Композиція, що містить антиген і ліпополісахарид у формі масло-в-воді, та спосіб її використання (варіанти)

Реферат: Винахід стосується композиції для індукції імунної відповіді у тварин, яка містить антиген і ліпополісахарид у формі масло-в-воді, де ліпополісахарид включає бактеріальний ЛПС J5 з Е. соlі, і де форма масло-в-воді включає рідке парафінове масло в суміші з триолеатом сорбіту і/або полісорбатом 80; способу вакцинації тварини такою композицією; способу індукції або UA 115053 C2 (12) UA 115053 C2 стимуляції антиген-специфічного гуморального і клітинного імунітету у тварини; способу вакцинації свиней і поросят проти Mycoplasma hyopneumoniae; способу захисту поросят від захворювань, що викликаються Mycoplasma hyopneumoniae. UA 115053 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується нових композицій для створення імунної відповіді у ссавців. Винахід також стосується способів вакцинації ссавців проти патогенів, а також способів захисту ссавців від захворювань. Винахід грунтується, зокрема, на конкретних ад'ювантах, які викликають сильні і стабільні імунні відповіді. Винахід зокрема підходить для вакцинації свиней проти мікоплазменних інфекцій. Передумови створення винаходу Mycoplasma hyopneumoniae (Mh) є етіологічним агентом ензоотичної пневмонії свиней. Це одне з найбільш важливих захворювань, що уражають свиней і звичайно призводять до найбільш важких втрат тварин. Захворювання найчастіше призводить до недостатнього набору маси тіла і хворобливості у тварин. Mh-інфіковані свині також схильні до вторинної інфекції, що в кінцевому наслідку приводить до загибелі. Були зареєстровані різні вакцини для захисту свиней від інфекції, викликаної Mycoplasma hyopneumoniae. До них належать, наприклад, вакцини, що містять поверхневі антигени Mh (EP283840), вакцину, що включає клітинну стінку Mh або вакцини, що містять живі чи інактивовані бактерії Mh (US3,917,819, W02009/61798). Вищевказані вакцини, тим не менше, не завжди забезпечують достатній захист у вакцинованих свиней. Зокрема, ці вакцини, очевидно, не викликають адекватної клітинної і гуморальної відповіді для формування ефективного захисту у тварин. Вакцини, що містять інактивовані штами Mh, є комерційно доступними, наприклад, Respifend (R). Ця вакцина вимагає декількох ін'єкцій. Існує потреба в покращених композиціях, що індукували б кращу імунну відповідь у тварин, для створення сильнішого захисту проти захворювань, викликаних патогенними агентами, такими як Mh. Короткий виклад суті винаходу Даний винахід забезпечує композиції і способи, які викликають ефективну імунну реакцію проти патогенів у ссавців, і можуть бути використані для запобігання виникненню та/або зменшення тяжкості захворювання, викликаного такими патогенами, або щоб коректувати або полегшити, щонайменше, один симптом, пов'язаний з хворобою. Перший аспект винаходу полягає, зокрема, в композиції, яка містить антиген і ліпополісахарид в формі масло-в-воді. Як буде продемонстровано, заявник виявив, що поєднання ЛПС і композиції масло-в-воді дозволяє стимулювати як клітинний, так і гуморальний імунітет, і індукує збалансовану Thl/2 відповідь, яка придатна для ефективного захисту ссавців проти захворювань, що викликаються патогенами. У конкретному варіанті здійснення композиція включає в себе декілька антигенів, і є ефективною для індукції імунної відповіді проти різних патогенів. У переважному варіанті здійснення, щонайменше один антиген являє собою бактеріальний антиген, переважно являє собою інактивовану бактерію. Ще одним аспектом даного винаходу є вакцина, що містить антиген і ліпополісахарид у формі масло-в-воді. Ще одним аспектом даного винаходу є вакцина, що містить патогенний антиген і ліпополісахарид у формі масло-в-воді, для використання для захисту ссавців, що не є людьми, від захворювань, викликаних патогенами. Винахід також стосується методу вакцинації ссавців, що не є людьми, проти патогенів, що полягає у введенні тварині композиції або вакцини, що містить патогенний антиген і ліпополісахарид у формі масло-в-воді. Крім того, винахід стосується способу індукції або стимуляції антиген-специфічного гуморального і клітинного імунітету у тварини, що не є людиною, що включає введення тварині композиції або вакцини, яка містить бактеріальний антиген і ліпополісахарид в формі масло-в-воді. Інший аспект даного винаходу полягає в способі вакцинації свиней і поросят проти Mycoplasma hyopneumoniae (Mh), що включає введення вказаним свиням або поросятам композиції або вакцини, що містить інактивовану Mh і ліпополісахарид в формі масло-в-воді. Винахід також стосується способу захисту поросят від захворювання, що викликається, що полягає у введенні тварині композиції або вакцини, що містить інактивовану Mh і ліпополісахарид у формі масло-в-воді. Інший аспект даного винаходу стосується способу захисту тварин проти захворювання, що викликається Mycoplasma hyopneumoniae і/або зменшення тяжкості захворювання у вказаних тварин, що полягає у введенні тварині композиції або вакцини, що містить інактивовану Mh і полісахарид у формі масло-в-воді. Короткий опис фігур креслення 1 UA 115053 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 1. Гуморальна та клітинна імунна відповідь вакцинованих поросят. Фіг. 2: порівняння маси тіла свиней на момент зараження (D175) і забою (D204). Фіг. 3: Середні значення кумулятивних оцінок легень вакцинованих і контрольних тварин. Фіг. 4: Гуморальна імунна відповідь поросят. Детальний опис винаходу Даний винахід стосується способів і композицій для вакцинації ссавців, які не є людиною, проти патогенів. Це особливо стосується захисту тварин від захворювань, що викликаються зазначеними патогенами, або зниження тяжкості, тривалості або симптомів зазначених захворювань. Це застосовне до вакцинації будь-яких ссавців, включаючи свиней, поросят, собак, котів, коней, корів або телят. Це особливо стосується вакцинації свиней і поросят проти Mycoplasma hyopneumoniae. Як зазначено вище, даний винахід стосується нових композицій, що містять антиген і ліпополісахарид в формі масло-в-воді. Такі композиції напрочуд стимулюють як клітинний, так і гуморальний імунітет у тварин, яким застосовуються, і індукують збалансовану Thl/2 відповідь, що ефективно захищає ссавців від захворювань, що викликаються патогенами. Наші результати також показують тривалість захисного імунітету 6 місяців після вакцинації композицією за винаходом у великому дослідженні з експериментальним зараженням з використанням 1 дози вакцини у віці 3 тижнів в імунізованих свиней і невакцинованих контролів. Вакцина запобігає втраті ваги через ензоотичну пневмонію (ЕП) і значно зменшує тяжкість патологічних процесів через інфекцію, викликану Mycoplasma hyopneumoniae. Антиген(и) в композиції можуть бути різного походження. Зокрема, антиген(и) можуть бути цілим патогеном (наприклад, клітина, вірус) або його частиною або екстрактом, такими як мембрана, органела, супернатант, білок або його фрагмент (наприклад, пептид), нуклеїнова кислота, ліпід або їх комбінація. Іноді антиген називають "патогенним" антигеном, оскільки він походить від патогену, навіть якщо він сам по собі не патогенний. У переважному варіанті здійснення антиген представляє собою цілу клітину або вірус у живій, інактивованій або вбитій формі. Антиген може також бути рекомбінантним вірусом, що включає імуногенний епітоп. У більш переважному варіанті здійснення композиція містить щонайменше один інактивований або вбитий вірус або бактерію, такі як одна інактивована або вбита бактерія Mh. Інактивований або вбитий означає вірус або бактерію, що втратили здатність викликати захворювання у ссавців, але зберігають їх імуногенні властивості, зокрема, здатність викликати специфічну імунну відповідь. Термін "інактивована бактерія" включає невірулентну бактерію. Способи отримання або селекції інактивованих бактерій або вірусів добре відомі в даній галузі техніки. Вони включають в себе способи термічної або хімічної інактивації. Інактивація може бути здійснена шляхом впливу на бактерію або вірус хімічним агентом, таким як формалін, формальдегід, параформальдегід, [3-пропіолактон, етиленімін, бінарний етиленімін (BEI), тимеросал, або їх похідні. Альтернативно, інактивація може бути здійснена фізичними процедурами, такими як термічна обробка або обробка ультразвуком. Способи інактивації добре відомі фахівцям в даній галузі техніки. Інактивований патоген може бути концентрований традиційними методами концентрації, зокрема, шляхом ультрафільтрації, і/або очищений звичайними способами очищення, зокрема, за допомогою хроматографічних методів, включаючи, але не обмежуючись гель-фільтрацію, центрифугування на градієнті сахарози, або селективну преципітацію, зокрема в ПЕГ. У типовому варіанті здійснення бактерія інактивується етиленіміном з використанням кінцевої концентрації 500 мікрограмів/мл. Інактивація проводиться при 37С протягом 24 годин і зупиняється додаванням натрію тіосульфату. У переважному варіанті здійснення композиція включає кількість антигену, достатню для того, щоб викликати або стимулювати імунну відповідь проти патогену у тварин, що підлягають впливу. Точна кількість, необхідна для імунологічно ефективної дози, може варіювати від суб'єкта до суб'єкта, залежачи від таких факторів як вік і загальний стан суб'єкта, природа композиції і шлях введення. Відповідна "ефективна кількість" може бути визначена фахівцем із звичайною кваліфікацією в даній галузі з використанням тільки звичайних експериментів. Наприклад, способи для визначення або титрування прийнятного дозування вакцини, щоб знайти мінімальні ефективні дози на основі маси тварини суб'єкта, що не є людиною, концентрації вакцини та інших типових чинників, є відомими в даній галузі. Дозування вакцини, концентрація компонентів в ній і час введення вакцини, які викликають необхідну імунну відповідь, можуть бути визначені за допомогою методів, наприклад, шляхом титрування антитіл сироватки, наприклад, ІФА та/або реакції нейтралізації сироватки і/або оцінкою реакції на вакцинацію. 2 UA 115053 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Коли антиген являє собою цілу бактерію (живу, інактивовану або вбиту), переважним є 2 11 3 11 використання доз між приблизно 10 і 10 клітин/дозу, більш переважно від 10 до 10 . 7 10 Переважні дозування знаходяться в межах між 10 і 10 клітин/дозу. Також, композиції можуть містити декілька різних антигенів, зокрема 1, 2 або 3, тим самим захищаючи тварин, які піддаються впливу, проти різних патогенів. У конкретному варіанті здійснення композиція містить щонайменше один антиген, отриманий із щонайменше одного з наступних патогенних агентів: Actinobacillus pleuropneumoniae; Adenovirus; Alphavirus такий як вірус Східного енцефаліту коней; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., переважно B. hyodysenteriae, B. pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, переважно біовари 1,2 і 3; вірус класичної лихоманки свиней, вірус Африканської лихоманки свиней; Chlamydia і Chlamydophila sp. і переважно C. pecorum і C. abortus; Clostridium spp., переважно Cl. difficile, Cl. perfringens типи A, B and C, Cl. novyi, Cl. septicum, Cl. tetani; шлунково-кишкові і респіраторні коронавіруси; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp.; Eperythrozoon suis, в даний час перейменований у Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, переважно субтипи 1, 7 і 14; вірус гемаглютинуючого енцефаломієліту; Isospora suis; вірус японського енцефаліту; Lawsonia intracellularis; Leptospira spp., переважно Leptospira interrogans 55 lato, Leptospira borgpetersenii, Leptospira inadai, Leptospira meyeri, Leptospira noguchii, Leptospira santarosai, Leptospira weilii, Leptospira wolbachii, включаючи штами із серогруп і сероварів australis, canicola, grippotyphosa, hardjo, Icterohaemorrhagiae, sejroe, Pomona і tarassovi; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp. переважно, M. avium, M. intracellulare і M. bovis: Mycoplasma hyopneumoniae; Parvovirus; Pasteurella multocida; Porcine cytomegolovirus; Porcine parovirus, Porcine reproductive і респіраторні віруси: Pseudorabies virus; Rotavirus; вірус Sagiyama; Salmonella spp. переважно, S. enterica, S. thyphimurium і S. choleraesuis; Staphylococcus spp. переважно, S. hyicus; Streptococcus spp., переважно Strep. suis; цитомегаловірус свиней; вірус герпесу свиней; вірус грипу свиней; Swine pox virus; Toxoplasma gondii; вірус везикулярного стоматиту і вірус екзантеми свиней; або інші ізоляти і субтипи свинячого цирковірусу. У переважному варіанті здійснення композиція містить антиген з щонайменше одного з наступних патогенів: Mycoplasma hyopneumoniae, вірус репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRS), парвовірус свиней (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, лептоспіри, вірус грипу свиней, антиген Escherichia coli, респіраторний коронавірус свиней, ротавірус, патоген що викликає захворювання Aujesky, патоген, що викликає трансмісивний гастроентерит свиней. У більш переважному варіанті здійснення композиція містить інактивовану або вбиту Mh і, необов'язково, один антиген PCV2. PCV2-інфекції або асоційовані захворювання включають, зокрема, мультисистемний синдром виснаження після відлучення (PMWS), синдром дерматиту і нефропатії свиней (PDNS), комплексне респіраторне захворювання свиней (PRDC), репродуктивні розлади, гранулематозний ентерит, ексудативний епідерміт, некротичний лімфаденіт, і вроджений тремор. Переважно, тварина, що не є людиною, така як свиня, захищена в такій мірі, в якій від одного до всіх побічних фізіологічних симптомів або ефектів PCV2-інфекції значно знижуються, зменшуються або повністю запобігаються. В іншому переважному варіанті здійснення, композиція містить інактивовану або вбиту Mh і, необов'язково, один PRRS антиген. Композиція містить ліпополісахарид і масло для створення форми масло-в-воді. Як показано в прикладах, така конкретна композиція не викликає сильної і стабільної імунної відповіді у тварин, що піддаються впливу. Зокрема, композиція індукує клітинну і гуморальну імунну відповідь, з правильним балансом Thl/Th2, що підходить для ефективного захисту тварин від хвороб, викликаних патогеном. ЛПС для використання в даному винаході являється переважно бактеріальним ЛПС, зокрема, отриманим з E. coli. ЛПС є комерційно доступним і може бути отриманий з різноманітних джерел. Він переважно є очищеним з E. coli супернатантом, найбільш переважно на день 5. ЛПС для використання у винаході повинен бути фармацевтично сумісним. Також, 2 4 переважним є використання ЛПС у кількості між 5×10 і 5×10 EU/мл, навіть більш переважно 3 4 3 між 10 і 10 EU/мл, типово в кількості близько 5×10 EU/мл. Альтернативно, ЛПС використовується у 0,1-2,5 % об./об. в композиції, більш переважно нижче 1 % об./об. У конкретному прикладі ЛПС є ЛПСJ5 з E coli. Масло зазвичай присутнє в композиції в кінцевій концентрації близько 1-50 % (об./об.) і більш типово в кінцевій концентрації близько 10-35 % (об./об.), типово 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, або 30 % (об./об.). У переважному варіанті здійснення масло присутнє в кінцевій концентрації 3 UA 115053 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 між 10-20 % (об./об.). У конкретному варіанті здійснення, масло присутнє в концентрації близько 15 % (об./об.). Отримані результати показують, що при високому вмісті масла (наприклад, між 10-25 %), композиція індукує сильну відповідь, навіть при низькій дозі антигену. Переважною композицією даного винаходу є композиція масло-в-воді, що містить інактивовані або убиті бактерії, ЛПС, і 10-20 % (об./об.) масла, більш переважно 12-18 % (об./об.) масла. Більш переважна композиція даного винаходу є композицією масло-в-воді, що містить 2 інактивовані або вбиті бактерії, принаймні, 5×10 EU/мл ЛПС, і 10-20 % (об./об.) масла. Ще більш переважною композицією даного винаходу є композиція масло-в-воді, що містить 3 2 щонайменше 10 інактивованих бактерій, щонайменше 5×10 EU/мл ЛПС і 10-20 % (об./об.) масла. Конкретним прикладом композиції винаходу є композиція типу масло-в-воді, що містить 3 3 щонайменше 10 інактивованих бактерій, близько 5×10 EU/мл ЛПС і близько 15 % (об./об.) масла. У найбільш переважному варіанті здійснення бактерією є інактивована або вбита або невірулентна Mh. Масло для композиції може бути вибране з безлічі комерційно доступних масел. Вони включають рослинні масла, мінеральні масла, тваринні масла та їх комбінації. Приклади рослинних масел включають або можуть бути отримані з арахісового масла, сафлорової олії, оливкової олії, бавовняної олії, кукурудзяної олії, кунжутної олії або кокосового масла. Приклади мінеральних масел включають або можуть бути отримані з легкого рідкого парафінового масла або важкого рідкого парафінового масла. У переважному варіанті масло містить рідке парафінове масло, більш переважно світле рідке парафінове масло. У ще одному переважному варіанті масло містить рідке парафінове масло в суміші з сорбітаном триолеатом та/або полісорбатом 80. Комбінація може бути зроблена у відповідності з наступними пропорціями: легке рідке парафінове масло 50-80 %), переважно 58-70 %) об./об. 13-18 %o, переважно 15-17 % триолеат сорбіту об./об. полісорбат80 7-32 %, переважно 13-25 % об./об. У конкретному варіанті здійснення, масло являє собою MixA, з наступним складом: легке рідке парафінове 60-63 % об./об. масло сорбітан триолеат 15-16 % об./об. полісорбат80 25-21 % об./об. Композиція за винаходом може містити додаткові інгредієнти. Зокрема, в переважному варіанті здійснення композиція даного винаходу являє собою вакцину, і може містити додаткові інгредієнти, такі як фармацевтично прийнятні носії, наповнювачі, розріджувачі, заморожені висушуючі стабілізатори, змочувальні або емульгуючі агенти, рН буферні агенти, добавки для підвищення гелеутворення або в'язкості і консерванти, в залежності від шляху введення. Приклади фармацевтично прийнятних носіїв, наповнювачів або розріджувачів включають, але не обмежуються ними, демінералізовану або дистильовану воду; сольовий розчин; леткі силікони; сквален; похідні целюлози, такі як метилцелюлоза, етилцелюлоза, карбоксиметилцелюлоза, натрієва сіль, або гідроксипропілметилцелюлоза; нижчі алканоли, наприклад етанол або ізопропанол; нижчі аралканоли; нижчі поліалкіленгліколі або нижчі алкіленгліколі, наприклад, поліетиленгліколь, поліпропіленгліколь, етиленгліколь, пропіленгліколь, 1,3-бутиленгліколь або гліцерин; складні ефіри жирних кислот, такі як ізопропілпальмітат, ізопропілміристат або етилолеат; полівінілпіролідон; агар; карагенан; трагакантову камедь або камедь акації, і вазелін. Типово, носій або носії утворюють від 10 % до 99,9 % по масі композиції вакцин, і може бути забуферений звичайними методами з використанням реагентів, відомих в даній галузі техніки, таких як натрію гідрофосфат, дигідрофосфат натрію, гідрофосфат калію, дигідрофосфат калію, їх суміші тощо. Прикладами стабілізатора виморожування висушуванням можуть бути, наприклад, вуглеводи, такі як сорбіт, маніт, крохмаль, сахароза, декстран або глюкоза, білки, такі як альбумін або казеїн та їх похідні. Композиції або вакцини можуть бути рідкими композиціями, такими як водний розчин, емульсії вода-в-маслі або масло-в-воді, сироп, еліксир, настойки, препарат для парентерального, підшкірного, внутрішньошкірного, внутрішньом'язового або внутрішньовенного введення (наприклад, введення ін'єкцією), такими як стерильні суспензії або 4 UA 115053 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 емульсії. Такі форми відомі в галузі техніки і типово готуються розчиненням антигену та інших типових добавок у відповідному носії або системах розчинників. Рідкі композиції також можуть включати суспензії та емульсії, які містять суспендуючі або емульгуючі агенти. Шлях введення може бути черезшкірний, нанесення на слизові оболонки або парентеральний (інтрадермальний, внутрішньом'язовий, підшкірний, вн утрішньовенний або інтраперитонеальний). Вакцини композиції даного винаходу можна вводити окремо, або можна вводити спільно або послідовно вводити з іншими способами лікування або терапії. Даний винахід також стосується способу імунізації або індукції імунної відповіді у свиней, що включає введення вакцини, як описано вище, а також методу вакцинації свиней, і способів лікування та/або профілактики інфекційних захворювань. Вакцини даного винаходу можуть бути зручно введені інтраназально, трансдермально (наприклад, наносити на або по поверхні шкіри для системної абсорбції), парентерально, через очі і т.п. Парентеральний шлях введення включає, але не обмежується ними, внутрішньом'язовий, внутрішньовенний, інтраперитонеальний шляхи тощо. Дозування вакцини, складеної згідно з даним винаходом, буде залежати від виду, породи, віку, розміру, вакцинального анамнезу, стану здоров'я тварини, що підлягає вакцинації, так само як і шляху введення – підшкірний, інтрадермальний, пероральний, внутрішньом'язовий або внутрішньовенний. Вакцини даного винаходу можуть бути введені у вигляді разової дози або в повторних дозах. Вакцини даного винаходу можуть бути введені окремо або можуть бути введені одночасно або послідовно з однією або декількома додатковими композиціями, такими як, наприклад, інші імуногенні композиції або вакцини для свиней. Де композиції вводять з різницею в часі, введення можуть бути відокремлені одне від одного або перекриватися в часі. Як правило, вакцину вводять у дозі в межах від 0,5 до 3 мл кожна. Вакцини даного винаходу особливо підходять для застосування у свиней, дорослих свиней, а також молодих свиней, поросят або вагітних особин, або інших видів ссавців, що не є людиною. Вакцинація вагітних особин забезпечує пасивний імунітет у новонароджених через передачу материнських антитіл. Свині можуть бути молодшими, ніж 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 тиждень; від 1 до 6 тижнів; від 2 до 5 тижнів; або від 3 до 4 тижнів. Наприклад, "тест"тваринам може бути введена вакцина за винаходом для того, щоб оцінити продуктивність вакцини з метою її подальшого використання або розробки вакцини для свиней. Бажано, вакцина вводиться суб'єкту, який іще не контактував із патогеном. Переважно, суб'єктом є свиня, що потребує вакцинації проти мікоплазменної інфекції, мультисистемного синдрому виснаження після відлучення (PMWS) і/або синдрому дерматиту і нефропатії свиней (PDNS). Даний винахід надає контейнер, що містить імунологічно ефективну кількість вакцини, як описано вище. Винахід також надає вакцинальні набори, що містять необов'язково стерильний контейнер з імунологічно ефективною кількістю вакцини, засоби для введення вакцини свиням, і нарешті інструкцію, що містить інформацію щодо введення імунологічно ефективної кількості композиції свиням для лікування та/або профілактики інфекційних захворювань. Даний винахід далі стосується способу отримання антитіла, яке здатне зв'язуватися з патогеном або його субодиницею. Спосіб може включати імунізацію тварини, такої як кролик, морської свинки, або гризуна та збирання антитіл, продукованих ними. Антитіла винаходу можуть бути поліклональними або моноклональними препаратами антитіл, моноспеціфічними антисироватками, людськими антитілами, або можуть бути гібридними або химерними антитілами, такими як гуманізовані антитіла, змінені антитіла (Fab')2фрагменти, F(ab) фрагменти, Fc-фрагменти, одно-доменні антитіла, димерні або тримерні фрагменти антитіл або конструктів, або їх функціональні фрагменти, які зв'язуються з антигеном, про який йде мова. Антитіла можуть бути отримані з використанням методик, добре відомих фахівцям в даній галузі і описані в "A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988)”. Нижченаведене приводиться для ілюстрації варіантів здійснення винаходу і не повинне розглядатися як таке, що обмежує об'єм винаходу. Приклади 1. Приготування вакцинної композиції Склад вакцини об./об. % Водна фаза (що містить ад'ювант E. coli J5 ЛПС) 85 5 UA 115053 C2 Масло (MixA) 15 Ад'юванти Назва MixA масло E. coli J5 ЛПС 5 10 15 Композиція Хімічний опис об./об. % Легке рідке парафінове 60-63 масло Сорбітан триолеат 15-16 Полісорбат 80 25-21 ЛПС Використовувана кількість вакцини 15 об./об. % 3 5×10 EU/мл Підготовка/метод емульгування Метод емульгування є процедурою змішування в один крок. Всі інгредієнти (поверхневоактивні речовини) змішують в маслі, потім масляну фазу додають до водної фази, яка містить необхідну кількість антигену і ад'ювантного компонента кишкової палички J5 ЛПС, при перемішуванні. Немає необхідності для спеціальної стадії гомогенізації. - Почніть змішування стерилізованого масляного ад'юванта кімнатної температури (2025 °C) і мішайте його протягом не менше 20 хвилин. - Почніть додавання масляного ад'юванта у водну фазу через стерильний вхідний отвір при енергійному перемішуванні. Енергійне перемішування водної фази є необхідним (280-320 об./хв.). Швидкість додавання максимально має бути 4-8 кг/хвилину. Після додавання емульсія перемішується щонайменше 60 хвилин при тих самих об./хв. За цим методом, додаткові вакцини отримують використанням наступного складу: об./об. % Водна фаза (що містить ад'ювант E. coli J5 ЛПС) Масло (MixA) 90 10 об./об. % Водна фаза (що містить ад'ювант E. coli J5 ЛПС) Масло (MixA) 20 80 20 2. Приготування додаткових вакцинних композицій. 3. Наступні вакцинні препарати були приготовані. Таблиця 1 Склад вакцин вакцина Масло 1 2 3 4 5 25 30 MixA MixA MixA MixA MixA CCU/мл 8 3×10 9 2,81×10 9 2,81×10 9 9,35×10 9 9,35×10 Антиген (Mh) ATP lum./mL OD540/мл до після 5 6,77×10 506,1 0,150 5 6,77×10 0,087 5 6,77×10 0,087 6 2,26×10 0,291 6 2,26×10 0,291 об./об. % Масло (об./об. %) J5ЛПС (об./об. %) 0,60 0,51 0,51 1,70 1,70 15 15 10 15 10 2 0,4 0,4 0,4 0,4 4. Імунний захист Імунний захист проти інфекції, викликаної Mycoplasma hyopneumoniae (Mh), опосередковується як гуморальною, так і клітинною ланками імунної системи, з більшим акцентом на останній. Тому, для ефективної вакцини Mh дуже важливо на додаток до антитільної індукувати клітинно-опосередковану імунну відповідь (CMI) у свиней. Завдяки використанню вакцинних композицій із прикладу 2 ми змогли створити збалансовану Thl/Th2 імунну відповідь у свиней при вакцинації інактивованою Mh вакциною. Матеріали і методи 6 UA 115053 C2 Шість груп із 10 чотиритижневих поросят, серонегативних до Mh були імунізовані однократно у віці 3 тижнів (D21) композицією масло-в-воді, що містить інактивований антиген Mh плюс нетоксичний ЛПС ад'ювант, отриманий з E. coli J5 у різних комбінаціях доз (Таблиця 2). Таблиця 2 Вакцинні препарати, застосовані до 6 груп поросят. Вакцина відповідає вакцині # в таблиці 1 Вакцина 1 2 3 4 5 контроль Антиген низький низький низький високий високий Масло високий високий низький високий низький високий ЛПС високий низький низький низький низький низький 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Тест гіперчутливості сповільненого типу (DTH) проводився на половині кожної групи на день 40 за допомогою внутрішньошкірних ін'єкцій очищеного Mh антигену. Фітогемаглютинін (PHA) в концентрації 20 мкг/мл в 0,1 мл використовувався як позитивний контроль. Товщину шкіри вимірювали за допомогою цифрового супорту, чутливого до тиску (Mitutoyo, Японія). Зразки крові відбиралися у другої половини кожної групи на інтерферон-гамма (IFNy) ELISPOT і антитіла ІФА на день 40. Для кількісної оцінки антиген-специфічної секреції цитокінів in vitro стимульованими РВМС використовували набір IFNy ELISPOT для свиней (R&D, США), і ELISPOT рідер (CTL, США). Коротко, відділені РВМС поміщали в PVDF-донні 96-ямкові планшети в двох примірниках 5 при 5×10 клітин на ямку і стимулювали концентрованим очищеним Mycoplasma hyopneumoniae антигеном. Нестимульовані клітини використовувалися як негативний контроль. Стимульовані PHA клітини і рекомбінантний свинячий IFN-γ служили як позитивні контролі, відповідно. Після 72-96 годин інкубування при кімнатній температурі (RT) клітини були промиті, і біотинільовані анти-pIFN-γ антитіла були виміряні в ямках при інкубуванні протягом ночі при 4 °C. Плямоутворення візуалізували через 2 години інкубування з кон'югатом стрептавідину-AP при кімнатній температурі з наступним 1-годинним інкубуванням з субстратом BCIP/NBT при кімнатній температурі. Кількість плям на ямку аналізували за допомогою аналізатора CTL ELISPOT (S5 Versa). Титр Mh-специфічних антитіл сироватки визначався непрямим ІФА (ELISA). Результати На фіг. 1 показаний ефект різних композицій на клітинний і гуморальний імунітет. Цікаво, що сама по собі вища доза антигену не збільшує гуморальну відповідь, в той час як дещо підвищує обидва типи клітинно-опосередкованої відповіді (Група 5 проти 3). Найбільш збалансований Thl/Th2 ад'ювантний ефект був досягнутий у масляній композиції з високим ЛПС+ при низькій дозі антигену (Група 1 проти 3). У цьому ефекті ЛПС відіграє основну роль (Група 1 проти 2). Ефект масляного ад'юванта був більш виражений при високій дозі антигену (Група 4 проти 5), ніж при низькій дозі антигену (Група 2 проти 3). Заключення і обговорення Тут ми описали ад'ювантний ефект різних вакцинних препаратів на клітинну імунну відповідь і титр антитіл в сироватці крові, виміряний DTH, IFNy ELISPOT і кількісним методом ІФА (ELISA), відповідно. Композиція масло-в-воді в комбінації з нетоксичним ад'ювантом ЛПС приводила до збалансованої Thl/Th2 імунної відповіді у серог=негативних тварин. Ця композиція надає довготривалу клітинно-опосередковану і гуморальну імунну пам'ять. 4. Тривалість імунітету після однієї дози вакцини Mycoplasma hyopneumoniae у свиней Mycoplasma hyopneumoniae є етіологічним агентом ензоотичної пневмонії (ЕП) у свиней. Захворювання характеризується високою захворюваністю у тварин середнього віку і віку забиття, тим не менш, циркуляція збудника починається, як правило, вже в розпліднику після змішування поросят. Тяжкість клінічних проявів сильно залежить від вірулентності і інфікуючої дози штаму M. hyopneumoniae (M.h.). Метою даного дослідження було підтвердити, що вакцинами за винаходом забезпечується шестимісячний захист проти важкого захворювання. Матеріали і методи: Дизайн дослідження, всього 25 M.h. серонегативних 3-тижневих поросят були розділені на 2 окремі групи. Дванадцять поросят групи 1 (Г1) отримували 1-дозну вакцинацію вакциною №2 таблиці 1 у день 0 (Д0). Тринадцять невакцинованих контрольних 7 UA 115053 C2 5 10 15 20 25 поросят такого самого віку були залучені у досліджувану групу 2 (Г2). Зараження проводили у віці відгодівлі, два дні поспіль на Д175 і Д176. Всіх тварин інтраназально заражали високою дозою M.h (91ogl0 одиниць зміни кольору/тварину). Вони спостерігалися на предмет виникнення респіраторних симптомів протягом 28 днів, а потім умертвляли для аутопсії і оцінки стану легень на Д204 у віці близько 6,5 місяців. Клінічні і посмертні параметри використовувались у обох дослідженнях: 1) респіраторні симптоми, 2) ректальна температура, 3) маса тіла, 4) оцінка стану легень проводилась у відповідності Європейською фармакопеєю. Уражені ділянки долі були виражені у відсотках відносно маси цілої долі. Підрахунок кінцевих (або кумулятивних) значень балів був здійснений мультиплікаційним фактором, залежним від долі легень (1). Результати: 1) Протягом періоду спостереження після зараження смертей, пов'язаних з ЕП, не було. Ні у вакцинованих, ні у контрольних тварин не було респіраторних симптомів. 2) Після не спостерігалось лихоманки ні в контролі (Г2), ні у вакцинованих тварин (Г1). 3) Середня маса тіла вакцинованих була на 3,8 кг вище, ніж у контролів (G2) (див. Фіг. 2). 4) Загальний бал оцінки легень контрольних тварин був у 7,75 разів вище, ніж у вакцинованих свиней в Г1. Різниця була значущою на користь групи вакцинованих. (P=0.0015) (див. Фіг. 3). Обговорення: Тривалість захисного імунітету протягом 6 місяців після вакцинації композицією винаходу була доведена у потужному дослідженні з експериментальним зараженням з використанням 1 дози вакцини у віці 3 тижнів в імунізованих свиней і невакцинованих контролях. Вакцина попереджала втрату ваги, викликану ЕП, і значно зменшувала тяжкість патологічних змін, спричинених інфекцією, що викликається Mycoplasma hyopneumoniae. 5. Імунний статус вакцинованих тварин 5.1. Гуморальна імунна відповідь В таблиці 3 нижче показані середні титри антитіл (EU/мл) до і після вакцинації і після зараження. Групи Вакциновані Контроль 30 35 Д13 Д90 Д126 Д175 45 Д13 0,2 0,1 Д63 3,2 0,7 Д126 3,0 0,2 Д175 6,1 0,1 Д202 17,3 0,1 На день 63 після вакцинації була визначена вимірювана імунна відповідь проти M. hyopneumoniae у вакцинованих поросят. Чотири тижні після зараження у вакцинованих тварин визначалися високі титри антитіл проти M. hyopneumoniae. У вакцинованих тварин в кінці дослідження (Д202) рівень антитіл проти M. hyopneumoniae був у 173 рази вищим в порівнянні із контрольними тваринами. (див. Фіг. 4). 5.2. Клітинна імунна відповідь В таблиці 4 нижче наведені середні кількості антиген-специфічних лейкоцитів / 6 log 10 периферичних мононуклеарів крові (PBMC) День відбору зразка 40 Д0 0,2 0,1 Середнє значення ELISPOT Група 1 (вакциновані) Група 2 (контроль) 23,75 0,56 25,31 1,64 5,38 0,83 10,38 2,00 Результати показують, що через 13 днів після вакцинації (Д13) клітинна імунна відповідь була в 42,41 рази вище у вакцинованих тварин в порівнянні із контрольними. У вакцинованих тварин спостерігалось у 5,19 разів більше антиген-специфічних лейкоцитів, ніж в контролі, перед зараженням інфекцією (Д175). В результаті статистичного аналізу відмічено суттєві відмінності у середніх значеннях рівнів антиген-специфічних лейкоцитів між вакцинованими і контрольною групою на Д13 і Д90 (PD13=0.027, PD9o=0.016). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 1. Композиція, що містить антиген і ліпополісахарид у формі масло-в-воді, де ліпополісахарид включає бактеріальний ЛПС J5 з Е. соlі, і де форма масло-в-воді включає рідке парафінове 8 UA 115053 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 масло в суміші з сорбітаном триолеатом і/або полісорбатом 80, і в якій форма масло-в-воді 2 включає від 1 до 50 об. % масла і композиція включає щонайменше 5×10 EU/мл ЛПС J5 з Е. соlі. 2. Композиція за п. 1, де антиген є бактеріальним антигеном, переважно інактивованою або вбитою бактерією. 3. Композиція за п. 2, де антиген являє собою інактивовану або вбиту мікоплазму, переважно інактивовану або вбиту Mycoplasma hyopneumoniae. 4. Композиція за будь-яким із пунктів 1-3, яка містить декілька різних антигенів. 5. Композиція за пунктом 4, яка містить інактивовану або вбиту Mycoplasma hyopneumoniae і щонайменше один PCV2 або PRRS антиген. 6. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, де композиція масло-в-воді містить від 1 до 30 об. % масла, переважно від 5 до 30 об. %, навіть більш переважно від 10-30 об. %, 10-25 об. % або 10-20 об. %. 7. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, де масло містить рідке парафінове масло в суміші з сорбітаном триолеатом та полісорбатом 80. 8. Композиція масло-в-воді за будь-яким з попередніх пунктів, що містить інактивовану або 2 вбиту бактерію, щонайменше 5×10 EU/мл ЛПС J5 з Е. соlі і 10-20 об. % рідкого парафінового 3 масла і переважно щонайменше 10 EU/мл ЛПС J5 з Е. соlі. 9. Композиція за будь-яким з попередніх пунктів, яка є вакциною. 10. Спосіб вакцинації тварини, що не є людиною, проти патогену, що полягає у введенні тварині композиції або вакцини, яка містить патогенний антиген і ліпополісахарид у формі масло-в-воді, де ліпополісахарид включає бактеріальний ЛПС J5 з Е.соlі, і де форма масло-в-воді включає рідке парафінове масло в суміші з сорбітаном триолеатом і/або полісорбатом 80, і в якій форма 2 масло-в-воді включає від 1 до 50 об. % масла і композиція включає щонайменше 5×10 EU/мл ЛПС J5 з Е. соlі. 11. Спосіб індукції або стимуляції антиген-специфічного гуморального і клітинного імунітету у тварини, що не є людиною, що полягає у введенні тварині композиції або вакцини, яка містить бактеріальний антиген і ліпополісахарид у формі масло-в-воді, де ліпополісахарид включає бактеріальний ЛПС J5 з Е. соlі, і де форма масло-в-воді включає рідке парафінове масло в суміші з сорбітаном триолеатом і/або полісорбатом 80, і в якій форма масло-в-воді включає від 2 1 до 50 об. % масла і композиція включає щонайменше 5×10 EU/мл ЛПС J5 з Е. соlі. 12. Спосіб вакцинації свиней і поросят проти Mycoplasma hyopneumoniae (Mh), що полягає у введенні зазначеним свиням і поросятам композиції або вакцини, яка містить інактивовану Mycoplasma hyopneumoniae і ліпополісахарид у формі масло-в-воді, де ліпополісахарид включає бактеріальний ЛПС J5 з Е. соlі, і де форма масло-в-воді включає рідке парафінове масло в суміші з сорбітаном триолеатом і/або полісорбатом 80, і в якій форма масло-в-воді 2 включає від 1 до 50 об. % масла і композиція включає щонайменше 5×10 EU/мл ЛПС J5 з Е. соlі. 13. Спосіб захисту поросят від захворювань, що викликаються Mycoplasma hyopneumoniae, який полягає у введенні тварині композиції або вакцини, яка містить інактивовану Mycoplasma hyopneumoniae і ліпополісахарид у формі масло-в-воді, де ліпополісахарид включає бактеріальний ЛПС J5 з Е. соlі, і де форма масло-в-воді включає рідке парафінове масло в суміші з сорбітаном триолеатом і/або полісорбатом 80, і в якій форма масло-в-воді включає від 2 1 до 50 об. % масла і композиція включає щонайменше 5×10 EU/мл ЛПС J5 з Е. соlі. 9 UA 115053 C2 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 10