Біологічно активна субстанція з імуномодулюючою активністю

Реферат: Біологічно-активна субстанція з імуномодулюючою активністю містить біомасу лікарського гриба Flammulina velutipes (Curtis) Singer 1878 у формі сухого порошку, отриманого методом біотехнологічного синтезу на відходах олійно-екстракційної промисловості. UA 117165 U (12) UA 117165 U UA 117165 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель, що заявляється, належить до медицини та фармації, а саме до фармацевтичних субстанцій на основі продуктів біотехнологічного синтезу, зокрема біомаси лікарських грибів, призначених для застосування як активних компонентів препаратів для профілактики та лікування захворювань імунної системи. За даними Українського науково-дослідного центру клінічної імунології та імунопрофілактики НАМН та МОЗ України кількість хворих з виявленими первинними генетично детермінованими імунодефіцитними станами становить близько 1 % населення, придбаними - до 20 %; від 30 до 38 % населення України має порушення імунної системи. Очікується, що в XXI столітті алергічні та імунодефіцитні захворювання за поширеністю вийдуть на перше місце серед всіх захворювань (Л.В. Кузнецова, В.Д. Бабаджан, Н.В. Харченко та ін., 2013). Екологічні забруднення, поліпрагмазія, застосування вакцин і сироваток, стресові ситуації, тютюнопаління, зловживання алкоголем, наркотиками, ВІЛ-інфекція тощо - є основними причинами неухильного зростання числа таких розладів, що обумовлює високий рівень захворюванності, смертності та інвалідності населення (О.М. Біловол, П.Г. Кравчун, В.Д. Бабаджан та ін., 2011; І.А. Зупанець, Т.С. Сахарова, Н.П. Безугла, 2014). Створення, розробка та дослідження нових ефективних препаратів природного походження, що здатні активізувати імунітет, залишаються актуальними завданнями фармацевтичної технології, адже такі засоби, на відміну від традиційних медикаментозних значно рідше викликають небажані алергічні реакції, побічні та токсичні ефекти. Багатовікова практика використання грибів у Китаї та Японії з метою лікування та профілактики низки захворювань свідчить про їх значний потенціал та перспективність застосування у вітчизняній традиційній медицині. Дослідження біологічної активності різноманітних біологічно-активних речовин (БАР) Flammulina velutipes - об'єкту дослідження а саме, полісахаридів, протеїн-глюканових комплексів, стеролів, лектинів, пероксидаз, протеаз тощо, показали їх здатність чинити імуномодулюючу, протипухлинну, антиоксидантну, тромболітичну, фібринолітичну, гіпотензивну, антибактеріальну, протигрибкову, противірусну, мітотичну активності (Leung M.Y.K., Fung K.P., Choy Y.M., 1997; Kim J.M., Ra K.S., Noh D.O. et al, 2002; Borhani A., Badalyan S.M. et al, 2011; Hassan F.R.H., Chada M., El-Kady A.T.M., 2012). В основу корисної моделі поставлено задачу розробити субстанцію, що володіє імуномодулюючими властивостями, на основі міцелію лікарського гриба шляхом культивування штаму Flammulina velutipes (Curtis) Singer 1878. Для вирішення поставленої задачі, біологічно-активну субстанцію з імуномодулюючою активністю, яка містить біомасу лікарського гриба Flammulina velutipes, отримують шляхом культивування штаму Flammulina velutipes (Curtis) Singer 1878 у формі сухого порошку методом біотехнологічного синтезу на відходах олійно-екстракційної промисловості. Так, використання досліджуваного субстрату дозволяє покращити якісний склад біомаси та одержати активний фармацевтичний інгредієнт у формі сухого порошку із високим вмістом біологічно-активних речовин, придатний для використання у складі лікарських препаратів, лікувально-профілактичних засобів, біологічно-активних та харчових добавок різної направленості дії. Прикладом отримання біологічно-активної субстанції з імуномодулюючою активністю є наступний: як живильне комплексне середовище у кількості 60 г на 1 л води очищеної використовували СO2-шрот амаранту - побічний продукт екстракції рідким вуглекислим газом насіння Amaranthus caudatus L. сорту "Геліос", отриманий в "Інституті харчової біотехнології та геноміки Національної академії наук України" (м. Київ). Після стерилізації в автоклаві (30 хв., 1 атм., 121 °C) ємності з живильним середовищем інокулювали рідкою гомогенізованою суспензією біомаси (10 % за об'ємом, отриманої у гомогенізаторі протягом 1 хвилини при 6000 об/хв) F. velutipes 1878, що була попередньо вирощена у чашці Петрі на агаризованому глюкозо-пептонно-дріжджевому середовищі такого складу (г/л): глюкоза - 25, пептон - 3, дріжджевий екстракт - 2, КН2РО4-1, К2НРО4-1, MgSO4 × 7H2O-0,25 [4]. Глибинне культивування проводили у термостатичному приміщенні на лабораторній качалці (120 об/хв) за температури 26±2 °C, рН середовища - 6,0 протягом 10 діб. Отриману біомасу відфільтровували від культуральної рідини, висушували у вакуумній ліофільній сушці Cryodos-500 (Terrasa, Іспанія) та подрібнювали. Таким чином, біологічно-активна субстанція у формі сухого порошку містить різні групи фізіологічно-активних речовин, якісний та кількісний (відсотковий) склад яких представлений у Таблиця 1-4, які зумовлюють стимулюючий вплив на імунну систему. 1 UA 117165 U Таблиця 1 Вміст фракції полісахаридів сухого порошку біомаси (СПБ) лікарського гриба F. velutipes Номер визначення 1 2 3 Середній сумарний вміст Вміст полісахаридів, % 30,99 31,01 30,92 30,97±0,04 Таблиця 2 Амінокислотний склад сухого порошку біомаси (СПБ) лікарського гриба F. velutipes Амінокислоти Незамінні амінокислоти Валін Ізолейцин Лейцин Лізин Метіонін Треонін Фенілаланін 1 Замінні амінокислоти Аланін Аргінін* Аспарагінова кислота Гістидин* Гліцин Глутамінова кислота Пролін Серин Тирозин Цистин 2 заг 1/2 Кількість мг/100 мг % 0,825 0,636 1,408 0,673 0,387 0,841 0,833 5,603 4,45 3,43 7,59 3,63 2,09 4,54 4,49 30,22 1,246 0,950 1,561 0,400 1,362 3,026 1,113 1,248 0,728 1,313 12,947 18,550 0,43 6,72 5,12 8,41 2,15 7,34 16,31 6,00 6,73 3,92 7,08 69,78 100,00 Примітка: * - умовно незамінні амінокислоти (аргінін - для дітей та осіб похилого віку; гістидин - для дітей) Таблиця 3 Жирнокислотний склад сухого порошку біомаси (СПБ) лікарського гриба F. velutipes Метилові ефіри жирних кислот Насичені жирні кислоти Арахінова Бегенова Генеікозанова Ізолауринова Ізоміристинова Ізопальмітинова Ізостеаринова Каприлова Вміст метилових ефірів ЖК, % від суми 1,53137 0,75463 0,58303 0,14989 0,05421 0,20066 0,10636 0,05322 2 UA 117165 U Таблиця 3 Жирнокислотний склад сухого порошку біомаси (СПБ) лікарського гриба F. velutipes Метилові ефіри жирних кислот Капринова Лауринова Лігноцеринова Маргаринова Міристинова Пальмітинова Пентадеканова Стеаринова Тридеканова Трикозанова Ундецилова Ненасичені жирні кислоти Арахідонова Гексадекадієнова Гептадеценова Гондова Докозагексаєнова Докозапентаєнова Ейкозадієнова Ейкозапентаєнова Ерукова Лауролеїнова Лінолева Ліноленова Міристолеїнова Нервонова Олеїнова Пальмітолеїнова Пентадеценова Тетрадекадієнова Неідентифіковані жирні кислоти Неідентифікована Неідентифікована Неідентифікована Неідентифікована Неідентифікована Неідентифікована Неідентифікована Загальна сума ЖК Загальна сума насичених ЖК Загальна сума ненасичених ЖК Загальна сума неідентифікованих ЖК Вміст метилових ефірів ЖК, % від суми 0,12055 1,57682 0,22632 0,20579 0,41472 23,51428 0,98760 5,99928 0,04852 0,30104 0,13431 0,74729 0,94268 1,35254 0,59444 0,06361 0,07862 0,47166 1,27705 0,07683 0,08121 28,91230 1,17219 0,27455 1,19788 23,99814 0,59339 0,08567 0,26256 0,37168 0,17772 0,06555 0,06444 0,00001 0,07016 0,10524 100 36,9626 62,18261 0,8548 3 UA 117165 U Таблиця 4 Вітамінний склад сухого порошку біомаси (СПБ) лікарського гриба F velutipes Вітамін В1 (тіамін) В2 (рибофлавін) В9 (фолієва кислота) РР (ніацин) Примітка: n=5 5 10 15 20 25 30 35 40 Вміст, мг/100г 3,2±0,2 1,13±0,03 37,94±2,0 16,7±1,2 За доступними даними літератури така субстанція з імуномодулюючою дією на основі їстівного та лікарського гриба Flammulina velutipes невідома. Так, були проведені дослідження імуномодулюючої дії сухого порошку біомаси F. velutipes, обумовленої його впливом на гематологічні показники та лейкоцитарну формулу периферійної крові мишей-самців: Протягом 14 днів дослідним тваринам вводиться (інтрагастрально per os) сухий порошок біомаси (СПБ) лікарського та їстівного гриба Flammulina velutipes у різних дозах з подальшим дослідження периферійної крові мишей (гематологічні показники крові та лейкоцитарна формула крові). Дослідження субстанції здійснюється наступним чином: В експеримент було відібрано мишей-самців масою 20-22 г, яких розподілили на окремі групи по 6 мишей у кожній. 1-а група - інтактні тварини (контроль), тваринам 2-6 груп протягом 14 діб інтрагастрально per os за допомогою металевого зонду вводили водну суспензію сухого порошку досліджуваної субстанції у п'яти варіантах доз - 300, 400, 500, 600 та 800 мг/кг маси тіла людини, що з урахуванням коефіцієнту видової чутливості, який для мишей складає 12,3 [5] становить - 52, 70, 88, 106 та 140 мг/кг маси тіла, 7 група - мишам даної групи також інтрагастрально per os уводили препарат порівняння (таблетки Ехінацеї виробництва АстраФарм, Україна) у дозі 106 мг/кг (600 мг/кг маси тіла людини). Для введення препарату тваринам з сухого порошку готували водні суспензії. Щоденно готували свіжі суспензії усіх досліджуваних зразків. Індивідуальні дози для введення розраховували в мл та мг з урахуванням щотижневих змін маси тіла. Через 24 год. після останнього введення мишам досліджуваних препаратів за умов легкого ефірного наркозу отримували зразки крові для гематологічних досліджень, після чого здійснювали евтаназію методом цервікальної дислокації. Диференційний підрахунок типів лейкоцитів в мазках периферійної крові тварин проводили після фарбування за методом Романовського-Гімза [2, 3]. Зразки крові були дослідженні у день їх отримання. Кров для гематологічних досліджень, відібрану у пробірки з калію етилендіамінтетраоцтової кислоти (КАВЕ Labortechnik), аналізували на автоматичному гематологічному аналізаторі Mythic 18, Швейцарія. Математична обробка отриманих даних проводилась з використанням MS Excel. Дані наводили, як середнє значення ± похибка середнього значення (М±т). Статистична обробка даних проводилася із використанням програми Statistics for Windows. Аналіз вірогідності результатів експерименту проводився з використанням модулю однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA). Різницю між показниками вважали статистично вірогідною при значенні р