Спосіб активації та кон’югації фактора коагуляції

УКРАЇНА (19) UA (11) 115221 (13) C2 (51) МПК A61K 47/54 (2017.01) A61K 38/37 (2006.01) МІНІСТЕРСТВО ЕКОНОМІЧНОГО РОЗВИТКУ І ТОРГІВЛІ УКРАЇНИ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (21) Номер заявки: a 2012 10994 Дата подання заявки: 21.02.2011 (22) (24) Дата, з якої є чинними 10.10.2017 права на винахід: (31) Номер попередньої 61/306,513 (32) Дата подання 21.02.2010 заявки відповідно до Паризької конвенції: попередньої заявки відповідно до Паризької конвенції: (33) Код держави-учасниці US Паризької конвенції, до якої подано попередню заявку: (41) Публікація відомостей 10.12.2012, Бюл.№ 23 про заявку: (46) Публікація відомостей 10.10.2017, Бюл.№ 19 про видачу патенту: (86) Номер та дата подання міжнародної заявки, поданої відповідно до Договору PCT PCT/US2011/025592, 21.02.2011 (72) Винахідник(и): Фогель Єнс Х. (DE), То Чі Шунг Браян (US), Б'янко Кароліна Лучія (US) (73) Власник(и): БАЄР ХЕЛСКЕР ЛЛСІ, 555 White Plains Road, Tarrytown, NY 10591, United States of America (US) (74) Представник: Шамріна Олена Олексіївна, реєстр. №141 (56) Перелік документів, взятих до уваги експертизою: T. TAKAKURA, "Physicochemical and Pharmacokinetic Characterization of Highly Potent Recombinant L-Methionine -Lyase Conjugated with Polyethylene Glycol as an Antitumor Agent", CANCER RESEARCH, US, (20060301), vol. 66, no. 5, doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-3910, ISSN 00085472, pages 2807 - 2814 KRISHNASWAMI RAJA ET AL, "One-Pot Synthesis, Purification, and Formulation of Bionanoparticle-CpG Oligodeoxynucleotide Hepatitis B Surface Antigen Conjugate Vaccine via Tangential Flow Filtration", BIOCONJUGATE CHEMISTRY., US, (20070301), vol. 18, no. 2, doi:10.1021/bc060118q, ISSN 10431802, pages 285 - 288 TAO HU ET AL, "Influence of the chemistry of conjugation of poly(ethylene glycol) to Hb on the oxygen-binding and solution properties of the PEGHb conjugate", BIOCHEMICAL JOURNAL, (20051215), vol. 392, no. 3, doi:10.1042/BJ20050663, ISSN 0264-6021, pages 555 - 564, XP055242116 [X] 1-3,5-8 * page 556, FEE C J, "SIZE-EXCLUSION REACTION CHROMATOGRAPHY (SERC): A NEW TECHNIQUE FOR PROTEIN PEGYLATION", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, WILEY & SONS, HOBOKEN, NJ, US, (20030201), vol. 82, no. 2, doi:10.1002/BIT.10561, ISSN 00063592, pages 200 - 206 J.R. MOLEK ET AL, "Separation of PEGylated [alpha]-Lactalbumin from Unreacted Precursors and Byproducts Using Ultrafiltration", BIOTECHNOLOGY PROGRESS., US, (20071207), vol. 23, no. 6, doi:10.1021/bp070243w, ISSN 8756-7938, pages 1417 - 1424 US 2009/0286955 A1, 19.11.2009 US 2007/0173634 A1, 26.07.2007 US 7 384 909 B9, 10.06.2008 WO 2011/077309 A2, 30.06.2011 US 2005/175619 A1, 11.08.2005 (54) СПОСІБ АКТИВАЦІЇ ТА КОН'ЮГАЦІЇ ФАКТОРА КОАГУЛЯЦІЇ (57) Реферат: Представлений винахід стосується способу одержання кон'югату біомолекули, де спосіб є інтегрованим в єдину операційну одиницю. UA 115221 C2 (12) UA 115221 C2 UA 115221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Представлений винахід стосується способу одержання бімолекулярного кон'югату, де спосіб є інтегрованим в єдину операційну одиницю. Передумови створення винаходу З просуванням в біотехнологічній галузі для задоволення нереалізованих потреб медицини розробляються біофармацевтичні лікарські засоби. Тим не менш, їх короткий in-vivo період напіввиведення вимагає від пацієнтів приймати дані біофармацевтичні лікарські засоби часто та/або у великих дозах для досягнення наміченої терапевтичної або профілактичної цілі. Тривала внутрішньовенна терапія або часті ін'єкції могли впливати на якість життя пацієнтів. Різні полімери, такі як поліетиленгліколь (ПЕГ), можуть бути кон'югованими з біомолекулою (наприклад, білком) для підвищення періоду напіввиведення та біологічної активності багатьох біомолекул (Reddy, Ann. Pharmacother. 34:915-923, 2000). Інші переваги кон'югації полімеру включають (а) покращення стабільності продукту протягом процесу виробництва, (б) зниження ниркового кліренсу (Fung, et al., Polym. Prepr. 38:565-566, 1997); покращення направленої доставки до пухлини (Yowell, et al., Cancer Treat. Rev. 28 Suppl. A:3-6, 2002); зниження антигенності та імуногенності (Muller, et al., Br. J. Haematol. 110:379-384, 2000; Abshire, et al., Blood 96:1709-1715, 2000); та кращу терпимість (Safra, et al., Ann. Oncol. 11:1029-1033, 2000; Judson, et al., Eur. J. Cancer 37:870-877, 2001). ПЕГілювання застосовують до факторів росту людини (Kim, et al., Biomaterials 23:2311-2317, 2002; Wu, et al., Protein Expr. Purif. 48:24-27, 2006), фактору вивільнення гормону росту (Piquet, et al., J. Chromatogr. 944:141-148, 2002), вектору аденовірусу (Eto, et al., Int. J. Pharm. 354:3-8, 2008) та плазміди ДНК (Hosseinkhani, et al., J. Control Release, 97:157-171, 2004). Завдяки перевагам Пегілювання, було розроблено багато хімічних реакцій кон'югації (Roberts, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002) та полімерних похідних (Європейський патент EP № 1578841). Оскільки застосування кон'югації біомолекула-полімер зростає, існує необхідність розробити простий, відтворюваний та здатний до масштабування типовий процес для задоволення виробничих потреб. Скорочений опис винаходу Представлений винахід стосується способу одержання бімолекулярного кон'югату, що включає стадії активування біомолекул шляхом контактування з активуючим агентом; видалення активуючого агента; та сполучення біомолекули шляхом взаємодії біомолекули з активованим полімером; де стадії способу є інтегрованими в єдину операційну одиницю. Спосіб додатково може включати стадію відокремлення кон'югату біомолекули від некон'югованих біомолекул. В одному втіленні кон'югат біомолекули відокремлюють від некон'югованих біомолекул, застосовуючи ексклюзійну хроматографію за розміром або іонообмінну хроматографію. В одному втіленні єдина операційна одиниця є інтегрованою системою фільтрування тангенціальним потоком. В іншому втіленні активуючий агент вибирають з обмінного буферу, pH регулюючого або відновлюючого агента. В ще одному втіленні відновлюючим агентом є дитіотреїтол або трис(2-карбоксиетил)фосфін. В іншому втіленні полімером є поліетиленгліколь, та біомолекулу вибирають з білків, полісахаридів та нуклеїнових кислот. В наступному втіленні білок вибирають з факторів коагуляції, антитіл, гормонів, факторів росту та ферментів. ОПИС ФІГУР Фігура 1. Профіль елюювання катіонобмінної хроматографії контрольної серії ПЕГілювання. Фігура 2. SDS-PAGE піки елюювання катіонобмінної хроматографії з контрольної серії ПЕГілювання. Фігура 3. Піки елюювання ексклюзійної хроматографії за розміром катіонобмінної хроматографії з контролю ПЕГілювання. Фігура 4. Профіль елюювання катіонобмінної хроматографіїПЕГілювання, здійсненого за способом TFF. Фігура 5. Профілі елюювання катіонобмінної хроматографії серій TFF в лабораторному масштабі. Фігура 6. Профілі SEC ПЕГільованого rFVIII, одержаного в серіях за способом TFF в лабораторному масштабі. Фігура 7. Профілі елюювання катіонобмінної хроматографії серій в напівпромисловому масштабі. ОПИС ВИНАХОДУ Слід розуміти, що даний винахід не обмежується конкретним пристроєм або описаними частинами, та в зв'язку з цим може змінюватися. До того ж, слід розуміти, що термінологія, використовувана в цьому документі, вживається тільки з метою опису конкретних варіантів 1 UA 115221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснення, і не призначена для обмеження об'єму представленого винаходу, який буде обмежуватись тільки формулою винаходу, що додається. Необхідно зазначити, що як використано в даному документі та в формулі винаходу, яка додається, форми однини включають посилання на множину, якщо контекст явно не диктує інше. Так, наприклад, посилання на "агент" є посиланням на один або кілька агентів і включає їх еквіваленти, відомі спеціалісту в даній галузі з рівня техніки, і так далі. Якщо не вказано інше, всі технічні та наукові терміни, що використовують в даному документі, мають те ж саме значення, яке зазвичай зрозуміло будь-яком середньому спеціалісту в галузі, до якої належить даний винахід. Кон'югація, така як ПЕГілювання біомолекули, може бути випадковою кон'югацією або сайтспецифічною кон'югацією. В обох випадках біомолекула зазвичай активується, забезпечуючи ефективне сполучення з полімером, таким як ПЕГ. У випадковому ПЕГілюванні ПЕГ може бути ковалентно сполучений з випадковими активованими амінокислотними залишками. Зазвичай це в результаті призводить до суміші моно-ПЕГільованих та мульти-ПЕГільованих біомолекул. Для сайт-специфічного ПЕГілювання біомолекула може бути генетично модифікованою таким чином, що молекула ПЕГ може зв'язуватись з конкретним сайтом на поверхні біомолекул. Такий підхід зводить до мінімуму утворення побічних продуктів та полегшує навантаження на наступній стадії очистки, на якій продукт відокремлюють від побічних продуктів. Залишки розчинника, що знаходяться на біомолекулі, можуть бути активованими або шляхом доведення рН розчину або шляхом використання відновлюючих агентів, таких як дитіотреїтол (ДТТ) або трис(2-карбоксиетил)фосфін (TКЕФ). Після відновлення молекула ПЕГ може бути приєднана до активованого залишку за допомогою ковалентного зв'язку. Якщо використовується відновлюючий агент, то може бути необхідним видалення відновника перед реакцією сполучення. Ексклюзійна хроматографія за розміром (SEC) є загальною методикою для видалення відновника в лабораторних масштабах. На сучасному рівні розвитку даної галузі для ефективного сполучення біомолекул, як правило, необхідно декілька одиниць операцій, наприклад, - активація шляхом термостатування/контрольованого перемішування з відновлюючим агентом, яку, як правило, проводять в ємності для змішування, такій як активаційний бак з перемішуванням; - видалення активуючого агента, як правило, шляхом ексклюзійної хроматографії за розміром або іншим хроматографічним методом; - сполучення шляхом термостатування/контрольованого перемішування з активованим полімером (таким як ПЕГ), яке, як правило, проводять у баку для сполучення з перемішуванням; та - відокремлення кон'югованих молекул від молекул, які не прореагували, та побічних продуктів за допомогою хроматографії, такої як, іонообмінна хроматографія. Такий процес вимагає декількох систем та в промислових масштабах, значного простору та ручного регулювання/передавання між одиницями операцій. Крім того, SEC важко реалізувати в промислових масштабах виробництва та вимагає створення як автономної операційної одиниці. Спосіб згідно з представленим винаходом інтегрує стадії активації, видалення активуючого агента та сполучення в одну єдину операційну одиницю шляхом застосування інтегрованого фільтрування тангенціальним потоком для контактування/змішування та наступного видалення реагентів. В той час як цільову біомолекулу утримують шляхом застосування мембран з межею відсікання з прийнятною молекулярною масою, фізико-хімічні умови, такі як концентрації, pH, електропровідність та види буферу, можуть бути зміненими перед, протягом або після активації/сполучення. Регулювання гідродинаміки в системі дозволяє регулювати оптимальні концентрації, та, необов'язково, досягнення концентрацій контактування, локалізованих вище поверхні мембрани, для подальшої оптимізації процесу активації та сполучення. Даний спосіб є простим в експлуатації, відтворюваним, здатним до масштабування та прийнятним для використання в промислових масштабах фармацевтичного виробництва. Приклади полімерів, які можуть бути використані в способі згідно з представленим винаходом включають, але не обмежуються ними, поліалкіленові оксиди, такі як поліетиленгліколь, декстрани, коломінові кислоти або інші полімери на основі вуглеводнів, полімери амінокислот, похідні біотину, полівініловий спирт (ПВС), полікарбоксилати, полівінілпіролідон, співполімер поліетилену та ангідриду малеїнової кислоти, співполімер полістиролу та ангідриду яблучної кислоти, поліоксазолін, поліакрилоїлморфолін, гепарин, альбумін, целюлози, гідролізати хітозану, глікоген, агарози та їх похідні, гуарову камедь, пулулан, інулін, ксантанову камедь, каррагінан, пектин, гідролізати альгінової кислоти та будьякі їх еквіваленти. Прикладом поліетиленгліколю є метоксиполіетіленгліколь (мПЕГ). Іншими 2 UA 115221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 корисними сполуками поліалкіленгліколю є поліпропіленгліколі (ППГ), полібутиленгліколі (ПБГ), ПЕГ-гліцидилові естери (Епоксид-ПЕГ), ПЕГ-оксикарбонілімідазол (КДІ-ПЕГ), розгалужені поліетиленгліколі, лінійні поліетиленгліколі, роздвоєні поліетиленгліколі та багатопроменеві або суперрозгалужені поліетиленгліколі (star-PEG). Поліетиленгліколі (ПЕГ) включають будь-який водорозчинний полі(етиленовий оксид). Як правило, ПЕГі включають наступну структуру "-(OCH2CH2)–", де (n) становить від 2 до 4000. Як використано в даному документі, ПЕГ також включає "-CH2CH2–O(CH2CH2O)–CH2CH2–" та (OCH2CH2)O–" в залежності від того, чи термінальні кисні були заміщені. Поліетиленгліколь, крім того, включає структури, що мають різні термінальні або кінцеві блокуючі групи, такі як, без обмеження, гідроксил або C120 алкокси група. Поліетиленгліколь також означає полімер, який містить більшість, тобто, більше, ніж 50 %, -OCH2CH2- субодиниць, що повторюються. Що стосується конкретних форм, то ПЕГ може мати будь-яке число різних молекулярних мас, а також різні структури або геометрії, такі як розгалужену, лінійну, роздвоєну та багатофункціональну. Приклади біомолекул включають, наприклад, будь-який білок, полісахарид або нуклеїнові кислоти. Білки включають, але не обмежуються зазначеними, фактори коагуляції, антитіла, гормони, фактори росту та ферменти. Мається на увазі, що способи та матеріали, описані в даному документі є представленими прикладами винаходу, та буде зрозуміло, що межі винаходу не обмежуються межами прикладів. Кваліфікованому фахівцю в даній галузі з рівня техніки буде зрозуміло, що винахід може бути здійснений з варіаціями розкритих способів та матеріалів, вважається, що такі зміни знаходяться в межах винаходу. ПРИКЛАДИ З метою можливості кращого розуміння даного винаходу наведено наступні приклади. Дані приклади представлені тільки з метою ілюстрації і не розглядаються як такі, що обмежують обсяг прав за винаходом в будь-якій формі. Всі публікації, згадані в даному документі, включені у вигляді посилань в повному їх обсязі. Приклад 1: ПЕГілювання В контролі, вихідний розчин трис(2-карбоксиетил)фосфіну (ТКЕФ) завантажували в 7,2 мл розчину, очищеного rFVIII (0,4 мкМ). Після відновлення, ТКЕФ в розчині rFVIII видаляли за допомогою SEC, використовуючи колонку Superdex-75. Твердий ПЕГ завантажували в розчин rFVIII до кінцевої концентрації ПЕГ 30 мкМ. rFVIII витримують з ПЕГ протягом 13 годин при 28 °C. Наприкінці термостатування ПЕГілювання серію розбавляли втричі та переносили в 4 мл катіон обмінну хроматографічну колонку. Зв'язаний rFVIII з колонкою відокремлюють та елююють градієнтом. В іншій партії, 695 мл розчину очищеного rFVIII (0,49 мкМ) переносили в ємність для 2 ретентату установки тангенціального потоку, оснащеної 50 см 30 кДа целюлозною мембраною фільтрування тангенціальним потоком (TFF). Розчин rFVIII спочатку концентрували до 1,78 мкМ шляхом проходження 500 мл фільтрату крізь TFF мембрану. Після концентрування, вихідний розчин ТКЕФ завантажували в концентрований розчин rFVIII. Термостатування відновлення продовжувалось протягом 30 хвилин. Швидкість поперечного потоку ретентату підтримували 4 2 л/хв/м , в той час як фільтрат повертається назад в ємність для ретентату зі швидкістю 0,7 2 л/хв/м . Після відновлення ТКЕФ в ретентаті видаляли за допомогою діафільтрації проти 5 об'ємів буферу ПЕГілювання. Під час діафільтрації зразки ретентату та фільтрату відбирали з кожної об'єму діафільтрації для аналізу на концентрацію ТКЕФ. Наприкінці видалення ТКЕФ шляхом діафільтрації твердий ПЕГ завантажували до ємності для ретентату, щоб досягти кінцевої концентрації ПЕГ 39 мкМ. rFVIII витримували з ПЕГ протягом приблизно 2 годин. Під час термостатування забезпечували перемішування за допомогою рециркуляції ретентату 2 через TFF систему зі швидкістю 4 л/хв/м . Наприкінці термостатування ПЕГілювання ретентат збирали та розбавляли в 4 рази. Частину розбавленого ретентату завантажували до 5 мл катіон обмінної хроматографічної колонки. Зв'язаний з колонкою rFVIII видаляли та елюювали градієнтним елюювання. Фракції, отримані від градієнтного елюювання, аналізували за допомогою SDS-PAGE та аналітичної ексклюзійної ВЕРХ, в той час як зразки ретентату та фільтрату аналізували на ТКЕФ за допомогою аналітичного ВЕРХ дослідження. Профіль елюювання катіон обмінної хроматографії контрольного експерименту показаний на Фігурі 1. Він складається з трьох піків елюювання, в яких піки 1, 2 та 3 елюювали 49,5 %, 58 % та 63,7 % буфером В, відповідно. SDS-PAGE використовували для характеристики піків елюювання. Так як пляма йодиду барію утворює комплекс з поліетиленгліколем, SDS-PAGE гель спочатку забарвлювали 3 UA 115221 C2 5 10 15 20 йодидом барію, щоб підтвердити кон'югацію поліетиленгліколю з rFVIII. Після того, як знімок був зроблений, з гелю знімали забарвлення, а потім знову забарвлювали кумассі синім. SDS-PAGE, забарвлений кумассі синім, показаний на Фігурі 2, виявляє, що rFVIII до ПЕГілювання містить важкий ланцюг (ВЛ) та легкий ланцюг (ЛЛ), які мають молекулярні маси від 82 кДа до 116 кДа. Після ПЕГілювання легкий ланцюг в rFVIII на піку 1 зростає до значення вищого, ніж 182 кДа. Збільшення молекулярної маси пов'язано зі сполученням поліетиленгліколю з легким ланцюгом під час ПЕГілювання, що підтверджується за допомогою плями йодиду барію. Пік 2 містить різні види білків, які не є ПЕГільованими. Види, зібрані в піку 3, містять важкий ланцюг та неПЕГільований легкий ланцюг. Крім того, зразок з кожного піку елюювання був проаналізований за допомогою SEC. Фігура 3 показує, що в аналітичному SEC час утримування піку 1 (ПЕГільований rFVIII), піку 2 та піку 3 (не-ПЕГільований rFVIII) становить 16,6 хвилин, 17,8 хвилин та 19,4 хвилин, відповідно. Так як час утримування не-ПЕГільованого rFVIII становить на 2,8 хвилини довше, ніж ПЕГільованого rFVIII, аналітичну SEC можуть використовувати як ортогональний спосіб для підтвердження кон'югації ПЕГ з молекулою rFVIII. Додатковою стадією в процесі ПЕГілювання є видалення відновлювального агента перед стадією сполучення. Таблиця 1 показує, що ретентат та фільтрат, зібрані в серіях TFF ПЕГілювання, мають аналогічні концентрації ТКЕФ в кінці кожного об'єму діафільтрації. Після 4-х об'ємів діафільтрації ТКЕФ в обох і ретентаті і фільтраті знижується до рівня нижчої межі виявлення аналізу. Це означає, що діафільтрація є ефективною для видалення відновлювального агента. Таблиця 1 Об'єм діафільтрації 1 2 3 4 5 25 30 35 40 45 50 ТКЕФ ретентату (мкМ) 241,3 147,0 54,0 0 0 ТКЕФ фільтрату (мкМ) 326,0 181,6 69,2 0 0 Профіль елюювання катіон обмінної хроматографії речовини, одержаної за способом TFF ПЕГілювання показано на Фігурі 4. Подібно до Фігури 1, вона також складається з трьох піків елюювання, в яких піки 1, 2 та 3 елюювали 48,3 %, 56,1 % та 62,8 % буфером В, відповідно. В аналітичній ексклюзійній ВЕРХ час утримування піку 1 складає 15,6 хвилини в порівнянні з 18,5 хвилинами піку 3. Різниця в часі утримання (2,9 хвилини) між цими двома піками елюювання катіон обмінної хроматографії узгоджується з тим, що й для контрольної групи. Це демонструє, що TFF спосіб процесу ПЕГілювання може інтегрувати стадії, включені в сполучення біомолекула-полімер в одній TFF стадії. Приклад 2. Послідовність дослідження Для оцінки послідовності способу TFF процесу ПЕГілювання, здійснювали декілька серій лабораторного масштабу. Об'єми 700-900 мл розчину очищеного rFVIII завантажували до 2 системи Uniflux™ TFF (GE Healthcare, Piscataway, NJ), оснащену 50-100 см 30 кДа целюлозною мембраною (Millipore Corporation, Billerica, MA), що регенерується. Розчини rFVIII концентрували до цільової концентрації. ТКЕФ завантажували до ємності для ретентату для досягнення ефективної концентрації 250-450 мкМ та витримували протягом 30 хвилин. Після відновлення, ТКЕФ з системи видаляли за допомогою діафільтрації. ПЕГ завантажували до відновленого rFVIII для досягнення ефективної концентрації 13-26 мкМ та термостатували протягом 10-15 годин. Швидкість поперечного потоку ретентату та швидкість потоку фільтрату, що 2 використовували під час концентрування та діафільтрації, становила 6-15 л/хв/м та 0,5-2 2 л/хв/м , відповідно. Після ПЕГілювання ретентати повертали в систему TFF, розбавляли та завантажували до 56 мл катіон обмінної хроматографічної колонки. Зв'язаний з колонкою rFVIII відокремлювали та елюювали за допомогою градієнту. Концентрацію білку визначали за допомогою аналітичної ексклюзійної ВЕРХ. Ефективність зразків визначали шляхом хромогенного аналізу. Площа мембрани, що використовували для серій лабораторного масштабу, представлена в Таблиці 2. Вихідні концентрації розчинів rFVIII, що використовували для серій TFF, знаходяться в діапазоні від 35 мкг/мл до 55 мкг/мл. Розчини послідовно концентрували аж до 10 разів перед відновленням та ПЕГілюванням. 4 UA 115221 C2 Таблиця 2 Серія 1 50 53,6 152 59 % 2 Площа мембрани TFF (см ) Вихідна концентрація rFVIII (мкг/мл) Концентрація відновлення rFVIII (мкг/мл) ПЕГільований rFVIII (%) 5 Серія 2 50 35,1 353 72 % Серія 3 100 56,0 183 64 % Серія 4 100 54,5 140 48 % Профіль елюювання катіон обмінної хроматографії серій TFF в лабораторному масштабі представлено на Фігурі 5. Дані профілі є подібними до тих, що показані на Фігурі 4, які містять ПЕГільований rFVIII, не-ПЕГільований rFVIII та інші rFVIII відповідні види. Профілі елюювання аналітичної ексклюзійної ВЕРХ, показані на Фігурі 6, демонструють, що ПЕГільований rFVIII є моно-ПЕГільованим. Час утримання в ексклюзійній ВЕРХ, підсумований в Таблиці 3, показує, що ПЕГільований rFVIII елююється на 2,5-2,6 хвилини раніше, ніж неПЕГільований rFVIII. Це узгоджується з тим, що спостерігалось в Прикладі 1. Таблиця 3 № проби в лабораторному масштабі 1 2 3 4 rFVIII час утримування (хв.) 16,6 16,7 16,6 16,6 ПЕГільований rFVIII час утримування (хв.) 14,1 14,1 14,1 14,1 10 15 20 25 30 35 40 Ефективність ПЕГілювання TFF серій розраховували, використовуючи потенційну можливість проміжних сполук процесу. Вона знаходиться в діапазоні 48-72 % (Таблиця 2Ошибка! Источник ссылки не найден.), що є порівняльною до ПЕГілювання інших білків (Brocchini, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 60:3-12, 2008; Schiavon, et al., Farmoco 55:264-269, 2000; Lee, et al., Bioconjug. Chem. 18:1728-1734; 2007). Даний приклад демонструє, що ПЕГілювання в способі TFF є відтворюваним з ефективністю ПЕГілювання співвідносною до тієї, яка повідомляється в літературі. Приклад 3. TFF спосіб ПЕГілювання в напівпромисловому масштабі Серії TFF способу ПЕГілювання в напівпромисловому масштабі проводили, щоб продемонструвати здатність процесу до масштабування. В даних серіях приблизно 25 л 2 розчину rFVIII переносять в TFF пристрій для переміщення, оснащений 0,5 м 30 кДа целюлозною мембраною, що регенерується. Розчин rFVIII концентрували та відновлювали за допомогою ТКЕФ з ефективною концентрацією 600 мкМ. Після відновлення ТКЕФ видаляють шляхом діафільтрації проти буферу ПЕГілювання. ПЕГ завантажували до відновленого rFVIII для досягнення ефективної концентрації 40 мкМ. Швидкість поперечного потоку та швидкість потоку фільтрату, що використовували під час концентрування та діафільтрації становила 7 2 2 л/хв/м та 1 л/хв/м , відповідно. Наприкінці термостатування ПЕГілювання, ретентат збирали, розбавляли та завантажували в 4 л катіон обмінну хроматографічну колонку. Зв'язані з колонкою білки відокремлювали та елюювали градієнтом. ПЕГільований rFVIII аналізували за допомогою аналітичної ексклюзійної ВЕРХ, в той час як ефективність ПЕГілювання розраховували, ґрунтуючись на потенційній здатності, визначеній за допомогою хромогенного аналізу. Профіль елюювання катіон обмінної хроматографії серій TFF в напівпромисловому масштабі показано на Фігурі 7. Даний профіль є подібним до тих, що показані в попередніх прикладах, профілі елюювання містять пік ПЕГільованого rFVIII та інші rFVIII відповідні види. ПЕГільований rFVIII може бути відокремлений від інших видів шляхом катіон обмінної хроматографії з прийнятним градієнтом. Час утримання ПЕГільованого та не-ПЕГільованого rFVIII є підсумованим в Таблиці 4. Різниця в часі утримання між цими 2 rFVIII видами становить 3 хвилини. Ефективність ПЕГілювання знаходилась в межах 40-55 %. Крім того, це узгоджується з тим, що показано в попередніх прикладах. Даний приклад продемонстрував, що спосіб TFF ПЕГілювання є здатним до масштабування та сумісності. 5 UA 115221 C2 Таблиця 4 № проби в лабораторному масштабі 1 2 3 rFVIII час утримування (хв.) 18,0 18,0 18,0 ПЕГільований rFVIII час утримування (хв.) 15,0 15,0 15,0 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 1. Спосіб одержання кон'югата фактора коагуляції, що включає такі стадії: активацію фактора коагуляції шляхом контактування з активуючим агентом; видалення активуючого агента; і ополчення фактора коагуляції шляхом взаємодії фактора коагуляції з активованим полімером; де стадії способу інтегровані в інтегровану систему фільтрування тангенціальним потоком і де полімером є поліетиленгліколь, і де активуючим агентом є відновлюючий агент. 2. Спосіб за пунктом 1, який додатково включає стадію відокремлення кон'югата фактора коагуляції від некон’югованого фактора коагуляції. 3. Спосіб за пунктом 2, в якому кон'югат фактора коагуляції відокремлюють від некон'югованого фактора коагуляції за допомогою ексклюзійної хроматографії за розміром або іонообмінної хроматографії. 4. Спосіб за одним або більше з пунктів 1-3, в якому фактором коагуляції є rFVIII. 5. Спосіб за одним або більше з пунктів 1-4, в якому відновлюючим агентом є дитіотреїтол або трис(2-карбоксіетил)фосфін. 6 UA 115221 C2 7 UA 115221 C2 8 UA 115221 C2 9 UA 115221 C2 Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 10