основі. Вживання в їжу продуктів, що використовують заявлений консорціум, сприяє колонізації слизової кишечнику, витисненню патогенної й умовно патогенної мікрофлори, корегуванню кишкового дисбактеріозу, і відновленню біфідофлори. Використання заявленого консорціуму у виробництві кисломолочних, неферментованих продуктів, біологічно активних добавок, біфідовміщуючих препаратів, косметичних і гігієнічних засобів, наприклад: кремів, серветок, лосьйонів тампонів, живильних масок, жіночих прокладок, мила, косметичного молока і т.п., забезпечує пробіотичний і бактеріологічний ефект, сприяє відновленню нормальної мікрофлори, шкірних і слизових покривів, а також спрямовано на розширення арсеналу аналогічних засобів. Приклад 1. Використання консорціуму штамів біфідобактерій у складі закваски для готування кисломолочних продуктів. 1-ий пасаж - Ліофілізовані штами Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В379М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ у кількості 0,1г (1 доза) сухої біомаси вносять окремо в середовище вирощування і титрують методом десятикратних розведень до 10-9. Вирощують до появиокремих колоній в останньому розведенні при 37,538°С. Або 1 дозу сухої біомаси кожного штаму вносять у дві пробірки з 30мл живильного середовища у кожній. Вирощують до одержання біомаси з вмістом кліток не менше 10 8/мл. 2-ий пасаж - Вирослу культуру кожного зі штамів об'ємом не більше 10% вносять у середовище вирощування і культивують до одержання біомаси з вмістом мікробних тіл не менше 108/мл. 3-ій пасаж - (продукт) Отриману біомасу кожного зі штамів змішують, одержуючи консорціум, і в обсязі не більше 5% вносять у стерильне молоко і культивують до утворення згустку, що розливають у ємності і прохолоджують. Отриманий продукт містить у 1мл не менше 108 живих біфідобактерій. Приклад 2. Використання консорціуму штамів біфідобактерій у складі біологічно активної добавки. 1-ий пасаж - Ліофілізовані штами Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В379М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ активізують шляхом посіву в живильне і середовище вирощують при 37-38,5°С до одержання біомаси з вмістом кліток не менше 108/мл. 2-ий пасаж - Вирослу біомасу кожного зі штамів в обсязі не більше 10% вносять у живильне середовище і культивують до одержання біомаси з кількістю кліток не менше 108/мл. Одержання біологічно активної добавки - Отриману біомасу кожного зі штамів змішують, одержуючи консорціум, вносять у живильне середовище не більше 5% і вирощують до одержання біомаси з високим, не менше 108/мл титром біфідобактрій. У концентрат можна вносити різні біфідогенні фактори, що сприяють стабілізації властивостей культури і кращого приживлення штаму в організмі. Концентрат, розлитий у ємності, можна безпосередньо використовувати як біологічно активну добавку лікувально-профілактичної дії. Можна одержати суху біологічну активну добавку, для цього до отриманої біомаси додають захисні середовища висушування (сахарозожелатинову, знежирене молоко), суспензію заморожують при температурі не менше -45°С, ліофілізують, закупорюють і одержують сухий концентрат з вмістом біфідобактерій не менше 107/мл, який можна використовувати як біологічну добавку, вносячи її в харчовій сировині безпосередньо перед вживанням. Приклад 3 Використання консорціуму штамів біфідобактерій для одержання біфідовміщуючого препарату. 1-ий пасаж - Ліофілізовані штами Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В379М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ активізують шляхом посіву в живильне середовище і вирощують при 37-38,5°С до одержання біомаси з вмістом кліток не менше 108/мл. 2-ий пасаж - Вирослу біомасу кожного зі штамів в обсязі не більше 10% вносять у живильне середовище і культивують до одержання біомаси з кількістю кліток не менше 108/мл. Одержання біфідовміщуючого препарату - До вирослої біомаси консорціуму, що являє собою рідкий концентрат з високим, не менше 108/мл титром біфідобактерій, додають захисні середовища висушування (сахарозожелатинову, знежирене молоко), суспензію заморожують при температурі не менше -45°С, ліофілізують, закупорюють і одержують сухий концентрат з вмістом біфідобактерій не менше 108/мл, який можна використовувати в якості біфідовміщуючого препарату. Згідно НТД на сухий біфідумбактерін (ФС1.32 ВС 94) допускається вміст в 1 дозі препарату не менше 107 живих кліток біфідобактерій. Приклад 4. Використання консорціуму штамів біфідобактерій для одержання квасу або соку. 1-ий пасаж - Ліофілізовані штами Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В379М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ активізують шляхом посіву в живильне середовище і вирощують при 37-38,5°С до одержання біомаси з вмістом кліток не менше 108/мл. 2-ий пасаж - Вирослу біомасу кожного зі штамів в обсязі не більше 10% вносять у живильне середовище і культивують до одержання біомаси з кількістю кліток не менше 108/мл. 3-ій пасаж (одержання продукту) - Вирослу біомасу кожного зі штамів змішують, одержуючи консорціум, і в обсязі не більше 5% вносять у хлібний квас або сік після їхньої пастеризації з розрахунку, щоб вміст біфідобактерій у Імл квасу або соку складав не менше 108. Квас або сік прохолоджують і вживають без наступного бродіння. Приклад 5. Використання консорціуму штамів біфідобактерій для одержання косметичного засобу. 1-ий пасаж - Ліофілізовані штами Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В379М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterium breve 79-119-МБ активізують шляхом посіву в живильне середовище і вирощують при 37-38,5°С до одержання біомаси з вмістом кліток не менше 108/мл. 2-ий пасаж - Вирослу біомасу кожного зі штамів в обсязі не більше 10% вносять у живильне середовище і культивують до одержання біомаси з кількістю кліток не менше 108/мл. 3-ій пасаж (одержання косметичного засобу) - Вирослу біомасу змішують, одержуючи консорціум, і в обсязі не більше 5% вносять у біореактор з тіогліколевим середовищем і інкубують при 37,5-38°С при слабкому перемішуванні до досягнення титру бі фідобактерій 109 кліток/мл. Згодом отриману суспензію кліток руйнують нагріванням в автоклаві. Отриману суспензію біологічно активних компонентів прохолоджують і змішують із кремовою основою в співвідношенні 1:2-1:20 у залежності від призначення крему, що виготовляють.