Спосіб отримання похідних пристинаміціну

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК (19) (5i)s С 07 Р 4 9 8 / 1 4 , А 61 К 3 1 / 3 9 5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ ПРИ ГННТ СССР (21) 4202596/23-04 •(22) 21.05.87 (31) 8607270 1 \ * 2 40 »30 (m, 1Н, 5 Ї ) ; 2 , 3 5 ( d , I = 1 5 , 1Н, ; 2 , 5 0 ( d d , 1H, - C H 2 S - ) ; 2 , 6 0 ( 3 d , 1Н, 5Єг); 2 , 7 8 (m, 1H, - S Н2' 2,90-3,10 (m, 1H, -CH 2 -S- и -S 3,15 (го, 1H, ) ;*3,48 45 )i (ш, 1К, 50 N ) ; 4 , 9 5 ( d d , 1H, 5 £ , ) ; 5 , 2 8 55 (m, 2 H , 5 t f и 4 o i ) ; 7 , 8 7 ( m , 1Hx xO,85, 1 ' H 6 1-ого изомера); 7,93 (m, 1HxQ,15 1 ' Hg 2-го и з о м е р а ) . [З-Хинуклидинил пристинамицин І д перекристаллизо' вывают следующим образом. Растворяют 14,15 г £з-хинуклидинил ^)-5о-тиометил~|-лристинамицина Ід в 75 см 3 метанола. Добавляют к этому раствору 4 см3 дистиллированной воды, затем оставляют для кристаллизации при 4°С . Полученные кристаллы фильтруют, затем прополаскивают 4 раза по 10 см3 смеси метанола и воды (95-5 об.%). После сушки при пониженном давлении (90 Па) при 42°С получают 10,22 г белыхкристаллов с т . п л . 190^0. З-Меркапто-хинуклидин (R) получают по примеру 2, но на основе 32,5 г 3-ацетилтио-хинуклидина (R) и 35 см 3 водного раствора 10 н . г и д р окенда натрия. Получают 11,5 г 3 меркапто-хинуклидина (R) в форме б е лых кристаллов с т . п л . 45°С и о т г о н я - ' емых при 90°С и при 930 Па (С^ХЇ = = +121°С, С = 1,1, метанол). З-Ацетилтио-хинуклидин (R) получают аналогично примеру 1, но на основе 104,7 г трифенилфосфина, 80,8 г диизопропилазодикарбоксилата и 25,7 г 3-оксихинуклидина (S) (Acta Pharm Snec, 1979, 16, 281). Таким образом, получают 33,8 г 3-ацетнлтиохинуклидина (R) в форме светло-коричневого масла (R/ = 0 , 4 ; растворитель хлористый метилен-метанол 80-20 о б . % ) . П р и м е р 4, Аналогично примеру 1, но исходя из 3,5 г 5о метиленпристинамицина I . и 0,6 г меркаптохинуклидина (Helv Chim Acta 1974, 57, 2339) и после концентрации д о с у ха, получают твердое вещество, которое перемешивают в простом этиловом эфире. После фильтрования вьделяют 3,6 г твердого ''вещества бежевого ц в е т а , которое очищают "мгновенной" хроматографией, отбирая фракции по 50 см3 (растворитель - хлористый метилен-метанол 85-15 о б . % ) . После концентрации досуха фракций 19-35, промывки простым этиловым эфиром, фильтрования, затем сушки образующегося твердого вещества при пониженном • давлении (2,7 кПа) при 20"С получают 1,2 г (4-хинуклидинил)-5а-тиометнлпристинамицина І й в форме измельченыого белого порошка с т . п л . 200 о С. Спектр ядерного магнитного р е - ' зонанса (2 изомера на уровне углерода 5 о в количествах 85-15 приблизит е л ь н о ) : 0,62 (dd, I = 1Ь и 5 , 5 , Ш, 161 6520 1,87 ( t , 6Н, - S 4 ~ 2,20 (та, 1Н, 5fr); 2,28 (га, 1Н, - C H 4 - S - ) ; 2,35 ( d , I = 15, 1H, 5(3,); 2,47 (dd, 1H, 5 £ J ; 3,10 ( t , 6H, 10 (растворитель - хлористый метиленметанол 90-10 об.%), концентрации до> суха фракций 19-32 и сушки при пониженном давлении (2,7 кПа) при 30°С 5 получают 0,5 г [З-хинуклидинил ( S ) ] 5о~тиометил-виргиниамицина (S) в форме бледно-желтого порошка с т . п л . 190°С. Спектр ядерного магнитного р е 10 'зонанса (2 изомера на уровне углерод да 5о в количествах приблизительно 85-15 об.%): 0,39 (dd, I = 15 и 5, HI, 5/J z ); 1,5-2,3 (m, 5H, ) ; 3,22 (dd, 1H, :N CH/ -CH 2 -, - S - ) ; 5,01 (dd, 1H, 5 ^ ) ; 5,29 (широкая, I = 5 , 5 , 5o0_; 7,86 (m, 0,85 H, і'Нgотносящийся к большинству изомер); 7,92 (m, 0,15Н 1 r Hg относящийся к меньшинству и з о І, і і ^тп, і Н , , 1 5 мер) . П р и м е р 5. Аналогично примеру 1 , но исходя из 1,2 г 5о-метилен- г ' 2,34 (d, I =15, 1H, 5 j V ; 2,52 (dd, виргиниамицина S в 20 см 3 метанола 1H, -CH 2 S-); 2,64 (dd, 1H, 5 £ z ) ; и 0,21 г 3-меркапто-хинуклидина (R)/ 20 2,66 (dd, 1H, S-f>i ) , 2 , 9 0 - 3 , 2 После очистки "мгновенной" хроматографией, отбирая фракции по 10 см3 N ,S {растворитель - хлористый метилен-ме(m, 6H, 1H, - C H - - S - , и Н танол 95-5 об.7а до фракции 3 5 , затем хлористый метилен-метанол 80-20 об.%) -s концентрации досуха фракций 47-55 и 3,3-3,5 (га, 1Н,. сушки при пониженном давлении (2,7 кПа) при 30 С получают 0,6 г 1Н, 5 £ ч ) ; 5,27 (d широкая, 1Н, £3-хинуклидинил (R)l -50-тиометилвир7,8O(dd, 1 = 4 и 1 1Н*О,85, Г н 6 1 - г о гиниамицина (S) в форме измельченно-изомера); 7,90 (dd, I = 4 и 1, 1Н X 30 го белого порошка с т . п л . 185 С. ^0,15, 1 ; Н^ 2-го изомера). Спектр ядерного магнитного р е з о ' П р и м е р 7, Аналогично примеру нанса (2 изомера на уровне углерода 2, но исходя из 1,6? г 3-меркапто5 а в количествах приблизительно 80хинуклидина (S) и перемешивания 2 0 ) : 0,4 ( d d , I - 15 и 5 , 5 , 1Н, 5 ^ ; при ~20°С в течение 20 ч получают 35 1,5-2,2 (ш, 5Н, -s-T^CH,» 5 ^ ' после концентрации досуха при пониженном давлении (2,7 кПа) при 30°С 11,4 г вещества бежевого цвета, котон рое перемешивают в 100 см 3 простого _ с дд диэтилового эфира, фильтруют, затем 2 (m, 1H, ~ S ~[^) ) ; 2,34 ( d , I = 15, прополаскивают 3 раза по 20 см 3 того N же растворителя. Этот продукт можно • 1Н, 5ft,); 2,52 (dd, 1H - CHf S - ) ; перекристаллизовывать из ацетона, 2,63 (dd, 1H, 5 £ J ; 2,78 (dd, 1H, как описано в примере 2, чтобы полу) ; 2,85-3,15 (га, 1Н, -СН 2 S- 45 чить 6,6 г 3-хинуклидинил ( 3 ) - 5 о - т и о Н метил-пристинапицина 1^ в форме б е -S лых кристаллов с т . п л . 198-200 С, характеристики которого идентичны ха1Н рактеристикам продукта, полученного ' " N 50 в примере 2 и содержащего 3% относя4,94 (dd, 1H, 5 6, >; .5,27 (d широкая щегося к меньшему количеству изоме1 = 5, 1H, 5cO; 7*,82 (dd, 1 = 4 р а , высокоразрешающей жидкостной и 1, 1 ' l t 6 1-го изомера); 7,9 (dd, хроматографией (HPLC). I = 3 и 1, 1'Hg 2-го изомера). П р и м е р З . В раствор 1 г П р и M e p 6. Аналогично приме5о-метилен-пристиндмицина h в ру 1 , но исходя из 1,1 г 5І)-метилен- 55 20 см3 ацетона добавляют при -20 С виргиниамиципа (S) в 20 см3 метанола за 1 ч 0,16 г 3-меркапто-хинуклидина и 0,19 г 3-меркапто-хинуклидина ( S ) . (S) в растворе в 5 см3 ацетона. ПосПосле очистки "мгновенной" хроматогра3 л е 18 ч перемешивании при -20 С фильтфией, отбирая фракции по 10 см —— • - » N м 16 16520 руют реакционную смеет», промывают твердое вещество 3 раза по 2 см* ацетона. После сушки воздухом получают 0,6 г [3-хинуклидинил (S)]-5(fтиометил-пристинамицина Ід в форме белых кристаллов с т . п л . 190 С, характеристики которого идентичны характеристикам продукта, полученного в примере 2 и содержащего 3 от% носящегося к меньшинству изомера, определенного HPLC. П р и м е р 9 , В раствор 1,?2 г 3 5о-метилен-пристинамицина Ід в 15 см ацетона добавляют при -78 С 0,16 г 3-меркапто-хинуклидина (S) в раство3 ре в 5 см ацетона, затем перемешивают полученный раствор в атмосфере азота в течение 24 ч при -73°С. Потом реакционную смесь концентрируют досуха при пониженном давлении (2,7 Па) при 30°С, чтобы получить 1,4 г кремового белого твердого в е щества, содержащего 5% относящегося к меньшему количеству изомера,определенного HPLC и имеющего характеристики, идентичные характеристикам продукта, полученного в примере 2. П р и м е р 10. Исследование биологической активности полученных соединений. Испытание полученных соединений на бактериостатическую активность in v i t r o , К серии пластинок, содержащих 20 см3 среды для культуры (агар Мюллер Хинтона), добавляют 1/10 этого объема серии геометрически увеличивающихся разведении (отношение геометрической прогрессии 2) испытываемого соединения. На пластинки производят посев культуры с помощью многоточечного инокулятора, который дает пятно из 104 образующих колонию единиц микроорганизма втрипти евом соевом бульоне, лрохоцивіьеь инкубацию в течение J8 ч при 37 С и разведенного в отношении 1/100 в той же среде. После посева микроорганизмов пластинки инкубируют в течение 24 ч при 37°С. . Минимальной ингибирующей концентрацией (М.И.К) является самая низкая концентрация, при которой ин~ гибируется развитие микроорганизма. Результаты испытаний представлены в табл.1. Испытание полученных соединений " на активность против внутрибрюшинной 12 инфекции на мышах. Мміням явпдчт внут3 рпбрюшинную инъекцию 0,5 см взболтанной культуры возряста 18 ч тест микроорганизма в среде "Мозговой и сердечной инъекции" (Difсо), р а з в е денной 5%-ным свиным муцином. Такая инъекция вызывает смерть контрольных животных в течение 24-48 ч, Испыты,« ваемое соединение вводят подкожно дважды с интервалом 5 ч в день инъекции, причем первую дозу вводят через 1 ч после инъекции микроорганизма. Использовались единичные дозы в объе3 ме 50 ^м -'кг. 15 DCc0 - является дозой испытывае 20 25 30 35 40 д 5 ГА мого соединения, вводимой при каждом подкожном уколе, приводящей к т о му, что 50% испытываемых животных выживают в течение непитательного периода (8 дней). Тест микроіцікла СЮ in v i t r o . ДанІ ное исследование рассчитано на оценку потенциальной активности продуктов путем возбуждения появления микроядер в клетках яичника китайского хомяка (СНО) с метаболической активацией и без метаболической активации. Циклофосфамид (случай с активацией) и метилметансульфонат (случай без активации) использовались параллельно в качестве позитивного контроля. Культуры клеток фибробластулы китайского хомяка (СН0-К1) подвергают действию испытываемого соединения в присутствии или отсутствии экзогенной метаболической активации. После воздействия испытываемых соединений клетки фиксировались и окрашивались. Затем предметные стекла анализировались для обнаружения микроядер. Клетки исследовались через 44 ч после конца воздействия. В данных исследованиях используется полная среда, приготовленная на основе культурной среды, Hamis F-12 выпускаемой фирмой Flow Laboratories. К среде Hamis F-12 добавлено, мас.%: сыворотка зародыша теленка 10; пенициллина (5000 межд.един. в 1 мл) и стрептомицин (5000 мгк/мл в растворе) 1; глютамин 1L. Система метаболической активации (смесь S9), используемая в испытаниях, является гомогенным препаратом печени (S9) крыс, предварительно обработанных препаратом полихлорированным бифенилом, содержащим 54% 14 '3 , Ь520 ,, 1fi СІ Лroc l o r 1 234 , к которому добавлены тинамицина Т1« (патент Франции кофакторы и минеральные соли. (f 2549 260). Смесь S9 приготавливают следуюТаким образом, соединения общей щим образом. формулы ( I ) могут использоваться в свободной форме или в форме соли приРаствор кофакторов нпкотинамидасоединения с фармацевтически приемдениндинуклеотидфосфат, мл; NADF , лемой кислотой, в чистом виде или (0,1 моль) 0,30; ультрачистая вода в сочетании с пристинамицином И д 3,40; изоцнтрат (0,15 моль) 8 , 7 . Раствор S 9:1 мл приготавливают .Q или предпочтительно с растворимым следующим образом. производным пристинамицина І І В в Самцы крыс (порода Спрейг-Доули) фармацевтических композициях. Кроме подвергают внутрибрюшинной инъекции т о г о , эти композиции могут содержать Aroclor 1254 (500 мг,кг) в объеме любое другое фармацевтически совмес25 мл/кг и убивают через 5 дней. Пос- ^ тимое веществоj которое может быть л е этого асептически удаляют печень инертным или физиологически а к т и в и гомогенизируют в присутствии КС1 ным . (0,15 моль) при температуре ниже В терапии человека полученные +4°С. Гомогенный препарат подвергасоединения особенно полезны при л е ч е ют центрифугированию в течение 20 "^и инфекций бактерийного происхож10 мин при числе оборотов 9000g, дения. Дозы зависят от искомого эфверхний слой (S9) разливают в флакофекта и от времени лечения. Для взрос ны и хранят в жидком азоте при — 18U С, лого они составляют обычно между 2000 Для каждой концентрации 2 чашки и 4000 мг в день при парентеральном 2 Nunc (площадью 10 см ) заселяют при25 приеме, особенно при внутривенном мерно 150000 клеток, содержащихся в приеме с медленной перфузией. 2 мл полной среды, и подвергают инкубации при 37°С в Течение 4 ч . Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я В конце инкубационного периода среды с веществом выливают, чашки 3Q Способ получения производных пристинамицина общей формулы споласкивают PBS и инкубируют с 2 мл полной среды. Через 44 ч после конца обработки клетки окрашивают 1 мл раствора MEYGrunwald в течение 3 мин*. Затем за 1 мин добавляют 1 мл дистиллированной воды. Клетки споласкивают 1 мл _ дистиллированной воды. G i e n s a , разведенную в отношении 1/3 дистиллированной водой, добавляют в течение 20 мин. Затем клетки где Y - водород или диметиламиногрупсполаскивают. Дно чашки выдавливают па; и приклеивают на лредметное стекло R - 3- или 4-хинуклидинил, каплей клея E u k i t t . в виде отдельного изомера или смеси Одно из двух предметных стекол, • изомеров или их кислотно-аддитивных полученных от двух чашек, анализирусолей* о т л и ч а ю щ и й с я тем, ют для подсчета. Подсчитывают количто производное пристинамицина обчество клеток с микроядрами на 1000 щей формулы всех клеток. Результаты испытаний представле- 50 ны в т а б л . 2 и 3 . L.D.- полученных соединений выше 150 мг/кг при испытании на мышах при подкожном введении. Соединения, полученные по предла55 гаемому способу, проявляют, кроме т о г о , явление синергии, когда они сочетаются с пристинамицином I I д или с растворимым производным прис 15 16 16 J6520 где Y имеет указанные значения, подвергают взаимодействию с тиолом общей формулы R - SH, где R имеет указанные значения, в среде органического растворителя с последующим вьделением целевого соединения или в виде основания, или в виде кислотно-аддитивной соли. на П р и о р и т е т к а м: I Staphylococcus aureus Smith Активность Активность in in vitro М.И.К, мг/мл vivo DC50 , мг/кг (подкожно) 1 2 3 4 5 6 Известные соединения: а) 5#-[3(4-метил-1-пиперазинил ) пр опил] тиометилпристи намиїдин І ^ б) 5о~0~метил4-пиперидил)тиометилпристинамицин Ід б) 5Ї-(2-диэтиламиноэтил) тиометилпристинамицин 1^ п р и з 22.05.86 при Y - водород или диметиламиногруппа, R - 3-хинуклидинил. 21.05.87 при Y - водород, или диметиламиногруппа, R - 4-хинуклиto диннл. Т а б л и ц а Пример по 2 f 1 0,5 f 1 5 8,5 19 48 120 34 4,5 20 18 Т