Спосіб ампліфікації сегмента-мішені рнк

1. Способ амплификации сегментамишени РНК, который содержит неперекрывающиеся 5'-субсегмент и З'-субфрагмент, причем способ включает контактирование сегмента-мишени РНК с реакционной смесью, содержащей первый праймер, представляющий собой однонитевую ДНК и включающий последовательность, в достаточной мере комплементарную последовательности 3'-субсегмента сегмента-мишени и операбельно присоединенную к последовательности промотора, и второй праймер, представляющий собой однонитевую ДНК и включающий последовательность, являющуюся частью 5"-субсегмента сегмента-мишени, фермент с активностью РНК-полимеразы, узнающий упомянутый промотор, фермент, обладающий активностью ДНКзависимой ДНК-полимеразы, фермент, обладающий активностью ДНК-зависимой РНК-полимеразы, и рибонуклеозидтрифосфаты и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что упомянутая реакционная смесь содержит, кроме того, фермент, обладающий активностью РНКазы Н, и упомянутую реакционную смесь поддерживают при подходящих условиях так, что происходит реакция, включающая образование матрицы, включающей функциональный двунитевой промотор и последовательность упомянутого сегмента-мишени РНК, и образование РНК путем транскрипции с матрицы, включающей упомянутый промотор, с помощью фермента, обладающего активностью РНК-полимеразы, при этом транскрибированную РНК используют в качестве мишени для дальнейшей амплификации с применением фермента(ов) с активностями РНК-зависимой ДНК-полимеразы, ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, фермента с активностью РНК-полимеразы и двух праймеров, причем процесс, являясь непрерывным, не включает никакой существенной термальной денатурации нуклеиново-кислотного дуплекса. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щийся тем, что фермент, обладающий активностью РНКазы Н, является РНКаза Н Е. со!і. 3. Способ по п.1 или 2, о т л и ч аю щ и й с я тем, что активности как ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, так и обратной транскриптазы обеспечивают обратной транскриптазой ретровируса, выбираемого из группы, состоящей из AMV и MMLV, активность РНК-полимеразы обеспечивают РНК-полимеразой бактериофага, выбираемого из группы, состоящей из 17, ТЗ и SP6, причем в растворе присутствует одна РНК-полимераза. 4. Способ по п. 1 или 2, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что упомянутую реакционную смесь поддерживают при температуре 33-46"С. 5. Способ по любому из пп. 1-4, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что после С > ел О 26754 ампликации РНК-мишень и/или РНК с последовательностью, комплементарной упомянутой РНК-мишени, детектируют гибридизационным анализом с нуклеиновокислотным зондом. б. Способ по любому из пп. 1-5, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что второй праймер получают в результате селективного расщепления РНК-нітги дуплекса РНК/ДНК, который образуется при осуществлении способа Изобретение относится в основном к достижениям в молекулярной биологии и технологии рекомбинантных ДНК, изобретение касается способов и средств, включая анализы и фармацевтические наборы, содержащие требуемые реагенты и средства, для обнаружения в установке in vitro и ex vivo присутствия в биологической пробе целевой нуклеиново-кислотной последовательности или экстраполированной КРН-последовательности из соответствующей целевой ДНК-последовательности, и путем дедукции соответствующего полипептида, который кодирует последовательность РНК (ДНК). Изобретение отличается проведением амплификации такой конкретной целевой последовательности нуклеиновых кислот в самоподдерживающейся in vitro системе, причем амплификацию целевой нуклеиново-кислотной последовательности осуществляют путем получения множества транскрипт-продуктов, которые имеют необязательную способность саморепликации. Эта самоподдерживающаяся система амплификации устраняет необходимость повторной денатурации нуклеиново-кислотных дуплексов, которые нуждаются в температурной циклизации. Изобретение по-новому объединяет все реагенты, необходимые для образования в одной реакционной установке амплифицированного продукта или продукта, пригодного для обнаружения в амплифицированной форме, представляющей наличие целевой нукле и но во-кислотной последовательности. Среди применений, в которых находит использование изобретение, следует отметить анализы РНК-последовательностей или путем экстраполирования ДНК-последовательностей, которые являются характерными для конкретного или общего патогенного заболевания или состояния путем зондовои гибридизации общих вод организма и тканей, содержащих требуемуюцелевую нуклеиново-кислотную последовательность (и). В данной области техники одной из целей является обнаружение различных последовательностей нуклеиновых кислот в биологической пробе, в которой данная последовательность, так называемая целевая нуклеиновая кислота, присутствует в малых количествах по отношению к ее присутствию среди широкого круга других нуклеиново-кислотных видов, включая РНК, ДНК или и то и другое. Таким образом желательно обнаружить нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептиды, которые могут ассоциироваться с патологическими заболеваниями или состояниями, как например, нуклеиновая кислота, взаимосвязанная с нуклеиновой кислотой вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Кроме определения нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, желательно определить другие нуклеиновые кислоты, характерные для патологического заболевания или состояния, как например, дефективный ген, как в случае обнаружения дефективного гена человеческого бета глобина, имеющего место при гемофилии Нуклеиновые кислоты, ассоциируемые с ними, присутствуют в малых количествах относительно всей нуклеиновой кислоты в данной биологической пробе, такой как проба крови или другой общей воды организма, или проба ткани данного исследуемого пациента. Обнаружение таких нуклеиново-кислотных видов предполагает такую специфичность, чтобы данная разновидность нуклеиновых кислот могла быть обнаруживаемой и измеряемой среди широкого круга других нуклеиново-кислотных видов, с которыми она ассоциируется. Некоторые из этих видов могут нести тесную гомологию по крайней мере в выделенных сегментах с целевой нуклеиновой кислотой. Кроме того, эти целевые нуклеиново-кислотные виды очень часто находятся только в очень малых количествах в биологической пробе, подлежащей исследованию. Для проведения правильного диагноза состояния бо 5 10 15 20 25 30 35 40 45 26754 лезни важно, чтобы даже маленькие количества такой целевой нуклеиновой кислоты можно было обнаружить недвусмысленно для правильности системы анали5 за. Для достижения данной цели известного уровня техники разработаны различные подходы, один из которых заключается в том, что количество нуклеиновой кислоты в пробе не изменяется или не под- 10 вергается взаимодействию. Кроме того, разработана система, при которой большое число обнаруживаемых молекул, соответствующих нуклеиново-кислотной мишени, продуцируется для целей легкого об- 15 наружения и измерения. Такая система представляет собой сигнал-генерирующую систему, ассоциированную с целевой нуклеиновой кислотой, продуцирующей обнаруживаемый сигнал, который являет- 20 ся репрезентативным ряда молекул целевой последовательности. Разработан другой подход, который включает повышение числа копий самой целевой нуклеиново-кислотной последова- 25 тельности. Это можно сделать путем селективной амплификации целевой последовательности нуклеиновых кислот. Можно рафинировать культуральные методики пробы таким образом, чтобы целевая нук- 30 леиново-кислотная последовательность амплифицировалась предпочтительно к другим нуклеиново-кислотным последовательностям. Данные методики затруднительны и расходуют много времени, под- 35 вергаясь пробам и ошибкам. Другим примером данного подхода является амплификация целевой нуклеиново-кислотной последовательности в так называемой "цепной, полимеразной реак- 40 ции" ЦПР (Сайки и др. Science, 1985, 230, 1350; Заявки ЕР N 200362 и 201184; Патенты США N 4683195 и 4683202} и в частности предполагает гибридизацию к сегменту целевой нуклеиново-кислотной 45 последовательности праймера, удлинение указанного праймера полимеразой и придание одноцепочности дуплексам, полученным в результате реакции праймерного удлинения. Данную методику можно 50 повторять на протяжении нескольких циклов с тем, чтобы амплифицировать целевую, нуклеиново-кислотную последовательность. Известно использование стадии полу- 55 чения нового РНК-транскрипта в сочетании с синтезированной копией двунитевой кДНК целевой последовательности, оперативно связанной с промотором (Патенты США N 07/064141 и N 07/202978; РСТ N WO 88/10315), Благодаря стадии транскрипции, являющейся доминантной в смысле новизны, можно говорить о системе амплификации на транскрипционной основе (ТАС). Изобретение предусматривает обнаружение in vitro или ex - vivo по крайней мере одной специфической нуклеиново-кислотной последовательности (целевой последовательности или сегмента) в пробе, содержащей нуклеиновую кислоту, при этом предлагается способ получения двунитевой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, соответствующую целевой последовательности, оперативно связанной с РНК-полимеразным промотором, использование двунитевой нуклеиновой кислоты в качестве матрицы двунитевой нуклеиновой кислоты для получения иэ нее множества РНК-транскриптов, каждый из которых несет РНКпоследовательность, соответствующую целевой последовательности, и обнаружение присутствия указанной РНК-последовательности, а также по аналогии присутствия целевой последовательности. Двунитевый нуклеиново-кислотный темплат (матрицу) в свою очередь получают путем создания первого нуклеиновокислотного праймера или зонда, содержащего промоторную последовательность, оперативно связанную с последовательностью, соответствующей сегменту целевой последовательности, гибридизации в пригодных условиях первого нуклеиновокислотного праймера с целевой последовательностью в пробе, содержащей нуклеиновую кислоту, удлинения гибридизированного первого нуклеиново-кислотного праймера в реакции полимеразного удлинения комплементарно целевой последовательности с образованием соответствующей дуплексной нуклеиновой кислот, отделения нитей дуплекса, гибридизации в пригодных условиях к отделенной нити промоторсодержащей последовательности второго нуклеиново-кислотного праймера в конце, который противоположен промоторной последовательности, и удлинение второго нуклеиново-кислотного праймера в цепной полимеразной реакции комплементарно, промоторсодержащей последовательности. Таким образом изобретение позволяет получить однонитевыи РНК-транскрипт или РНК-ДНК-дуллекс, образованный из него, когда не предпринимаются меры для предотвращения его образования, причем он имеет последовательность, соответст 26754 вующую целевой нуклеиновой кислоте. Продукт однонитевого РНК-транскрипта позволяет непосредственно обнаружить целевой сегмент без использования затруднительных, склонных к ошибкам повторных ЦПР-циклов и разделения нитей. Такие преимущества не дает методика ЦПР, которая приводит к получению двунитевой ДНК (одна нить которой содержит целевой сегмент, а другая нить содержит комплемент целевого сегмента), которую не нужно разделять перед обнаружением, а только после того, как большое число повторных циклов достигли приемлемых уровней амплификации. Целью изобретения является использование основного репликативного процесса для амплификации с тем, чтобы облегчить обнаружение целевых нуклеинов о-кислотных последовательностей, достигая тем самым экспоненциального копирования без необходимости в температурной циклизации, и иным образом регистрируя течение способа амплификации в отношении прибавления реагентов и т.д. Другой целью изобретения является объединение новым образом достижений методик транскрипции и удлинения продуктов в качестве средства обнаружения и измерения соответствующей целевой нуклеиновой кислоты. Главной целью изобретения является ферментативное применение селективного переваривания РНК-нити РНК-ДНК-дуплекса, образованного гибризацией праймера с целевой последовательностью нуклеиновых кислот, с последующим праймерным удлинением, как средство получения ДНК-нити в качестве матрицы с целью дальнейшей гибридизации с ней и с последующим праймерным удлинением. Двунитевый ДНК-дуплекс продукта содержит по крайней мере одну промоторную последовательность, которая распознается ДНК-зависимой РНК-полимеразой и таким образом служит в качестве матрицы для получения множества транскриптов, которые в конце концов обнаруживают и измеряют в качестве средств обнаружения и измерения целевой нуклеиново-кислотной последовательности. Данная цель обеспечивает получение преимуществ амплификации целевой последовательности, т.е. амплификация является самоподдерживающейся без необходимости температурной циклизации в единой реакционной смеси, содержащей три подходящие ферментативные активности и по крайней мере один праймер, содержащий промо 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8 тор, оперативно узнаваемый ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Таким образом, полной целью изобретения является объединение и решение задач известного уровня техники и создание селективных средств для дальнейшей благоприятной амплификации целевых нуклеин ово-кислотных последовательностей. Изобретение также позволяет создать простую методику, которую можно использовать репродуктивно за приемлемо короткий период времени в системе изотермической реакции, используя известные реагенты и имея точность, необходимую для достижения последовательных научных результатов, причем данную методику можно использовать в репродуктивном анализе и приспосабливать для применения в наборах для лабораторных/клинических анализов. Изобретение направлено на использование средств и способов "нитеразделения" дуплекса РНК/ДНК с тем, чтобы освободить нить ДНК для гибридизации с олигонуклеотидами, содержащими РНК-полимеразасвязующем последовательности (РСП), с последующим удлинением праймера с тем, чтобы образовать ДНК-дуплекс (двунитевую ДНК), который может служить в качестве матрицы для получения множества соответствующих РНКтранскриптов, которые восприимчивы к обнаружению и измерению, в качестве выведенного анализа на присутствие целевой нуклеиновокислотной последовательности. Дуплекс РНК/ДНК в свою очередь получают гибридизацией с мишенью РНК или праймером ДНК, оперативно содержащими промоторную последовательность, после чего осуществляют праймерное удлинение. Средства изобретения, вызывающие "нитеразделение", включают использование фермента, имеющего РНКаза Н-подобную активность, такую как РНКаза Н, который бы селективно и предпочтительно переваривал РНК-нить дуплекса с тем, чтобы ДНК-нить можно было освободить для дальнейшего процессинга. Использование такого фермента устраняет использование температурного цикла для денатурации дуплекса. Целевой последовательностью нуклеиновых кислот может быть та, которая присутствует от природы в пробе нуклеиновой кислоты, или ею может быть продукт экстраполирования соответствующей ДНК целевой последовательности. Продукт экстраполирования получают денатурацией целевой последовательности двунитевой 26754 ДНК, гибризацией с ней последовательности праймера, имеющей оперативно ассоциированную промоторную последовательность, с последующей реакцией праймерного удлинения, образуя дуплекс ДНК. Данный ДНК/РНК-дуплекс в свою очередь денатурируют, и нить, содержащую промоторную последовательность, гибридизируют к противоположному от промотора концу с вторым праймером, с последующим праймерным удлинением, образуя ДНК-дуплекс, который при взаимодействии с ДНК-зависимой РНК-полимеразой продуцирует соответствующий транскрипт, продукт экстраполяции. РНК затем служит в качестве целевой нуклеиново-кислотной последовательности для целей изобретения. После получения целевой последовательности нуклеиновых кислот (каким бы ни был ее источник) в соответствии с изобретением ее гибридизируют с праймерной последовательностью, оперативно ассоциированной с промоторной последовательностью, с последующим праймерным удлинением, получая РНК/ДНК-дуплекс, содержащий промоторную последовательность у 5'-конца нити ДНК. Реакцию праймерного удлинения можно осуществлять с любой пригодной полимеразой, например, обратной транскриптазой. Основной вариант изобретения тогда служит для освобождения ДНК-нити РНК/ДНКдуплекса путем обработки РНК/ДНК-дуплекса ферментом, который селективно переваривает РНК-нить, таким как РНКаза Н. Освобожденную таким образом ДНКнить либо подвергают самогенерированному праймерному удлинению посредством РНК-праймера, полученного в результате предыдущего селективного переваривания, либо гибридизируют с имеющим внешнее происхождение олигонуклеотидным праймером, по выбору несущим промоторную последовательность Удлинение праймера создает двунитевую ДНК, содержащую одну или две промоторные последовательности, которая служит в качестве матрицы (темплата) для ДНК-зависимой РНК-полимеразой индукции транскрипции с получением множества транскриптов. Последовательность реакций можно осуществлять изотермически и в одной смеси с тремя соответствующими ферментными активностями, такими, которые дают обратная транкриптаза, РНКаза и ДНК-зависимая РНК-гтолимераза, при этом различные стадии в вышеприведенном процессе осуществляют непрерывно, одновременно в течение опре 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 10 деленного периода времени. Таким обра зом в конечной точке процесса продуци руемые транскрипты можно обнаружить и измерить на выведенное присутствие исходной целевой нуклеиново-кислотной последовательности Однако, хотя непрерывный и одновременный характер вышеописанной последовательности реакций является независимым от температурной циклизации и предполагает только единственное, первоначальное прибавление ферментных активностей, необходимых для осуществления данных реакций, сами продукты транскриптов подвергают ся гибридизации с праймером, необязательно несущим дополнительную промоторную последовательность. Данный гибридизационный комплекс подвергают реакции праймерного удлинения с получением второго РНК-ДНК-дуплекса, который, в свою очередь, подвергают воздействию фермента селективного переваривания РНК для освобождения из него ДНК-нити, которую в свою очередь гибридизируют с самогенерирующимся РНК-праймером или имеющим внешнее происхождение олигонуклеотидным праймером, присутствующим в реакционной смеси, который может по выбору нести оперативно ассоциированную промоторную последовательность с тем, чтобы получить второй ДНКдуплекс, восприимчивый к распознаванию ДНК-зависимой РНК-полимеразой, получая множество транскриптов, имеющих смысл противоположный транскриптам, продуцированным первоначально. Хотя еще не выявлен полностью механизм вышеприведенной последовательности (ей) реакций, полагают, что поскольку реакционную смесь используют в сочетании с тремя приемлемыми ферментными активностями, такими, которые дают обратная транскриптаза, РНКаза Н и ДНК-зависимая РНК-полимераза, и по крайней мере одним праймером, содержащим промотор, распознаваемый полимеразой, и поскольку реакции не зависят от температурной циклизации, используются два промоторсодержадцих олигонуклеотидных праймера, и реакции могут проходить через несколько циклов одновременно и непрерывно, продуцируя как смысловые»-так и антисмысловые транскрипты, которые могут быть обнаружены и измерены с получением амплификационного анализа количества целевой нуклеиново-кислотной последовательности, присутствующего в исследуемой пробе. Сущность изобретения способствует созданию реакционной смеси, находящей 11 26754 ся в состоянии покоя в течение периода времени при пригодной температуре без необходимости в проведении циклизации между более высокими и более низкими температурами и без необходимости в периодическом прибавлении фермента или других реагентов, посредством чего целевая нуклеиново-кислотная последовательность амплифицируется непрерывно и одновременно самогенерирующимся образом в присутствии по крайней мере одного прэймера, оперативно несущего лромоторную последовательность и ферментную активность такую, которую дает РНКполимераза, которая распознает полимераза-связанный сайт промотора, обратная транскриптаза, фермент, такой как РНКаза Н, который селективно переваривает РНК, когда РНК гибридизируют к ДНК в дуплексной форме, и необходимые субстраты нуклеозид-трифосфата для РНКполимеразы и обратной транскриптазы. В такой системе воспроизводимые уровни амплификации до -10 могут быть достигнуты приблизительно за 2 ч при температуре около 37*С, используй, например, РНК-полимеразу Т7, обратную транскриптазу AMV и РНКазу Н Е. соїі. Операбельной является температура приблизительно 4-50'С, предпочтительно около 40*С. В предпочтительных вариантах размер целевой последовательности нуклеиновых кислот составляет менее, чем приблизительно 250 оснований. Другие переменные величины могут воздействовать на оптимизацию амплификации, такие, как использование РНК-полимеразы, использование обратной транскриптазы, рН концентрации солей, концентрации нуклеозид-трифосфата. Таким образом, изобретение включает обнаружение in vitro или ex vivo no крайней мере одной специфической нуклеиново-кислотной целевой последовательности в пробе, содержащей гетерогенную коллекцию РНК. Изобретение предусматривает способ, включающий получение двунитевой ДНК, кодирующей последовательность, соответствующую целевой последовательности и имеющую оперативный РНК-полимеразный промотор, причем двунитевую ДНК получают, в свою очередь, гибридизацией, с последующим праймерным удлинением к ДНК-нити, которая освобождена от ее РНК-комплемента в дуплексе РНК/ДНК, под действием фермента селективного переваривания РНК, при этом дуплекс РНК/ДНК образован гибридизацией с праймером, несущим оперативно промоторную последовательность, к це 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 12 левой нуклеиново-кислотной последовательности с последующим праймерным удлинением. Двунитевая ДНК служит в качестве темплата для получения множества РНК-транскриптов, каждый из которых переносит РНК-последовательность, соответствующую целевой нуклеиново-кислотной последовательности. Присутствие РНК-последовательности, а путем дедукции, присутствие целевой последовательности можно определить и измерить в соответствии с изобретением. Изобретение направлено на все ассоциированные способы и средства получения и использования таких РНК-транскриптов. В одном варианте изобретения предлагается необязательно периодически повторяющийся способ получения двунитевого нуклеиново-кислотного темллата, определенного выше, с получением первого нуклеиново-кислотного праймера, содержащего промоторную последовательность, оперативно связанную с последовательностью, соответствующей сегменту целевой нуклеиново-кислотной последовательности, гибридизацией в пригодных условиях первого нуклеиново-кислотного праймера с целевой нуклеиново-кислотной последовательностью в пробе, содержащей нуклеиновую кислоту, удлинением гибризированного первого нуклеиново-кислотного праймера в реакции полимеразного удлинения комплементарно целевой последовательности, с образованием соответствующей нуклеиновой кислоты РНК/ ДНК-дуплекса, ферментативным расщеплением РНК РНК/ДНК-дуплекса, гибридизацией к освобожденной нити промоторсодержащее, ДНК последовательности в пригодных условиях второго нуклеиновокислотного праймера в конце, который противоположен промоторной последовательности, либо посредством продукта, имеющего происхождение от РНК-праймера, либо посредством олигонуклеотидиого праймера, необязательно содержащего промоторную последовательность, оперативно связанную с ним, удлинением гибридинированного второго нуклеиновокислотного праймера в реакции полимеразного удлинения комплементарно промоторсодержащей последовательности. Изобретение в другом варианте направлено на способы и средства использования двунитевои нуклеиновой кислоты в качестве темплата для получения множества РНК-транскриптов в реакции, катализируемой ДНК-зависимой РНК-полимеразой, которая распознает его промотор, и после осуществления дополнитель 13 26754 ной необязательной циклизации обнаруживают и измеряют наличие РНК-транскриптов, В другом варианте изобретение направлено на усовершенствование в способе амплификации целевой нуклеиново-кислотной последовательности, генерированной как таковой или в виде экстраполяционного продукта из целевой ДНК-последовательности, причем осуществляют гибридизацию с целевой последовательностью ДНК-праймера, имеющего промоторную последовательность, оперативно связанную с ней, с последующим праймерным удлинением, получая соответствующий РНК/ДНК-дуплекс, гибридизацию освобожденного продукта ДНК-удлинения в виде нити, несущей промоторную последовательность дуплекса, с вторым праймером в конце, противоположном промоторной последовательности, с последующим праймерным удлинением, образующим двунитевый ДНК-темплат, пригодный для получения по выбору реплицируемых РНК-транскриптов для обнаружения как таковых или для рециркуляции, как определено выше. Усовершенствование включает высвобождение ДНК-нити продукта удлинения, несущей промоторную последовательность праймера, дуплекса РНК/ДНК, путем селективного ферментативного расщепления РНК-нити РНК/ ДНК-дуплекса. В одном варианте изобретение направлено на продукт процесса обработки РНК дуплекса РНК/ДНК, имеющий примыкающую к 5"-концу ДНК-последовательности промоторную последовательность, с помощью фермента селективного РНКпереваривания. В другом варианте изобретение направлено на создание наборов, включающих требуемые реагенты и ассоциируемые средства, пригодные при обнаружении in vitro или ex - vivo по крайней мере одной специфической нуклеиново-кислотной целевой последовательности в пробе, содержащей РНК, с использованием способов и средств, определенных выше. На чертеже показано схематическое изображение варианта изобретения. Схематическое изображение создает представление о 12 стадиях, которые в предпочтительных вариантах являются непрерывными, самогенерирующимися стадиями в присутствии требуемых трех ферментов в реакционной среде вместе с целевой последовательностью и данной операбельной температурой. Тремя ферментами являются перечисленные выше обратная транскриптаза (RT), используе 14 мая для реакции прафмерного удлинения, РНКаза Н, которая является ферментом селективного РНК-переваривания, представляя основной аспект изобретения, и 5 РНК-полимераза Т7 в качестве примера фермента, пригодного для получения трзнскриптов из темплата ДНК-дуплекса. Сущность изобретения представлена стадией 3 схематического изображения, при10 ( е м продукт РНК-транскрипта стадии 6 может быть обнаружен и измерен как таковой или может быть подвергнут непрерывной реакции, как указано в стадиях 712, с образованием антисмысловой нити 15 РНК-транскрипта. Генерированные РНКтранскрипты обнаруживают и измеряют как результат присутствия целевой нуклеиново-кислотной последовательности. PBS обозначает сайт полимеразного связыва20 ния промоторной последовательности, TCS обозначает целевую комплиментарную пос• ледовательность. В изобретении используются ссылки * на стандартные руководства по молеку25 лярной биологии, которые содержат определения, а также способы и средства для осуществления основных методик изобретения, например: получение ДНК-зонда или праймера, 30 включая синтез ДНК или выделение последовательностей из натуральных источников посредством расщепления рестрикционными ферментами и их наращивание с тем, чтобы они были пригодны 35 как таковые или, когда присоединения к другой ДНК, для использования в качестве праймера или зонда; получение олигонукпеотидов с различными функциональными последователь40 ностями для использования при гибридизации; методология гибридизации, включающая варианты в строгих условиях для получения большей или меньшей гибриди45 зации, зависящей от степени гомологии праймера к целевой ДНК-последовательности; идентификация, выделение или получение промоторов или ^олее конкретно 50 промоторов или сайтов, распознаваемых бактериофаг ДНК-зависимой РНК-полимеразой и бактериофаг РНК-зависимой РНКполимеразой, или при использовании эукариотных систем, вирусной ДНК- и РНК55 зависимой РНК-полимеразы, например аденовирус, кодируемой РНК-полимеразы и РНК-полимеразы вируса мозаики костра; идентификация, выделение или получение РНК-полимеразы, способной рас 15 26754 познавать промоторы или способной к реакции праймерного удлинения; условия, способствующие производству РНК-транскриптов, включая так называемые транскрипционно-энхансерные последовательности; условия, способствующие инициации и сохранению реакций праимерного удлинения, включая использование ДНК-зависимой полимеразы и дНТФ; механизм и методология для индуцированной репликации, и т.д. и т.п. (Maniatis at al. Molecular Cioning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. - New York. - 1982; Colowick et al. Methods in Enzymology//1987, Vol. 152, Academic Press, Inc.; Hohg, Biocsience Reports 1, 243, 1981; Cooke et a!. J.Biol. Chem. 1980, 255, 6502; Zoller et al. Methods in Enzymology, 1983, 100, 468-500; Crea et al., Nucleic Acids Res., 1980, 8, 2331; Narang et al. Meth. Enzyme., 1979; 68, 90; Beaucage et al. Tetrahedron Letters 1981, 22, 1859; Brown et al. Meth. Enzym. 1979, 68, 109; Caruthers et al., Meth. Enzym., 1985, T54, 287; Hitzeman et al. J. Biolog. Chem., 1980, 255, 2073; Lee et a!. Science, 1988, 239,1288; Milfigan et at. Nucleic Acils Res, 1987, 15, 8783; Miller et al. Virology, 1983, 125, 236; Aahlguist et al. J.Mol. Biol., 1981, 153, 23; Miller et at. Nature, 1985, 313, 681; Ahlguist et al. J.Mol.Biolog.,1984, 172, 369; Ahlguist et al. Plant. Мої. Biol., 1984, 3, 37; Ou et al. Pnas, 1982; 79, 5235; Chu et al. Nucl. Acids Res., 1936, 14, 5591; Заявка на Европатент N 194809; Marsh et al. Positive STrahg RNA Viruses, p.327-33, Aalan R.Uss (опублик, Нью-Йорк) 1987; Материалы Симпозиума Uda, 1986; Miller et al. J.Vol.Biol, 1986, 187, 537; Staflet et al. Science, 1988, 239, 491; Kramer et al. J.Mol Biol., 1974, 89, 719; Saris et al. Nucl. Acids Res., 19U2, 10, 4831; Bresser et al. Pnas, 1983, 80, 6523; Chu et al. Nucl. Acids Res., 1989, 16, 3671; Gubler et a)., Gene, 1983, 25, 263 and D'Alessio et al. Nucleic Acids Res., 1989, 16, 1999), а также отсылки, приводимые в изобретении, причем каждая из этих вышеприведенных публикаций введена в качестве отсылки. Под термином "промотор" подразумевается последовательность нуклеиновых кислот {встречающаяся в природе или полученная синтетически, или как продукт рестрикционного переваривания), которая специфически распознается РНКполимеразой, которая связывается с распознанной последовательностью и инициирует процесс транскрипции, посредством чего продуцируется РНК-транскрипт. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 16 Промотор может необязательно содержать нуклеотидные основания, простирающиеся за пределы фактического сайта распознавания, придавая дополнительную • устойчивость относительно процессов деградации, и также может включать дополнительные плюс (+) нуклеотиды, примыкающие к сайту транскрипционной инициации. В принципе можно использовать любую промоторную последовательность, для которой существует известная и доступная полимераза, способная распознавать последовательность инициации. Типичными известными и полезными промоторами являются те, которые распознаются некоторыми бактериофаг-пол имеразами, такими как бактериофаг ТЗ, Т7 или SP6 (Siebeniist et al. Cell, 1980, 20, 269). Они являются примерами тех полимеров, которые можно использовать в практике изобретения в сочетании с их ассоциируемыми промоторными последовательностями. "РНК-транскрипт" представляет собой последовательность рибонуклеиновой кислоты, продуцируемую после инициации транскрипции вслед за распознаванием РНК-полимеразой промоторной последовательности. Получение таких транскрилтов является более или менее непрерывным, частично в зависимости от количества присутствующей полимеразы. Под термином "зонд" или "праймер" подразумевается однонитевая последовательность нуклеиновых кислот {встречающаяся в природе или полученная синтетически, или же являющаяся продуктом рестрикционного переваривания), которая имеет достаточную комплиментарность с целевой последовательностью, такой, которая при пригодных условиях гибридизации способна гибридизировать, т.е. связывается с соответствующей (целевой) последовательностью. Типичный зонд или праймер имеет по крайней мере около 10 нуклеотидов в длину и, наиболее предпочтительно, около 20 или более нуклеотидных оснований в длину, и в наиболее предпочтительном своем варианте разделяет идентичность или очень высокую комплиментарность с соответствующей (целевой) последовательностью (ЕР Н 128042, опублик. 1984). Такой зонд или праймер таков, что он гибридизирует к комплиментарной последовательности для целевой реакции праимерного удлинения в присутствии соответствующих реагентов и условий. Термин "оперативно связанный" или^ "ассоциируемый", или его грамматичес 17 26754 кие варианты, в частности, в смысле связи промоторной последовательности в пределах РНК-кодирующей ДНК-последовательности, относится к функциональности при получении соответствующих РНКтранскриптов, когда промотор распознается пригодной полимеразой. Известны методики формирования сигнала обнаружения, например, путем радиоактивного мечения или хромогенных средств с использованием хромогенного восприимчивого фермента. Проба, на которой осуществляют метод испытания в соответствии с изобретением, может быть неочищенным образцом биологического материала, например сывороткой или другой общей водой организма, средой тканевой культуры или пищевым материалом. Более типично, когда метод осуществляют на пробе, которая является переработанным образцом, имеющим происхождение от сырого образца, с использованием различных обработок с тем, чтобы удалить материалы, которые могли бы воспрепятствовать обнаружению мишени, например, вызывая неспецифическое связывание родственных моетекул. Известны методы переработки сырых образцов с получением пробы, которая является более пригодной для метода испытания изобретения. Транскрипты (РНК) могут быть обнаружены различными путями. Обнаружение можно проводить ультрафиолетовым поглощением РНК, например, методом контактной фотопечи (Kutateladze et al. Anal. Biochein., 1979, 100, 129). Используя радиоактивно меченый рибонуклеозид - 5'-трифосфат в реакции, например, 3Н-меченый или альфа-32РО4меченый, так» что РНК является радиоактивной, РНК можно обнаружить любым из целого ряда известных способов посредством ее радиоактивности. Биотин или иминобиотин можно вводить в РНК, которую затем можно обнаружить известными способами с аддуктом фермента-видина или фермент стрептавидина, который связывается с РНКсвязанным биотином и катализирует получение удобно обнаруживаемого хромогена. Введение биотина или иминобиотина можно осуществлять путем использования УТФ (уридин-5*-трифосфат), который является биотинилированным посредством спейсера к углероду-5-урацильной части субстрата для репликазы в реакции репликации. Такие УТФ являются известными соединениями. Кроме того, известно, что такие УТФ представляют со 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 18 бой субстраты для QB-репликазы, и что РНК, которые включают урацилы, биотинилированные посредством спайсерных групп, присоединенных к положению углерода-5'-вследствие использования таких УТФ в синтезе, являются темплатами для репликации, катализируемой QB-penликазами. РНК можно сделать флуоресцентны ми путем использования реакции, катализируемой РНК-лигазой Т4, с прикреплением нуклеотидов, модифицированных к условиям флуоресценции, к З'~концу репликативной РНК (Cosstick et a)., Nucl. Acids Res, 1984, 12,1791). Флуоресценцию полученной РНК можно использовать для обнаружения РНК любыми стандартными методами. Среди других методов, кото-* рые могут быть использованы для обнаружения РНК, такие, в которых вещество, связываемое специфически с нуклеиновой кислотой, прибавляют в систему, в которой имела место репликация, или в среду, такую как положительно заряженный носитель, например бумага ECTEOL А, на которой выделяют реплицированную РНК и измеряют сигнал от данного вещества. Такие вещества включают хромогенные красители, такие как "универсальный краситель" (Lahlhberg et al.J.Molec.Biol., 1969, 4 1 , 139), метиленовый голубой (Dingman et al. Biochemistry, 1968, 7, 659) и серебряный краситель (Sammons et al., Electrophoresis, 1981, 2, 135; Igloi, Anal.Biochem.,1983, 184), флуорогенные соединители, которые связываются с РНК, например бромид этидия (Sharp et al. Biochemistry, 1973, 12, 3055; Bailey et al. Anat.Biochem., 1976, 70, 75), а также флуорогенные соединения, которые связываются специфически с РНК, являющимися темплатами для репликации путем ОВ-репликаз, например фикобилипротеин