Ефіри докозагексаєнової кислоти та їх застосування для лікування і попередження серцево-судинного захворювання

1. Складний ефір докозагексаєнової кислоти зі спиртом, вибраним з групи, що складається з: пантенолу формули: OH H HO OH N H3C CH3 O та O H ONO2 . 2. Складний ефір докозагексаєнової кислоти за п. 1 з пантенолом. 3. Складний ефір докозагексаєнової кислоти за п. 1 або 2 для застосування як лікарського засобу. 4. Складний ефір докозагексаєнової кислоти за п. 1 або 2 для застосування як лікарського засобу для попередження та/або лікування серцевосудинних захворювань, краще, пов'язаних з ритмом серця, краще, вибраних із передсерцевої та/або шлуночкової аритмії, тахікардії та/або фібриляції; для попередження та/або лікування захворювань, обумовлених дефектами в електричній провідності в клітинах міокарда; для попередження та/або лікування факторів ризику серцевосудинного захворювання, вибраних з гіпертригліцеридемії, гіперхолестеринемії, гіпертензії, гіперліпідемії, дисліпідемії, для лікування та/або пер (13) 96156 OH або ізосорбіду мононітрату формули: HO H O (11) H UA O C2 ізосорбіду формули: HO H O (19) (21) a200900468 (22) 22.06.2007 (24) 10.10.2011 (86) PCT/EP2007/056277, 22.06.2007 (31) 0605649 (32) 23.06.2006 (33) FR (46) 10.10.2011, Бюл.№ 19, 2011 р. (72) БРУНЕ ФРЕДЕРІК, FR, ДЕЛЬОН АНДРЕ, FR, ГАРДЕТТ ЖАН, FR, ПАТОСО ЖАН ФРАНСУА, FR, МАРТІ АЛЕН, FR, СЕВЕРАК ЕТЬЄН, FR (73) ПЬЄР ФАБР МЕДІКАМЕНТ, FR (56) WO 2004/091603 A, 28.10.2004 US 2003/050341 A1, 13.03.2003 WO 2004/047835 A, 10.06.2004 DATABASE CA [Online] CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE, COLUMBUS, OHIO, US; "3-Pyridylmethyl 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoate" HARVEY D J: "Picolinyl derivatives for the structural determination of fatty acids by mass spectrometry: Applications to polyenoic acids, hydroxy acids, diacids and related compounds" BIOMEDICAL MASS SPECTROMETRY 1984 UNITED KINGDOM, vol. 11, no. 7, 1984, pages 340-347 HUMEAU C ET AL: "Enzymatic synthesis of fatty acid ascorbyl esters" JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS - B ENZYMATIC 14 SEP 1998 NETHERLANDS, vol. 5, no. 1-4, 14 September 1998 (1998-09-14), pages 19-23 TORRES DE PINEDO A ET AL: "Efficient lipasecatalyzed synthesis of new lipid antioxidants based on a catechol structure" TETRAHEDRON, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 61, no. 32, 8 August 2005 (2005-08-08), pages 76547660 M. BRIGODIOT ET AL.: "Enzyme-catalyzed synthesis of aliphatic polyesters in organic media: study of transesterification equilibrium shift and characterization of cyclic compounds" JOURNAL OF POLYMER SCIENCE: PART A: POLYMER CHEMISTRY, vol. 33, 1995, pages 2691-2698 2 3 96156 4 винного або вторинного попередження серцевосудинного захворювання, що є результатом порушень ритму серця, та/або для лікування післяінфарктного стану. 5. Складний ефір докозагексаєнової кислоти за п. 1 або 2 для застосування як лікарського засобу для попередження та/або лікування фібриляції передсердь. 6. Спосіб одержання складного ефіру докозагексаєнової кислоти за п. 1 або 2, який включає трансетерифікацію етилового ефіру докозагексаєнової кислоти зі спиртом, вибраним з групи, що складається з пантенолу, ізосорбіду, ізосорбіду мононітрату. 7. Спосіб за п. 6, де зазначений спосіб здійснюють в присутності каталізатора. 8. Спосіб за п. 7, де каталізатор є ліпазою. 9. Спосіб за п. 8, де етанол видаляють під час реакції. 10. Спосіб за п. 8 або 9, де реакція протікає в безводному розчиннику або без розчинника в сухій атмосфері. 11. Фармацевтична композиція, яка містить складний ефір докозагексаєнової кислоти за п. 1 і щонайменше один фармацевтично прийнятний ексципієнт. 12. Фармацевтична композиція за п. 11 для застосування як лікарського засобу. 13. Фармацевтична композиція за п. 11 для застосування як лікарського засобу для попередження та/або лікування серцево-судинних захворювань, краще, пов'язаних з ритмом серця, краще, вибраних із передсерцевої та/або шлуночкової аритмії, тахікардії та/або фібриляції; для попередження та/або лікування захворювань, обумовлених дефектами в електричній провідності в клітинах міокарда; для попередження та/або лікування факторів ризику серцево-судинного захворювання, вибраних з гіпертригліцеридемії, гіперхолестеринемії, гіпертензії, гіперліпідемії, дисліпідемії, для лікування та/або первинного або вторинного попередження серцево-судинного захворювання, що є результатом порушень ритму серця, та/або для лікування післяінфарктного стану. 14. Фармацевтична композиція за п. 11 для застосування як лікарського засобу для попередження та/або лікування фібриляції передсердь. 15. Застосування піридин-3-ілметилдокозагексаноату для застосування як лікарського засобу для попередження та/або лікування серцево-судинних захворювань, краще, пов'язаних з ритмом серця, краще, вибраних із передсерцевої та/або шлуночкової аритмії, тахікардії та/або фібриляції; для попередження та/або лікування захворювань, обумовлених дефектами в електричній провідності в клітинах міокарда; для попередження та/або лікування факторів ризику серцево-судинного захворювання, вибраних з гіпертригліцеридемії, гіперхолестеринемії, гіпертензії, гіперліпідемії, дисліпідемії, для лікування та/або первинного або вторинного попередження серцево-судинного захворювання, що є результатом порушень ритму серця, та/або для лікування післяінфарктного стану. 16. Застосування піридин-3-ілметилдокозагексаноату для застосування як лікарського засобу для попередження та/або лікування фібриляції передсердь. Даний винахід стосується складних ефірів докозагексаєнової кислоти (DHA) зі спиртами, вибраними з вітамінів чи провітамінів групи В, такими як нікотиніловий спирт (В3), пантенол (В5) або інозит (В7), або ізосорбіду чи ізосорбіду мононітрату і, зокрема, піридин-3-ілметилдокозагексаноату, та їхнього застосування як лікарського засобу для лікування та попередження серцево-судинних захворювань. Поліненасичені жирні кислоти омега-3, зокрема, ЕРА (ейкозапентаєнова кислота) і DHA, краще, очищені та концентровані у вигляді етилового ефіру, відомі завдяки їхньому потенційному застосуванню для лікування деяких серцево-судинних захворювань і для модуляції відповідних факторів ризику. Зокрема, вони відомі для лікування гіперліпідемії, гіперхолестеринемії та гіпертензії. Клінічні випробування, проведені із препаратами, що містять високу концентрацію етилового ефіру ЕРА і DHA, на пацієнтах, що страждають інфарктом міокарда, показали їхню ефективність у зниженні смертності та, зокрема, раптової смерті. Ці результати приписувалися почасти стабілізуючому ефекту на клітинні мембрани кардіоміоцитів шлуночків, які запобігають виникненню злоякісної аритмії в присутності ішемічних міоцитів, як спостері гається у пацієнтів після інфаркту або в експериментальних моделях, що відтворюють такі умови. Крім того, відповідно до патентної заявки WO2004/047835 також відомо, що етилові ефіри DHA і ЕРА можуть бути використані для запобігання фібриляції передсердь. Однак несподівано автори даної заявки виявили, що DHA і ЕРА виявляють неоднаковий ефект на фібриляцію передсердь: DHA має набагато більший ефект на фібриляцію передсердь, ніж ЕРА. Таким чином, для лікування фібриляції передсердь і, звичайно, для лікування більшості серцево-судинних захворювань краще використовувати одну DHA, а не суміш DHA і ЕРА. Вітаміни групи В охоплюють водорозчинні молекули, що належать до хімічних класів, які сильно різняться, але які усі володіють як основною функцією здатністю контролювати активність ферментів в процесі обміну речовин в організмі. Ці вітаміни називаються: тіамін (В1), рибофлавін (В2), ніацин (В3), пантотенова кислота (В5), піридоксин (В6), біотин (В8), фолієва кислота (В9) і ціанокобаламін (В 12). Вітаміни та провітаміни групи В мають переваги, пов'язані з їхньою функцією. Зокрема, нікотиніловий спирт є спиртом, похідним від нікотинової 5 кислоти (вітамін В3). В організмі людини він швидко перетворюється на нікотинову кислоту. Нікотинова кислота, також відома як ніацин, є водорозчинним вітаміном групи В, що може бути синтезований із триптофану. Однак, ефективні терапевтичні дози для цілей зниження холестерину та ліпідів є вищими, ніж кількості, що синтезуються організмом. Таким чином, доведено, що пероральна добавка є істотною для зниження рівнів холестерину та/або тригліцеридів. Що стосується механізму дії, то припускають, що нікотинова кислота інгібує вивільнення вільних жирних кислот з жирової тканини, що приводить до зниження надходження жирних кислот у печінку. Оскільки менше жирних кислот буде етерифікуватися в тригліцериди, менше буде включатися в ліпопротеїни низької густини (LDL), у такий спосіб знижуючи рівні холестерину LDL. Також звернули увагу, що нікотинова кислота значно збільшує рівні холестерину HDL, найбільш імовірно, шляхом інгібування катаболізму цієї форми холестерину HDL. Зокрема, нікотинова кислота створює сильний периферичний судинорозширювальний ефект. Таким чином, внутрішньовенна ін'єкція нікотинілового спирту після його перетворення на нікотинову кислоту приводить до вазодилатації, сприятливої для зниження артеріального тиску. Нікотинову кислоту широко використовують у терапії для зниження рівнів холестерину та ліпідів. Також було показано, що нікотинова кислота може бути об'єднана з інгібіторами HMG-СоАредуктази (гідроксиметилглутарил-кофермент Аредуктази), такими як статини, наприклад, у випадках, коли зниження холестерину цими інгібіторами HMG-CoA-редуктази не є достатнім. Така комбінація може бути корисна, коли домагаються вигоди від ефектів кожної сполуки, зокрема, зниження холестерину LDL статинами та підвищення холестерину HDL нікотиновою кислотою. Крім того, нікотинова кислота є придатною для лікування змішаної дисліпідемії і, таким чином, здатна впливати на рівні як холестерину, так і тригліцеридів. Пантенол є спиртовим похідним пантотенової кислоти, більш відомим як вітамін В5. В організмі пантенол перетворюється на пантотенову кислоту. Пантотенова кислота потім стає важливою частиною сполуки коферменту А, який є особливо цікавим для клітинного метаболізму. Дійсно, він бере участь у метаболізмі ліпідів, вуглеводів та білків. Пантенол також бере участь в утворенні ацетилхоліну та адренальних стероїдів. Він також відіграє роль у детоксифікації сторонніх предметів та в стійкості до інфекції. Інозит (вітамін В7) мобілізує жири шляхом запобігання їх накопиченню. Він також має анксіолітичний ефект, він стимулює нервову систему та печінку, і він знижує рівень холестерину в крові. Він залучений до збільшення активності серотонінової системи, контролю концентрації внутрішньо 96156 6 клітинного кальцію, підтримання потенціалу клітинної мембрани та складання цитоскелета. Ізосорбід, зокрема, ізосорбіду мононітрат, є потужним периферичним вазодилататором. Несподівано автори винаходу виявили, що складні ефіри докозагексаєнової кислоти (DHA) зі спиртами, вибраними з вітамінів або провітамінів групи В, таких як нікотиніловий спирт (В3), пантенол (В5) та інозит (В7), або з ізосорбідом чи ізосорбіду мононітратом, зокрема, піридин-3ілметилдокозагексаноат (складний ефір докозагексаєнової кислоти (DHA) з нікотиніловим спиртом), також виявляють значну активність по відношенню до серцево-судинного захворювання. Таким чином, даний винахід стосується складного ефіру докозагексаєнової кислоти зі спиртом, вибраним з вітамінів або провітамінів групи В, які краще складаються з: - нікотинілового спирту такої формули: - пантенолу такої формули: та - інозиту такої формули: або з ізосорбідом такої формули: або ізосорбіду мононітратом такої формули: Краще, складний ефір за даним винаходом є піридин-3-ілметилдокозагексаноатом такої загальної формули (1): 7 96156 8 (1) , Даний винахід також стосується способу одержання складного ефіру докозагексаєнової кислоти за даним винаходом, зокрема, піридин-3ілметилдокозагексаноату (1), шляхом трансетерифікації етилового ефіру докозагексаєнової кислоти зі спиртом, вибраним з групи, що включає нікотиніловий спирт, пантенол, ізосорбід, ізосорбіду мононітрат та інозит, краще, з нікотиніловим спиртом. Трансетерифікація може бути здійснена способами, добре відомими фахівцям в даній області техніки. Краще, трансетерифікацію за даним винаходом здійснюють у присутності каталізатора. Краще, такий каталізатор є карбонатом лужного металу або карбонатом лужноземельного металу, краще, К2СО3. Краще, молярне співвідношення карбонату лужного металу або карбонату лужноземельного металу до етилового ефіру DHA находиться в діапазоні від 1/1 до 6/1. Краще, молярне співвідношення спирту до етилового ефіру DHA находиться в діапазоні від 1/1 до 6/1, ще краще, молярне співвідношення нікотинілового спирту до етилового ефіру DHA находиться в діапазоні від 1/1 до 6/1. Краще, реакцію трансетерифікації здійснюють у розчиннику, краще, вибраному з діоксану або тетрагідрофурану (THF); краще, вибраний THF. Краще, THF дегазують шляхом барботування азотом. Ще краще, реакційну суміш нагрівають зі зворотним холодильником, краще, протягом щонайменше 14 годин. В іншому конкретному втіленні винаходу каталізатор трансетерифікації за даним винаходом є ліпазою, краще, ліпазою з Candida antarctica. Зокрема, ліпаза перебуває в іммобілізованій формі. Краще, ліпазою є Novozyme®, продаваний фірмою Novo Nordisk (Ново Нордиск). Краще, реакція протікає в середовищі без розчинника або в розчиннику, такому як 2-бутанол або ацетонітрил, краще, в середовищі без розчинника у випадку нікотинілового спирту та в розчиннику у випадку пантенолу. Краще, у випадку інозиту, використовуваний розчинник є іонним полярним розчинником, таким як 1-бутил-3-метилімідазолій тетрафторборат (BF4) або 1-бутил-3-метилімідазолій C(CN)2. Краще, реакція протікає при температурі вище кімнатної температури, краще, при 60 °C. Краще, етанол видаляють під час реакції, краще, під вакуумом або шляхом барботування азотом, ще краще, шляхом барботування азотом. Таким шляхом збільшують швидкість конверсії, прискорюють реакцію та видаляють паразитну реакцію гідролізу. Краще, молярне співвідношення спирту до етилового ефіру DHA находиться між 1 та 5, краще, між 1,5 і 4,5. Краще, реакцію здійснюють протягом від 1 години до 100 годин, краще, від 1 години до 72 годин, краще, від 1 години до 48 годин, ще краще, від 1 години до 3 годин. В іншому конкретному втіленні способу за даним винаходом реакція трансетерифікації протікає в безводному розчиннику, у небезводному розчиннику в присутності водовіддільника, такого як, наприклад, хлорид літію, MgCl2 або силікагель, або без розчинника в сухій атмосфері. У такий спосіб видаляють паразитну реакцію гідролізу. Краще, реакція трансетерифікації протікає із чистим етиловим ефіром докозагексаєнової кислоти (щонайменше 95 %-ний чистоти, наявним у продажі або очищеним способами, добре відомими фахівцям в даній області техніки, із суміші етилових ефірів жирних кислот) або із сумішшю, що містить щонайменше 70 % мол. етилового ефіру DHA. У випадку, коли використовуваний етиловий ефір DHA є сумішшю, доцільно очищати отриманий складний ефір після реакції трансетерифікації. Даний винахід також стосується фармацевтичної композиції, що містить складний ефір докозагексаєнової кислоти за даним винаходом, зокрема, піридин-3-ілметилдокозагексаноат, та щонайменше один фармацевтично прийнятний ексципієнт. Фармацевтичні композиції за даним винаходом можуть бути приготовлені у вигляді препаратів для введення ссавцям, включаючи людину. Дози варіюються залежно від режимів лікування та захворювань, які лікують. Ці композиції виготовляють таким чином, щоб вводити пероральним, сублінгвальним, підшкірним, внутрішньом'язовим, внутрішньовенним, трансдермальним, місцевим або ректальним шляхом. У цьому випадку активний інгредієнт можна вводити тваринам або людям у вигляді лікарських форм на одну дозу або в суміші зі стандартними фармацевтичними носіями. Придатні лікарські форми на одну дозу включають форми для введення пероральним шляхом, такі як таблетки, желатинові капсули, порошки, гранули та пероральні розчини або суспензії, форми для сублінгвального та перорального введення, форми для підшкірного, місцевого, внутрішньом'язового, внутрішньовенного, інтраназального або внутрішньоочного введення та форми для ректального введення. Коли тверду композицію виготовляють у таблетованій формі, тоді первинний активний інгредієнт змішують із фармацевтичним носієм, таким як желатин, крохмаль, лактоза, стеарат магнію, тальк, аравійська камедь, діоксид кремнію або аналоги. Таблетки можуть бути покриті сахарозою або іншими придатними речовинами, або вони можуть бути оброблені таким чином, щоб мати уповільнену або відстрочену активність і щоб без 9 перервно вивільняти задану кількість активного інгредієнта. Препарат у вигляді желатинової капсули одержують шляхом змішування активного інгредієнта з розріджувачем і потім висипання отриманої суміші в м'які або тверді желатинові капсули. Препарат у вигляді сиропу або еліксиру може містити активний інгредієнт у поєднанні з підсолоджувачем, антисептичним засобом, а також ароматизатором і придатним барвником. Порошки або гранули, які можуть бути дисперговані у воді, можуть містити активний інгредієнт у суміші з диспергувальними агентами, зволожуючими агентами або суспендувальними агентами, а також із смако-ароматичними агентами або підсолоджувачами. Супозиторії, які виготовляють зі сполучними агентами, що плавляться при ректальній температурі, такими як какаова олія або поліетиленгліколь, наприклад, використовують для ректального введення. Для парентерального (внутрішньовенного, внутрішньом'язового і т.д.), інтраназального або внутрішньоочного введення призначені водні суспензії, ізотонічні сольові розчини або стерильні ін'єковані розчини, що містять фармакологічно сумісні диспергуючі агенти та/або зволожуючі агенти. Активний інгредієнт може бути також приготовлений у вигляді мікрокапсул, можливо, з однією чи більше добавками. Краще, фармацевтична композиція за даним винаходом призначена для введення пероральним або внутрішньовенним шляхом, краще, внутрішньовенним шляхом у випадку лікування післяінфарктного стану. Фармацевтична композиція за даним винаходом може містити інші активні інгредієнти, які дають комплементарний або, можливо, синергічний ефект. Краще, фармацевтична композиція не містить складного ефіру ЕРА. Даний винахід також стосується складного ефіру докозагексаєнової кислоти за даним винаходом, зокрема, піридин-3-ілметилдокозагексаноату, або фармацевтичної композиції за даним винаходом для застосування як лікарського засобу. Даний винахід також стосується складного ефіру докозагексаєнової кислоти за даним винаходом, зокрема, піридин-3-ілметилдокозагексаноату, або фармацевтичної композиції за даним винаходом, для застосування як лікарського засобу для попередження та/або лікування серцевосудинного захворювання, яке, краще, стосується ритму серця (краще, порушенню ритму або порушення провідності), краще, вибраного із передсердної та/або шлуночкової аритмії, тахікардії та/або фібриляції; для попередження та/або лікування захворювань, обумовлених дефектами в електричній провідності в клітинах міокарда; для попередження та/або лікування безлічі факторів ризику серцево-судинного захворювання, краще, вибраних з гіпертригліцеридемії, гіперхолестеринемії, гіпертензії, гіперліпідемії, дисліпідемії, краще, змішаної дисліпідемії, та/або фактора VII гіперактив 96156 10 ності в згортанні крові; для лікування та/або первинного чи вторинного попередження серцевосудинного захворювання, яке є результатом порушень ритму, таких як передсердна та/або шлуночкова аритмії, тахікардія, фібриляція та/або дефекти електропровідності, викликані інфарктом міокарда, краще, раптова смерть; та/або для лікування післяінфарктного стану. Порушення ритму включають, зокрема, дефекти синусно-передсердного вузла, такі як синусна тахікардія; передсердну аритмію, таку як передсердні екстрасистоли, регулярна передсердна тахікардія або фібриляція передсердь; вузлову тахікардію, таку як пароксизмальна вузлова тахікардія або синдром Вольффа-Паркінсона-Уайта; або шлуночкову аритмію, таку як передчасне скорочення шлуночків, тахікардія шлуночків або фібриляція шлуночків. Порушення провідності включають, зокрема, брадикардію. Отже, даний винахід стосується складного ефіру докозагексаєнової кислоти за даним винаходом, зокрема, піридин-3ілметилдокозагексаноату, або фармацевтичної композиції за даним винаходом, для застосування як лікарського засобу для попередження та/або лікування фібриляції передсердь. Не будучи зв'язаними теорією, вважають, що складний ефір докозагексаєнової кислоти за даним винаходом, зокрема піридин-3ілметилдокозагексаноат, вивільняє в організмі спирт та DHA, зокрема, нікотиніловий спирт і DHA у випадку піридин-3-ілметилдокозагексаноату, завдяки естеразній активності. Таким чином, складний ефір докозагексаєнової кислоти за даним винаходом, очевидно, має таку ж активність у вигляді суміші DHA та спирту. Таким чином, якщо цей спирт є вітаміном або провітаміном групи В, то складний ефір докозагексаєнової кислоти за даним винаходом буде мати такий же ефект, як і суміш DHA та вітаміну або провітаміну групи В. Звідси також випливає, що у випадку піридин-3ілметилдокозагексаноату нікотиніловий спирт перетворюється в організмі на нікотинову кислоту. Таким чином, піридин-3-ілметилдокозагексаноат за даним винаходом, очевидно, має таку ж активність, що й суміш DHA та нікотинової кислоти. Перевага судинорозширювального ефекту нікотинової кислоти полягає в найбільш задовільному розподілі DHA по периферії, зокрема, у випадку внутрішньовенної ін'єкції піридин-3ілметилдокозагексаноату, після перетворення нікотинілового спирту на нікотинову кислоту. Винахід буде більш зрозумілим при посиланні на графічні матеріали та на приклади, які наведені нижче. На фіг. представлена залежність витрати DHA-EE (етилового ефіру докозагексаєнової кислоти) у відсотках від часу для прикладів 3.1 (відкрита пробірка), 3.2 (під вакуумом) і 3.3 (при барботуванні азотом) під час реакції трансетерифікації в присутності 200 мг Novozyme® при 60 °C зі співвідношенням спирту до складного ефіру, рівним 3. Наступні приклади наведені як приклади, що не обмежують винахід. 11 96156 Приклад 1: Синтез піридин-3-ілметилдокозагексаноату з використанням К2СO3 Поміщають 1 г (2,8 ммоль) етилдокозагексаноату (чистота більше 95 %; поставляється фірмою Interchim) в 5 мл THF, дегазованого шляхом барботування азотом у присутності 1,53 г (11 ммоль) здрібненого К2СО3 і 1,06 мл (10,9 ммоль) нікотинілового спирту (чистота більше 98 %; поставляється фірмою Acros). Реакційну суміш нагрівають зі зворотним холодильником протягом 7 год. і потім додають 0,76 г (5,5 ммоль) К2СО3 та нагрівання продовжують протягом 7 год. Після охолодження реакційну суміш виливають у воду і потім екстрагують етилацетатом. Органічні фази сушать над MgSO4, фільтрують і потім концентрують досуха. Отриманий залишок очищають за допомогою флеш-хроматографії на силікагелі (СН2Сl2 → градієнт СН2Сl2/етилацетат, 90/10, протягом 15 хв.). Виділяють прозоре масло (0,84 г, вихід 71 %). TLC (тонкошарова хроматографія) на силікагелі 60F254 Merck,СН2Сl2/AcOEt, 90/10, Rf=0,35. Приклад 2: Синтез піридин-3-ілметилдокозагексаноату з використанням ліпази Всі реакції здійснюють у реакторі з періодичним перемішуванням (магнітне перемішування) 12 при оптимальній температурі для кожного ферменту. Використовуваними матеріалами є: - суміш етилових ефірів, збагачених до 70 % етиловим ефіром DHA (DHA-EE) (продається фірмою Croda Chemical Ltd.), називана нижче "70 %на ефірна суміш DHA-EE"; - Novozyme®, іммобілізована форма ліпази з Candida antarctica, продається фірмою Novo Nordisk; - нікотиніловий спирт. Реакційна суміш є або: - середовищем без розчинника, яке використовують тільки для субстратів; або - органічним середовищем з використанням різних розчинників. Розчинниками, використовувані в цьому органічному середовищі, є: - 2-метил-2-бутанол (2М2В), помірно полярний розчинник, що уможливлює спільну солюбілізацію гідрофобних сполук, таких як складні ефіри поліненасичених жирних кислот, і гідрофільних сполук, таких як нікотиніловий спирт; або - ацетонітрил, з тих же причин, що й 2М2В. Реакційні умови наведені в наступній таблиці 1: Таблиця 1 Реакційні умови, протестовані для трансетерифікації 70 %-них складних ефірів DHA-EE з нікотиніловим спиртом Спирт Середовище Нікотиніловий спирт Органічне (2М2В та ацетонітрил) Без розчинника 70 %-ні складні Загальний об'єм Молярне співвідношення Спирт ефіри DHA-EE, (М) (мл) спирт/складний ефір 0,43 0,64 12 1,5 1,5 4,5 3,5 3 Для кожної умови інкубують з 200 мг Novozyme® при 60 °C. Реакції в 2М2В, проведені на відкритому повітрі (у витяжній шафі) тестували при 60 °C з ×200 мг Novozyme®. Регулярні зразки обсягом 500 мкл беруть перед завершенням реакцій. Реакційний процес гасять центрифугуванням протягом 5 хвилин при 13000 об./хв, уможливлюючи видалення іммобілізованого ферменту із середовища. Всі зразки зберігають при 4 °C до аналізу. Контрольні реакції без ферменту та контрольні реакції без косубстрату (нікотиніловий спирт) проводили паралельно. Аналізи проводять із використанням двох методик ВЕРХ (з використанням апарата Agilent серії 1100) у відповідності з такими параметрами: Методика 1 - Колонка Zorbax SB-C18 (4,6 мм × 25 см) - Температура: 40 °C - Швидкість потоку: 1 мл/хв. - Елюент: 0,02 % метанол/оцтова кислота - Детектування: рефрактометрія - Час прогону: 15 хвилин Методика 2 - Колонка Zorbax SB-C18 (4,6 мм × 25 см) - Температура: 40 °C - Швидкість потоку: 3 мл/хв - Елюент: 50/50 ацетонітрил/ацетон - Детектування: рефрактометрія - Час прогону: 15 хвилин Зразки, узяті під час різних реакцій, розбавляють заздалегідь до концентрації менше 100 мм у суміші 0,02 % метанол/оцтова кислота у випадку методики 1 і в ацетоні у випадку методики 2. Результати та обговорення: Два продукти утворюються під час реакції трансетерифікації. Перший елююється при 4,15 хвилинах і відповідає продукту гідролізу складного ефіру, а другий елююється при 4,85 хвилинах при аналітичних умовах. Остання сполука відповідає продукту трансетерифікації між 70 %-ними складними ефірами DHA-EE і нікотиніловим спиртом. Тут очікується тільки один продукт, оскільки нікотиніловий спирт має тільки один первинний гідроксил. Відносні конверсії, отримані в різних реакційних умовах, наведені в наступній таблиці 2: 13 96156 14 Таблиця 2 Відносна конверсія, отримана під час трансетерифікації 70 %-них етилових ефірів DHA-EE з нікотиніловим спиртом Реакційні умови Ацетонітрил 2М2В 2М2В на відкритому повітрі* Без розчинника Без розчинника на відкритому повітрі* Відносні конверсії DHA-EE на DHA-нікотиніловий спирт 31 % через 72 год. 47 % через 48 год. 60 % через 118 год. 11 % через 72 год. 100 % через 72 год. *: у цьому випадку пробірку залишають відкритою для забезпечення можливості випаровування етанолу, утвореного під час реакції Швидкості конверсії вище, коли реакції здійснюють на відкритому повітрі; отриманий етанол, що зсуває рівновагу реакції убік синтезу DHAнікотинілового спирту, випарюють. Ці реакції трансетерифікації супроводжуються сильним почорнінням реакційної суміші. Продукти гідролізу з'являються переважно, коли як розчинник реакції використовують 2М2В. Однак слабка реакція гідролізу також присутня у середовищі без розчинника. Таким чином, із цього випливає, що вода присутня також у використовуваному нікотиніловому спирті, або що вологість навколишнього середовища викликає цю паразитну реакцію. Продемонстрували здійсненність реакцій трансетерифікації 70 %-них складних ефірів DHA-EE з нікотиніловим спиртом, при цьому такі реакції показали переважні швидкості конверсії, близькі до 90 % чи вище, зокрема, коли етанол, отриманий під час реакції, видаляють із реакційної суміші. Однак паразитна реакція гідролізу через присутність води у використовуваних розчинниках та/або вологість навколишнього середовища перешкоджає цим синтезам. Таким чином, здається цікавим спробувати уникнути спостережуваної паразитної реакції гідролізу. Наприклад, можна було б використовувати повністю безводні розчинники. Також можна проводити ці однакові реакції в присутності водовіддільника (хлорид літію, MgCl2 або силікагель, наприклад) для усунення будь-якої можливості гідролізу. Для реакції синтезу складного ефіру нікотиніловий спирт-DHA, етанол, отриманий під час реакції, очевидно, є елементом, що обмежує реакції. Його видалення зсуває рівновагу реакції убік синтезу розглянутих складних ефірів. Таким чином, доцільно оптимізувати це видалення, особливо при здійсненні синтезу при зниженому тиску. Це уможливлює швидке випаровування етанолу і, таким чином, збільшення швидкостей реакції. Приклад 3: Синтез піридин-3-ілметилдокозагексаноату з використанням ліпази; оптимізація трансетерифікації; випарювання етанолу, отриманого під час реакції, і усунення окисного потемніння Реакцію синтезу, аналогічну реакції із прикладу 2, здійснювали з використанням тих же вихідних продуктів (нікотиніловий спирт, 70 %-на ефірна суміш DHA-EE, Novozyme®) у середовищі без розчинника при 60 °C в присутності 200 мг Novozyme® зі співвідношенням спирту до складного ефіру, рівним 3. Використовуваний реактор є таким же, як реактор із прикладу 2, і методи аналізу є такими ж. Приклад 3.1: Єдина відмінність у порівнянні із прикладом 2 полягає в тому, що реакцію здійснювали у відкритій ємності (відкрита пробірка). Результати (фіг.): Реакція трансетерифікації є "повільною", займає в цілому приблизно 80 годин. Окисне потемніння присутнє. "Сильний" паразитний гідроліз присутній. Приклад 3.2: Єдина відмінність у порівнянні із прикладом 2 полягає в тому, що реакцію здійснювали під вакуумом. Результати (фіг.): Спостерігається прискорення реакції у порівнянні із прикладом 3.1, але вона залишається "повільною" та займає в цілому приблизно 48 годин. Крім того, окисне потемніння та паразитний гідроліз залишаються. Приклад 3.3: Єдина відмінність у порівнянні із прикладом 2 полягає в тому, що реакцію здійснювали при барботуванні азотом. Результати (фіг.): Спостерігається дуже істотне прискорення реакції, яка займає у цілому менше 3 годин внаслідок негайного видалення етанолу, отриманого під час реакції, та поліпшеної суміші. Відзначено відсутність окисного потемніння. Паразитний гідроліз сильно знижений. Приклад 4: Синтез складного ефіру DHA з пантенолом з використанням ліпази Експериментальні та аналітичні умови є такими ж, як у прикладі 2, за винятком таких відмінностей: Реакційні умови наведені в наступній таблиці 3: 15 96156 16 Таблиця 3 Реакційні умови, протестовані для трансетерифікації 70 %-них складних ефірів DHA-EE з пантенолом Спирт Середовище 70 %-ні складні ефіри DHA-EE,(М) Спирт Пантенол Органічне (2М2В та ацетонітрил) 0,43 1,28 Результати та обговорення: Два види елююють при 3,9 хвилинах та 4,14 хвилинах в аналітичних умовах. Пантенол має два первинних спирти. Таким чином, можна було б припустити продукцію декількох продуктів (максимум трьох). Однак для контролю без косубстрату (пантенол), з'являється пік при 4,14 хвилинах. Зазначений пік, таким чином, буде відповідати гідро Загальний об'єм Молярне співвідношення (мл) спирт/складний ефір 12 3 лізу етилового ефіру, пов'язаному із присутністю води у використовуваному розчиннику. Ця реакція спостерігається тільки в присутності ферменту. Отже, тільки перший пік відповідає синтезу складного ефіру пантенол-DHA. Відносні конверсії, отримані в різних реакційних умовах, наведені в наступній таблиці 4: Таблиця 4 Відносна конверсія, отримана під час трансетерифікації 70 %-них етилових ефірів DHA-EE з пантенолом Реакційні умови Ацетонітрил 2М2В 2М2В на відкритому повітрі* Відносні конверсії DHA-EE на DHA-пантенол 68 % через 136 год. 76 % через 115 год. 88 % через 96 год. *: у цьому випадку пробірку залишають відкритою для забезпечення можливості випарювання етанолу, отриманого під час реакції Із цього випливає, що відносна конверсія 70 %-них складних ефірів DHA-EE збільшується, коли реакцію здійснюють на відкритому повітрі. Дійсно, при цій умові етанол, отриманий під час реакції, випарюють. Рівновага реакції, таким чином, зсувається убік синтезу складних ефірів пантенол-DHA. Більш того, ці значення конверсії, звичайно, недооцінені внаслідок спільного випарювання 2М2В розчинника (ефект концентрування середовища). Ці реакції трансетерифікації також супроводжуються сильним почорнінням реакційної суміші. Продемонстрували здійсненність реакцій трансетерифікації 70 %-них складних ефірів DHA-EE з пантенолом, і такі реакції показали переважні швидкості конверсії, близькі до 90 % або вище, зокрема, коли етанол, отриманий під час реакції, видаляють із реакційної суміші. Однак паразитна реакція гідролізу внаслідок присутності води у використовуваних розчинниках та/або вологості навколишнього середовища перешкоджає цим синтезам. Таким чином, здається цікавим спробувати уникнути спостережуваної паразитної реакції гідролізу. Наприклад, можна було б використовувати повністю безводні розчинники. Також можна проводити ці однакові реакції в присутності водовіддільника (хлорид літію, MgCl2 або силікагель, наприклад) для усунення будь-якої можливості гідролізу. Для реакції синтезу складного ефіру пантенолDHA, етанол, отриманий під час реакції, очевидно, є лімітувальним елементом реакції. Його видалення зсуває рівновагу реакції убік синтезу розглянутих складних ефірів. Таким чином, доцільно оптимізувати це видалення, особливо при здійсненні синтезу при зниженому тиску. Це уможливлює швидке випарювання етанолу і, таким чином, збільшення швидкостей реакції. Приклад 5: Порівняльні результати дії ЕРА і DHA на надшвидкий потік калію і, таким чином, на фібриляцію передсердь Серцевий потенціал дії є основною електричною одиницею збудливих клітин серця та означає активність декількох типів іонних каналів, відповідальних за різні фази потенціалу дії. Різні типи потенціалів дії відповідають різним областям у серці, у такий спосіб забезпечуючи послідовну та координовану активність у цих областях. Із цієї причини, калієві канали Kv 1.5, кодовані геном KCNA5, експресуються тільки в передсердній тканині та відповідають за надшвидкий потік калію (ІKur), що бере участь у реполяризації передсердного потенціалу дії. Ця високолокалізована експресія Kv 1.5 є фактично мішенню вибору для лікування фібриляції передсердь, патології, при якій спостерігаються зміни в передсердних потенціалах дії. Таким чином, досліджували ефекти DHA і ЕРА на ІKur. Для цієї мети людську ізоформу каналу Kv 1.5 (hKv 1.5) переносили у стабільний спосіб в клітини НЕК 293 (ембріональна нирка людини), і потік, що є результатом активності цих каналів, дос 17 96156 ліджували з використанням методу петч-кламп (patch-clamp) на цілій клітині. Матеріали та методи Підтримання клітинної лінії. Клітини НЕК 293-hKv 1.5 вирощують в стандартних умовах (37 °C, інкубатор при 95 % О2 і 5 % СО2) у чашках Falcon до 80 %-ної конфлюентності. Потім їх переносять і культивують на 35 мм чашках Петрі, що містять таке культуральне середовище: DMEM (Invitrogen); 10 % фетальної бичачої сироватки (Invitrogen); суміш 100 од./мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину та 0,25 мг/мл глутаміну (Invitrogen); і 1,25 мг/мл Geneticin® як селективного антибіотика. Електрофізіологія ІKur досліджують із використанням методу петч-кламп на цілій клітині при температурі навколишнього середовища (19-22 °C). Середовище для піпетування містить: 125 мМ К-аспартату, 20 мМ КСl, 10 мМ EGTA, 5 мМ HEPES, 5 мМ Mg 18 ATP, 1 мМ MgCl2,pH 7,3 (КОН). Позаклітинне середовище містить: 140 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, 5 мМ D(+)-глюкози, 5 мМ КСl, 2 мМ СаСl2, 1 мМ MgCl2, pH 7,4 (NaOH). ІKur індукують кожні 15 секунд за допомогою 300 мс, +60 мВ деполяризуючих імпульсів з -80 мВ утримуючого потенціалу з наступною -50 мВ реполяризацією. Амплітуду піка потоку встановлюють на основі максимального потоку, отриманого під час перших 100 мс деполяризуючого імпульсу. Амплітуду потоку наприкінці імпульсу визначають під час останніх 20 мс деполяризуючого імпульсу. Реагенти DHA і ЕРА поставляються фірмою Sigma. Вихідні розчини (10 мМ) готують в етанолі, і кінцева концентрація розчинника становить 0,25 %. Результати: Результати наведені в наступній таблиці 5. Таблиця 5 Процентне інгібування ІKur за допомогою DHA і ЕРА при різних концентраціях DHA Пік ІKur Концентрація 1 мкм 3,2 мкм 5,6 мкм 10 мкм 25 мкм Середнє 8,2 10,9 15,4 22,6 58,1 Кінець імпульсу ІKur Середнє SEM 10,1 5,8 14,5 6,5 33,7 7,8 78,0 4,2 86,5 3,4 SEM 6,3 6,9 4,8 4,0 13,6 n 5 5 6 6 5 SEM - стандартна помилка середнього ЕPA Пік ІKur Концентрація 1 мкМ 3,2 мкМ 10 мкМ 25 мкМ Середнє 14,6 16,1 17,5 5,4 SEM 1,7 3,1 6,4 6,8 ЕРА дещо зменшує амплітуду піка ІKur (максимальне інгібування 17,5±6,4 %, n=10, р