Лікарський засіб від lct-отруєнь

1. Застосування інгібітора або активатора протеазної активності LCT (великих клостридіальних цитотоксинів) для виробництва лікарського засобу/фармацевтичного агента для попередження або ослаблення отруєння LCT. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що використовують інгібітор або активатор активності протеази токсину A (TcdA) Clostridium difficile і/або токсину В (TcdB) Clostridium difficile, та/або летального токсину (TcsL) Clostridium sordellii, та/або токсину (Тсn) Clostridium novyi. 2 (19) 1 3 96768 4 12. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що інгібітором є хімічна речовина, зокрема протеїн, а саме антитіло, яка взаємодіє з протеїновою ділянкою токсину TcdA від AS 1651 до AS 1675 відповідно до амінокислотної послідовності токсину TcdA № Р16154 (SwissProt/TrEMBL). 13. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що інгібітором є хімічна речовина, зокрема протеїн, а саме антитіло, яка взаємодіє з мотивом DXG в амінокислотному положенні AS 1662 протеїну токсину TcdA відповідно до амінокислотної послідовності № P16154 (SwissProt/TrEMBL). 14. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що інгібітором є хімічна речовина, зокрема протеїн, а саме антитіло, яка взаємодіє з протеїновою ділянкою токсину TcsL від AS 1654 до AS відповідно до амінокислотної послідовності токсину TcsL № Q46342 (SwissProt/TrEMBL). 15. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що інгібітором є хімічна речовина, зокрема протеїн, а саме антитіло, яка взаємодіє з мотивом DXG в амінокислотному положенні AS 1666 протеїну токсину TcsL згідно з амінокислотною послідовністю токсину TcsL № Q46342 (SwissProt/TrEMBL). 16. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що інгібітором є хімічна речовина, зокрема протеїн, а саме антитіло, яка взаємодіє з протеїновою ділянкою токсину Тсn від AS 1641 до AS 1665 відповідно до амінокислотної послідовності токсину Тсn, № Q46149 (SwissProt/TrEMBL). 17. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що інгібітором є хімічна речовина, зокрема протеїн, а саме антитіло, яка взаємодіє з протеїновою ділянкою токсину TcsB від AS 1400 до AS 2300 відповідно до амінокислотної послідовності токсину TcsB № Р18177 (SwissProt/TrEMBL) або з еквівалентними або гомологічними протеїновими ділянками токсину TcdA або TcsL, або Тсn. 18. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що інгібітором є хімічна речовина, зокрема протеїн, а саме антитіло, яка взаємодіє з протеїновою ділянкою токсину TcsB від AS 1517 до AS 2142 відповідно до амінокислотної послідовності токсину TcsB № Р18177 (SwissProt/TrEMBL) або з еквівалентними або гомологічними протеїновими ділянками токсину TcdA або TcsL, або Тсn. 19. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що інгібітором є хімічна речовина, зокрема протеїн, а саме антитіло, яка взаємодіє з протеїновою ділянкою токсину TcsB від AS 1517 до AS 1593 або від AS 1918 до AS 2142 відповідно до амінокислотної послідовності токсину TcsB № Р18177 (SwissProt/TrEMBL) або з еквівалентними або гомологічними протеїновими ділянками токсину TcdA або TcsL, або Тсn. 20. Застосування за п. 1 або 2 для виробництва лікарського засобу для попередження або ослаблення отруєння токсинами LCT, яке відрізняється тим, що засіб є придатним для призначення його як вакцини, і інгібітор являє собою антиген-активний інгредієнт, який (а) містить той фрагмент протеїну токсину TcdB амінокислотної послідовності № Р18177 (SwissProt/TrEMBL), який включає щонайменше один мотив DXG в положенні 1665, бажано амінокислотну послідовність в положеннях від AS 1653 до AS 1678, ще краще амінокислотну послідовність від AS 1500 до AS 1800, та/або (b) містить той фрагмент протеїну токсину TcdA амінокислотної послідовності № Р16154 (SwissProt/TrEMBL), який включає щонайменше один мотив DXG в положенні 1662, бажано амінокислотну послідовність в положеннях від AS 1651 до AS 1675, та/або (с) містить той фрагмент протеїну токсину TcsL його амінокислотної послідовності № Q46342 (SwissProt/TrEMBL), який включає щонайменше один мотив DXG в положенні 1666, бажано амінокислотну послідовність в її положеннях від AS 1654 до AS 1679, та/або (d) містить той фрагмент протеїну токсину Тсn його амінокислотної послідовності № Q46149 (SwissProt/TrEMBL), який включає щонайменше одну амінокислотну послідовність в її положеннях від AS 1641 до AS 1665. Галузь техніки, до якої відноситься винахід Винахід відноситься до лікарського засобу для попередження або ослаблення наслідків отруєння великими клостридіальними цитотоксинами (LCT), зокрема, токсинами А, В (TcdA, TcdB) Clostridium difficile, летальним токсином (TcsL) Clostridium sordellii та -токсином (Тсп) Clostridium novyi. Рівень техніки Токсин Clostridium difficile є грампозитивним мікроорганізмом, який розвивається в суворо анаеробних умовах і здатен утворювати спори, ідентифікований він лише в кінці 70-х років як етіологічний чинник асоційованої з антибіотиками діареї та псевдомембранного коліту. З 90-х років Clostridium difficile вважається найбільш значним хвороботворним інфекційним фактором в розвинених країнах. Наслідком постійно зростаючого застосування антибіотиків широкого спектру ви явилося неухильне зростання інциденції спричинених Clostridium difficile інфекцій перш за все у хворих, які проходили лікування в умовах стаціонару. Відповідальними за асоційовані з Clostridium difficile захворювання є екзотоксини A (TcdA) та В (TcdB), які продукуються Clostridium difficile. Існують різні штами з різною вірулентністю та виробленням токсинів. Приблизно чверть всіх штамів токсинів не виробляють. Ті штами, які токсини виробляють, майже завжди продукують вказані обидва види токсину. TcdA є ентеротоксином, який унаслідок цитотоксичного пошкодження ентероцитів підвищує проникність слизової оболонки кишківника, викликаючи тим самим діарею. TcdB є цитотоксином, який порушує перенесення електроліту, викликає втрату рідини та функціональні порушення в роботі кишківника. Токсини TcdA 5 та TcdB відносяться до групи так званих великих клостридіальних цитотоксинів (LCT) і складаються відповідно з пептидного ланцюга з трьома функціональними доменами, а саме С-термінального домена, відповідального за прикріплення токсину до мембрани клітини господаря, гідрофобного середнього домена, (спільно) відповідального за процес транслокації крізь клітинні мембрани, та Nтермінального домена, який виконує функцію глікозилтрансферази і надає молекулі токсичної активності. І хоча в механізмі проникнення токсинів до клітини господаря не все ще є ясним, проте фактом є те, що після свого прикріплення до рецептора клітини господаря за допомогою ендоцитозу токсини поступають до цієї клітини, і що для проявів своєї токсичності N-термінальні каталітичні домени відщеплюються та переміщаються в цитозоль клітини господаря. Тут каталітичний домен специфічно гліколізує ГТФази підродини Rho (Rho, Rac та Cdc42), які у свою чергу беруть участь в безлічі каскадів для трансдукції сигналів, і блокує таким чином процеси трансдукції сигналів, що зрештою веде до розпаду цитоскелета та загибелі клітини. Тому в рівні техніки до теперішнього часу виходили з того, що клітинна протеаза каталізує відщеплення каталітичного N-термінального домена пептидних ланцюгів токсинів TcdA та TcdB, а також інших «великих клостридіальних цитотоксинів» (LCT) (Rupnik та ін., 2005, і Pfeiffer та ін., 2003). Проте відповідного підтвердження не представлено. Розкриття винаходу В ході досліджень, які лягли в основу даного винаходу, несподівано було встановлено, що розщеплення TcdA та TcdB є автокаталітичним процесом, який ініціюється інозитолфосфатом (IP), і отже, токсини Clostridium difficile разом з їх каталітичною функцією глікозилтрансферази виконують ще функцію протеази для саморозщеплення або автокаталітичного розщеплення. Така функція протеази ідентифікована як аспартат-протеаза. Протеїнова область, яка містить амінокислотну послідовність в амінокислотному положенні від AS 1653 до AS 1678 токсину TcdB згідно послідовності № Р18177 (SwissProt/TrEMBL) ідентифікована як каталітичний центр функції протеази. Мотив DXG (Rao та ін., 1998), характерний для аспартат-протеази, знаходиться в амінокислотному положенні 1665. Протеїнова область, яка містить амінокислотну послідовність в положенні від AS 1517 до AS 2142 протеїну токсину TcdB згідно послідовності № Р18177 (SwissProt/TrEMBL) була ідентифікована, як місце скріплення. Така амінокислотна послідовність є мотивом інозин-5монофосфат-дегідрогенази, який складається з двох ділянок: AS 1517 - AS 1593 та AS 1918 - AS 2142, розділених протеїновою ділянкою завдовжки 325 амінокислот без гомології послідовностей. При лікуванні хворих, інфікованих Clostridium difficile, спочатку відміняють, наскільки це можливо, антибіотик, який виявився причиною інфекції. Подальше лікування проводиться виключно симптоматично. При тривалому або важкому протіканні хвороби, а також у тому випадку, коли відміна від 96768 6 повідного антибіотика не видається можливою з інших причин, для лікування призначається метрондіазол або ванкоміцин. Антимікробна терапія, яка до сьогодні практикується, має численні недоліки. Вирішальне значення при цьому має, перш за все, та обставина, що хвороба, спровокована антибіотиками при лікуванні іншої інфекції, не піддається ефективній антимікробній терапії. Це пояснюється тим, що токсин Clostridium difficile в кишківнику здорової людини зустрічається відносно рідко і не може розвинутися серед нормальної флори кишківника. У разі порушення нормальної флори кишківника в ході лікування антибіотиками Clostridium difficile може розвинутися та ефективно заселити кишківник. Застосування антибіотиків проти Clostridium difficile знову веде до руйнування флори кишківника і служить причиною, яка перешкоджає відновленню здорової флори цього кишківника. Цим пояснюється також велика кількість ремісій, які спостерігаються після закінчення антимікробної терапії. Додатковим недоліком прийнятої терапії є поява останнім часом зростаючої кількості мультирезистентних штамів Clostridium difficile. Небезпека цього полягає в тому, що цей, до теперішнього часу єдиний, спосіб лікування захворювань викликаних Clostridium difficile, стає безрезультатним і кількість смертельних випадків, спричинених Clostridium difficile, зростає. Крім того, необхідні для лікування спричиненої Clostridium difficile інфекції антибіотики, є дуже дорогими і застосовуються зазвичай лише в окремих випадках як резервні. Тому існує гостра потреба в медикаментах, які здатні пригнічувати (попереджувати, усувати, полегшувати) симптоми спричинених токсинами Clostridium difficile інфекцій з виключенням ризику розвитку резистентності клостридіїв або ж інших бактерій, а також без пошкодження природної бактерійної флори, зокрема, флори кишківника у відповідних пацієнтів. Завданням даного винаходу є створення такого медикаменту. Вирішення цієї задачі полягає в створенні лікарського засобу згаданого вище типу, який характеризується тим, що як активну речовину він містить, щонайменше, один ефектор, а саме інгібітор або активатор автокаталітичної активності протеази великих клостридіальних цитотоксинів (LCT), зокрема, автокаталітичної активності протеази токсину A (TcdA) Clostridium difficile та/або токсину В (TcdB) Clostridium difficile та/або летального токсину (TesL) Clostridium sordellii та/або -токсину (Tcna) Clostridium novyi. Активатори та інгібітори автокаталітичної активності протеази цитотоксинів LCT наведені нижче як ефектори автокаталітичної активності протеази цитотоксинів LCT. Якщо активною речовиною або ефектором є інгібітор, то його антитоксична дія обумовлена тим, що він знижує активність протеази непошкодженого токсину, зокрема, токсину TcdB або TcdA або NCSL або Теn, і тим самим попереджає відщеплення цитотоксично ефективного фрагмента з 7 функцією глюкозилтрансферази (у випадку TcdA та TcdB таким фрагментом є фрагмент 63 кДа). Придатними для застосування інгібіторами є хімічні речовини, які інгібірують активність протеази токсинів. Поняття «хімічна речовина» включає, тут і далі, як неорганічні, так і органічні сполуки, іони і пептиди або протеїни. Кращими інгібіторами служать ті хімічні речовини, які незворотньо інгібірують активність протеази. Прикладом може служити речовина 1,2епокси-3-(р-нітрофенокси) -пропан (EPNP). Ця речовина вступає в незворотню реакцію із залишками аспартату в каталітичному центрі протеаз і таким чином інгібірує протеолітичну дію. Інші інгібітори протеази відомі пересічному фахівцеві і можуть бути ним легко ідентифіковані за допомогою відомих методів (комп'ютерне моделювання, високоефективна рентгеноскопія). Наприклад, для проведення «високоефективної рентгеноскопії» може бути синтезований пептид, послідовність амінокислот якого відповідає послідовності місця розщеплення протеази цитотоксинів LCT. В результаті з'єднання цього пептиду, наприклад, з барвником АМС (7-аміно,4-метил-кумарином) за допомогою відомих фахівцеві методів може бути створений зонд. Потім для проведення «високоефективної рентгеноскопії» зонд з маркуванням сполучають з токсином і речовинами-кандидатами. Якщо зонд розщеплюється, то це веде до змін спектру флуоресценції. Такі зміни легко реєструються добре відомими фахівцеві методами (детекторами флуоресценції). Суміші, в яких не спостерігається зміни спектру флюоресценції, містять, отже, потенційні інгібітори протеази. Як приклад слід описати ще один спосіб ідентифікації речовин, які впливають на підвищення автокаталітичної активності протеази цитотоксинів LCT. Для цього можуть застосовуватися голотоксин або відповідні фрагменти токсину, які зв'язані, наприклад, з барвником, флуоресценція якого затухає в нерозщепленому токсині або його фрагменті. В результаті автокаталітичного розщеплення токсину або його фрагментів виключається ефект загасання. Як вже указувалося, зміни в спектрі флуоресценції можуть бути легко зареєстрованими. Особливо придатними інгібіторами, тобто ефекторами з функцією інгібування, є хімічні речовини, зокрема, протеїни, з поміж них, перш за все, антитіла, які знижують автокаталітичну активність протеази цитотоксинів LCT і взаємодіють з активним центром протеази. Вираз «взаємодіяти» означає в даному контексті будь-який тип взаємодії між цитотоксинами LCT і хімічною речовиною, зокрема, протеїном, і включає, зокрема, ковалентні зв'язки, як, наприклад, дисульфідні зв'язки, і не ковалентні зв'язки, як, наприклад, сили Ван-дер-Вальса, гідрофобні або електростатичні взаємодії, а також зв'язки у вигляді водневих містків. Більш бажаними є при цьому протеїни, із них, передусім, антитіла, які взаємодіють с протеїновою областю токсину Тс&В від AS 1500 до AS 1800, зокрема, від AS 1653 до AS 1678, і, передусім, із мотивом DXG в положенні 1665, відповідно 96768 8 до амінокислотної послідовності токсину TcdB, № P18177 (SwissProt/TrEMBL), або ж із еквівалентними або гомологічними протеїновими областями токсину TcdA або TcsL або Тсп. При цих еквівалентних або гомологічних протеїнових областях мова йде у випадку з TcdA про ділянку амінокислотної послідовності від AS 1651 до AS 1675 відповідно до амінокислотної послідовності токсину TcdA, № P16154 (SwissProt/TrEMBL) із мотивом DXG в амінокислотному положенні AS 1662, у випадку з с токсином TcsL - про ділянку амінокислотної послідовності від AS 1654 до AS 1679, відповідно до амінокислотної послідовності токсину TcsL, № Q46342 (SwissProt/TrEMBL) із мотивом DXG в амінокислотному положенні AS 1666 і у випадку із токсином Тсn - про ділянку амінокислотної послідовності від AS 1641 до AS 1665 відповідно до амінокислотної послідовності токсину Тсn, № 46149 (SwissProt/TrEMBL). Іншими придатними до застосування інгібіторами (ефекторами з функцією інгібування) служать хімічні речовини, зокрема, протеїни, із них, перш за все, антитіла, які знижують автокаталітичну активність протеази цитотоксинів LCT, при цьому вони інгібірують взаємодію між інозитолфосфатом і токсином. Оскільки зв'язок з IP виключений, то не відбувається протеолітичного розщеплення токсинів. При цьому бажаними є протеїни, з них, перш за все, антитіла, які взаємодіють з протеїновою областю токсину TcdB від AS 1400 до AS 2300, зокрема, від AS 1517 до AS 2142 та, перш за все, від AS 1517 до AS 1593 або від AS 1918 до AS 2142, відповідно до амінокислотної послідовності токсину TcdB № Р18177 (SwissProt/TrEMBL), або ж з еквівалентними або гомологічними протеїновими областями токсинів TcdA або TcsL або Тсn. Так же успішно можуть генеруватися антитіла або інші протеїни, які не взаємодіють безпосередньо з місцем скріплення інозитолфосфату, зокрема, із указаними вище протеїновими областями, а направлені у бік суміжних областей, стерично перешкоджають зв'язку з IP, запобігаючи тим самим протеолітичному розщеплюванню токсинів. Крім того, можуть генеруватися антитіла та інші протеїни, які безпосередньо не взаємодіють із мотивом DXG функції протеази цитотоксинів LCT, а перешкоджають протеолітичному розщеплюванню за рахунок зв'язку на суміжних ділянках протеїну. Придатними інгібіторами (ефекторами з функцією інгібування) служать також структурні аналоги інозитолфосфату (IP), зокрема, інозитолгексафосфату (ІР6), які замість IP і, зокрема, ІР6 можуть займати місця реакційного скріплення цитотоксинів LCT, зокрема, токсину TcdA та/або TcdB та/або TCSL та/або Тсn, проте вони не мають ініціаторної функції, властивої IP або ІР6. Такі структурні аналоги є, отже, антагоністами щодо агоністів IP (зокрема, ІР6) і викликають змагальне зниження активності протеази цитотоксину LCT, зокрема, токсину TCDA та/або TCDB та/або TCSL та/або Тсn. Придатні для застосування структурні аналоги відомі пересічному фахівцеві і можуть бути легко ідентифіковані добре відомими фахівцеві 9 способами дослідження (відповідні приклади приведені вище). Придатними інгібіторами служать крім того уповільнювачі інозитолфосфату (синоніми : уповільнювач інозитолфосфату і інгібітор інозитолфосфату), тобто такі уповільнювачі, які зв'язують або модифікують інозитолфосфат і, зокрема, інозитолгексафосфат, таким чином, що вони втрачають свою здатність до ініціації активності протеази цитотоксинів LCT, зокрема, токсину TCDA та/або TCDB та/або TCSL та/або Тсn. Прикладом таких речовин можуть служити двовалентні іони, такі, як 2+ Са , які створюють разом з ІР6 нерозчинні комплекси. Подібні речовини фахівцеві відомі або можуть бути легко ідентифіковані відомими йому способами дослідження (приклади приведені вище). Іншими придатними інгібіторами (ефекторами з функцією інгібування) є хімічні речовини, які пригнічують утворення інозитолфосфатів в просвіті кишки пацієнтів (ссавців, зокрема, людей) або в соматичних клітинах пацієнтів (ссавців, зокрема, людей) або які руйнують вже наявний інозитолфосфат і які перешкоджають таким чином протеолітичному розщеплюванню цитотоксинів LCT при впровадженні в цитоплазму. Кращими прикладами такої речовини служать літій, VPA (Valproic acid) або CBZ (карбамазепін). Придатними активаторами, тобто ефекторами з функцією активатора, є хімічні речовини, які підвищують активність протеази токсинів. Антитоксична дія активатора заснована на тому, що він ініціює активність протеази непошкодженого токсину, зокрема, токсину TcdA та/або TcdB та/або TcsL та/або Тсn., ще до того, як токсин приєднується до клітини господаря так, щоб розщеплений фрагмент міг би проникнути всередину клітини (цитозол). Отже, активатор викликає відщеплення цитотоксично ефективного фрагмента з функцією глюкозилтрансферази (у випадку з TcdA та TcdB таким фрагментом є фрагмент 63 кДа) за межами клітини господаря. Після цього цитотоксично ефективний фрагмент більше не може потрапити до середини клітини і проявити в ній свою цитотоксичну дію. Особливо придатним активатором (ефектором з функцією активатора) є ізольований інозитолфосфат (IP) (на відміну від цитозолічного), бажано інозитолгексафосфат (ІР6). Медикамент з такою діючою речовиною володіє тією перевагою, цитотоксин LCT, зокрема, токсин TcdA та/або TcdB та/або TcsL та/або Тсn, який присутній в кишківнику пацієнта, під дією медикамент введеного IP зазнає розщеплення вже в кишківнику, тобто ще до того, як він з'єднається з клітинами кишківника або іншими соматичними клітинами і проявить токсичну дію. Так же успішно може застосовуватися як активатор (ефектор з функцією активатора) речовина, яка підвищує аналогічно до ІР6 автокаталітичну активність протеази цитотоксину LCT, зокрема, токсину TcdA та/або TcdB та/або TcsL та/або Тсn. Такі речовини фахівцеві відомі і можуть бути легко ідентифіковані відомими методами. Додатково придатними для цього є також модифіковані 96768 10 варіанти описаних вище «високоефективних способів аналізу» (High-Troughput-Assays). При цьому токсин і потенційні речовини-активатори з'єднують і в подальшому досліджують на зміни спектру флуоресценції. Суміші, в яких відбулися великі зміни протягом короткого часу, містять придатні активатори (ефектори з функцією активатора). Відповідно до винаходу каталітичні центри функції протеази цитотоксинів LCT можуть також використовуватися як антигени (вакцини), які призначаються цілеспрямовано для створення імунітету до токсинів. Тому об'єктом даного винаходу є також лікарський засіб для попередження або ослаблення отруєння цитотоксинами LCT, який відрізняється тим, що він може призначатися як вакцина, а також, що він містить амінокислотну послідовність каталітичного центру токсину TcdA та/або TcdB та/або TcsL та/або Тсn повністю або фрагментарно у вигляді антигенної активної речовини (речовин). Антигенна речовина (речовини) бажано обирається із групи наступних протеїнових фрагментів: - мотив DXG в положенні 1665 амінокислотної послідовності токсину TcdB № P18177 (SwissProt/TrEMBL) - положення від AS 1653 до AS 1678 амінокислотної послідовності токсину TcdB № P18177 (SwissProt/TrEMBL) - положення від AS 1500 до AS 1800 амінокислотної послідовності токсину TcdB № P18177 (SwissProt/TrEMBL) - мотив DXG в положенні 1662 амінокислотної послідовності токсину TcdA № P16154 (SwissProt/TrEMBL) - положення від AS 1651 до AS 1675 амінокислотної послідовності токсину TcdA № P16154 (SwissProt/TrEMBL) - мотив DXG в положенні 1666 амінокислотної послідовності токсину TcsL № Q46342 (SwissProt/TrEMBL) - положення від AS 1654 до AS 1679 амінокислотної послідовності токсину TcsL № Q46342 (SwissPro/TrEMBL) - положення від AS 1641 до AS 1665 амінокислотної послідовності токсину Тсn, № Q46149 (SwissPro/TrEMBL). Нижче винахід докладніше пояснюється за допомогою прикладів виконання і фігур. При цьому зображено на: фіг. 1 - розщеплення голотоксину TcdB10463 (270 кДа) на домени транслокації/ліганди (207 кДа) та N-термінальні каталітичні домени (63 кДа) за допомогою електрофорезу в ПААГ у присутності додецилсульфату натрію, проведене за допомогою: a) суміші, яка складається з токсину TcdB10463, маркування якого проведене за допомогою Су3, і екстракту клітин свинячої селезінки (приклад 1 А); b) суміші, яка складається з токсину TcdB10463, маркування якого проведене за допомогою Су3, і екстракту клітин свинячої селезінки, які не містить протеїну (приклад 1 В); c) суміші, з токсину TcdB10463, маркування якого проведене за допомогою Су3, і інозитолфосфату; 11 d) суміші, яка складається з токсину TcdB10463 без маркування, та інозитолфосфату; e) суміші, яка складається з токсину TcdB10463 без маркування (очищеного за допомогою афінної хроматографії), та інозитолфосфату; а - e: відповідно відразу після інкубації за кімнатної температури протягом 1 години; фіг. 2 - електрофорез в ПААГ у присутності додецилсульфату натрію суміші, яка складається з токсину TcdB10463 і/або ІР6, після або без попередньої обробки токсину за допомогою EPNP; Слід 1: TcdB10463 після попередньої обробки за допомогою EPNP без застосування ІР6, на ділянці 63 кДа смуга не виявлена; Слід 2 : TcdB10463 після попередньої обробки за допомогою EPNP і після інкубації спільно з ІР6, типова смуга 63 кДа виражена слабо; Слід 3 : TcdB10463 без попередньої обробки за допомогою EPNP і після інкубації спільно з ІР6, в зоні молекулярної ваги 63 кДа простежується чітко виражена смуга; Слід 4: TcdB10463 без попередньої обробки за допомогою ENPN і без застосування ІР6, на ділянці 63 кДа смуга не виявлена; фіг. 3 - МС-аналіз методом ESI-PX-MC після триптичного переварювання нативного (а) і модифікованого за допомогою ENPN (b) протеїну токсину TcdB. МС-сканування (крупне зображення) і спектри фрагментації (вставка). Всі способи, вказані в прикладах, які наводяться нижче, відомі фахівцям і описані, наприклад, у Ausubel та ін. (2003) . Приклад 1. Підтвердження автокаталітичної активності протеази токсину TcdB Токсин В Clostridium difficile (270 кДа) контрольного штаму TcdB10463, який позначається нижче скорочено як TcdB10463, піддали спочатку флуоресцентному маркуванню за допомогою Су3. Для цього 200 - 400 мкг TcdB10463, (tgcBIOMICS, м. Майнц, ФРН) маркували барвником Су3 відповідно до інструкцій виробника (Amersham Bioscience), при цьому токсин разом з розчиненим в диметилформаміді барвником інкубували протягом години при 4°С. Незв'язаний барвник видалили потім за допомогою витіснювальної хроматографії (Size Exclusion Chromatography = SEC), причому 10 ммолів Tpic-HCL при рН 8,5 служили буферним розчином. Молекулярне співвідношення між барвником і TcdB10463, маркованим за допомогою Су3, склало 0,8 - 1.6. Маркований токсин TcdB10463 був розділений на аліквотні частини і зберігався при 80°С до наступного випадку застосування. (А) Для проведення відомого в рівні техніки «аналізу розщепленням in vitro» (in-vitro-cleavageassay) (див., зокрема, Rupnik та ін., (2005), посилання приводитимуться на цю публікацію) аліквотну частину розмороженого до кімнатної температури токсину TcdB10463, маркованого за допомогою Су3, інкубували протягом 1 години за кімнатної температури із застосуванням екстракту клітин свинячої селезінки. Цей екстракт клітин свинячої селезінки приготовляли таким чином. Свіжу свинячу селезінку помістили у фосфатний буфер (PBS) і подрібнювали для отримання суспензії з окремих клітин. 96768 12 Добавкою буфера з низьким вмістом солі, а саме 150 ммолів NH4CI, 1 ммоля КНСО3 та 0,1 ммоля етилендиамінтетраоцтової кислоти, рН 7,6, лізували наявні еритроцити, і тим самим їх видаляли. Потім клітини селезінки промили двічі в 10 ммолях Тріс-НСІ, рН 8,5, і відразу піддали глибокому заморожуванню при -80°С. Для отримання необхідного екстракту клітин одну аліквотну частину заморожених клітин селезінки розморозили в одній аліквотній частині з 10 ммолів Тріс-НСІ, рН 8,5, і суспендували, потім отриману суспензію піддали ультразвуковій обробці. Отриманий лізат центрифугували протягом 1 години при 200 000 X g і 4°С і надосадкову частину використовували в експериментах. В кінці фази інкубації суміш з токсину TcdB10463, маркованого за допомогою Су3, і екстракту клітин свинячої селезінки піддавали електрофорезу в поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE) для сепарації і визначення фрагментів токсину TcdB, які утворилися під час інкубації. Результат такого електрофорезу представлений на фіг. 1а. Як і очікувалося, були отримані два відомих і характерних фрагмента 63 кДа і 207 кДа токсину В Clostridium difficile, в даному випадку TcdB10463. Для негативного контролю служили аліквотні частини токсину TcdB10463, без домішків екстракту клітин селезінки (див. фіг. 1 "-"). (В) У досліді, який проводився одночасно, екстракт клітин селезінки, описаний в розділі (А), перед інкубацією разом з токсином TcdB10463, маркованим за допомогою Су3, очистили від протеїну. Для цього аліквотну частину отриманого згідно (А) екстракту клітин свинячої селезінки піддавали після ультразвукової обробки шестиразовій екстракції фенол-хлороформом, яку проводили таким чином. Екстракт клітин свинячої селезінки змішували з фенол-хлороформ-ізоаміловим спиртом (25/24/1) в об'ємному співвідношенні 1:1. Отриману суміш центрифугували протягом 10 хвилин при 1 7 00 X g та 4°С. Самий верхній водний шар декантували в чисту ємність центрифуги і п'ятиразово повторили центрифугування і декантацію. З метою видалення залишків фенолу насамкінець провели екстракцію хлороформом. Аліквотні частини отриманої таким чином водної фракції екстракту клітин селезінки, яка не містила протеїну, розбавили в об'ємному співвідношенні 1 : 30 (30), 1 : 100 (100) або 1 : 300 (300) за допомогою 10 ммолів Тріс-НСІ, рН 8,5, і, як описано в розділі (А), змішували з аліквотними частинами розмороженого до кімнатної температури токсину TcdB10463, маркованого за допомогою Су3, та інкубували протягом 1 години за кімнатної температури. В кінці інкубаційної фази отримані суміші піддали електрофорезу в ПААГ у присутності додецилсульфату натрію для відділення і визначення фрагментів токсину TcdB10463, які утворилися під час інкубації. Результат такого електрофорезу наочно представлений за допомогою гелю Doc EQ System Image Readers (BIO-RAD, м. Мюнхен, ФРН) і показаний на Фіг. 1b. Для всіх випробовуваних сумішей були отримані характерні фрагменти токсину TcdB10463 : 63 кДа та 207 кДа. Це показує, що водна 13 фракція екстракту клітин селезінки, яка не містить протеїну як і раніше характеризується або характеризувалася здатністю розщеплювати токсин TcdB10463 на обидва його характерні фрагменти. У досліді, який проводився одночасно, описаний в (А) екстракт клітин селезінки піддавали тепловій обробці (96°С, 30 хвилин) до того, як його інкубували, як описано в розділі (А) разом з токсином TcdB10463, маркованим Су3, і проводили електрофорез в ПААГ за відсутності додецилсульфату натрію. Результат цього електрофорезу приведений на фіг. 1b. Знову були отримані два характерні фрагменти токсину TcdB10463 : 67 кДа і 207 кДа. Результат свідчить про те, що індукований теплом екстракт клітин селезінки як і раніше характеризувався здатністю розщеплювати токсин TcdB10463 на два характерні фрагменти. (С) У ході подальшої серії дослідів маркований за допомогою Су3 і не маркований токсин TcdB10463 інкубували окремо (тобто без домішування екстракту клітин селезінки) із застосуванням різних інозитолфосфатів протягом 1 години за кімнатної температури і потім відповідні суміші піддали електрофорезу в ПААГ у присутності додецилсульфату натрію. Результат цих досліджень приведений в таблиці 1 і на фігурах 1с - 1е. Неочікувано отримали дані, згідно яких протеолітичне розщеплення токсину TcdB10463 ініціюється вже однією хімічною речовиною, такою, як інозитолфосфат, і, отже, за такого протеолітичного розщеплення відбувається автокаталітичний процес за участю протеїну токсину. Із таблиці 1 можна бачити, що ряд інозитолфосфатів здатний ініціювати автокаталітичне розщеплення токсину TcdB10463. Із поміж випробуваних інозитолфосфатів максимальною активністю щодо розщеплювання характеризувався інозитолгексафосфат (ІР6), що означає, що ІР6 характеризується найбільшою активністю ініціатора (див. також Фігури 1с - 1е). Структурні аналоги або інші споріднені з інозитолфосфатами речовини, які характеризується активністю ініціатора, добре відомі фахівцям і можуть бути легко визначені за допомогою відомих методів (наприклад, комп'ютерного моделювання). Також можуть бути застосовані, наприклад, описані вище «високоефективні способи аналізу» (HighTroughput-assays). Випробування ІР6 у різних його концентраціях в досліді із інкубації із застосуванням токсину TcdB10463 (див. Фіг. 1с, 1d) показали, що для розщеплення маркованого флуоресцентною речовиною токсину В достатньою є концентрація IP 10 мкмолів (Фіг. 1с), тоді як для розщеплення не маркованого токсину В (що наочно продемонстровано на електрофорезі в ПААГ у присутності додецилсульфату натрію за допомогою фарбування цинковим пігментом (Zinc Stain and Destain Kit, Biorad, Hercules, США)) достатніми були ще менші концентрації, які не перевищували 1 мкмоля (Фіг. 1d). Аналогічні експерименти проводилися також з токсинами TcdB10463, TCSL Clostridium sordellii та Tcn. При цьому виявилося, що інозитолфосфати активували автокаталітичне розщеплення досліджуваних токсинів сімейства LCT. 96768 14 (D) Для виключення забруднення протеазами, використаного в дослідах і виділеного з надосадкової культури токсину TcdB10463 Clostridium difficile, був проведений контрольний дослід із застосуванням спеціального очищеного токсину TcdB10463. Очищення токсину TcdB10463 проводилося за допомогою афінної хроматографії з використанням моноклонального антитіла 2CV (DSM АСС 2321) таким чином. 7 міліграм специфічного для токсину TcdB моноклонального антитіла 2CV (очищена від протеїну надосадова частина, яка не містить сироватки гібридомної культури) помістили в колонку НіТrар NHS Sepharose (стандартна, така, яка випускається фірмою GE Healthcare, м. Фрайбург, ФРН). Розміщення і елюювання проводилися відповідно до інструкцій виробника. У готову колонку помістили близько 4 міліграма токсину TcdB10463 і видалили не зв'язані протеїни триразовою промивкою 50 ммолями Тріс- НСІ, рН 7.0, і 125 ммолями NaCl. Елюювання проводилося в один прийом із застосуванням 0,1 молів триетаноламін-соляної кислоти, рН11. Токсин елюювали у вигляді трьох фракцій по 4 мл у концентраціях від 450 до 185 мкг/мл. Елюйований токсин відразу нейтралізували 1 молем Трис-HCL, рН 7,5, при об'ємному співвідношенні 1 : 10, що стало можливим завдяки тому, що цей нейтралізуючий розчин вже до початку елюювання знаходився в пробірках для уловлювання фракцій. Потім перевірили на відсутність забруднюючих протеїнів за допомогою електрофорезу в ПААГ у присутності додецилсульфату натрію і подальшого фарбування цинковим пігментом (див. Фіг. 1е "-"). Контрольний дослід складався з інкубації за допомогою описаного способу не маркованого токсину TcdB10463 разом з ІР6, подальшого електрофорезу в ПААГ у присутності додецилсульфату натрію і визначення токсину або його фрагментів за допомогою фарбування цинковим пігментом. Результат цього досліду представлений на фіг. 1е, він свідчить про повне розщеплення голотоксину на два відомі фрагменти 63 кДа і 207 кДа. Приклад 2. Інактивація токсину TcdB-10463 за допомогою інкубації з інгібітором протеази Як описано в прикладі 1 (D), токсин TcdB10463 очищували за допомогою афінної хроматографії із застосуванням моноклонального антитіла 2CV і потім попередньо обробляли протягом 60 хвилин за кімнатної температури або (і) інгібітором протеази EPNP (10 ммолів 1,2-епокси-3-(рнітрофенокси) -пропану), або (іі) - як контроль буфером (50 ммолів N-2-гідроксиетилпіперазин-N'2-гідроксипропансульфонової кислоти, 1 моль NaCl, 1 ммоль етилендиамінтетраоцтової кислоти, рН 8,0). Потім, аналогічно до прикладу 1 (А), провели аналіз на розщеплення in vitro. Досліджувані суміші застосовувалися в об'ємі 10 мкл і містили відповідно 50 - 100 нг не маркованого токсину TcdB10463, 100 мкмолів ІР6 та 10 ммолів Тріс- НСІ, рН 8,5. Ці досліджувані суміші піддалися після інкубації (1 год. за кімнатної температури) електрофорезу в ПААГ у присутності додецилсульфату натрію (10 %) і потім токсини та їх фрагменти проявлялись за допомогою фарбування цинковим пігментом. 15 На фіг. 2 представлений результат даного експерименту. Інкубація токсину TcdB10463 із застосуванням одного ІР6 (слід 3) викликала появу смуги, яка виразно простежувалася, в зоні молекулярної ваги 63 кДа. Якщо токсин попередньо обробляється за допомогою EPNP (слід 2), то типова смуга 63 кДа виражена слабо. Такі результати свідчать про те, що за умов додавання інгібітору протеази EPNP майже повністю пригнічується протеолітична активність (протеази) токсину TcdB10463. Попередньо оброблений за допомогою EPNP токсин додатково досліджували в досліді з яєчником китайського хом'яка (СНО) за Moos та ін., (2000), на його залишкову активність (цитотоксична дія). Дослід СНО проводили таким чином. На мікротитрувальну планшетку з 96 комірками висіювали клітини яєчника китайського хом'яка (5000 клітин на комірку) і протягом 16 годин інкубували за стандартизованих умов (5 % СО2, 37°С, DMEM F12 (DMEM: модифіковане способом Дульбеко середовище Іґла) з додаванням 2 ммолів L-глютаміну, 5% FCS). Потім після послідовного розбавлення токсинів в середовищі зростання домішували до клітин. Випробовували стадії розбавлення від 100 до 10-8. Клітини інкубували протягом 3 годин за стандартизованих умов. Потім під мікроскопом визначали частку округлих клітин, для чого фотографували декілька репрезентативних відтинків комірки і підраховували клітини довгастої та заокругленої форм (див. також Moos та ін., Meth Enzymol. 2000, 325: 114 - 125. Тут спеціально робиться посилання на цю публікацію). Результати випробування СНО показали, що токсин TcdB10463, попередньо оброблений за допомогою Ерnр, характеризується істотно меншою цитотоксичною активністю у порівнянні з таким же необробленим токсином (див. табл. 2). Оскільки інгібуюча дія EPNP заснована, як відомо, на тому, що EPNP вступає в ковалентну взаємодію з каталітичними залишками аспартату і викликає цим незворотню інактивацію протеази (Salto та ін., 1994), то результати даного досліду свідчать про те, що пригнічення активності токсину TcdB10463 спричинене пригніченням активності протеази в молекулі цього токсину. Описаний експеримент із застосуванням EPNP доводить, що токсична дія TcdB10463 та інших токсинів LCT значно знижується в результаті попередньої обробки токсинів відповідним інгібітором протеази. EPNP є модельною речовиною для ковалентного інгібітору токсинів LCT. Інші співвідносні, ковалентно діючі або змагально пригнічуючі інгібітори, відомі пересічному фахівцеві або ж вони можуть бути визначені відомими методами, наприклад, за допомогою вже описаного «високоефективного методу аналізу». Приклад 3. Інактивація цитотоксичної дії токсину TcdB10463 шляхом позаклітинної активації протеази за допомогою ІР6 Токсин TcdB10463 інкубували, як це описано в прикладі 1 (С), із застосуванням 100 мкмолів ІР6. Після інкубації відокремлювали менший фрагмент 63 кДа протеїну токсину, який відщепився унаслі 96768 16 док активності протеази, при цьому початкову суміш очищували за допомогою пробірок Microcon (Millipore, величина виключення: 100 кДа). Цей фрагмент 63 кДа токсину TcdB10463 досліджували, як описано в прикладі 2, випробуванням СНО за Moos та ін. (2000), на округлість клітин. При цьому нерозбавлений і розбавлений на декількох стадіях протеїн додали до клітин. У цьому досліді було встановлено, що фрагмент 63 кДа, який характеризувався функцією глюкозилтрансферази в токсині TcdB10463, за даних умов самостійно не міг викликати цитотоксичної дії. Як у розбавленому, так і в нерозбавленому вигляді не була відмічена округлість клітин (унаслідок глюконізації специфічних ГТФаз підродини Rho, результуючої звідси блокування процесів трансдукції сигналів і, як наслідок, розпаду цитоскелета). Дані результати, відповідно до яких генерований за допомогою автокаталізу фрагмент токсину, опинився інактивним за межами клітини, підтверджує результати авторів Pfeifer та ін. (2003) та Rupnik та ін. (2005), які показали, що відщеплений каталітичний домен токсину TcdB10463 не надходить до еукаріотичних клітин і тому залишається інактивним у клітинному середовищі. (В той час, як в цих роботах автокаталітична активність токсинів LCT очевидно виключається (Pfeiffer та ін., 2003) або ж повідомляється про клітинну протеазу, яка активує токсини LCT (Rupnik та ін., 2005), результати дослідів, які проводилися у зв'язку із даним винаходом, вперше показали, що N-термінальний фрагмент токсину відщеплюється автокаталітично). Отже, цитотоксична дія токсину TcdB10463 та інших токсинів LCT може бути попереджене за рахунок того, що протеолітичне розщеплення токсинів може бути індуковане ще до проникнення токсинів у клітини. Приклад 4. Визначення активного центру протеази токсину TcdB10463 Токсин TcdB10463, який був інактивований за допомогою EPNP (див. приклад 2) і не піддався обробці, був розділений за допомогою гелю додецилу сульфату натрію і проявлений цинковим пігментом. Потім були вирізані і розділені на дрібні частини смуги, які відповідали протеїнам. їх знебарвили і просушили, потім відновили в 2 ммолях дихлордифенілтрихлоретану і алкілювали 20 ммолями ацетаміду йоду. Після промивання і повторного просушування фрагментів гелів їх піддали переварюванню трипсином протягом ночі при 37°С. Утворені пептиди розділили високоефективною рідинною хроматографією (NaniAcquity ultraperformance Liquid Chromatography, Waters, Milford, США). Для цього 2 мкл проб наносили на колонку із зворотною фазою (NaniEase ВЕН C18 (75 мкм х 10 cm) Waters, Milford, США) в 2%-ий буфер В з рухомою фазою (0,1% мурашиної кислоти в ацетонітрилі ). Рухома фаза буфера А містила 0,1% мурашиної кислоти в Н2О. Потім фрагменти елюювали з колонки при градієнті 3 - 40% мобільної фази буфера В (90 хвилин при 300 нл/хв.). Потім елюйовані фрагменти досліджували під мас-спектрометром. Для цього застосували мас 17 спектрометр Q-Tof Premier фірми Waters. Прилад калібрували розчином, який містив [глю-1]фібриногенпептид (500 фмолів/мкл при 300 нл/хв.), із застосуванням контрольного розпилювача ф. NanoLockSpray (Waters). Аналіз результатів проводився із використанням програмного забезпечення MassLnyx4.1 (Waters). Аналіз результатів показав, що не оброблений токсин TcdB відрізняється від токсину, обробленого за допомогою EPNP, тільки триптичним фрагментом (Фіг. 3). Цей фрагмент містить амінокислоти від AS 1653 до AS 1678 протеїну токсину TcdB відповідно до амінокислотної послідовності № P18177 (SwissProt/TrEMBL) з мотивом DXG в положенні 1665, характерним для протеаз аспартату. Порівняння амінокислотної послідовності від AS 1653 до AS 1678 каталітичного центру токсину TcdB10463 з відповідними каталітичними центрами і протеїновими областями токсинів TcdA, TcsL та Тсп показало, що область характеризується високим ступенем консервації (див. табл. 3). Тому фахівець може генерувати за допомогою відомих методів антитіла або інші протеїни, які специфічно взаємодіють з активним центром домена протеази токсинів і тим самим перешкоджають, наприклад, автокаталітичному розщеплюванню токсинів LCT. Так же успішно можуть генеруватися антитіла або протеїни, які безпосередньо не блокують активний центр, а тільки направлені у бік сусідніх областей і тим самим стерично перешкоджають автопротеолітичному розщеплюванню токсину. Приклад 5. Інгібірування дії токсину TcdB з допомогою антитіл в результаті імунізації інактивованим токсином TcdB Для захисту від цитотоксичних ефектів токсину TcdB були приготовані наступні препарати, які містили токсин TcdB, і які застосувались для імунізації кроликів: препарат A: TcdB, інактивований формаліном; препарат В: TcdB, інактивований за допомогою EPNP (див. приклад 2); препарат С: фрагмент TcdB AS 1601 - 1716 (мотив DSG); препарат D : фрагмент TcdB AS 1508 -1601 (частина мотиву, який зв'язує інозин); препарат Е: фрагмент TcdB AS 1508-2157 (Мотив DSG і повністю мотив, який зв'язує інозин). Фрагменти токсину TcdB були виділені відомими фахівцеві методами із плазміди рЕТ-19 (Novagen) і очищені за допомогою пришитої гісмітки. Після цього гіс-мітку відщепили в результаті переварювання ентерокіназою. Чистоту протеїну перевірили гелем додецилсульфату натрію (дані не приведені). Спочатку кроликів піддавали основній імунізації із застосуванням антигена, потім декільком реімунізаціям. З їх крові були отримані поліклональні антисироватки. З метою перевірки їх нейтралізуючої дії поліклональною антисироваткою попередньо обробили спочатку токсин TcdB (стадія розбавлення 1 : 100) та інкубували протягом 1 години за 96768 18 кімнатної температури. Потім перевірили нейтралізуючу дію антисироваток за допомогою випробування СНО, як це описано в прикладі 2. Мірою нейтралізуючої дії сироваток служила тривалість захисту клітин від цитотоксичної дії токсину TcdB. У кроликів, імунізованих препаратом А, титр антитіл був низьким (див. табл. 4), крім того сироватка цих кроликів не діяла нейтралізуюче. Такі результати відповідають відомим фахівцеві показникам, отриманим в дослідах із імунізації токсинами, розщепленими мурашиною кислотою. Тварини, імунізовані препаратом В, хоча і мали помітний титр (розведення до 1 : 1500), проте і ця антисироватка не характеризувалася нейтралізуючим ефектом під час випробування СНО (табл. 4). Кролики, імунізовані препаратами С - Е, також мали титр антитіл, крім того їх поліклональні сироватки проявили під час випробування СНО помітну нейтралізуючу дію (табл. 4). Поліклональна сироватка, отримана в результаті імунізації за допомогою препарату Е, характеризувалася якнайкращими нейтралізуючими властивостями. Сироватки, які були виготовлені в результаті окремої імунізації препаратами С і D, показали меншу нейтралізуючу дію. Успіх, досягнутий імунізацією із застосуванням фрагмента D, який містив частину області, що зв'язує інозитол, доводить, що дана ділянка токсинів LCT є областю важливою для активації токсинів. Скріплення ІР6 на цій ділянці токсину веде до підвищення автокаталітичної активності протеази і, отже, активації токсинів LCT. Нейтралізуюча дія розташованої довкола мотиву DSG області доводить, що антитіла, направлені у бік активного центру протеази, здатні інгібірувати протеолітичну активність. За допомогою таких антитіл може бути забезпечена захист від токсичної дії токсинів LCT також in vitro. Разом з імунізацією препаратом Е застосовувалися тільки обидва фрагменти успішних препаратів 3 і D. Успішна імунізація із застосуванням обох фрагментів токсину TcdB заснована на тому, що у тварин були індуковані як антитіла, направлені проти активної зони протеази, так і антитіла, які приєднуються до області, яка зв'язує інозитолфосфат. Таким чином дія антисироватки пояснюється тим, що вперше вдалося індукувати специфічні антитіла, які цілеспрямовано пригноблюють активність токсину. Для природного введення токсинів LCT у цільові клітини важливим є автокаталітичне розщеплення токсинів, оскільки тільки таким чином в цільових клітинах може бути вивільнений Nтермінальний фрагмент, який викликає власне токсичну активність. Скріплення специфічних антитіл на ділянці навколо мотиву DSG протеази аспартату і місця скріплення інозитолфосфату попереджає автокаталітичне розщеплення токсинів. Отже у пацієнтів може бути вироблена ефективна імунізація проти токсинів LCT застосуванням фрагментів токсинів, необхідних для автокаталітичного розщеплення токсинів LCT. 19 96768 20 Таблиця 1 Автокаталітичне розщеплення токсину TcdB10463 додаванням певних інозитолфосфатів IP Концентрація 100 мкмолів + + + + + + 1 ммоль + + + + + + + + + + + 1,5 1,4 4,5 1,4,5 2,3,5 1,3,5 1,3,5,6 1,2,3,4,6 1,3,4 1,3,4,5 3,4,6 1,2,3,4 1,2,3,4,5 1,2,3,5,6 1,3,4,5,6 3,4,5,6 2,3,4,5,6 1,4,5,6 1,2,3,4,5,6 10 мкмолів + Таблиця 2 Округлість (%) клітин яєчника китайського хом'яка після інкубації 3 токсином TcdB10463, після або без попередньої обробки за допомогою EPNP Розбавлення -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 10 Округлість клітин через 3 год. % TcdB - 10463 TcdB - 10463 + EPNP 100% 100% 100% 100% 100% 50% 100% 10% 10% < 5% < 5% 24 год. Ausubel, F.M. et al.: "Current Protocols in Molecular Biology" (2003), John Wiley and Sons. Inc. 21 Rupnik et al. (2005) "Characterization of the cleavage site and function of resulting cleavage fragments after limited proteolysis of Clostridium difficile toxin B(TcdB) by host cells." Mikrobiol 151, 199-208. Moos et al. (2000) "Purification and evaluation of large clostridial cytotoxins that inhibit small GTPases of Rho and Ras subfamilies" Meth Enzymol. 325: 114-125. Pfeifer et al. (2003) "Cellular Uptake of Clostridium difficile toxins B" J. Biol. Chem. 278: 44535-41. 96768 22 Rao et al. (1998) "Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases" Microbiol. Моl. Biol. Rev. 62: 597-635. Salto et al. (1994) "In vitro characterization of nonpeptide irreversible inhibitors of HIV proteases", J. Biol. Chem. 269: 10691-8. Tang (1971) "Specific and irreversible inactivation of pepsin by substrate-like Epoxides", J. Biol. Chem. 246: 4510-17. 23 96768 24 25 96768 26 27 Комп’ютерна верстка В. Мацело 96768 Підписне 28 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601