Поліпептиди фактора коагуляції vii людини

1. Поліпептид фактора VII, що містить принаймні два заміщення стосовно амінокислотної послідовності SEQ ID NO:1, де вказані заміщення являють собою: (і) заміщення L305 амінокислотою, вибраною з групи, що складається з Val, Туr та Ilе, і (іі) 2 (19) 1 3 82177 4 20. Вектор експресії, що кодує поліпептид фактора 9. Поліпептид фактора VII за п. 7, у якому D309 VII за будь-яким з пп. 1-18. була заміщена іншою амінокислотою, вибраною з 21. Клітина-хазяїн, що містить вектор експресії за групи, що складається з Ser та Thr. п. 20. 10. Поліпептид фактора VII за п. 2, у якому 22. Клітина-хазяїн за п. 21, яка являє собою принаймні одна амінокислота, що відповідає еукаріотичну клітину. амінокислоті в позиції, вибраній з 330-339 у SEQ 23. Клітина-хазяїн за п. 22, яка походить із ссавців. ID NO:1, була заміщена іншою амінокислотою. 24. Клітина-хазяїн за п. 23, де клітина вибрана з 11. Поліпептид фактора VII за п. 2, у якому А274 групи, що складається з СНО клітин, НЕК клітин та була заміщена іншою амінокислотою. ВНК клітин. 12. Поліпептид фактора VII за п. 11, у якому 25. Спосіб одержання поліпептиду фактора VII за вказана А274 була заміщена амінокислотою, будь-яким з пп. 1-18, де спосіб включає вибраною з групи, що складається з Met, Leu, Lys культивування клітини за будь-яким з пп. 21-24 в та Arg. придатному середовищі для зростання за умов, 13. Поліпептид фактора VII за п. 1, у якому L305 що дозволяють експресію полінуклеотидного була заміщена Val. конструкту та виділення поліпептиду, що 14. Поліпептид фактора VII за будь-яким з пп. 1утворився, з культурального середовища. 13, у якому поліпептид фактора VII являє собою 26. Фармацевтична композиція, що містить фактор VII людини. поліпептид фактора VII за будь-яким з пп. 1-18 та, 15. Поліпептид фактора VII за будь-яким з пп. 1необов'язково, фармацевтично прийнятний носій. 13, у якому поліпептид фактора VII являє собою 27. Застосування поліпептиду фактора VII за будьфактор VIIa людини. яким з пп. 1-18 для приготування лікарського 16. Поліпептид фактора VII за п. 1, у якому вказане засобу для лікування розладів кровотеч або співвідношення становить принаймні приблизно випадків кровотеч. 2,0; а краще становить принаймні приблизно 4,0. 28. Застосування поліпептиду фактора VII за будь17. Поліпептид фактора VII за п. 1, який являє яким з пп. 1-18 для приготування лікарського собою L305V/K337A-FVII. засобу для підсилення нормальної гемостатичної 18. Поліпептид фактора VII за п. 2, який являє системи. собою L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII. 29. Застосування за п. 27 для лікування гемофілії 19. Поліпептид фактора VII за будь-яким з пп. 1-18 А або В. для застосування як лікарського засобу. Цей винахід стосується нових поліпептидів фактора коагуляції Vllа людини, що мають коагулянтну активність, а також полінуклеотидних конструктів, що кодують такі поліпептиди, векторів і клітин-хазяїв, що містять і експресують полінуклеотиди, фармацевтичних композицій, використань і способів лікувань. Коагуляція крові - це процес, що складається зі складної взаємодії різних компонентів крові (або факторів), що зрештою приводить до утворення фібринового згустку. Загалом, компоненти крові, які беруть участь у процесі, що має назву "каскад" коагуляції, є ферментативно неактивними білками (проферментами або зимогенами), що перетворюються на протеолітичні ферменти дією активатора (котрий сам по собі є активованим фактором згортання). Фактори коагуляції, що зазнали такого перетворення, мають назву "активні фактори" та позначаються додаванням літери "а" до назви фактора коагуляції (наприклад, фактор Vllа). Початок гемостатичного процесу здійснюється формуванням комплексу між тканинним фактором, вивільненим внаслідок пошкодження стінки судини, і фактором Vllа. Цей комплекс потім перетворює фактори IX та X на їхні активні форми. Фактор Ха перетворює обмежену кількість протромбіну на тромбін на клітині, що несе тканинний фактор. Тромбін активує тромбоцити та фактори V та VIII на фактори Va та Vllа, обидва кофактори в подальшому процесі, що приводить до повного вивільнення тромбіну. Цей процес включає утворення фактора Ха фактором ІХа (в комплексі з фактором Vllа) та відбувається на поверхні активованих тромбоцитів. Тромбін зрештою перетворює фібриноген на фібрин, що приводить до утворення фібринового згустку. Нещодавно було виявлено, що фактор VII і тканинний фактор є головними ініціаторами згортання крові. Фактор VII - це глікопротеїн плазми в слідовій кількості, що циркулює в крові як одноланцюговий зимоген. Зимоген є каталітично неактивним. Одноланцюговий фактор VII може бути перетворений на дволанцюговий фактор VIl фактором Ха, фактором ХІІа, фактором ІХа, фактором Vllа або тромбіном in vitro. Подібно до кількох інших білків плазми, що беруть участь в гемостазі, активність фактора VII залежить від вітаміну К, котрий потрібен для g-карбоксилювання численних залишків глутамінової кислоти, що зібрані в кластер близько амінокінця білка. Ці gкарбоксильовані глутамінові кислоти необхідні для іон металу-індукованої взаємодії фактора VII з фосфоліпідами. Перетворення зимогену фактора VII на активовану дволанцюгову молекулу відбувається розщепленням внутрішнього Аrg152lle153 пептидного зв'язку. За присутності тканинного фактора, фосфоліпідів і іонів кальцію дволанцюговий фактор Vllа швидко активує фактор X або фактор IX за допомогою обмеженого протеолізу. Часто бажано стимулювати або селективно блокувати коагуляційний каскад пацієнта. Фактор 5 82177 6 Vllа використовували для лікування хвороб Leu305 розташований на кінці a-спіралі, згортання крові, що мають кілька причин, такі як знайденій в комплексі тканинний фактор-фактор дефіцит фактора згортання (наприклад, гемофілія Vllа, котрий вважається важливим для активності. А та В або дефіцит факторів коагуляції XI або VII) Спіраль вільного фактора Vllа (фактор Vllа, не або інгібіторів фактора згортання. Фактор Vllа зв'язаний з тканинним фактором) деформована й, також використовували для лікування таким чином, можливо нестабільна. Поліпептидні надлишкових кровотеч, що мають місце в пацієнтів варіанти згідно з цим винаходом набувають з нормально функціонуючим каскадом згортання активної конформації, котра зазвичай має бути крові (відсутній дефіцит фактора згортання або викликана тканинним фактором. Підвищена інгібіторів відносно будь-яких факторів коагуляції). активність варіантів поліпептиду порівняно з Такі кровотечі можуть, наприклад, бути викликані фактором Vllа дикого типу може бути завдяки дефектним функціонуванням тромбоцитів, стабілізації a-спіралі, реорієнтації спіралі або тромбоцитопенією або захворюванням Фон деякої іншої зміни в конформації. Заміщення Віллебранда. Кровотечі є також головною Leu305 викликатиме реорієнтацію й/або проблемою у зв'язку з операцією та іншими стабілізацію спіралі. формами ушкодження тканини. Амінокислоти, що містять Lys157, Lys337, [Європейський патент №200421 Asp334, Ser336, Val158, Glu296, і Met298 (Зимогенетика)] стосується нуклеотидної розташовані в зоні, що вважається такою, що послідовності, що кодує фактор VII людини, і впливає на вставку амінокінця протеазного рекомбінантної експресії фактора VII в клітинах домену, і, у такий спосіб, утворення каталітично ссавців. активної конформації фактора Vllа, котра залежить Dickinson et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, від сольового містка між кінцевою аміногрупою 14379-14384,1996] описує варіант фактора VII, в llе153 і боковим ланцюгом Asp343. Заміщення якому LEU305 був заміщений на Ala (FVII(Ala305)). може видалити електростатичне відштовхування, Iwanaga et al. [Thromb. Haemost. (додаток, додати водневі зв'язки або іншим чином серпень 1999), 466, реферат 1474] описує полегшити вставку амінокінця. варіанти фактора Vllа, де залишки 316-320 Завдяки вищій власній активності бажаних видалені або залишки 311-322 заміщені на варіантів поліпептиду фактора Vllа порівняно з відповідні залишки трипсину. природним FVIIa, менша доза може бути достатня Існує потреба у варіантах фактора Vllа, що для одержання функціонально рівної концентрації мають коагулянтну активність, варіантах з високою в активному центрі й, таким чином, буде можливо активністю, що можуть бути введені за відносно вводити меншу дозу пацієнтові, що має кровотечі низьких доз, і варіантах без небажаних побічних або потребує підсилення нормальної ефектів, таких як системна активація згортання гемостатичної системи. крові та кровотеч, пов'язаних із Винахідниками цього винаходу було знайдено, загальноприйнятою терапією. що заміщенням амінокислоти Leu305 разом з ОПИС ВИНАХОДУ однією або кількома Lys у положенні 157, Lys у Нещодавно було виявлено, що варіанти положенні 337, Val у положенні 158, Glu у поліпептиду фактора коагуляції Vllа людини, де положенні 296, Met у положенні 298, Asp у амінокислота Leu305 і щонайменше одна положенні 334, Ser у положенні 336, фактор Vllа амінокислота, незалежно вибрані з групи, що спонтанно набуває деяку активну конформацію, складається з Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, що зазвичай має бути викликана тканинним Val158, Glu296, і Met298 Послідовності №1, фактором. Такі варіанти поліпептиду фактора Vllа заміщені на різні амінокислоти, підвищували виявляють власну активність, котра може бути коагулянтну активність порівняно з фактором терапевтично корисною у ситуаціях, де коагуляції Vllа людини дикого типу. прокоагулянтна активність не залежить від Термін "інша амінокислота", як використано в тканинного фактора (утворення фактора Ха на цьому винаході, означає амінокислоту, що поверхні тромбоцитів), наприклад коли введені відрізняється від амінокислоти, що природно високої дози NovoSeven®. присутня в цьому положенні. До неї належить, У подальшому втіленні додаткові заміщення окрім іншого, амінокислота, що може бути амінокислот у протеазному домені ще більше кодована полінуклеотидом. Краще, якщо інша полегшують утворення активної конформації амінокислота знаходиться в природній L-формі й молекули. Вважається, проте, що більшість може бути кодована полінуклеотидом. значних ефектів спостерігатимуться, коли Характерним прикладом є L-цистеїн (Cys). вищезгадані мутації виконані поблизу (послідовно Термін "активність", як використано в цьому або тривимірно) цих останніх семи амінокислот. винаході, означає здатність поліпептиду фактора Винахід надалі стосується заміщення кількох VII перетворювати його субстрат - фактор X на амінокислот в N-кінцевому Gla домені активний фактор Ха. Активність поліпептиду (амінокислоти у положенні, що відповідає 1-37 фактора VII може бути виміряна з допомогою Послідовності №1) фактора Vllа, що можуть "Протеолізу in vitro" (див. Приклад 6). зробити білок з істотно вищою спорідненістю до Термін "власна активність" також включає фосфоліпідів мембрани, таких як фосфоліпіди здатність утворювати тромбін на поверхні мембрани клітин або тромбоцитів, що несуть активованих тромбоцитів за відсутності тканинного тканинний фактор, у такий спосіб утворюючи фактора. варіанти поліпептиду фактора VII, котрі мають поліпшений прокоагулянтний ефект. 7 82177 8 та/або, де одна або кілька амінокислот були Таким чином, варіанти поліпептиду фактора вставлені в білок і/або, де одна або кілька Vllа, згадані вище, можуть, окрім уже виконаного амінокислот були додані до вихідного білка. Таке заміщення амінокислоти в положенні 305 разом із додавання може мати місце або на N-кінці або на заміщеннями в положеннях 157, 158, 296, 298, С-кінці вихідного білка або обох. "Варіант" або 334, 336 або 337 і за бажанням заміщення "варіанти" у межах цього визначення також мають амінокислот будь-де в протеазному домені, також активність FVII в його активованій формі. В одному мати щонайменше одну амінокислоту заміщену в втіленні варіант на 70% ідентичний послідовності N-кінцевому Gla домені, у такий спосіб одержуючи Послідовності №1. В одному втіленні варіант на білок, що має підвищену активність, а також 80% ідентичний послідовності Послідовності №1. підвищену спорідненість до фосфоліпідів В іншому втіленні варіант на 90% ідентичний мембрани порівняно з природним фактором VII. послідовності Послідовності №1. У подальшому Краще, якщо амінокислоти у положеннях 10 і 32 втіленні варіант на 95% ідентичний послідовності (стосовно Послідовності №1) фактора VII можуть Послідовності №1. бути заміщені на іншу амінокислоту. До прикладів У подальшому аспекті винахід стосується кращих амінокислот для введення у вищезгадані поліпептиду фактора VII, що містить щонайменше положення належать: амінокислота Pro в два заміщення стосовно послідовності положенні 10 заміщена на GIn, Arg, His, GIn, Asn амінокислот Послідовності №1, де вищезгадане або Lys; і/або амінокислота Lys у положенні 32 заміщення - це: (і) заміщення L305 на будь-яку заміщена на Glu, GIn або Asn. іншу амінокислоту, і (іі) заміщення на будь-яку іншу Інші амінокислоти в Gla домені, виходячи з амінокислоту однієї або кількох амінокислот, різних фосфоліпідних спорідненостей та вибраних з групи, що складається з К157, К337, послідовностей вітамін К-залежних білків плазми, D334, 3336, V158, Е296 і М298. можуть також бути розглянуті для заміщення. У другому аспекті винахід стосується Термін "N-кінцевий GLA-домен" означає поліпептиду фактора VII з двома заміщеннями амінокислотну послідовність 1-37 фактора VII. стосовно послідовності амінокислот Послідовності Трилітерне позначення "GLA" означає 4№1, де вищезгадане заміщення - це: (і) заміщення карбоксиглутамінову кислоту (g-карбоксиглутамат). L305 на будь-яку іншу амінокислоту, і (іі) Термін "протеазний домен" означає заміщення на будь-яку іншу амінокислоту однієї амінокислотну послідовність 153-406 фактора VII амінокислоти, вибраної з групи, що складається з (важкий ланцюг фактора Vllа). К157, К337, D334, S336, V158, Е296, і М298. Термін "поліпептид фактора VII", як У третьому аспекті винахід стосується використано в цьому винаході, означає будь-який поліпептиду фактора VII з трьома заміщеннями білок, що містить послідовність амінокислот 1-406 стосовно послідовності амінокислот Послідовності природного фактора VII людини (Послідовність №1, де вищезгадане заміщення - це: (і) заміщення №1) або його варіанти. До нього належить, окрім L305 на будь-яку іншу амінокислоту, і (іі) іншого, фактор VII людини, фактор Vllа людини та заміщення на будь-яку іншу амінокислоту двох його варіанти. амінокислот, вибраних з групи, що складається з Термін "фактор VII", як використано в цьому К157, К337, D334, S336, V158, Е296 і М298. винаході, включає неактивну одноланцюгову У подальшому аспекті винахід стосується молекулу зимогену фактора VII, а також поліпептиду фактора VII з чотирма заміщеннями активовану дволанцюгову молекулу фактора VII стосовно послідовності амінокислот Послідовності (фактор Vllа). Сюди належать білки, що мають №1, де вищезгадане заміщення - це: (і) заміщення послідовність амінокислот 1-406 природного L305 на будь-яку іншу амінокислоту, і (іі) фактора VII людини або фактора Vllа. Сюди також заміщення на будь-яку іншу амінокислоту трьох належать білки зі злегка модифікованою амінокислот, вибраних з групи, що складається з послідовністю амінокислот, наприклад, К157, К337, D334, 3336, V158, Е296 і М298. модифікований N-кінець, включаючи N-кінцеві У подальшому аспекті винахід стосується амінокислотні делеції або додавання настільки, поліпептиду фактора VII з п'ятьма заміщеннями наскільки ті білки істотно зберігають активність стосовно послідовності амінокислот Послідовності фактора Vllа. Термін "фактор Vllа", або "FVllа", як №1, де вищезгадане заміщення - це: (і) заміщення використано в цьому винаході, означає продукт, L305 на будь-яку іншу амінокислоту, і (H) що містить активовану форму (фактор Vllа). заміщення на будь-яку іншу амінокислоту чотирьох "Фактор VII" або "фактор Vllа" у межах амінокислот, вибраних з групи, що складається з вищезгаданого визначення також включає К157, К337, D334, 3336, V158, Е296 і М298. природні алельні варіації, що можуть існувати й У подальшому аспекті винахід стосується відбуватися в однієї особи або іншої. Також, поліпептиду фактора VII з шістьома заміщеннями ступінь і розташування глікозилювання або інших стосовно послідовності амінокислот Послідовності посттрансляційних модифікацій можуть варіювати №1, де вищезгадане заміщення - це: (і) заміщення залежно від обраної клітини-хазяїна та природи L305 на будь-яку іншу амінокислоту, і (іі) внутрішнього середовища клітини. заміщення на будь-яку іншу амінокислоту п'ятьох Терміни "варіант" або "варіанти", як амінокислот, вибраних з групи, що складається з використано в цьому винаході, означають фактор К157, К337, D334, S336, V158, Е296 і М298. VII, що містить послідовність Послідовності №1, де У подальшому аспекті винахід стосується одна або кілька амінокислот вихідного білка були поліпептиду фактора VII із сьома заміщеннями заміщені на іншу амінокислоту та/або, де одна або стосовно послідовності амінокислот Послідовності кілька амінокислот вихідного білка були видалені 9 82177 10 ссавців. У подальшому втіленні рекомбінантна №1, де вищезгадане заміщення - це: (і) заміщення клітина-хазяїн вибрана з групи, що складається з L305 на будь-яку іншу амінокислоту, і (іі) СНО клітин, НЕК клітин і ВНК клітин. заміщення на будь-яку іншу амінокислоту шістьох Термін "клітина-хазяїн", як використано в амінокислот, вибраних з групи, що складається з цьому винаході, представляє будь-яку клітину, К157, К337, D334, S336, V158, Е296 і М298. включаючи гібридну клітину, в котрій може бути У подальшому аспекті винахід стосується експресована чужорідна ДНК. До типових клітинполіпептиду фактора VII з вісьмома заміщеннями хазяїв належать, окрім іншого, клітини комах, стосовно послідовності амінокислот Послідовності клітини дріжджів, клітини ссавців, включаючи №1, де вищезгадане заміщення - це: (і) заміщення клітини людини, такі як ВНК, СНО, НЕК і COS L305 на будь-яку іншу амінокислоту, і (іі) клітини, краще, якщо в практиці цього винаходу заміщення на будь-яку іншу амінокислоту клітини-хазяї, що культивують, це клітини ссавців, амінокислот К157, К337, D334, S336, V158, Е296 і ще краще, якщо постійна лінія клітин ссавців, М298. включаючи, окрім іншого, СНО (наприклад, АТСС У подальшому аспекті винахід стосується CCL 61), COS-1 (наприклад, АТСС CRL 1650), полінуклеотидного конструкту, що кодує клітини нирок ховрашенят (ВНК) і НЕК293 поліпептид фактора VII, що містить щонайменше [наприклад, АТСС CRL 1573; Graham et al., J. Gen. два заміщення стосовно послідовності Virol. 36:59-72, 1977] лінії клітин. Кращою лінією амінокислот Послідовності №1, де вищезгадане клітин ВНК є tk- ts13 ВНК лінія клітин [Waechter і заміщення - це: (і) заміщення L305 на будь-яку Baserga, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106-1110, іншу амінокислоту, і (іі) заміщення на будь-яку іншу 1982], що надалі має назву ВНК 570 клітини. Лінію амінокислоту однієї або кількох амінокислот, клітин ВНК 570 можна одержати від вибраних з групи, що складається з К157, К337, американського типового зібрання культур, 12301 D334, S336, V158, Е296 і М298. Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, під АТСС Термін "конструкт" означає полінуклеотидний номером доступу CRL 10314. Лінію клітин tk" ts13 сегмент, котрий може бути оснований на повній ВНК також можна одержати від АТСС під номером або частковій, що зустрічається в природі, доступу CRL 1632. До інших придатних ліній клітин нуклеотидній послідовності, що кодує потрібний належать, окрім іншого, Rat Hep І (гепатома щура: поліпептид. Конструкт може за бажанням містити АТСС CRL 1600), Rat Hep II (гепатома щура; АТСС інші полінуклеотидні сегменти. Подібним чином, CRL 1548), ТСМК (АТСС CCL 139), легенів людини термін "амінокислоти, котрі можуть бути кодовані (АТСС НВ 8065), NCTC 1469 (АТСС CCL 9.1) і полінуклеотидними конструктами", стосується DUKX клітини [Urlaub і Chasin, Proc. Natl.Acad.Set. амінокислот, котрі можуть бути кодовані USA 77:4216-4220, 1980]. Також корисними є ЗТЗ полінуклеотидними конструктами, описаними клітини, клітини Namalwa, мієломи та злиття вище, тобто амінокислот, таких як Ala, Val, Leu, lIe, мієлом з іншими клітинами. Met, Phe, Trp, Про, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, У подальшому аспекті винахід стосується Lys, Arg, His, Asp і GIn. трансгенної тварини, що містить і експресує У подальшому аспекті винахід стосується полінуклеотидний конструкт. рекомбінантного вектора, що містить У подальшому аспекті винахід стосується полінуклеотидний конструкт, що кодує поліпептид трансгенної рослини, що містить і експресує фактора VII. полінуклеотидний конструкт. Термін "вектор", як використано в цьому У подальшому аспекті винахід стосується винаході, означає будь-яку нуклеїнову кислоту, способу одержання поліпептиду фактора VII здатну до ампліфікації в клітині-хазяї. Таким винаходу, спосіб, що складається з культивування чином, вектор може бути вектором, що автономно клітини, що містить полінуклеотидний конструкт в реплікується, тобто вектором, котрий існує як придатному середовищі для зростання, за умов, екстрахромосомне тіло, реплікація котрого не що дозволяють експресію полінуклеотидного залежить від реплікації хромосом, наприклад конструкту й одержання поліпептиду, що плазміда. Як альтернатива, вектор може бути утворився, з культурального середовища. таким, що коли він уведений в клітину-хазяїна, він Як використано в цьому винаході, термін інтегрується в геном клітини-хазяїна й "придатне середовище для зростання" означає реплікується разом з хромосомою(мами), в котру середовище, що містить поживні речовини та інші він інтегрувався. Вибір вектора часто залежатиме компоненти, потрібні для росту клітини та експресії від клітини-хазяїна, у котрий він має бути послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує уведений. До векторів належать, окрім іншого, поліпептид фактора VII винаходу. плазмідні вектори, фагові вектори, віруси або У подальшому аспекті винахід стосується космідні вектори. Вектори зазвичай містять способу одержання поліпептиду фактора VII, початок реплікації та щонайменше один генспосіб, що складається з одержання поліпептиду з маркер, тобто ген, котрий кодує продукт, котрий молока, одержаного з трансгенної тварини. легко визначається або присутність котрого є У подальшому аспекті винахід стосується необхідною для росту клітин. способу одержання поліпептиду фактора VII, У подальшому аспекті винахід стосується спосіб, що складається з культивування клітини рекомбінантної клітини-хазяїна, що містить трансгенної рослини, що містить полінуклеотидний полінуклеотидних конструкт або вектор. В одному конструкт, і одержання поліпептиду з рослини, що втіленні рекомбінантною клітиною-хазяїном є утворилась. еукаріотична клітина. В іншому втіленні рекомбінантною клітиною-хазяїном є клітина 11 82177 12 може бути пригнічений потребою негайного У подальшому аспекті винахід стосується гомеостазу й може початися кровотеча, фармацевтичної композиції, що містить незважаючи на нормальний гемостатичний поліпептид фактора VII, що містить щонайменше механізм. Досягнення задовільного гомеостазу є два заміщення стосовно послідовності також проблемою, коли кровотечі відбуваються в амінокислот Послідовності №1, де вищезгадане органах, таких як мозок, внутрішнє вухо та очі з заміщення - це: (і) заміщення L305 на будь-яку обмеженою можливістю хірургічного гемостазу. іншу амінокислоту, і (іі) заміщення на будь-яку іншу Така сама проблема може виникнути в процесі амінокислоту однієї або кількох амінокислот, відібрання біопсій з різних органів (печінка, легені, вибраних з групи, що складається з К157, К337, тканина пухлин, шлунково-кишковий тракт), а D334, S336, V158, Е296 і М298; і, за бажанням, також за лапароскопічної операції. Спільним для фармацевтично прийнятний носій. всіх цих ситуацій є труднощі створення гомеостазу У подальшому аспекті винахід стосується хірургічними способами (шви, затискувачі тощо), використання поліпептиду фактора VII, що містить що також має місце, коли кровотечі є дифузними щонайменше два заміщення стосовно (геморагічний гастрит та надмірні маточні послідовності амінокислот Послідовності №1, де кровотечі). Гострі та надмірні кровотечі можуть вищезгадане заміщення - це: (і) заміщення L305 на також відбуватися у пацієнтів за антикоагулянтної будь-яку іншу амінокислоту, і (іі) заміщення на терапії, в яких порушений гомеостаз був будь-яку іншу амінокислоту однієї або кількох викликаний застосованою терапією. Такі пацієнти амінокислот, вибраних з групи, що складається з можуть потребувати хірургічного втручання у К157, К337, D334, S336, V158, Е296 і М298; для випадку, коли антикоагулянтному ефектові одержання ліків. В одному втіленні ліки створені потрібно швидко протидіяти. Радикальну для лікування розладів кровотеч або кровотеч, або ретролобкову простатоектомію зазвичай для підсилення нормальної гемостатичної виконують для пацієнтів з місцевим раком системи. В одному втіленні ліки застосовуються простати. Операція часто ускладнюється значними для лікування гемофілії А або В. та іноді великими втратами крові. Значні втрати У цьому контексті термін "лікування" крові під час простатоектомії головним чином стосується як запобігання очікуваної кровотечі, стосуються ускладненої анатомічної ситуації з такої як за хірургічного втручання, так і за різноманітними щільносудинізованими сайтами, регулювання кровотечі, що вже розпочалась, такої до котрих немає легкого доступу для хірургічного як за травми, з метою інгібування або мінімізації гомеостазу, і котрий може призводить до дифузної кровотечі. Профілактичне уведення поліпептиду кровотечі з великою площею. До інших ситуацій, фактора VII згідно з винаходом також, таким що можуть викликати проблеми у випадку чином, стосується терміну "лікування". незадовільного гомеостазу, належать такі, коли Термін "кровотечі" стосується пацієнтам з нормальним гемостатичним неконтрольованих і надлишкових кровотеч. механізмом призначають антикоагулянтну терапію Кровотечі можуть бути головною проблемою як в для запобігання тромбоемболії. До таких видів хірургії, так і в інших формах ушкодження тканини. терапії може належати уведення гепарину, інших Неконтрольовані та надлишкові кровотечі можуть форм протеогліканів, варфарину або інших форм відбуватися в осіб, що мають нормальну систему антагоністів вітаміну К, а також аспірину та інших коагуляції, а також в осіб, що мають розлади інгібіторів агрегації тромбоцитів. коагуляції або кровотеч. Як використано в цьому У першому втіленні винаходу кровотечі винаході, термін "розлад кровотечі" стосується пов'язані з гемофілією. В іншому втіленні кровотечі будь-якого дефекту, успадкованого, набутого або пов'язані з гемофілією з набутими інгібіторами. В викликаного, клітинного або молекулярного іншому втіленні кровотечі пов'язані з походження, що проявляється в кровотечах. До тромбоцитопенією. В іншому втіленні кровотечі прикладів належать дефіцит фактора згортання пов'язані з захворюванням Фон Віллебранда. В (наприклад, гемофілії А і В або дефіцит факторів іншому втіленні кровотечі пов'язані з сильними коагуляції XI або VII), інгібітори фактора згортання, ушкодженнями тканин. В іншому втіленні кровотечі порушення функції тромбоцитів, тромбоцитопенія пов'язані з сильними травмами. В іншому втіленні або хвороба Фон Віллебранда. кровотечі пов'язані з операцією. В іншому втіленні Надлишкові кровотечі також відбуваються у кровотечі пов'язані з лапароскопічною операцією. пацієнтів з нормальним функціонуючим каскадом В іншому втіленні кровотечі пов'язані з згортання крові (відсутній дефіцит фактора геморагічним гастритом. В іншому втіленні згортання або інгібітори будь-яких факторів кровотечі є надмірними маточними кровотечами. В коагуляції) і можуть бути викликані порушеним іншому втіленні кровотечі відбуваються в органах функціонуванням тромбоцитів, тромбоцитопенією з обмеженою можливістю для механічного або захворюванням Фон Віллебранда. За таких гомеостазу. В іншому втіленні кровотечі випадків, кровотечі можуть бути такими самими, як відбуваються в мозку, внутрішньому вухові або і кровотечі, викликані гемофілією, оскільки в очах. В іншому втіленні кровотечі пов'язані з гемостатичній системі, як і в гемофілії, не вистачає процесом відібрання біопсій. В іншому втіленні або існує надлишок необхідних "сполук" згортання кровотечі пов'язані з антикоагулянтною терапією. (таких як тромбоцити або білковий фактор Фон Термін "суб'єкт", що використовується в цьому Віллебранда), що викликає більшість кровотеч. У винаході, означає будь-яку тварину, зокрема пацієнтів, хто зазнав значного ушкодження ссавців, таких як людина, і може, де прийнятно, тканини, пов'язаного з операцією або великою травмою, нормальний гемостатичний механізм 13 82177 14 використовуватись рівнозначно з терміном У подальшому втіленні винаходу поліпептид "пацієнт". фактора VII - це поліпептид, де щонайменше одна Термін "підсилення нормальної гемостатичної амінокислота, що відповідає амінокислоті в системи" означає підсилення здатності положенні, вибраному з 159-170 Послідовності утворювати тромбін. №1, була заміщена на будь-яку іншу амінокислоту. У подальшому аспекті винахід стосується У подальшому втіленні винаходу поліпептид способу лікування розладів кровотеч або кровотечі фактора VII - це поліпептид, де щонайменше одна в суб'єкті або для підсилення нормальної амінокислота, що відповідає амінокислоті в гемостатичної системи, спосіб, що складається з положенні, вибраному з 290-304 Послідовності уведення терапевтично або профілактично №1, була заміщена на будь-яку іншу амінокислоту. ефективної кількості поліпептиду фактора VII, що У подальшому втіленні винаходу поліпептид містить щонайменше два заміщення стосовно фактора VII - це поліпептид, де R304 була послідовності амінокислот Послідовності №1, де заміщена на амінокислоту, вибрану з групи, що вищезгадане заміщення - це: (і) заміщення L305 на складається з Tyr, Phe, Leu, і Met. будь-яку іншу амінокислоту, і (іі) заміщення на У подальшому втіленні винаходу поліпептид будь-яку іншу амінокислоту однієї або кількох фактора VII - це поліпептид, де щонайменше одна амінокислот, вибраних з групи, що складається з амінокислота, що відповідає амінокислоті у К157, К337, D334, S336, V158, Е296 і М298; положенні, вибраному з 306-312 Послідовності суб'єктові за потреби. №1, була заміщена на будь-яку іншу амінокислоту. У подальшому аспекті винахід стосується У подальшому втіленні винаходу поліпептид поліпептиду фактора VII винаходу для фактора VII - це поліпептид, де М306 була використання як ліки. заміщена на амінокислоту, вибрану з групи, що В одному втіленні винаходу, поліпептид складається з Asp і Asn. фактора VII - це поліпептид, де L305 заміщена на У подальшому втіленні винаходу поліпептид будь-яку іншу амінокислоту і К157 заміщена на фактора VII - це поліпептид, де D309 була будь-яку іншу амінокислоту. заміщена на амінокислоту, вибрану з групи, що У подальшому втіленні винаходу, поліпептид складається з Ser і Thr. фактора VII - це поліпептид, де L305 заміщена на У подальшому втіленні винаходу поліпептид будь-яку іншу амінокислоту і К337 заміщена на фактора VII - це поліпептид, де щонайменше одна будь-яку іншу амінокислоту. амінокислота, що відповідає амінокислоті у У подальшому втіленні винаходу, поліпептид положенні, вибраному з 330-339 Послідовності фактора VII - це поліпептид, де L305 заміщена на №1, була заміщена на будь-яку іншу амінокислоту. будь-яку іншу амінокислоту і D334 заміщена на У подальшому втіленні винаходу поліпептид будь-яку іншу амінокислоту. фактора VII - це поліпептид, де А274 була У подальшому втіленні винаходу, поліпептид заміщена на будь-яку іншу амінокислоту. фактора VII - це поліпептид, де L305 заміщена на У подальшому втіленні винаходу, поліпептид будь-яку іншу амінокислоту і S336 заміщена на фактора VII - це поліпептид, де А274 була будь-яку іншу амінокислоту. заміщена на амінокислоту, вибрану з групи, що У подальшому втіленні винаходу, поліпептид складається з Met, Leu, Lys і Arg. фактора VII - це поліпептид, де L305 заміщена на У подальшому втіленні винаходу поліпептид будь-яку іншу амінокислоту і V158 заміщена на фактора VII - це поліпептид, де К157 була будь-яку іншу амінокислоту. заміщена на амінокислоту, вибрану з групи, що У подальшому втіленні винаходу, поліпептид складається з Gly, Val, Ser, Thr, Asn, GIn, Asp і Glu. фактора VII - це поліпептид, де L305 заміщена на У подальшому втіленні винаходу поліпептид будь-яку іншу амінокислоту і Е296 заміщена на фактора VII - це поліпептид, де вищезгадана К337 будь-яку іншу амінокислоту. була заміщена на амінокислоту, вибрану з групи, У подальшому втіленні винаходу, поліпептид що складається з Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, GIn, фактора VII - це поліпептид, де L305 заміщена на Asp і Glu. будь-яку іншу амінокислоту і М298 заміщена на У подальшому втіленні винаходу поліпептид будь-яку іншу амінокислоту. фактора VII - це поліпептид, де вищезгадана D334 У подальшому втіленні винаходу поліпептид була заміщена на амінокислоту, вибрану з групи, фактора VII - це поліпептид, де щонайменше одна що складається з Gly і Glu. амінокислота в остаточних положеннях в У подальшому втіленні винаходу поліпептид протеазному домені була заміщена на будь-яку фактора VII - це поліпептид, де вищезгадана S336 іншу амінокислоту. була заміщена на амінокислоту, вибрану з групи, У подальшому втіленні винаходу поліпептид що складається з Gly і Glu. фактора VII - це поліпептид, де щонайменше одна У подальшому втіленні винаходу поліпептид амінокислота в остаточних положеннях в фактора VII - це поліпептид, де вищезгадана V158 протеазному домені була заміщена на будь-яку була заміщена на амінокислоту, вибрану з групи, іншу амінокислоту. що складається з Ser, Thr, Asn, GIn, Asp і Glu. У подальшому втіленні винаходу поліпептид У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII - це поліпептид, де щонайбільше 20 фактора VII - це поліпептид, де вищезгадана Е296 додаткових амінокислот в остаточних положеннях була заміщена на амінокислоту, вибрану з групи, у протеазному домені були заміщені на будь-які що складається з Arg, Lys і Val. інші амінокислоти. У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII - це поліпептид, де вищезгадана М298 15 82177 16 приблизно 2,0, за умови тестування в тесті була заміщена на амінокислоту, вибрану з групи, "Гідроліз in vitro". У подальшому втіленні що складається з Lys, Arg, GIn і Asn. відношення між активністю вищезгаданого У подальшому втіленні винаходу поліпептид поліпептиду фактора VII і активністю природного фактора VII - це поліпептид, де вищезгадана L305 поліпептиду фактора VII, наведеного в була заміщена на амінокислоту, вибрану з групи, Послідовності №1, становить щонайменше що складається з Val, Туr і llе. приблизно 4,0, за умови тестування в тесті У подальшому втіленні винаходу поліпептид "Гідроліз in vitro". фактора VII - це поліпептид, де вищезгадана L305 У подальшому втіленні винаходу поліпептид була заміщена на Val. фактора VII - це поліпептид, де відношення між У подальшому втіленні винаходу поліпептид активністю вищезгаданого поліпептиду фактора фактора VII - це поліпептид, де амінокислота була VII і активністю природного поліпептиду фактора заміщена на іншу амінокислоту, котра може бути VII, наведеного в Послідовності №1, становить кодована полінуклеотидними конструктами. щонайменше приблизно 1,25, за умови тестування У подальшому втіленні винаходу поліпептид в тесті "Протеоліз in vitro". В одному втіленні фактора VII - це поліпептид, де вищезгаданий відношення між активністю вищезгаданого поліпептид фактора VII - це фактор VII людини. поліпептиду фактора VII і активністю природного У подальшому втіленні винаходу поліпептид поліпептиду фактора VII, наведеного в фактора VII - це поліпептид, де вищезгаданий Послідовності №1, становить щонайменше поліпептид фактора VII - це фактор Vllа людини. приблизно 2,0, за умови тестування в тесті У подальшому втіленні винаходу поліпептид "Протеоліз in vitro". У подальшому втіленні фактора VII - це поліпептид, де відношення між відношення між активністю вищезгаданого активністю вищезгаданого поліпептиду фактора поліпептиду фактора VII і активністю природного VII і активністю природного поліпептиду фактора поліпептиду фактора VII, наведеного в VII, наведеного в Послідовності №1, становить Послідовності №1, становить щонайменше щонайменше приблизно 1,25. В одному втіленні приблизно 4,0, за умови тестування в тесті відношення між активністю вищезгаданого "Протеоліз in vitro". У подальшому втіленні поліпептиду фактора VII і активністю природного відношення між активністю of вищезгадане фактор поліпептиду фактора VII, наведеного в VIІ поліпептид і активністю природного Послідовності №1, становить щонайменше поліпептиду фактора VII, наведеного в приблизно 2,0. У подальшому втіленні відношення Послідовності №1, становить щонайменше між активністю вищезгаданого поліпептиду приблизно 8,0, за умови тестування в тесті фактора VII і активністю природного поліпептиду "Протеоліз in vitro". фактора VII, наведеного в Послідовності №1, У подальшому втіленні винаходу поліпептид становить щонайменше приблизно 4,0. фактора VII - це FVll людини зі щонайменше У подальшому втіленні винаходу поліпептид двома заміщеннями стосовно послідовності фактора VII - це поліпептид, де відношення між амінокислот Послідовності №1, де вищезгадане активністю вищезгаданого поліпептиду фактора заміщення - це: (і) L305V, і (іі) одна або кілька VII і активністю природного поліпептиду фактора амінокислот, вибраних з групи, що складається з VII, наведеного в Послідовності №1, становить К157Х1, К337А, D334X2, S336X3, V158X4, E296V і щонайменше приблизно 1,25, за умови тестування M298Q, де X1 - це Gly, Val, Ser, Thr, Asn, GIn, Asp, в тесті на активність фактора Vllа. В одному або Glu; X2 - це Gly або Glu; X3 - це Gly або Glu; X4 втіленні відношення між активністю вищезгаданого - це Thr або Asp. поліпептиду фактора VII і активністю природного У подальшому втіленні винаходу поліпептид поліпептиду фактора VII, наведеного в фактора VII - це L305V/K337A-FVII. Послідовності №1, становить щонайменше У подальшому втіленні винаходу поліпептид приблизно 2,0, за умови тестування в тесті на фактора VII - це L305VA/158D-FVII. активність фактора Vllа. У подальшому втіленні У подальшому втіленні винаходу поліпептид відношення між активністю вищезгаданого фактора VII - це L305V/E296V-FVII. поліпептиду фактора VII і активністю природного У подальшому втіленні винаходу поліпептид поліпептиду фактора VII, наведеного в фактора VII - це L305V/M298Q-FVI1. Послідовності №1, становить щонайменше У подальшому втіленні винаходу поліпептид приблизно 4,0, за умови тестування в тесті на фактора VII - це L305V/V158T-FVII. активність фактора Vllа. Активність фактора Vllа У подальшому втіленні винаходу поліпептид може бути виміряна в тестах, описаних в фактора VII - це L305V/K337A/V158T-FVII. прикладах 5 або 6. У подальшому втіленні винаходу поліпептид У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII – це 1305V/K337A/M298Q-FVII. фактора VII - це поліпептид, де відношення між У подальшому втіленні винаходу поліпептид активністю вищезгаданого поліпептиду фактора фактора VII - це L305V/K337A/E296 V-FVII. VII і активністю природного поліпептиду фактора У подальшому втіленні винаходу поліпептид VII, наведеного в Послідовності №1, становить фактора VII - це L305V/K337AA/158D-FVII. щонайменше приблизно 1,25, за умови тестування У подальшому втіленні винаходу поліпептид в тесті "Гідроліз in vitro". В одному втіленні фактора VII - це L305V/V158D/M298Q-FVII. відношення між активністю вищезгаданого У подальшому втіленні винаходу поліпептид поліпептиду фактора VII і активністю природного фактора VII - це L305V/V158D/E296V-FVII. поліпептиду фактора VII, наведеного в Послідовності №1, становить щонайменше 17 82177 18 У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII - це L305VA/158T/M298Q-FVII. У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII - це L305V/V158T7E296V-FVII. У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII - це L305V/E296 V/M298Q-FVII. У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII - це L305V/V158D/E296V/M298Q-FV1I. У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII - це L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII. У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII - це L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII. У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII - це L305V/V158T/E296V/K337A-FVII. У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII - це L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII. У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII - це L305V/E296V/M298Q/K337A -FVII. У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII - це L305V/V158D/E296V/K337A -FVII. У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII це L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII. У подальшому втіленні винаходу поліпептид фактора VII це L305V/V158Т/Е296V/M298Q/K337A-FVII. У подальшому аспекті винахід стосується поліпептидів фактора коагуляції Vllа людини, що підвищували тканинний фактор-незалежну активність порівняно з природним фактором Vllа коагуляції людини. В іншому аспекті підвищена активність не супроводжується змінами в субстратній специфічності. В іншому аспекті винаходу зв'язування варіантів поліпептиду з тканинним фактором не має бути порушено й варіанти поліпептиду мають мати щонайменше активність фактора Vllа дикого типу за зв'язування з тканинним фактором. Термінологія заміщень амінокислот, використана в цьому описі, є такою. Перша літера представляє амінокислоту, що природно присутня у положенні Послідовності №1. Наступна цифра Одержання варіантів поліпептиду Фактора VII представляє положення в Послідовності №1. Винахід також стосується способу одержання Друга літера представляє іншу амінокислоту, що варіантів поліпептиду фактора VII людини, як було заміщує природну амінокислоту. Прикладом є згадано вище. Варіанти поліпептиду фактора VII, L305V/K337A-FVII, лейцин у положенні 305 описані в цьому винаході, можуть бути одержані у Послідовності №1 заміщений на валін, а лізин у способи рекомбінантних нуклеїнових кислот. положенні 337 Послідовності №1 заміщений на Загалом, клонована послідовність нуклеїнової аланін, обидві мутації в одному варіанті кислоти фактора VII дикого типу модифікується поліпептиду фактора VII. для кодування бажаного білка. Цю модифіковану У цьому контексті трилітерні або однолітерні послідовність потім вставляють в експресійний позначення амінокислот були використані в їх вектор, котрим, у свою чергу, трансформують або загальноприйнятому значенні, як зазначено в трансфікують клітини-хазяї. Вищим еукаріотичним Таблиці 1. Якщо тільки не зазначено окремо, клітинам, зокрема культивованим клітинам амінокислоти згадані в цьому винаході це Lссавців, надають перевагу як клітинам-хазяям. амінокислоти. Надалі, ліві та праві кінці Відомі повні нуклеотидні та амінокислотні послідовності амінокислот пептиду є, відповідно, послідовності для фактора VII людини [див. патент N- і С-кінцями, якщо тільки не зазначено іншим США №4784950, де описано клонування та чином. Таблиця 1: Абревіатури амінокислот: експресія рекомбінантного фактора VII людини]. Послідовність фактора VII бика описана в [Takeya et al., J. Biol. Chem. 263:14868-14872 (1988)]. Зміни послідовності амінокислот можуть бути досягнуті цілою низкою способів. Модифікація послідовності нуклеїнової кислоти може бути виконана як сайтспецифічний мутагенез. Способи сайтспецифічного мутагенезу дуже добре відомі в 19 82177 20 порушують здатність білка діяти, як фактор галузі й описані в, наприклад, [Zoller і Smith (DNA коагуляції. Наприклад, варіанти поліпептиду 3:479-488,1984) або "Splicing by extension overlap", фактора VII можуть також бути модифіковані в Horton et al., Gene 77,1989, pp.61-68]. Таким активаційному сайті розщеплення для інгібування чином, використовуючи нуклеотидну й перетворення зимогену фактора VII на його амінокислотну послідовності фактора VII, можна активовану дволанцюгову форму, що загалом вводити зміну(ни) на вибір. Подібним чином, описано в [патенті США №5288629], включеному в процедури одержання конструкту ДНК, цей винахід шляхом посилання. використовуючи полімеразну ланцюгову реакцію зі Послідовності ДНК, що кодують варіанти специфічними праймерами, дуже добре відомі поліпептидів фактора VII людини, зазвичай фахівцям в галузі [порівн. PCR Protocols, 1990, вставлені в рекомбінантний вектор, який може Academic Press, San Diego, California, USA]. бути будь-яким вектором, який може Конструкт нуклеїнової кислоти, що кодує загальноприйнято бути підданий процедурам варіант поліпептиду фактора VII винаходу, може рекомбінантної ДНК, де вибір вектора часто бути прийнятного геномного або кДНК залежатиме від клітини-хазяїна, в котру він був походження, наприклад одержаний приготуванням уведений. Таким чином, вектор може бути геномної або кДНК бібліотеки й скринінгом на автономним реплікаційним вектором, тобто послідовності ДНК, що кодують увесь або частину вектором, який існує як екстрахромосомне поліпептиду, гібридизацією, використовуючи утворення, реплікація котрого незалежна від синтетичні олігонуклеотидні зонди згідно зі реплікації хромосоми, наприклад, плазміда. Як стандартними способами [порівн. Sambrook et al., альтернатива, вектор може бути таким, щоб, коли Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd. Ed. Cold був уведений в клітину-хазяїна, інтегрувався в Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New геном клітини-хазяїна та реплікувався разом з York, 1989]. хромосомою(мами), у котру він інтегрувався. Конструкт нуклеїнової кислоти, що кодує Краще, якщо вектором є експресійний вектор, варіант поліпептиду фактора VII, може також бути у котрій послідовність ДНК, що кодує варіанти одержаний синтетично встановленими поліпептидів фактора VII людини, функціонально стандартними способами, наприклад, у з'єднана з додатковими сегментами, потрібними фосфоамідитний спосіб, описаний [Beaucage і для транскрипції ДНК. Загалом, експресійний Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859вектор одержують з плазмідної або вірусної ДНК, 1869], або в спосіб, описаний [Matthes et аl., ЕМВО або він може містити елементи обох. Термін Journal 3 (1984), 801-805]. Згідно з "функціонально з'єднаний" означає, що сегменти фосфоамідитним способом, олігонуклеотиди розташовані так, що вони функціонують разом з синтезуються, наприклад в автоматичному ДНКоднією метою, наприклад, транскрипція синтезаторі, очищуються, гібридизуються, починається в промоторі та продовжується через лігуються й клонуються в придатні вектори. ДНК послідовність, що кодує поліпептид. Послідовності ДНК, що кодують варіанти Експресійні вектори для використання в поліпептиду фактора VII людини, можуть також експресії варіантів поліпептиду фактора Vllа бути одержані полімеразною ланцюговою мають містити промотор, здатний до спрямування реакцією, використовуючи специфічні праймери, транскрипції клонованого гена або кДНК. наприклад, як описано в [патенті США №4683202, Промотором може бути будь-яка послідовність Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491, або ДНК, яка виявляє транскрипційну активність у Sambrook et al.,] згаданий вище. вибраній клітині-хазяїні та може походити з генів, Надалі конструкт нуклеїнової кислоти може що кодують свої білки або чужорідні білки бути змішаного синтетичного й геномного, стосовно клітини-хазяїна. змішаного синтетичного й кДНК або змішаного До прикладів придатних промоторів для геномного й кДНК походження, одержаний спрямування транскрипції ДНК, що кодує варіант зв'язуванням фрагментів синтетичного, геномного поліпептиду фактора VII людини в клітинах або кДНК походження (залежно від ситуації), ссавців, належить SV40 промотор [Subramani et фрагментів, що відповідають різним частинам аl., Моl. Cell Biol. 1 (1981), 854-864], МТ-1 (ген повного конструкту нуклеїнової кислоти, згідно зі металотіонеїну) промотор [Palmiter et al., Science стандартними способами. 222 (1983), 809-814], CMV промотор [Boshart et al., Краще, якщо конструкт нуклеїнової кислоти є Cell 41:521-530,1985] або головний пізній промотор конструктом ДНК. Послідовності ДНК для аденовірусу 2 [Kaufman та Sharp, Моl. Cell. Biol, використання за одержання варіантів поліпептиду 2:1304-1319,1982]. фактора VII згідно з цим винаходом, типово До прикладів придатних промоторів для кодують пре-про поліпептид на аміно-кінці використання в клітинах комах належать фактора VII для одержання певного полігедринові промотори [патент США 4745051; посттрансляційного процесингу (наприклад gVasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992)7-11], Р10 карбоксилювання залишків глутамінової кислоти) і промотор [J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69,1988, секреція з клітини-хазяїна. Пре-про поліпептид pp.765-776], промотор основного білка вірусу може бути фактором VII або іншим вітамін Кполігідрозу Autographa californica [Європейський залежним білком плазми, таким як фактор IX, патент №397485], промотор раннього гена 1 фактор X, протромбін, білок С або білок S. Як буде бакуловірусу [патент США №5155037; патент США оцінено фахівцем у галузі, додаткові модифікації №5162222] або промотор раннього гена, що можуть бути зроблені в послідовності амінокислот фактора VII, де ці модифікації незначно 21 82177 22 ДНК, що кодують поліпептиди фактора VII людини експресується із затримкою, бакуловірусу 39К у вірній рамці зчитування. Секреторні сигнальні [патент США №5155037; патент США №5162222]. До прикладів придатних промоторів для послідовності зазвичай розташовані 5¢ до використання в клітинах дріжджів-хазяїнів послідовності ДНК, що кодує пептид. Секреторна належать промотори з генів гліколізу дріжджів сигнальна послідовність може бути від цього ж [Hitzeman et aI., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073 білка або може бути з гена, що кодує інший 12080; Alber та Kawasaki, J. Моl. Appl. Gen. 1 секретований білок. (1982), 419-434] або гени алкогольдегідрогенази Для секреції з клітин дріжджів секреторна [Young et al., in Genetic Engineering of сигнальна послідовність може кодувати будь-який Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, сигнальний пептид, який забезпечує ефективне eds.), Plenum Press, New York, 1982], ТРl1 [патент спрямування експресованих варіантів поліпептидів США №4599311] або ADH2-4c [Russell et al., фактора VII людини на секреторний шлях клітини. Nature 304 (1983), 652-654] промотори. Сигнальний пептид може бути природним До прикладів придатних промоторів для сигнальним пептидом або його функціональною використання в ниткоподібних грибах клітин-хазяїв частиною, або це може бути синтетичний пептид. належать, наприклад, ADH3 промотор [McKnight et Придатними сигнальними пептидами є a-фактор al., EMBO J. 4 (1985), 2093-2099] або tpiA сигнальний пептид [див. патент США №4870008], промотор. До прикладів інших корисних сигнальний пептид амілази слинних залоз миші промоторів належать ті, що походять з гена, що [див. О. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, кодує A. oryzae ТАКА амілазу, Rhizomucor miehei pp.643-646], модифікований сигнальний пептид аспартатпротеїназу, А. niger нейтральну aкарбоксипептидази [див. L.A. Vails et al., Cell 48, 1987, pp.887-897], сигнальний пептид BAR1 амілазу, А. niger кислотостійку a-амілазу, А. niger дріжджів [див. WO 87/02670] або сигнальний або A. awamori глюкоамілазу (gluA), Rhizomucor пептид аспарагінової протеази 3 (YAP3) дріжджів miehei ліпазу, A. oryzae лужну протеазу, A. oryzae [див. М. Egel-Mitani et al., Vest 6,1990, pp.127-137]. тріозофосфатізомеразу або А. nidulans Для ефективної секреції в дріжджах ацетамідазу. Кращими є промотори ТАКА-амілази послідовність, що кодує лідерний пептид, може та gluA. Придатні промотори наведені, наприклад, також бути вставлена нижче від сигнальної в [Європейському патенті №238023 та послідовності та вище від послідовності ДНК, що Європейському патенті №383779]. кодує варіанти поліпептидів фактора VII людини. Послідовності ДНК, що кодують варіанти Функціонування лідерного пептиду складається в поліпептидів фактора VII людини можуть також, за тому, що експресований пептид спрямовується з необхідності, бути функціонально з'єднаними з ендоплазматичного ретикулуму до апарату придатними термінаторами, такими як термінатори Гольджі та, крім того, до секреторних везикул для гормону росту людини [Palmiter et al., Science 222, секреції в культуральне середовище (тобто 1983, pp.809-814], ТРl1 [Alber та Kawasaki, J. Моl. експорту варіантів поліпептидів фактора VII Appl. Gen. 1, 1982, pp.419-434] або ADH3 [McKnight людини через клітинну стінку або щонайменше et al., EМВО J. 4, 1985, pp.2093-2099] через клітинну мембрану у периплазматичний термінаторами. Вектор може також містити набір простір дріжджової клітини). Лідерний пептид може сайтів сплайсингу РНК, розташованих нижче від бути лідерною послідовністю альфа-фактора промотору та вище від сайту вставки для самої дріжджів використання котрого описано в, послідовності фактора VII. Кращі сайти сплайсингу наприклад, [патенті США №4546082, патенті США РНК можуть бути одержані з аденовірусу та/або №4870008, Європейському патенті №16201, генів імуноглобулінів. Також в експресійних Європейському патенті №123294, Європейському векторах знаходиться сигнал поліаденілювання, патенті №123544 та Європейському патенті розташований нижче від сайту вставки. Зокрема №163529]. Як альтернатива, лідерним пептидом до кращих сигналів поліаденілювання належать може бути синтетичний лідерний пептид, який є ранні або пізні сигнали поліаденілювання з SV40 лідерним пептидом, котрого не існує в природі. [Kaufman та Sharp, там само], сигнал Синтетичні лідерні пептиди можуть, наприклад, поліаденілювання з ділянки ЕІb аденовірусу 5, бути створені, як описано в [WO 89/02463 або WO термінатори гена гормону росту людини [DeNoto et 92/11378]. al. Nuc. Acid Res. 9:3719-3730, 1981] або сигнал Для використання в ниткоподібних грибах поліаденілювання з гена фактора VII людини або сигнальний пептид може загальноприйнято бути гена фактора VII бика. До експресійних векторів одержаним з гена, що кодує амілазу або може також належати некодуюча лідерна глюкоамілазу Aspergillus sp., гена, що кодує ліпазу послідовність вірусів, така як потрійна лідерна або протеазу Rhizomucor miehei або ліпазу послідовність аденовірусу 2, розташована між Humicola lanuginosa. Краще, якщо сигнальний промотором і сайтами сплайсингу РНК; та пептид походить з гена, що кодує ТАКА амілазу A. енхансерні послідовності, такі як SV40 енхансер. Для того, щоб спрямувати варіанти oryzae, нейтральну a-амілазу А. niger, поліпептидів фактора VII людини цього винаходу кислотостійку амілазу А. niger або глюкоамілазу А. на секреторний шлях клітини-хазяїна, секреторна niger. Придатні сигнальні пептиди описані в, сигнальна послідовність (також відома як лідерна наприклад, [Європейському патенті №238023 та послідовність, препропослідовність або Європейському патенті №215594]. препослідовність) може бути введена в Для використання в клітинах комах, рекомбінантний вектор. Секреторна сигнальна сигнальний пептид може загальноприйнято бути послідовність приєднується до послідовностей одержаним з гена комахи [див. WO 90/05783], 23 82177 24 речовини та інші компоненти, потрібні для росту такого як попередник сигнального пептиду клітин та експресії потрібних варіантів адипокінетичного гормону лускокрилого Manduca поліпептидів фактора VII людини. Середовища sexta [див. патент США №5023328]. загалом містять джерело вуглецю, джерело азоту, Процедури, що використовуються для незамінні амінокислоти, незамінні цукри, вітаміни, з'єднання послідовностей ДНК, що кодують солі, фосфоліпіди, білки та фактори росту. Для варіанти поліпептидів фактора VII людини, з промотором та за бажанням термінаторами та/або утворення g-карбоксильованих білків краще, якщо секреторною сигнальною послідовністю, середовище містить вітамін К за концентрації від відповідно, і для вставляння їх у придатні вектори, приблизно 0,1мкг/мл до приблизно 5мкг/мл. що містять інформацію, необхідну для реплікації, є Селекцію з допомогою ліків потім застосовують добре відомими фахівцям у галузі [див., для селекції на ріст клітин, що постійно наприклад, Sambrook et al., Molecular Cloning: експресують селективний маркер. Для клітин, що Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, були трансфіковані селективним маркером, 1989]. здатним до ампліфікації, концентрація ліків може Способи трансфекції клітин ссавців та бути підвищена для селекції на збільшену кількість експресії послідовностей ДНК, уведених в клітини, копій клонованих послідовностей, таким чином описані в, наприклад, [Kaufman та Sharp, J. Моl. підвищуючи рівень експресії. Клони стабільно Biol. 159 (1982), 601-621; Southern та Berg, J. Моl. трансфікованих клітин потім піддають скринінгові Appl. Gent 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. на експресію потрібного варіанту поліпептиду Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler et фактора VII людини. al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro та Pearson, Somatic Клітина-хазяїн, в котру вводять послідовності Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham та van der Eb, ДНК, що кодують варіанти поліпептиди фактора Virology 52 (1973), 456; та Neumann et al., EMBO VII людини, може бути будь-якою клітиною, яка J.1 (1982), 841-845]. здатна до утворення посттрансляційно Клоновані послідовності ДНК уводять у модифікованих поліпептидів фактора VII людини, і культивовані клітини ссавців, наприклад, через включає дріжджі, гриби та вищі еукаріотичної фосфат кальцію-опосередковану трансфекцію клітини. [Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro і До прикладів клітинних ліній ссавців для Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; використання в цьому винаході належать: COS-1 Graham і Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973] (АТСС CRL 1650), клітини нирок молодих ховрахів або електропорацію [Neumann et al., EMBO J. (ВНК) та 293 (АТСС CRL 1573; [Graham et аІ, J. 1:841-845, 1982]. Для ідентифікації та селекції Gen. Virol. 36:59-72, 1977]. Кращою ВНК клітинною клітин, що експресують екзогенну ДНК, ген, що лінією є tk- ts13 ВНК (Waechter та Baserga, Proc. надає селективний фенотип (селективний маркер), Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982, загалом уводять в клітини разом з геном або включений в цей винахід шляхом посилання), потрібною кДНК. До кращих селективних маркерів означена надалі у цьому винаході як ВНК 570 належать гени, що надають резистентність до клітини. ВНК 570 клітинна лінія була депонована в ліків, таких як неоміцин, гігроміцин і метотрексат. Американському типовому зібранні культур, 12301 Селективним маркером може бути ампліфікований Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852, під АТСС селективний маркер. Кращим здатним до номером доступу CRL 10314. Клітинна лінія tk- ts13 ампліфікації селективним маркером є ВНК є також доступною під АТСС номером послідовність дигідрофолатредуктази (ДГФР). доступу CRL 1632. Крім того, кілька інших Селективні маркери переглянуті Thilly (Mammalian клітинних ліній можуть бути використані в межах Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, цього винаходу, включаючи Rat Hep І (гепатома MA, включений в цей винахід шляхом посилання). щура; АТСС CRL 1600), Rat Hep II (гепатома щура; Фахівець у галузі легко зможе обрати придатні АТСС CRL 1548), ТСМК (АТСС CCL 139), легенів селективні маркери. людини (АТСС НВ 8065), NCTC 1469 (АТСС CCL Селективні маркери можуть бути введені в 9.1), СНО (АТСС CCL 61) та клітини DUKX [Urlaub клітину в окремій плазміді одночасно з потрібним та Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216геном або вони можуть бути введені в одну 4220,1980]. плазміду. Якщо в одній плазміді, селективний До прикладів придатних клітин дріжджів маркер та потрібний ген можуть бути під належать клітини Saccharomyces spp. або контролем різних промоторів або одного Schizosaccharomyces spp., зокрема штами промотору, останнє розташування веде до Saccharomyces cerevisiae або Saccharomyces утворення дицистронної матриці. Конструкти цього kluyveri. Способи трансформації клітин дріжджів типу відомі в галузі (наприклад, Levinson та чужорідною ДНК та одержання чужорідних Simonsen, [патент США №4713339]). Додавання поліпептидів описані, наприклад, у [патенті США додаткової ДНК може також бути перевагою, №4599311, патенті США №4931373, патенті США відомою як "ДНК-носій," до суміші, що вводиться в №4870008, 5037743, та патенті США №4845075], клітини. усі включені сюди шляхом посилання. Після того, як клітини прийняли ДНК, вони Трансформовані клітини вибираються по вирощуються в прийнятному середовищі для фенотипу, що визначається по селективному зростання, типово 1-2 дні, для початку експресії маркеру, зазвичай резистентністю до ліків або потрібного гена. Як використано в цьому винаході, здатністю рости за відсутності певної поживної термін "прийнятне середовищі для зростання" речовини, наприклад, лейцину. Кращим вектором означає середовище, що містить поживні для використання в дріжджах є вектор РОТ1, 25 82177 26 VII людини, утворений клітинами, може потім бути описаний у [патенті США №4931373]. одержаний з культурального середовища Послідовностям ДНК, що кодують поліпептиди загальноприйнятими процедурами, включаючи фактора VII людини, можуть передувати виділення клітин-хазяїв з середовища сигнальна послідовність та, за бажанням, лідерна центрифугуванням або фільтруванням, послідовність, наприклад, як описано вище. Крім осадженням білково-водних компонентів того, до прикладів придатних клітини дріжджів супернатанту або фільтрату з допомогою солі, належать штами Kluyveromyces, такі як К. lactis, наприклад, сульфату амонію, очищення Hansenula, наприклад, Н. polymorpha або Pichia, чисельними хроматографічними процедурами, наприклад, P. pastoris [див. Gleeson et al., J. Gen. наприклад, іонообмінною хроматографією, МікроbіоІ. 1321986, pp.3459-3465; патент США гельфільтрацією, хроматографією за №4882279]. спорідненістю тощо, залежно від типу поліпептиду, До прикладів інших клітин грибів належать що потрібно виділяти. клітини ниткоподібних грибів, наприклад, У межах цього винаходу трансгенна тваринна Aspergillus spp., Neunospora spp., Fusarium spp. технологія може бути використана для одержання або Trichoderma spp., зокрема штами A. oryzae, A. варіанту поліпептиду фактора VII людини. Краще, nidulans або А. niger. Використання Aspergillus spp. якщо одержувати білки в молочних залозах самиці для експресії білків описане в, наприклад, ссавця. Експресія в молочній залозі та наступна [Європейському патенті №272277, Європейському секреція потрібного білка в молоко дозволяє патенті №238023, Європейському патенті подолати багато складнощів, з котрими №184438]. Трансформація F. oxysporum може, стикаються за виділення білка з інших джерел. наприклад, бути виконана, як описано в [Malardier Молоко легко збирати, доступне у великий et al., 1989, Gene 78:147-156]. Трансформація кількості та добре описано біохімічно. Крім того, Trichoderma spp. може бути виконана, наприклад, головні білки молока присутні в молоці за високих як описано в [Європейському патенті №244234]. концентрацій (типово з приблизно 1 до 15г/л). Якщо ниткоподібні гриби використовуються як З комерційної точки зору абсолютно краще клітини-хазяї, вони можуть бути трансформовані використовувати як хазяї види, що мають великий конструктом ДНК винаходу загальноприйнятою вихід молока. У той час, як менші тварини, такі як інтеграцією конструкту ДНК в хромосому хазяїна, миші та щури, можуть використовуватись (і є щоб одержати рекомбінанту клітину-хазяїна. Ця кращими, як принциповий доказ) у межах цього інтеграція загалом вважається переважною, винаходу, краще використовувати стадних ссавців, оскільки більш імовірно, що послідовність ДНК включаючи, окрім іншого, свиней, кіз, овець та стабільно підтримується в клітині. Інтеграція крупний рогатий скот. Вівці є зокрема кращими конструктів ДНК у хромосому-хазяїна може бути завдяки таким факторам, як попередня історія виконана згідно з загальноприйнятими способами, трансгенезу цих видів, вихід молока, вартість та наприклад, гомологічною або гетерологічною наявність обладнання для збирання молока. [Див. рекомбінацією. WIPO публікацію WO 88/00239] для порівняння Трансформація клітин комах та одержання факторів, що впливають на вибір виду хазяїна. чужорідних поліпептидів у цьому винаході може Загалом бажано вибирати породу тваринибути виконана, як описано в [патенті США хазяїна, що була виведена для молочного №4745051; патенті США №4879236; патенті США використання, така як вівці East Friesland, або для №5155037; 5162222; Європейському патенті створення молочного стада виведенням №397485], включені в цей винахід шляхом трансгенної лінії пізніше. У будь-якому разі мають посилання. Клітинна лінія комах, що використовуватись тварини, відомі як такі, що використовуються як хазяїн, може бути клітинна мають гарне здоров'я. Щоб одержати експресію в лінія Lepidoptera, така як клітини Spodoptere молочній залозі, використовується транскрипція frugiperda або Trichoplusia nі [див. патент США промотору з гена білка молока. Гени білка молока №5077214]. Умови культивування можуть бути, як містять ті гени, що кодують казеїни [дивіться описано в, наприклад, [WO 89/01029 або WO патент США №5304489, включений в цей винахід 89/01028], або в будь-яких з вищезгаданих посилань. шляхом посилання], b-лактоглобулін, aТрансформовані або трансфіковані клітинилактальбумін та сиворотковий кислотний білок. хазяї, описані вище, потім культивують у Промотор b-лактоглобуліну (BLG) є кращим. У придатному поживному середовищі за умов, що випадку гена b-лактоглобуліну вівці загалом дозволяють експресію варіанту поліпептиду використовується проксимальна ділянка фактора VII людини, після чого всі або частина щонайменше 406 п.о. 5'-граничної послідовності пептиду, що утворився, може бути виділена з гена, хоча більші ділянки 5'-граничної культури. Середовище, що використовується для послідовності до приблизно 5 т.п.о. є кращими, культивування клітин, може бути будь-яким такі як приблизно 4,25 т.п.о. сегмент ДНК, що загальноприйнятим середовищем, придатним для вміщує 5'-граничний промотор та некодуючу вирощування клітин-хазяїв, таким як мінімальні ділянку гена b-лактоглобуліну. [Див. Whitelaw et al., або комплексні середовища, що містять прийнятні Biochem J. 286: 31-39 (1992)]. Є також придатними додатки. Придатні середовища, доступні від подібні фрагменти промотору ДНК з інших видів. комерційних постачальників, можуть бути Інші ділянки гена b-лактоглобуліну можуть одержані згідно з опублікованими рецептами також бути включені в конструкти, як і геномні (наприклад, у каталогах Американського типового ділянки гена, що має бути експресованим. зібрання культур). Варіант поліпептиду фактора Загалом у галузі прийнято, що конструкти, котрим 27 82177 28 включає експресійні контрольні послідовності гена бракує інтронів, наприклад, експресуються погано білка молока. У будь-якому разі клонування порівняно з тими, що містять такі послідовності експресійних одиниць в плазміди або інші вектори ДНК [див. Brinster et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA полегшує ампліфікацію варіанту поліпептиду 85: 836-840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. фактора VII людини. Ампліфікація Sci. USA 88:478-482 (1991); Whitelaw et al., загальноприйнято виконується в бактеріальній Transgene Res. 1:3-13 (1991); WO 89/01343; та WO (наприклад, E. соlі) клітині-хазяї, таким чином 91/02318, кожний з котрих включений в цей вектори типово містять початок реплікації та винахід шляхом посилання]. У цьому разі, загалом селективний маркер, функціональний в краще, де можливо, використовувати геномні бактеріальній клітині-хазяї. Експресійну одиницю послідовності, що містять усі або кілька природних потім уводять у запліднені яйця (включаючи інтронів гена, що кодує потрібний білок або ембріони на ранніх стадіях) обраного виду хазяїна. поліпептид, таким чином, окрім іншого, є кращим Уведення чужорідної ДНК може бути досягнуте включення щонайменше кількох інтронів з, одним з кількох шляхів, включаючи мікроін'єкцію наприклад, гена b-лактоглобуліну. Однією такою [наприклад, патент США №4873191], ретровірусну ділянкою є сегмент ДНК, який передбачає інфекцію (Jaenisch, Science 240:1468-1474 (1988)) сплайсинг інтронів та поліаденілювання РНК з 3'або сайт-спрямовану інтеграцію, використовуючи некодуючої ділянки гена b-лактоглобуліну вівці. ембріонні стволові клітини (ES) (в огляді Bradley et Цей сегмент b-лактоглобуліну вівці, коли al., Bio/Technology 10: 534-539 (1992)). Яйця потім заміщений на природну 3'-некодуючу імплантують в яйцепроводи або матку послідовність гена, може як підсилювати, так і псевдовагітних самиць та залишають для стабілізувати експресію потрібного білка або дозрівання. Нащадки, що несуть уведену ДНК в їх поліпептиду. У межах інших втілень ділянка, що зародкові клітини, можуть передавати ДНК своїм оточує початок ATG-послідовності, що кодує нащадкам нормальним чином, за Менделем, що варіант поліпептиду фактора VII людини, заміщена дозволяє розвиток трансгенних стад. Загальні на відповідні послідовності з молокоспецифічного процедури одержання трансгенних тварин відомі в гена білка. Таке заміщення сприяє галузі. [Дивіться, наприклад, Hogan et al., тканиноспецифічним умовам ініціації для Manipulating Mouse Embryo: Laboratory Manual, підсилення експресії. Є зручним заміщувати Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., повністю пре-про послідовність варіанту Bio/Technology 6:179-183 (1988); Wall et al., Biol. поліпептиду фактора VII людини та 5'-некодуючі Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhler et al., послідовності на такі, як наприклад, з гена BLG, Bio/Technology 8:140-143 (1990); Ebert et al., хоча можуть бути заміщені й менші ділянки. Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfort et al., Для експресії варіантів поліпептиду фактора Bio/Technology 9: 844-847 (1991); Wall et al., J. Cell. VII людини в трансгенних тваринах сегмент ДНК, Biochem. 49:113-120 (1992); патенти США що кодує варіант поліпептиду фактора VII людини, №4873191 та 4873316; WIPO публікації WO є функціонально з'єднаним з додатковими 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; та GB сегментами ДНК, потрібними для його експресії 87/00458], які включені в цей винахід шляхом для одержання експресійних одиниць. Такі посилання. Способи введення чужорідної додаткові сегменти містять вищезгаданий послідовності ДНК у ссавців та їх зародкові клітини промотор, а також послідовності, які були розроблені спочатку в миші. [Див., передбачають термінацію транскрипції та наприклад, Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA поліаденілювання мРНК. Експресійні одиниці, крім 77: 7380-7384 (1980); Gordon та Ruddle, Science того, містять сегмент ДНК, що кодує секреторну 214:1244-1246 (1981); Palmiter та Brinster, Cell 41: сигнальну послідовність, функціонально з'єднану з 343-345 (1985); та Brinster et al., Proc. Natl. Acad. сегментом, що кодує поліпептид фактора VII Sci. USA 82: 4438-4442 (1985)]. Ці способи потім людини. Секреторна сигнальна послідовність пристосували для використання в більших тварин, може бути природною секреторною сигнальною включаючи стадні види [див., наприклад, WIPO послідовністю поліпептиду фактора VII людини публікації WO 88/00239, WO 90/05188, та WO або може бути від іншого білка, такого як білок 92/11757; та Simons et al., Bio/Technology 6: 179молока [див., наприклад, von Heinje, Nuc. Acid Res. 183 (1988)]. У підсумок, у більшості ефективних 14: 4683-4690 (1986); та Meade et аl., патент США шляхів, що використовуються сьогодні в створенні №4873316, який включений в цей винахід шляхом трансгенних мишей або стадних тварин, кілька посилання]. сотень лінійних молекул ДНК потрібно ввести в Створення експресійних одиниць для одне з проядер заплідненого яйця згідно зі використання в трансгенних тваринах встановленими способами. Ін'єкція ДНК у загальноприйнято виконується вставленням цитоплазму зиготи також може бути використана. послідовності, що кодує варіант поліпептиду Також може бути використане одержання фактора VII людини, у плазміду або фаговий трансгенних рослин. Експресія може бути загальна вектор, що містять додаткові сегменти ДНК, хоча або спрямована в певний орган, такий як бульба. експресійна одиниця може бути створена зі [Дивіться, Hiatt, Nature 344:469-479 (1990); з'єднань головним чином будь-яких Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12:449-453 послідовностей. Зокрема є зручним створення (1992); Sijmons et al., Bio/Technology 8:217-221 вектора, що містить сегмент ДНК, що кодує білок (1990); та Європейський патент №255378]. молока, та заміщувати кодуючу послідовність Варіанти поліпептиду фактора VII винаходу білка молока на поліпептид фактора VII людини, виділяють з культурального середовища або таким чином створюючи складений ген, що 29 82177 30 природного фактора VII людини, показаного в молока. Варіанти поліпептиду фактора VII цього Фіг.1, становить вище 1,0, наприклад щонайменше винаходу можуть бути очищені низкою процедур, приблизно 1,25, краще, якщо щонайменше відомих в галузі, включаючи, окрім іншого, приблизно 2,0, так, що щонайменше приблизно 3,0 хроматографію (наприклад, іонообмінну, за або навіть ще краще, щонайменше приблизно 4,0, спорідненістю, гідрофобну, хроматофокусування за умови тестування в тесті "Гідроліз in vitro". та виключення за розмірами), електрофоретичні Активність варіантів може також бути процедури (наприклад, препаративне виміряна, використовуючи фізіологічний субстрат, ізоелектричне фокусування (IEF), диференційну такий як фактор X ("Протеоліз in vitro") (див. розчинність (наприклад, преципітація сульфатом Приклад 6), придатний за концентрації 100амонію), або екстракція [див., наприклад, Protein 1000нМ, де утворений фактор Ха визначається Purification, J.-C. Janson і Lars Ryden, editors, VCH після додавання придатного хромогенного Publishers, New York, 1989]. Краще, якщо вони субстрату (наприклад, S-2765). Крім того, аналіз можуть бути очищені афінною хроматографію на на активність може бути виконаний за фізіологічної колонці з анти-фактор VII антитілом. Використання температури. кальцій-залежних моноклональних антитіл, як Здатність варіантів фактора Vllа утворювати описано [Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. тромбін може також бути виміряна в тесті, що 261:11097-11108, (1986) і Thim et al., Biochemistry містить усі відповідні фактори коагуляції та 27: 7785-7793, (1988)], є особливо кращим. інгібітори за фізіологічних концентрацій (мінус Додаткове очищення може бути досягнуте фактор VIII за умов відтворення стану гемофілії), а загальноприйнятими методами хімічного також активовані тромбоцити [як описано на очищення, такими як рідинна хроматографія стор.543 в Monroe et al. (1997) Brit J. Haematol. 99, високої роздільної здатності. Інші способи 542-547], включений сюди шляхом посилання). очищення, включаючи преципітацію цитратом Уведення і Фармацевтичні композиції барію, відомі в галузі й можуть бути застосовані Варіанти поліпептиду фактора VII згідно з цим для очищення нових варіантів поліпептиду винаходом можуть бути використані для лікування фактора VII, описаних в цьому винаході [див., хвороб згортання крові, які мають кілька причин, наприклад. Scopes, R., Protein Purification, такі як дефіцит фактора згортання (наприклад, Springer-Verlag, N.Y., 1982]. гемофілія А та В або дефіцит факторів коагуляції З терапевтичною метою краще, якщо варіанти XI або VII) або інгібітори фактора згортання, або поліпептиду фактора VII винаходу є істотно вони можуть бути використані для лікування чистими. Таким чином, у кращому втіленні надлишкових кровотеч, що відбуваються у винаходу варіанти поліпептиду фактора VII пацієнтів з нормальним функціонуючим каскадом винаходу очищуються до щонайменше приблизно згортання крові (немає дефіциту фактора 90-95% гомогенності, краще, якщо до згортання або інгібіторів будь-якого з факторів щонайменше приблизно 98% гомогенності. коагуляції"). Кровотечі можуть бути викликані Чистота може бути оцінена, наприклад, гельдефектним функціонуванням тромбоцитів, електрофорезом і секвенуванням аміно-кінцевої тромбоцитопенією або захворюванням Фон амінокислоти. Віллебранда. Вони можуть також спостерігатися в Варіант фактора VII розщеплюється в його пацієнтів, у котрих підвищена фібринолітична активному сайті для перетворення його на його активність була викликана різними стимулами. дволанцюгову форму. Активація може бути У пацієнтів, хто переніс значне ушкодження виконана згідно з процедурами, відомими в галузі, тканин, пов'язане з операцією або загальною такими як ті, що описані [Osteoid, et al., травмою, гемостатичний механізм може бути Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, Патент пригнічений потребою в швидкому гомеостазі й у США №4456591; Hedner і Kisiel, J. Clin. Invest. них можуть виникнути кровотечі, незважаючи на 71:1836-1841 (1983); або Kisiel і Fujikawa, Behring нормальний гемостатичний механізм. Досягнення Inst. Mitt. 73:29-42 (1983)]. Як альтернатива, як задовільного гомеостазу є також проблемою, коли описано [Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 кровотечі відбуваються в органах, таких як мозок, September 1986, pp.564-565)], фактор VII може внутрішнє вухо та очі й може також бути бути активований пропусканням його через проблемою у випадках дифузних кровотеч іонообмінну хроматографічну колонку, таку як (геморагічний гастрит та надмірні маточні Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) або подібну. кровотечі), коли складно визначити джерело. Така Активований варіант фактора VII, що утворився, сама проблема може виникнути в процесі може потім складений у композицію та уведений, відібрання біопсій з різних органів (печінка, легені, як описано нижче. пухлина тканин, шлунково-кишковий тракт), а ТЕСТИ також у лапароскопічній операції. Спільним за цих У винаході також запропоновано придатні ситуацій є труднощі забезпечення гомеостазу способи селекції кращих варіантів фактора Vllа хірургічними способами (шви, затискачі тощо). згідно з цим винаходом. Ці способи можуть бути Гострі та надмірні кровотечі можуть також виконані як простий попередній тест in vitro. відбуватися у пацієнтів за антикоагулянтної Таким чином, у Прикладі 5 цього винаходу терапії, у котрих порушений гомеостаз був описано простий тест (названий "Гідроліз in vitro") викликаний впровадженою терапією. Такі пацієнти на активність варіантів фактора Vllа винаходу. можуть потребувати хірургічного втручання у Згідно з тестом поліпептиди фактора Vllа, які випадку, якщо антикоагулянтному ефектові складають певний інтерес, це такі поліпептиди, де потрібно швидко протидіяти. До інших ситуацій, відношення між активністю варіанта та активністю 31 82177 32 тощо, наприклад, ацетат натрію, лактат натрію, коли можуть викликати проблеми у випадку хлорид натрію, хлорид калію, хлорид кальцію незадовільного гомеостазу, належать такі, коли тощо. пацієнтам з нормальним гемостатичним Концентрація варіанту фактора VII в цих механізмом назначають антикоагулянтну терапію композиціях може змінюватись у широких межах, для запобігання тромбоемболічних захворювань. тобто, з менш, ніж приблизно 0,5% за масою, До таких видів терапії належать гепарин, інші зазвичай або щонайменше приблизно 1% за форми протеогліканів, варфарин або інші форми масою до 15 або 20% за масою та вибиратиметься вітамін К-антагоністів, а також аспірин та інші в першу чергу за об'ємом рідини, в'язкістю тощо, інгібітори агрегації тромбоцитів. згідно з певним обраним шляхом уведення. Системна активація каскаду коагуляції може Таким чином, типова фармацевтична приводити до розсіяної внутрішньосудинної композиція для внутрішньовенної інфузії може коагуляції (РВК). Проте, такі ускладнення не бути складена так, щоб містити 250мл стерильного спостерігалися в пацієнтів, яким уводили високі розчину Рингера та 10мг варіанту фактора VII. дози рекомбінантного фактора Vllа, завдяки Справжні способи одержання парентеральної локалізованому гемостатичному процесові, композиції відомі або очевидні фахівцям у галузі викликаному комплексом, утвореним між та описані більш детально в, наприклад, фактором Vllа та тканинним фактором на місці [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., ушкодження стінки судини. Прокоагулянтні Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)]. варіанти фактора VII згідно з винаходом можуть, Композиції, що містять варіанти поліпептиду таким чином, також використовуватись в їх фактора VII цього винаходу, можуть бути введені активованій формі для лікування таких для профілактичного та/або терапевтичного надлишкових кровотеч, пов'язаних з нормальним лікування. За терапевтичного застосування гемостатичним механізмом. композиція вводиться пацієнтові, що вже страждає Для лікування у зв'язку зі заздалегідь на захворювання, як описано вище, у кількості, спланованими втручаннями прокоагулянтні достатній для лікування, полегшення або варіанти фактора VII винаходу типово вводять у часткової зупинки захворювання та його межах приблизно 24 години перед виконанням ускладнення. Кількість, достатня для здійснення втручання та протягом 7 днів або більше після цієї мети, описана як "терапевтично ефективна того. Уведення, як коагулянту, може бути виконано кількість". Як буде зрозуміло фахівцю у галузі, багатьма шляхами, як описано в цьому винаході. кількість, ефективна для цієї мети, залежатиме від Доза варіантів фактора VII становить у межах важкості захворювання або ушкодження, а також від приблизно 0,05мг до 500мг/день краще, якщо з маси та загального стану пацієнта. Загалом, приблизно 1мг до 200мг/день, та ще краще, якщо з проте, ефективна кількість становитиме від приблизно 10мг до приблизно 175мг/день на 70кг приблизно 0,05мг до приблизно 500мг варіанту пацієнта як перша та підтримуюча доза залежно фактора VII на день для 70кг пацієнта, де більше від складності стану. за все використовуються дози від приблизно 1,0мг Фармацевтична композиція у першу чергу до приблизно 200мг варіанту фактора VII на день. призначена для парентерального введення для Поліпептиди FVII цього винаходу можуть профілактичного та/або терапевтичного лікування. загалом використовуватися за серйозних Краще, якщо фармацевтична композиція захворювань або ушкоджень, що загрожують вводиться парентерально, тобто, життю або є потенційно такими. За таких випадків внутрішньовенно, підшкірно або з метою зменшення чужорідних речовин та внутрішньом'язово, або вона може бути введена загального браку імуногенності варіантів фактора як безперервна або ударна інфузія. Композиції VII людини є можливим та може бути бажаним для парентерального введення містять варіант уведення спеціалізованим лікарем істотного фактора VII винаходу в комбінації з краще, якщо надлишку цих варіантних композицій фактора VII. розчиненим фармацевтично прийнятним носієм, За профілактичного застосування композиції, краще, якщо водному носії. Можуть бути що містять варіант фактора VII винаходу, використані чисельні водні носії такі, як вода, вводяться пацієнтові, прийнятного або піддатного буферна вода, 0,4% сольовий розчин, 0,3% гліцин до ризику захворювання або ушкодження для тощо. Варіанти поліпептиду фактора VII винаходу підсилення власної коагулятивної спроможності можуть також бути складені на ліпосомних пацієнта. Така кількість описана як "профілактично препаратах для доставки або спрямування до ефективна доза." За профілактичного сайтів ушкодження. Ліпосомні препарати загалом застосування точна кількість знову ж таки описані в, наприклад, [патентах США №4837028, залежить від стану здоров'я пацієнта та маси, але 4501728 та 4975282]. Композиції можуть бути доза загалом у межах від приблизно 0,05мг до стерилізовані загальноприйнятими, добре приблизно 500мг на день для 70-кілограмового відомими способами стерилізації. Водні розчини пацієнта, більше звичайно від приблизно 1,0мг до можуть бути спаковані для використання або приблизно 200мг на день для 70-кілограмового фільтровані за асептичних умов та ліофілізовані, пацієнта. ліофілізований препарат з'єднують зі стерильним Одиночне або чисельне введення композицій водним розчином перед уведенням. Композиції можуть виконуватися за доз та схем, обраних можуть містити фармацевтично прийнятні спеціалізованим лікарем. Для амбулаторних додаткові речовини, потрібні для відтворення пацієнтів, що потребують підтримання дози цілу фізіологічних умов, таких як нормалізуючі рН та добу, варіанти поліпептидів фактора VII можуть буферуючі агенти, агенти, що модулюють тонус, 33 82177 34 бути введені безперервною інфузією, Олігонуклеотидні праймери, кожний використовуючи, наприклад, портативну систему комплементарний протилежному ланцюгові подачі. вставки вектора, нарощувалися під час Локальне доставляння варіанту фактора VII температурних циклів з допомогою Pfu ДНКцього винаходу, таке як, наприклад, місцеве полімерази. Після вставляння праймерів, застосування, може виконуватися, наприклад, з створювали мутовану плазміду, що містить допомогою спрею, перфузії, подвійних балонних зміщені "ніки". Після температурних циклів, катетерів, стентів, вставлених у судинні продукт обробляли Dpnl, який є специфічним для трансплантати або стенти, гідрогелі, що метильованої та гемметильованої ДНК, для використовуються для покриття балонних розщеплення вихідної ДНК матриці та для селекції катетерів, або інші загальноприйняті способи. У на мутаціявмісної синтезованої ДНК. будь-якому разі фармацевтична композиція має Процедури одержання ДНК конструкту, нести кількість варіанту фактора VII, достатньої використовуючи полімеразну ланцюгову реакцію зі для ефективного лікування пацієнта. специфічними праймерами, є добре відомими Цей винахід, окрім іншого, проілюстрований фахівцям у галузі [див. PCR Protocols, 1990, наступними прикладами, які, проте, наведені як Academic ress, San Diego, California, USA]. такі, що не обмежують об'єм захисту. Деталі, Приклад 2 описані в наступному описові та прикладах можуть Одержання L305V/K337A-FVII. бути окремо й в будь-якій їх комбінації матеріалом ВНК клітини трансфікували головним чином, для втілення винаходу в його різноманітних форм. як попередньо описано [Thim et аl. (1988) На Фігурі 1 наведена повна послідовність Biochemistry 27, 7785-7793; Persson та Nielsen амінокислот природного (дикого типу) фактора VII (1996) FEBS Lett. 385. 241-243], щоб одержати коагуляції людини (Послідовність №1). експресію варіанта L305V/K337A-FVII. Варіант Приклади фактора VII очищували наступним чином: Термінологія для заміщень амінокислот, що Досліджуване середовище завантажували на використовується в наступних прикладах, така: 25-мл колонку з Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia перша літера представляє амінокислоту, що Biotech) після додавання 5мМ EDTA, 0,1% Triton Xприродно присутня в положенні послідовності №1; 100 та 10мМ Tris, доведення pH до 8,0 та наступне число представляє положення в доведення провідності до 10-11мСм/см послідовності №1; друга літера представляє іншу додаванням води. амінокислоту, що заміщує природну амінокислоту, Елюції білка досягали градієнтом з 10мМ Tris, наприклад, L305V/K337A-FVII, лейцин у положенні 50мМ NaCI, 0,1% Triton X-100, pH8,0; до 10мМ Tris, 305 Послідовності №1 заміщений на валін, а лізин 50мМ NaCI, 25мМ СаСІ 2, 0,1% Triton X-100, рН7,5. у положенні 337 Послідовності №1 заміщений на Фракції, що містили L305V/K337A-FVII, збирали та аланін, обидві мутації в одному варіанті фактора застосовували на 25-мл колонку, що містить VII. моноклональне антитіло F1A2 (Novo Nordisk, Приклад 1 Bagsvaerd, Denmark), зв'язане з CNBrДНК, що кодує L305V/K337A-FVII, активованою Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, Колонку врівноважували 50мМ Hepes, pH7,5, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII. що містить 10мМ СаСІ 2, 100мМ NaCI та 0,02% ДНК конструкти, що кодують L305V/K337ATriton X-100. Після промивання з врівноваженим FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII і буфером та врівноваженим буфером, що містить L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII 2М NaCI, зв'язаний матеріал елюювали одержували сайт спрямованим мутагенезом, врівноваженим буфером, що містить 10мМ EDTA використовуючи суперспіральний, дволанцюговий замість СаСІ 2. Перед використанням або вектор ДНК з потрібною вставкою, і двома зберіганням, додавали надлишок СаСІ 2 над EDTA синтетичними праймерами, що містять бажану або L305V/K337A-FVII переносили до Са2+мутацію. Використовували наступні праймери: вмісного буфера. Вихід кожного етапу Для L305V-FVII: супроводжувався визначеннями фактора VII ELISA та очищений білок аналізували з допомогою SDSPAGE. Приклад 3 Одержання L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII. ВНК клітини трансфікували головним чином, як попередньо описано [Thim et аl. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson та Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243], щоб одержати експресію варіанта L305V/V158D/E296V/M298QFVII. Поліпептид фактора VII очищували наступним чином: Досліджуване середовище завантажували на 25-мл колонку з Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) після додавання 5мМ EDTA, 0,1% Triton X100 та 10мМ Tris, доведення pH до 8,0 та 35 82177 36 Vllа") перевіряли паралельно для прямого доведення провідності до 10-11мСм/см порівняння їх специфічної активності. Тест додаванням води. виконували в мікротитровочному планшеті Елюції білка досягали градієнтом з 10мМ Tris, (Maxisorp, Nunc, Denmark). Хромогенний субстрат 50мМ NaCI, 0,1% Triton X-100, pH8,0; до 10мМ Tris, D-lle-Pro-Arg-р-нітроанілід (S-2288, Chromogenix, 50мМ NaCI, 25мМ СаСІ 2, 0,1% Triton X-100, рН7,5. Sweden), кінцева концентрація 1mM, додавали до Фракції, що містили L305V/V158D/E296V/M298Qфактора Vllа (кінцева концентрація 100нМ) в 50мМ FVII, збирали та застосовували на 25-мл колонку, Hepes, рН7,4, що містить 0,1М NaCI, 5мМ СаСІ 2 та що містить моноклональне антитіло F1A2 (Novo 1мг/мл альбуміну сироватки бика. Поглинання за Nordisk, Bagsvaerd, Denmark), зв'язане з CNBr405нМ визначалося безперервно в SpectraMax™ активованою Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). 340 планшетному зчитувачеві (Molecular Devices, Колонку врівноважували 50мМ Hepes, pH7,5, USA). Поглинання, розвинуте протягом 20що містить 10мМ СаСІ 2, 100мМ NaCI та 0,02% хвилинної інкубації після вирахування поглинання Triton X-100. Після промивання з врівноваженим в пустій лунці, що не містить ферменту, буфером та врівноваженим буфером, що містить використовували для підрахування відношення 2М NaCI, зв'язаний матеріал елюювали між активністю варіанта та фактора Vllа дикого врівноваженим буфером, що містить 10мМ EDTA типу: замість СаСІ 2. Перед використанням або Відношення =(А405нМ варіанта фактора зберіганням, додавали надлишок СаСІ 2 над EDTA Vlla)\(A405нМ фактора Vllа дикого типу). або L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII переносили Приклад 6 до Са2+-вмісного буфера. Вихід кожного етапу Протеоліз in vitro супроводжувався визначеннями фактора VII ELISA Природний (дикого типу) фактор Vllа та та очищений білок аналізували з допомогою SDSваріант фактора Vllа (обидва означені як "Фактор PAGE. Vllа") перевіряли паралельно для прямого Приклад 4 порівняння їх специфічної активності. Тест Одержання виконували в мікротитровочному планшеті L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIІ. (Maxisorp, Nunc, Denmark). Фактор Vllа (10нМ) та ВНК клітини трансфікували головним чином, фактор X (0,8мкМ) в 100мкл 50мМ Hepes, рН7,4, як попередньо описано [Thim et al. (1988) що містить 0,1М NaCI, 5мМ СаСІ 2 та 1мг/мл Biochemistry 27, 7785-7793; Persson та Nielsen альбуміну сироватки бика, інкубували протягом (1996) FEBS Lett. 385, 241-243], щоб одержати 15хв. Розщеплення фактора X потім зупиняли експресію варіанта додаванням 50мкл 50мМ Hepes, рН7,4, що містить L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII. 0,1М NaCI, 20мМ EDTA та 1мг/мл альбуміну Поліпептид фактора VII очищували наступним сироватки бика. Кількість утвореного фактора Ха чином: визначали додаванням хромогенного субстрату ZДосліджуване середовище завантажували на D-Arg-Gly-Аrg-р-нітроаніліду (S-2765, Chromogenix, 25-мл колонку з Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Sweden), кінцева концентрація 0,5мМ. Поглинання Biotech) після додавання 5мМ EDTA, 0,1% Triton Xза 405нМ визначалося безперервно в 100 та 10мМ Tris, доведення pH до 8,0 та SpectraMax™ 340 планшетному зчитувачеві доведення провідності до 10-11мСм/см (Molecular Devices, USA). Поглинання, розвинуте додаванням води. протягом 10-хвилинної інкубації після вирахування Елюції білка досягали градієнтом з 10мМ Tris, поглинання в пустій лунці, що не містить FVIIa, 50мМ NaCI, 0,1% Triton X-100, pH8,0; до 10мМ Tris, використовували для підрахування відношення 50мМ NaCI, 25мМ СаСІ 2, 0,1% Triton X-100, рН7,5. між активністю варіанта та фактора Vllа дикого Фракції, що містили типу: L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, збирали Відношення =(А405нМ варіанта фактора та застосовували на 25-мл колонку, що містить Vlla)\(A405нМ фактора Vllа дикого типу). моноклональне антитіло F1A2 (Novo Nordisk, Приклад 7 Bagsvaerd, Denmark), зв'язане з CNBrВідносна активність поліпептидів FVIIa, активованою Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). виміряна в способи, описані в прикладах 5 та 6. Колонку врівноважували 50мМ Hepes, pH7,5, що містить 10мМ СаСІ 2, 100мМ NaCI та 0,02% Triton X-100. Після промивання з врівноваженим буфером та врівноваженим буфером, що містить 2М NaCI, зв'язаний матеріал елюювали врівноваженим буфером, що містить 10мМ EDTA замість СаСl2. Перед використанням або зберіганням, додавали надлишок СаСІ 2 над EDTA або L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII переносили до Са2+-вмісного буфера. Вихід кожного етапу супроводжувався визначеннями Список послідовностей фактора VII ELISA та очищений білок аналізували Послідовність 1 (послідовність амінокислот з допомогою SDS-PAGE. природного фактора VII коагуляції людини): Приклад 5 Гідроліз in vitro Природний (дикого типу) фактор Vllа та варіант фактора Vllа (обидва означені як "Фактор 37 82177 38 Поліпептиди фактора коагуляції VII людини Фігура 1 послідовність амінокислот природного фактора VII коагуляції людини 39 82177 40 41 82177 42 43 82177 44