Функціонально відновлені вірусні мембрани, що містять ад’ювант, спосіб одержання відновленої вірусної мембрани та фармацевтична композиція, яка містить відновлену вірусну мембрану

Є ще 7 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Відновлена вірусна мембрана, подвійний ліпідний шар якої містить злитий вірусний протеїн, амфіфільний ад'ювант і необов'язково додатковий антиген, яка відрізняється тим, що (а) подвійний ліпідний шар має композицію ліпідів, сумісну із індукованим злитим протеїном злиттям вірусної мембрани із клітинною мембраною, яка може зливатися з вірусом, з якого отриманий такий злитий протеїн; (b) злитий протеїн і амфіфільний ад'ювант взаємодіють із гідрофобною внутрішньою частиною подвійного ліпідного шару, і (с) злитий протеїн, амфіфільний ад'ювант і необов'язковий додатковий антиген не є ковалентно зв'язаними.

2. Відновлена вірусна мембрана за п. 1, в якій ліпідний подвійний шар містить природні ліпіди вірусної мембрани.

3. Відновлена вірусна мембрана за пп. 1 або 2, в якій амфіфільним ад'ювантом є ліпопептид, гліколіпід або пептид.

4. Відновлена вірусна мембрана за будь-яким з пп. 1-3, в якій амфіфільним ад'ювантом є ліганд для Toll-подібного рецептора ссавця.

5. Відновлена вірусна мембрана за п. 3, в якій ліпопептид вибраний з групи, яка включає N-пальмітоїл-S-2,3-(біспальмітоїлокси)-пропілцистеїнілсерилсерин, S-2,3-(біспальмітоїлокси)-пропілцистеїнілсерилсерин, N-пальмітоїл-S-2,3-(біспальмітоїлокси)-пропілцистеїнілсерил-(лізил)3-лізин, S-2,3-(біспальмітоїлокси)-пропілцистеїнілсерил-(лізил)3-лізин, N-пальмітоїл-S-2,3-(бісолеоїлокси)-пропілцистеїнілсерил-(лізил)3-лізин, S-2,3-(бісолеоїлокси)-пропілцистеїнілсерилсерин-(лізил)3-лізин, N-пальмітоїл-S-2,3-(бісміристоїлокси)-пропілцистеїнілсерил-(лізил)3-лізин, S-2,3-(бісміристоїлокси)-пропілцистеїнілсерил-(лізил)3-лізин, N-пальмітоїл-S-3-(пальмітоїлокси)-пропілцистеїнілсерил-(лізил)3-лізин і N-пальмітоїл-S-2,3-гідроксипропілцистеїнілсерил-(лізил)3-лізин, N-пальмітоїл-S-2,3-(біспальмітоїлокси)-пропілцистеїнілсерил-(пропіл)3-пролін, N-пальмітоїл-S-2,3-(біспальмітоїлокси)-пропілцистеїнілсерил-(глютамініл)3-глютамінову кислоту.

6. Відновлена вірусна мембрана за п. 3, в якій гліколіпідом є фосфатидиінозитолманнозид, альфа-галактозилкерамід або модифікований ліпополісахарид із зниженою токсичністю.

7. Відновлена вірусна мембрана за будь-яким з пп. 1-6, в якій антиген є внутрішнім мембранним протеїном.

8. Відновлена вірусна мембрана за будь-яким із пп. 1-7, в якій антиген є вірусним антигеном.

9. Відновлена вірусна мембрана за п. 8, в якій антиген є похідним із вірусу грипу.

10. Відновлена вірусна мембрана за п. 9, в якій антиген є гемагглютиніном (НА), нейрамінідазою (NA) або протеїном М2.

11. Відновлена вірусна мембрана за п. 8, в якій антиген одержаний із вірусу, вибраного з групи, яка включає ретровіруси (Retroviridae), краснуха, параміксовіруси, віруси Flaviviridae, віруси герпесу, буньявірусів (Bunyaviridae), Arenaviridae, Hantaviridae, коронавіруси (Coronaviridae), паповавіруси (Papovaviridae), рабдовіруси (Rhabdoviridae), Coronaviridae, Alphaviridae, Arteriviridae, Filoviridae, Arenaviridae, Рoxviridae і вірус африканської чуми свиней.

12. Відновлена вірусна мембрана за будь-яким із пп. 1-7, в якій антиген отриманий від паразита, бактерії, гриба, дріжджів або такий антиген є пухлино-специфічним антигеном.

13. Спосіб одержання відновленої вірусної мембрани, який включає: (а) змішування амфіфільного ад'юванта, вірусного злитого протеїну, необов'язкового додаткового антигену і ліпідів у розчині, який містить детергент; (b) зменшення концентрації детергента за умов, які забезпечують відновлення вірусної мембрани, яка містить подвійний ліпідний шар, в якому амфіфільний ад'ювант і вірусний злитий протеїн взаємодіють з гідрофобною внутрішньою зоною подвійного ліпідного шару, при цьому амфіфільний ад'ювант і вірусний злитий протеїн переважно не є ковалентно зв'язаними, також при цьому переважно амфіфільний ад'ювант і необов'язковий додатковий антиген не є ковалентно зв'язаними, і при цьому відновлена вірусна мембрана має здатність до злиття; (с) необов'язкове очищення відновленої вірусної мембрани; і (d) необов'язкове включення відновленої вірусної мембрани до складу фармацевтичної композиції.

14. Фармацевтична композиція, яка містить відновлену вірусну мембрану за будь-яким з пп. 1-12 і фармацевтично прийнятний носій.

15. Фармацевтична композиція за п. 14, яка є придатною для інтраназального, перорального або парентерального призначення.

Текст

1. Відновлена вірусна мембрана, подвійний ліпідний шар якої містить злитий вірусний протеїн, амфіфільний ад'ювант і необов'язково додатковий антиген, яка відрізняється тим, що (а) подвійний ліпідний шар має композицію ліпідів, сумісну із індукованим злитим протеїном злиттям вірусної мембрани із клітинною мембраною, яка може зливатися з вірусом, з якого отриманий такий злитий протеїн; (b) злитий протеїн і амфіфільний ад'ювант взаємодіють із гідрофобною внутрішньою частиною подвійного ліпідного шару, і (с) злитий протеїн, амфіфільний ад'ювант і необов'язковий додатковий антиген не є ковалентно зв'язаними. 2. Відновлена вірусна мембрана за п. 1, в якій ліпідний подвійний шар містить природні ліпіди вірусної мембрани. 3. Відновлена вірусна мембрана за пп. 1 або 2, в якій амфіфільним ад'ювантом є ліпопептид, гліколіпід або пептид. 4. Відновлена вірусна мембрана за будь-яким з пп. 1-3, в якій амфіфільним ад'ювантом є ліганд для Toll-подібного рецептора ссавця. 5. Відновлена вірусна мембрана за п. 3, в якій ліпопептид вибраний з групи, яка включає Nпальмітоїл-S-2,3-(біспальмітоїлокси)пропілцистеїнілсерилсерин, S-2,3(біспальмітоїлокси)-пропілцистеїнілсерилсерин, Nпальмітоїл-S-2,3-(біспальмітоїлокси)пропілцистеїнілсерил-(лізил)3-лізин, S-2,3 UA (21) a200512191 (22) 18.06.2004 (24) 10.07.2009 (86) PCT/NL2004/000437, 18.06.2004 (31) PCT/NL03/00450 (32) 19.06.2003 (33) NL (46) 10.07.2009, Бюл.№ 13, 2009 р. (72) СТЕГМАНН АНТОНІУС ЙОХАННЕС ХЕНДРІКУС, NL, ВІЛСХУТ ЯН КРІСТІАН, NL, ВАН БЕРКУМ ЙОХАННЕС ХЕНРІКУС ГЕРАРДУС, NL (73) БЕСТЕВІЛ ХОЛДІНГ Б.В., NL (56) DIJKSTRA J ET AL: "ACTIVATION OF MURINE LYMPHOCYTES BY LIPOPOLYSACCHARIDE INCORPORATED IN FUSOGENIC, RECONSTITUTED INFLUENZA VIRUS ENVELOPES (VIROSOMES)" JOURNAL OF IMMUNOLOGY, THE WILLIAMS AND WILKINS CO. BALTIMORE, US, vol. 157, no. 3, 1 August 1996 (1996-08-01), pages 1028-1036. BRON R ET AL: "PREPARATION, PROPERTIES, AND APPLICATIONS OF RECONSTITUTED INFLUENZA VIRUS ENVELOPES (VIROSOMES)" METHODS IN ENZYMOLOGY, ACADEMIC PRESS INC, SAN DIEGO, CA, US, vol. 220, 1993, pages 313-331. COMPAGNON B ET AL: "TARGETING OF POLY(RL)-POLY(RC) BY FUSOGENIC (F PROTEIN) IMMUNOLIPOSOMES" EXPERIMENTAL CELL RESEARCH, SAN DIEGO, CA, US, vol. 200, no. 2, June 1992 (1992-06), pages 333-338. MENGIARDI B ET AL: "Virosomes as carriers for combined vaccines" VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 13, no. 14, 1 October 1995 (1995-10-01), pages 1306-1315. FERNANDES ISABELLE ET AL: "Synthetic lipopeptides incorporated in liposomes: In vitro stimulation of the proliferation of murine splenocytes 2 (19) 1 3 87269 4 (біспальмітоїлокси)-пропілцистеїнілсерил-(лізил)3Hantaviridae, коронавіруси (Coronaviridae), паповалізин, N-пальмітоїл-S-2,3-(бісолеоїлокси)віруси (Papovaviridae), рабдовіруси пропілцистеїнілсерил-(лізил)3-лізин, S-2,3(Rhabdoviridae), Coronaviridae, Alphaviridae, (бісолеоїлокси)-пропілцистеїнілсерилсеринArteriviridae, Filoviridae, Arenaviridae, Рoxviridae і (лізил)3-лізин, N-пальмітоїл-S-2,3вірус африканської чуми свиней. (бісміристоїлокси)-пропілцистеїнілсерил-(лізил)312. Відновлена вірусна мембрана за будь-яким із лізин, S-2,3-(бісміристоїлокси)пп. 1-7, в якій антиген отриманий від паразита, пропілцистеїнілсерил-(лізил)3-лізин, N-пальмітоїлбактерії, гриба, дріжджів або такий антиген є пухS-3-(пальмітоїлокси)-пропілцистеїнілсериллино-специфічним антигеном. (лізил)3-лізин і N-пальмітоїл-S-2,313. Спосіб одержання відновленої вірусної мемгідроксипропілцистеїнілсерил-(лізил)3-лізин, Nбрани, який включає: (а) змішування амфіфільного пальмітоїл-S-2,3-(біспальмітоїлокси)ад'юванта, вірусного злитого протеїну, необов'язпропілцистеїнілсерил-(пропіл)3-пролін, Nкового додаткового антигену і ліпідів у розчині, пальмітоїл-S-2,3-(біспальмітоїлокси)який містить детергент; (b) зменшення концентрапропілцистеїнілсерил-(глютамініл)3-глютамінову ції детергента за умов, які забезпечують відновкислоту. лення вірусної мембрани, яка містить подвійний 6. Відновлена вірусна мембрана за п. 3, в якій гліліпідний шар, в якому амфіфільний ад'ювант і віколіпідом є фосфатидиінозитолманнозид, альфарусний злитий протеїн взаємодіють з гідрофобною галактозилкерамід або модифікований ліпополісавнутрішньою зоною подвійного ліпідного шару, при харид із зниженою токсичністю. цьому амфіфільний ад'ювант і вірусний злитий 7. Відновлена вірусна мембрана за будь-яким з пп. протеїн переважно не є ковалентно зв'язаними, 1-6, в якій антиген є внутрішнім мембранним протакож при цьому переважно амфіфільний ад'ювант теїном. і необов'язковий додатковий антиген не є ковален8. Відновлена вірусна мембрана за будь-яким із тно зв'язаними, і при цьому відновлена вірусна пп. 1-7, в якій антиген є вірусним антигеном. мембрана має здатність до злиття; (с) необов'яз9. Відновлена вірусна мембрана за п. 8, в якій анкове очищення відновленої вірусної мембрани; і тиген є похідним із вірусу грипу. (d) необов'язкове включення відновленої вірусної 10. Відновлена вірусна мембрана за п. 9, в якій мембрани до складу фармацевтичної композиції. антиген є гемагглютиніном (НА), нейрамінідазою 14. Фармацевтична композиція, яка містить відно(NA) або протеїном М2. влену вірусну мембрану за будь-яким з пп. 1-12 і 11. Відновлена вірусна мембрана за п. 8, в якій фармацевтично прийнятний носій. антиген одержаний із вірусу, вибраного з групи, 15. Фармацевтична композиція за п. 14, яка є прияка включає ретровіруси (Retroviridae), краснуха, датною для інтраназального, перорального або параміксовіруси, віруси Flaviviridae, віруси герпесу, парентерального призначення. буньявірусів (Bunyaviridae), Arenaviridae, Винахід стосується вакцин проти антигенів, таких як мембранні протеїни із патогенних організмів або пухлинних клітин. Також винахід стосується способів одержання відновлених вірусних мембран, які мають здатність до злиття, і які представляють собою ліпідні двошарові мембрани, що містять природні вірусні ліпіди, амфіфільні антигени, а також амфіфільні ад'юванти, та фармацевтичних композицій, які містять такі відновлені вірусні мембрани. Традиційно вакцини проти оболонкових вірусів містять мертві або живі ослаблені віруси або представляють собою препарати на основі їх складників (наприклад, препарати на основі зруйнованого (розщепленого) вірусу або субодиничні вакцини). При вакцинації такі препарати зазвичай призначаються у вигляді ін'єкцій. Після ін'єкції віруси або протеїни, які містяться у таких вакцинах, захоплюються антиген-презентуючими клітинами імунної системи, такими як деревовидні клітини або макрофаги, після чого антигенні частини вакцин вступають у контакт з клітинами-ефекторами імунної системи. Призначення у вигляді ін'єкцій є ефективним завдяки тому, що антигенпрезентуючі клітини найбільш чисельні саме під шкірою. Проте, на сьогодні відомо, що подібні клі тини також присутні у слизовій оболонці, яка, наприклад, покриває ніс [Ogra et al. 2001]. Для того, щоб стимулювати присутні у слизовій оболонці фагоцити до викликання імунної відповіді, потрібне значно сильніше стимулювання, ніж щодо фагоцитів, які присутні під шкірою [Janeway et al. 2001]. Тоді як ін'єкційне призначення деяких вірусів або протеїнів, що містяться у вакцинах, наприклад вірусу грипу або кіру, викликає імунну відповідь, достатньо сильну для захисту від майбутнього зараження цим самим вірусом, цього не можна сказати про багато інших вірусів, наприклад про респіраторно-синцитіальний вірус (РСВ). Здійснювався ряд спроб посилити імунну відповідь з допомогою фізичних або хімічних засобів. Найважливіші принципи, які проявилися у ході таких експериментів - це: (1) для фізичного стимулювання необхідно об'єднувати множину копій вірусних протеїнів у частинках. Такі частинки можуть складатися з цілих вірусів, відновлених вірусних мембран або протеїнів на мікрочастинкових носіях. Частинки стимулюють імунну систему краще, ніж окремі субодиниці [Ogra et al. 2001; Janeway et al. 2001]. (2) 3 іншого боку, хімічне стимулювання вимагає, щоб фагоцити або клітини-ефектори імунної системи отримували певні сигнали через ре 5 87269 6 цептори, присутні на поверхні антигенбування показали, що додавання такого токсину презентуючих клітин, наприклад завдяки викорисбуло абсолютно необхідним для індукування титтанню ад'ювантів, хімічних сполук, які розпізнарів сироваткових антитіл, еквівалентних вакцині, ються цими рецепторами. призначеній ін'єкційним шляхом [Gluck et al. 1994]. При достатньому додатковому фізикоХоча додавання токсину таким чином посилювало хімічному стимулюванні вірусні протеїни можуть імуногенність вакцини, воно також викликало сервикликати сильну імунну відповідь навіть у випадку йозний побічний ефект, відомий як параліч Белла, їх призначення у мембрани слизової оболонки, тимчасовий периферійний параліч лицьового нернаприклад при їх призначення у ніс [Ogra et al. ва. Так як ад'ювантний ефект такого токсину є на2001]. Більшість сучасних методів і композицій для слідком розпізнавання антиген-презентуючими стимулювання імунної відповіді у такий спосіб, чи клітинами, у цьому випадку не можна бути впевнето хімічними, чи то фізичними засобами або їх ним у тому, що цей токсин і вірусний протеїн встукомбінацією, мають суттєві недоліки, на які буде патимуть у взаємодію з тією ж самою клітиною, а вказано далі. отже, потрібна буде доволі висока концентрація Окремий вид вакцинних композицій, який був токсину для забезпечення активації кожної клітирозроблений у цій галузі, відомий як «віросоми». ни, що підвищує шанси розпізнавання антигенів Вони представляють собою подвійні ліпідні шари, активованою клітиною. Відповідно, цей вид вірощо містять вірусні глікопротеїни. Віросоми можуть сомного препарату з доданими до нього ліпідами містити відновлені вірусні мембрани, які, як правимає цілий ряд недоліків. ло, отримуються екстракцією мембранних протеїВіросоми також одержували з очищених антинів і ліпідів з оболонкових вірусів з допомогою дегенів грипу, які змішували з похідними мурамілдитергента з наступним додаванням ліпідів і пептиду [ЕР 0205098 і ЕР 0487909]. У цьому випавидаленням такого детергента із екстрагованих дку похідна мурамілдипептиду утворює мембрану. вірусних мембранних протеїнів та ліпідів, завдяки Хоча мурамілдипептид є ад'ювантом, і композиція чому отримують характерні подвійні шари ліпідів, з справді посилювала імунну відповідь на антигени яких проступають протеїни [Stegmann et al. 1987]. грипу, мурамілдипептиди є пірогенними [Kotani та Віросоми також можуть містити мембрани, отриін. , 1976; Dinarello та ін. ,1978], швидко виводяться мані з очищених вірусних протеїнів і синтезованих з організму після ін'єкційного призначення і є місабо природних ліпідів, або інших сполук, які утвоцево токсичними, що викликає гранульоми і запарюють подвійні шари. Характерною ознакою віролення [Ribi та ін., 1979; Kohashi et al., 1980]. Більсом є те, що вони безпосередньо відтворюють ше того, вони мають короткий строк зберігання при склад, структуру поверхні і функціональну активнейтральному рН [Powell та ін., 1988], а оптимальність природної вірусної оболонки. Особливо важний рівень рН для підтримання їх структурної ціліливою характеристикою таких віросом є збересності є надто низьким для того, щоб вони могли ження здатності до зв'язування з рецепторами і включатися до складу вакцини разом із злитими злиття мембран, яка властива природній вірусній протеїнами вірусів, які проникають у клітини шляоболонці, що дозволяє віросомам проникати у ті ж хом рецептор-опосередкованого ендоцитозу, такі самі клітини, в які може проникати вірус та бути як гемагглютинін вірусу грипу. Більше того, такі представленими імунній системі тими ж самими синтетичні мембрани не є достатньо хорошою клітинами. Збереження здатності зв'язування з імітацією природної вірусної мембрани, а отже рецепторами та до злиття мембран є суттєвим для імунна відповідь на них буде відрізнятися від відекспресування повного спектру імуногенних власповіді, яка викликається вірусом. тивостей таких віросом [Arkema 2000; Bungener В якості альтернативи дослідники у цій галузі 2002]. також генерували комплексні антигени, відмінні від Щодо деяких вірусних антигенів віросоми вивідновлених вірусних мембран, такі як «Імуностикликають захисні імунні відповіді, які можуть бути мулюючі Комплекси» [ISCOMs, Morein та ін. 1984], сильними, навіть якщо вакцина, наприклад, приякі містять вірусні протеїни, що входять у комплекзначається інтраназально [як описано в міжнародси з ад'ювантами, такими як сапоніни, подібні до них заявках WO 88/08718 і WO 92/19267]. Проте, Quil АÒ [ЕР 0231039В1; ЕР 0109942А1; інші віросомні композиції демонструють лише часЕР0180564А1], більшість з яких виділяється із кори тково покращену імуногенність порівняно з препаQuillaia sopanaria Molina. У суміші з антигеном і ратами на основі мертвих вірусів або субодиниць ліпідами, такими як холестерин, ці ад'юванти утво[як описано у Glück та ін. 1994]. У цьому прикладі рюють кліткоподібні структури розміром 30-40нм, віросоми генерували через протокол, який вклюутворюючи антигенну частинку, при цьому водночає додавання екзогенних ліпідів, що, як ми вичас діючи як ад'ювант. Хоча імуностимулюючі комявили, зумовлює отримання композиції віросом та плекси (ISCOMs) застосовувались у ряді ветериструктуру поверхні, відмінну від властивих для нарних вакцин і посилюють імуногенність вірусних природної вірусної оболонки. Фахівцю у цій галузі мембранних протеїнів, розробці таких вакцин для відомо, що така відмінна структура поверхні може людей перешкоджали побоювання щодо їх токсипозначитися на властивостях злиття мембран у чності і складності суміші [Сох та ін. 1998]. одержаних віросом, а отже на їх імуногенності. У недалекому минулому були розроблені проДля посилення імунної відповіді, яка б дозвотеосомні вакцини грипу [заявка на патент США ляла інтраназальне призначення такої вакцини, 20010053368], які містять нековалентні комплекси ад'ювантний протеїн із Escherichia coli (термолабіочищених протеїнів зовнішніх мембран бактерій, льний токсин) змішували з ліпід-вмісною віросомтаких як менінгококи, у суміші з антигенними проною вакциною грипу [ЕР 0538437]. Клінічні випротеїнами, такими як гемагглютинін грипу або глікоп 7 87269 8 ротеїн оболонки вірусу імунодефіциту людини. за умов, які забезпечують реформування мембраТоді як такі множинні протеїни бактерій можуть ни. виступати в ролі ад'ювантів, комплексна природа Крім того, винахід стосується фармацевтичної таких сумішей, що містять множинні протеїни, підкомпозиції, яка містить відновлені вірусні мембранімає питання про регулятивні механізми. Більше ни згідно з винаходом, фармацевтично прийняттого, імунна відповідь направлена проти всіх проний носій, а також застосування таких відновлених теїнів та інших антигенів, присутніх у розчині, і вірусних мембран або фармацевтичної композиції менш специфічно проти вірусних протеїнів. згідно з винаходом у лікуванні або профілактиці Інша частинкова композиція, розроблена захворювань з використанням інтраназальних, Biovector Therapeutics, містить всередині вуглевопероральних або парентеральних способів достадневе ядро, оточене ліпідною оболонкою, що місвки. тить антигени. При використанні гемагглютиніну Відповідно до першого аспекту цей винахід грипу в якості антигену помічалось певне посиленстосується відновленої вірусної мембрани. Відноня імунної відповіді, але недостатнє для того, щоб влена вірусна мембрана переважно містить: (а) гарантувати подальший її розвиток. подвійний ліпідний шар; (b) злитий протеїн вірусу; Були розроблені інтраназальні вакцини на ос(с) амфіфільний ад'ювант і (d) необов'язково доданові живих ослаблених видів респіраторних вірутковий антиген. У відновленій вірусній мембрані сів, таких як пристосований до холоду штам вірусу переважно ліпідний подвійний шар має ліпідну грипу, з мінімальною реплікацією в дихальних композицію, яка сумісна із злиттям вірусної мемшляхах. Ці вакцини мають виразну перевагу у тобрани з клітиною-хазяїном природного хазяїна му, що вони викликають імунні відповіді, наближені вірусу, яке індукується злитим протеїном. Перевадо природного імунітету, який індукується вірусами жно ліпідна композиція сумісна із злиттям при опдикого типу. У випадку з вірусом грипу такі вакцини тимальному значенні рН злиття. Переважно злибули відомі з 1980-х, а зараз вони наближаються тий білок, амфіфільний ад'ювант і також до їх комерційного впровадження. Затримки були переважно необов'язковий додатковий антиген зумовлені притаманною багатьом вірусам здатнісвзаємодіють з гідрофобною внутрішньою частитю швидко мутувати, внаслідок чого ослаблені ною подвійного ліпідного шару, а саме зв'язуються віруси частково або повністю повертаються до з, інтегруються в і/або включаються в подвійний дикого типу, відтак в дійсності викликаючи захвошар вірусної мембрани через гідрофобну взаєморювання, якому мала запобігти вакцина. дію з ліпідами у подвійному шарі і/або одного з Із вищезазначених причин у цій галузі добре одним. Також переважно злитий білок і амфіфільвідомо, що, незважаючи на те, що були розроблені ний ад'ювант не є ковалентно зв'язаними. Перетакі композиції як імуностимулюючі комплекси і важно амфіфільний ад'ювант і додатковий антиген протеосоми, зокрема для індукування імунних відтакож не є ковалентно зв'язаними. Вірусні мемповідей на патогенні організми, які самі по собі не брани згідно з винаходом переважно є функціонавикликають сильну імунну відповідь, а також для льно відновленими вірусними мембранами, які інтраназального призначення та призначення в містять ліпіди, переважно природні вірусні ліпіди, інші слизові оболонки, все ще існує гостра потреба амфіфільний ад'ювант, вірусний злитий білок і у вакцинних композиціях з позитивними характеодин або більше антигенів, де амфіфільний ад'юристиками, які б індукували сильну імунну відповант, вірусні злиті протеїни ліпідів і антигени взаєвідь, не містили б живих вірусів і мали низьку токмодіють головним чином через механізм гідрофосичність. бної взаємодії, при якому гідрофобна частина Цей винахід стосується нових засобів і спосоамфіфільного ад'юванта переважно утворює небів вирішення ряду проблем і труднощів, які були від'ємну частину ліпідної двошарової мембрани, згадані вище. Винахід стосується відновленої вірупри цьому такий подвійний гар додатково містить сної мембрани, яка містить амфіфільний ад'ювант злитий протеїн, антиген(и) і ліпіди. Під функціонаі антиген, де такий ад'ювант і антиген взаємодіють льним відновленням мається на увазі, що відновчерез механізм гідрофобної взаємодії, обидва лена мембрана має здатність до злиття мембран. присутні разом з мембраною з подвійним ліпідним Переважна відновлена вірусна мембрана має фошаром з відновлених вірусних мембран, і в якій рму везикули. відновлена вірусна мембрана має здатність до Під злитим протеїном мається на увазі цілісзлиття, яка перевищує цю здатність у віросом, ний мембранний протеїн вірусу, як правило, обоодержаних відповідно до ЕР 0538437. Відновлені лонкового вірусу, який при його експресуванні на вірусні мембрани доволі близько імітують компоповерхні придатної клітини ссавця або птаха може зицію, поверхневу структуру і функціональні власвикликати злиття клітини при відповідному рН з тивості вірусної оболонки, з якої отримують відноклітинами, які є природним хазяїном для вірусу влену вірусну мембрану. Винахід також стосується [див., наприклад, Hernandez та ін., 1996]. Прикласпособу одержання таких відновлених вірусних ди вірусних злитих протеїнів для включення у відмембран, який включає деякі або всі із нижчевкановлені вірусні мембрани включають протеїн вірузаних стадій: і) розчинення вірусу у придатному су лісу Семліки Е1, гемагглютинін (НА) вірусу детергенті; іі) видалення вірусного генетичного грипу, протеїни ВІЛ gp120/gp41, F-протеїни параматеріалу і капсидних протеїнів; ііі) введення у міксовірусів. Можна виділити два типи злиття, інвзаємодію однієї або більше амфіфільних молекул дукованого вірусним злитими протеїнами. Перший з ад'ювантною активністю і антигеном у розчині, тип злиття, такий як, наприклад, індукований прощо містить детергент; і iv) видалення детергента теїнами ВІЛ gp120/gp41, має місце при нейтральному рН на поверхні клітин-хазяїв, які виступають 9 87269 10 мішенями. Другий тип злиття, такий як, наприклад, Ад'юванти включають будь-яку речовину або індукований гемагглютиніном (НА) вірусу грипу, сполуку, яка при її використанні у поєднанні з анмає місце під час інтерналізації при нижчому знатигеном для імунізації людини або тварини стимученні рН (5.0-6.5) зсередини ендосомного відділює імунну систему, таким чином викликаючи, полення клітини-хазяїна. Обидва типи злиття вклюсилюючи або сприяючи імунній відповіді на чені у цей винахід. антиген, переважно не генеруючи специфічної Здатність відновлених вірусних мембран згідімунної відповіді на сам ад'ювант. Переважні ад'юно з винаходом зливатися з клітинами-хазяїнами, ванти посилюють імунну відповідь на певний антитаким чином, залежить від присутності відповідноген принаймні на фактор 1.5, 2, 2.5, 5, 10 або 20, го вірусного злитого протеїну. Проте, ця здатність порівняно з імунною відповіддю на антиген, яка також залежить від ліпідної композиції подвійного генерується при тих самих умовах, але за відсутшару відновленої вірусної мембрани, так як опиності ад'юванта. Тести на визначення статистичносані раніше віросоми, які складаються з синтетичго середнього значення посилення імунної відпоних ліпідів і вірусних злитих протеїнів не мають віді на певний антиген, яка викликається здатності до злиття. Ліпідна композиція відновлеад'ювантом у групі тварин або людей, порівняно з них вірусних мембран, таким чином, переважно відповідною контрольною групою, відомі з рівня вибирається таким чином, щоб мембрани мали техніки. Переважно ад'ювант має здатність посиздатність до злиття з відповідним клітинамилювати імунну відповідь принаймні на два різні хазяїнами при відповідному рівні рН. Здатність антигени. Ад'ювантом згідно з винаходом перевавідновлених вірусних мембран до злиття може жно є сполука, яка є чужерідною для ссавця, що бути проаналізована з допомогою аналізу злиття виключає імуностимулюючі сполуки, які є ендогенпорожніх стром еритроцитів як описано у Прикладі ним для ссавців, такі як, наприклад, інтерлейкіни, 3. У випадку відновлених вірусних мембран, які інтерферони та інші гормони. Ад'ювантами, які містять гемагглютинін грипу, переважна активність переважно включаються у функціонально відновзлиття у цьому аналізі індукує злиття принаймні лені вірусні мембрани згідно з винаходом, перева30% везикул відновлених вірусних мембран з пожно є амфіфільні ад'юванти. рожніми стромами еритроцитів через 1 хвилину, у Термін "амфіфільний ад'ювант" включає будьвипадку, якщо 1мкмоль віросом змішують з який ад'ювант, включно зі сполуками, такими як 50мкмоль мембранних фосфоліпідів еритроцитних ліпопептиди і гліколіпіди, які мають включену гідпри рН, яке є оптимальним для згаданого гемаггрофобну мембрану і орієнтовані на середовище лютиніну. полярні (кінцеві групи) частини, і які, переважно Переважна активність злиття для інших відносамі по собі, можуть зв'язуватися з або, більш певлених мембран, яка не може бути перевірена з реважно, інтегруватися у везикули подвійного ліпідопомогою цього аналізу, є злиттям під час додадного шару або міцели у воді. Цей термін також вання відновлених вірусних мембран до клітин, включає будь-який амфіфільний ад'ювант, стабіздатних інфікуватися вірусом, з якого отримуються льно включений у ліпідний подвійний шар (який їх злиті протеїни. Відновлені мембрани мають злискладається з природних вірусних ліпідів) з його ватися принаймні з 10% клітин, з якими б зв'язувагідрофобною частиною, що контактує із внутрівся вірус, з якого отримують їх злиті протеїни. шньою гідрофобною ділянкою двошарової мемОднією з переважних ліпідних композицій, яка брани, і з його полярною частиною кінцевої групи, забезпечує відновлені вірусні мембрани, о мають орієнтованою на зовнішню полярну поверхню здатність до злиття, є ліпідна композиція, яка місмембрани. Проте, інші гідрофобні ад'юванти, які тить природні вірусні ліпіди. Термін "природні вірумають менш виражену амфіфільність, тобто зосні ліпіди" у контексті цього винаходу означає ліпівсім не мають або мають лише слабко полярні ди, які присутні у мембрані вірусу, який виріс на частини кінцевих груп, але можуть зв'язуватися клітині, переважно клітині ссавця, або розвинувся або інтегруватися у везикули подвійного ліпідного на яйці з ембріоном. Таким чином, природні ліпіди шару, не виключаються з об'єму цього винаходу. переважно отримують або виділяють з вірусних Термін "амфіфільні ад'юванти" з ад'ювантною акчастинок вирощених таким чином, на відміну від тивністю в контексті цього винаходу, відповідно, синтетичних ліпідів. Проте, функціонально відноввключає природні або (частково) синтетичні ад'юлені вірусні мембрани згідно з винаходом можуть ванти, здатні утворювати відновлені вірусні меммістити очищені ліпіди з інших поверхонь, наприбрани разом з одним або більшою кількістю антиклад синтетичні ліпіди, окрім природних ліпідів. генів і природних вірусних ліпідів у водному Таким чином, ліпідною композицією для одержансередовищі за умов, які забезпечують утворення ня відновлених вірусних мембран із здатністю до відновленої вірусної мембрани. злиття переважно є композиція, яку отримують або Відповідно до переважного варіанту амфіфіяка може бути отримана із природних вірусних льний ад'ювант, присутній у відновленій вірусній мембран. Ліпідні композиції для використання у мембрані, є фармацевтично прийнятним для зацьому винаході, відповідно, включають композиції, стосування у людей, на відміну від, наприклад, які складаються винятково з природних вірусних Quil АÔ або інших сапонінів, які є амфіфільним ліпідів, композиції, які складаються з природних речовинами з ад'ювантними властивостями, які вірусних ліпідів, доповнені ліпідами, отриманими з випробовувались за певних умов, відомих з рівня інших джерел, а також композиції, які складаються техніки. Амфіфільні ад'юванти згідно з винаходом з ліпідів з різних джерел, які імітують ліпідну компереважно не є ковалентно зв'язаними з антигепозицію природної вірусної мембрани. нами, а присутні разом з подвійними ліпідними шарами відновлених мембран. Той факт, що анти 11 87269 12 ген і ад'ювант не є ковалентно зв'язаними, забезсерпнів і/або цистеїнів. Особливо переважні ліпопечує те, що обробка антигену і представлення пептиди перелічені у Таблиці. його епітопів імунній системі по суті ідентична цим Відповідно до іншого варіанту винаходу таким процесам у природному протеїні, взятому окремо, амфіфіфльним ад'ювантом є гліколіпід. Переважщо забезпечує задовільне розпізнавання протеїну, ний гліколіпід для використання в якості амфіфіприсутнього на поверхні природного патогену. З льного ад'юванта має ад'ювантну активність і є іншого боку, гідрофобна взаємодія антигену і фармацевтично прийнятним для використання на ад'юванта з подвійним ліпідним шаром (та один з людях. Гліколіпіди - це ліпіди (або інші гідрофобні одним) забезпечує розподіл ад'юванта і антигену сполуки), ковалентно сполучені з одним або більпо поверхні відновлених вірусних мембран у више сахарозами. Відповідно до одного з найбільш гляді композиції, в якій більшість мембранних вепереважних варіантів винаходу винахід стосується зикул містить як антиген, так і ад'ювант в межах відновлених вірусних мембран згідно з винаходом, одної везикули, більш переважно принаймні 60, в яких гліколіпідом є a-галактозилкерамід або фо70, 80, 90, 95 або 95% везикул містять як антиген, сфатидилінозитолманнозид. Терміни "aтак і ад'ювант. Комбінація антигену і ад'юванта в галактозилкерамід" і "фосфатидилінозитолманноодній мембрані або везикулі забезпечує доставку зид" включають будь-які похідні цих сполук. Похідантигену до антиген-презентуючих клітин, які актині цих молекул, які мають ад'ювантну активність, ι вуються ад'ювантом, завдяки чому посилюється які є корисними в контексті цього винаходу, описатерапевтичний і/або профілактичний ефект, що ні, наприклад, в патентах США 5,936,076 і 4,542, забезпечується відновленими вірусними мембра212. Інші придатні гліколіпідні ад'юванти для занами. стосування в цьому винаході включають, наприВідповідно до переважного варіанту винаходу клад, модифіковані форми ендотоксичних ліпопотакий амфіфільний ад'ювант розпізнається Tollлісахаридів (ЛПС) від грам-негативних бактерій, подібним рецептором (Toll-like-receptor (TLR)), які мають знижену токсичність частини Ліпіду А присутнім на антиген-презентуючих клітинах. Різні ЛПС, але зберігають (частково) ад'ювантну активсполуки, які розпізнаються TLR відомі з рівня техність, і які можуть бути отримані з генетично моніки і включають, наприклад, ліпопептиди, ліпоподифікованих грам-негативних патогенів та як опилісахариди, пептидоглікани, ліоптеіхойні кислоти, сано в міжнародній заявці W002/09746. ліпопротеїни (з мікоплазми, мікобактерій або спіМодифікований ЛПС для застосування в якості рохет), двохланцюгову РНК (полі І:С), неметильоамфіфільного ад'юванта згідно з винаходом перевану ДНК, ліпоарабіноманнан, флагелін, CpGважно має модифіковану частину Ліпіду А із знивмісну ДНК і імідазохіноліни. Не всі розпізнавані женою токсичністю. Токсичність модифікованого TLR-рецептором сполуки придатні в якості ад'юваЛПС переважно нижча, ніж токсичність відповіднонтів, так як, наприклад, токсичність грамго ЛПС дикого типу, більш переважно токсичність негативних бактеріальних ліпополісахаридів дикомодифікованого ЛПС менша, ніж 90, 80, 60, 40, 20, го типу є надто високою для того, щоб їх можна 10, 5, 2, 1, 0.5 або 0.2% токсичності ЛПС дикого було використовувати в якості ад'ювантів, а саме типу. Токсичності ЛПС дикого типу і його модифівони не є фармацевтично прийнятними для застокованих форм із зниженою токсичністю можуть сування на людях. Інші розпізнавані TLRвизначатися з допомогою будь-якого придатного рецептором сполуки, проте, можуть застосовувааналізу, відомого у цій галузі. Переважним аналітись як ад'юванти. Такі розпізнавані TLRзом для визначення токсичності, а саме біологічної рецептором ад'юванти можуть бути амфіфільними активності модифікованих ЛПС є тест WEHI на ад'ювантами самі по собі або, як альтернатива, індукування фактора некрозу пухлини (TNFвони можуть бути модифіковані в амфіфільні альфа) макрофаговій клітинній лінії ММ6 [Espevik ад'юванти, наприклад, сполученням гідрофобних and Niessen, 1986, J. Immunol. Methods 95: 99-105; сполук (див. далі) з полярним TLR-лігандом. Як Ziegler-Heitbrock et al., 1988, Int. J. Cancer 41: 456альтернатива, амфіфільні ад'юванти можуть бути 461]. З іншого боку, модифікований ЛПС із зниженацілені на інші рецептори. Переважним амфіфіною токсичністю все ще повинен мати достатню льним ад'ювантом є ліпопептид, який може отриімуностимулюючу активність, а саме ад'ювантну муватися синтетичним або напівсинтетичним шляактивність. Модифікований ЛПС із зниженою токхом. Переважний ліпопептид для застосування в сичністю переважно має принаймні 10, 20, 40, 80, якості амфіфільного ад'юванта має ад'ювантні 90 або 100% імуностимулюючої активності відповластивості і є фармацевтично прийнятним для відного ЛПС дикого типу. Імуностимулююча активзастосування на людях. Ліпопептид згідно з винаність може визначатися in vivo у лабораторних ходом представляє собою молекулу, яка зазвичай тварин як описано вище або як описано у наведескладається з одного або більше (оліго)пептидів, них далі прикладах, або in vitro, наприклад, шляякі ковалентно сполучені з однією або більше гідхом визначення дозрівання деревовидних клітин, рофобною сполукою, вибраною з жирних кислот, які стимулюються інкубуванням з тестованим ЛПС ліпідів, керамідів, плазмалогенів, алкільних або визначенням продукування принаймні одного циалкенових ланцюгів або стеролів. Як правило, літокіну (наприклад, одного з IL12, ІL10, ТМР-альфа, попептиди для застосування згідно з цим винахоIL6 і IL-1-бета) ЛПС-стимульованими деревовиддом переважно містять 3, 4, 5, 6, 7 або 8 амінокисними клітинами, або шляхом визначення експресії лот, переважно такі пептиди містять 40-70% принаймні однієї костимулюючої молекули (наприамінокислот, які мають позитивний заряд, серед клад, CD40 або CD86) на ЛПС-стимульованих деяких перевага надається лізину і аргініну, і переревовидних клітинах. важно такі пептиди включають один або більше 13 87269 14 Відповідно до ще одного аспекту цього винавірусній або клітинній мембрані, але можуть преходу амфіфільний ад'ювант, присутній у віросомі зентувати епітопи, які за звичайних умов частково згідно з винаходом, є пептидом, переважно амфіабо принаймні тимчасово приховані у подвійному фільним пептидом. Переважний пептид для застоліпідному шарі мембрани. Стимулювання імунної сування в якості амфіфільного ад'юванта має системи такими антиген-презентуючими відновлеад'ювантну активність і є фармацевтично прийняними вірусними мембранами може бути наслідком тним для застосування на людях. Пептиди, зокрепоєднання їх специфічного розпізнавання клітинама полярні пептиди з ад'ювантною активністю, ми імунної системи, їх особливих характеристик, можуть бути перетворені у амфіфільні ад'юванти презентування протеїну та розкриття прихованих їх (ковалентним) зв'язуванням із придатною гідроепітопів. Переважно антигенні протеїни, які викофобною сполукою (див. вище). Альтернативно ристовуються у відновлених вірусних мембранах амфіфільні пептиди можуть включати гідрофобний згідно з винаходом, містять один або більше епіряд амінокислот, такий як трансмембранна послітопи, здатні викликати імунну відповідь у ссавця, довність, описана далі. Переважний пептид вклющо забезпечує захист від зараження патогеном, з чає послідовність із ліганда Jagged-1 Notchякого отриманий антиген, або який забезпечує рецептора [див. Weijzen et al., 2002; Genbank захист від пухлини, яка експресує такий антиген. accession no. AAC 52020] або послідовність із проВідповідно до переважних варіантів винаходу теїну A Staphylococcus aureus. Пептиди, які містять такі антигени отримують з вірусу, паразита, гриба послідовності ліганда Jagged-1 або протеїну А або бактерії. Особливо переважними є відновлені переважно ковалентно сполучені із придатною вірусні мембрани, в який такий антиген отриманий гідрофобною сполукою (див. вище) і/або містять з вірусу грипу. Протеїни з вірусу грипу, які можуть трансмембранну послідовність (див. нижче). (Повикористовуватись у відновлених вірусних мемлярна) частина пептидів, похідних із ліганда бранах згідно з винаходом, переважно є гемагглюJagged-1 або протеїну А, яка виступає за межі потиніном (НА), нейрамінідазою (NA) і/або протеїном двійного ліпідного шару, переважно складається М2, окремо або у комбінації. не більше, ніж з 3, 4, 5, 6, 7 або 8 амінокислот. Антигени, які можуть застосовуватись в утвоВідновлені вірусні мембрани згідно з винахоренні відновлених вірусних мембран згідно з винадом переважно придатні як для парентерального ходом, можуть бути отримані з усіх різновидів віпризначення, так і для призначення у слизову русів. Необмежуючий перелік прикладів таких оболонку (наприклад, інтраназально або пероравірусів включає: ретровіруси, такі як вірус імунольно). Проте, важливим аспектом цього винаходу дефіциту людини (ВІЛ); краснуха; параміксовіруси, є те, що відновлені вірусні мембрани згідно з витакі як віруси парагрипу, кір, інфекційний паротит, находом можуть застосовуватись для інтраназареспіраторний синцитіальний вірус, людський мельної доставки антигенів, які за звичайних обстатапневмовірус; віруси сімейства flaviviridae, такі як вин не викликали б достатню імунну відповідь при вірус жовтої лихоманки, вірус денге, вірус гепатиту інтраназальній доставці пацієнту, яка б забезпеС (HCV), вірус японського енцефаліту (JEV), вірус чила захист від наступного зараження патогенникліщового енцефаліту, вірус енцефаліту Сентми організмами, які містять такий антиген. Луїса або Західного Нілу; віруси герпеса, такі як Відновлені вірусні мембрани згідно з винаховірус простого герпеса, цитомегаловірус, вірус дом містять вірусний злитий протеїн і необов'язкоЕпштейна-Барра; сімейство буньявірусів во додатковий антиген. Таким чином, слід мати на (Bunyaviridae); Arenaviridae; Hantaviridae, такі як увазі, що відновлені вірусні мембрани, які містять вірус Хантаан; коронавіруси (Coronaviridae); паполише вірусний злитий протеїн і не містить додатвавіруси (Papovaviridae), такі як вірус людської кових антигенів, становлять частину цього винахопапіломи; рабдовіруси (Rhabdoviridae), такі як віду. У цьому випадку вірусний злитий протеїн також рус сказу. Коронавіруси, такі як людський коронавиконує функцію антигена на доповнення до своєї вірус; Alphaviridae, Arteriviridae, filoviridae, такі як функції вірусного злитого протеїну. Ebolavirus, Arenaviridae, poxviridae, такий як вірус Антигени, які є частиною відновленої вірусної натуральної віспи, і вірус африканської чуми свимембрани згідно з винаходом переважно мають ней. Подібним чином такі антигени можуть бути гідрофобну частину, здатну включатися у мембрапохідними від патогенних бактерій, грибів (включну подвійного ліпідного шару у везикулі відновлено з дріжджами), або паразитів. Такі антигени ної вірусної мембрани. Ряд патогенних одиниць, включають бактеріальні антигени від бактерій сітаких як віруси, бактерії, дріжджі і паразити перемейства Helicobacter, таких як Н. pylori, Neisseria, носять у свої капсиді, клітинній стінці або мембрані таких як N. mengitidis, Haemophilus, таких як Н. протеїни, які викликають імунну відповідь у клітиніinfluenza, Bordetella, таких як В. pertussis, хазяїні. Приклади антигенів, які мають гідрофобні Chlamydia, Streptococcus, таких як Streptococcus елементи, такі як, наприклад, трансмембранні сеsp. серотип A, Vibrio, таких як V cholera, грамгменти, і які здатні бути частиною відновленої вінегативні ентеропатогени, включно з, наприклад, русної мембрани згідно з винаходом, включають Salmonella, Shigella, Campylobacter і Escherichia, а протеїни, присутні в мембрані (які у випадку вірусів також антигени з бактерій, які збуджують сибірську також називаються оболонкою) патогена. Відповівиразку, проказу, туберкульоз, дифтерію, хворобу дно, переважно антиген, присутній у відновленій Ліма, сифіліс, тифоїдну гарячку і гонорею. Антигевірусній мембрані згідно з винаходом, є внутрішнім ни від паразитів, наприклад, включають антигени, мембранним протеїном. Антигенні протеїни у відотримані з найпростіших, таких як Babeosis bovis, новлених вірусних мембранах згідно з винаходом Plasmodium, Leishmania spp. Toxoplasma gondii, і орієнтовані у тому ж самому напрямку, що й на Trypanosoma, таких як Т. cruzi. Антигені, похідні від 15 87269 16 грибів, можуть включати антигени від таких грибів, шар, в якому амфіфільний ад'ювант і вірусний як Aspergillus sp., Candida albicans, Cryptococcus, злитий протеїн взаємодіють з гідрофобною внуттаких як, наприклад, C.neoformans і Histoplasma рішньою зоною подвійного ліпідного шару, при capsulatum. цьому амфіфільний ад'ювант і вірусний злитий Хоча вакцини традиційно застосовуються для протеїн переважно не є ковалентно зв'язаними, профілактичного захисту від патогенних організмів також при цьому переважно амфіфільний ад'ювант або для лікування захворювань, що є наслідком і необов'язковий додатковий антиген не є ковалензаражень патогенами, фахівцю у цій галузі відомо тно зв'язаними, і при цьому відновлена вірусна про можливість застосування вакцин для лікуванмембрана має здатність до злиття; (с) необов'язня пухлин. Більше того, все більше число пухлинокове очищення відновленої вірусної мембрани; і специфічних протеїнів виявляють належні власти(d) необов'язкове включення відновленої вірусної вості мішеней для людських або олюднених антимембрани до складу фармацевтичної композиції. З тіл. Такі пухлино-специфічні протеїни також станометою включення вірусних ліпідів цей спосіб може влять частину об'єму правової охорони винаходу. додатково включати: і) розчинення вірусу у придаРяд пухлино-специфічних антигенів відомі з рівня тному детергентів, такому як октаетиленгліколь техніки. Відповідно, згідно з одним із переважних моно-N-додециловий ефір іі) видалення вірусного варіантів винаходу останній стосується відновлегенетичного матеріалу і капсидних протеїнів, наних вірусних мембран, які містять пухлиноприклад диференціальним ультрацентрифугуванспецифічний антиген. Придатним пухлиноням. Концентрацію детергента переважно зменспецифічними антигенами є карциноембріонний шують за рахунок діалізу, діафільтрування або антиген, простата-специфічний мембранний антиабсорбції на гідрофобні гранули (і/або на виклюген, простата-специфічний антиген, протеїн MZ2чення за розміром) при відповідній швидкості виE, поліморфний епітеліальний муцин (ПЕМ), фодалення детергента, що дозволяє відтворити лат-зв'язуючий протеїн LK26, усічений епідермамембрану, при цьому переважно амфіфільний льний рецептор фактора росту (EGRF), (Т) антиген ад'ювант і вірусний злитий протеїн, а також переТомсена-Фріденрайха, GM-2 і GD-2 гангліозиди, важно додатковий антиген, присутній у такій відЕр-САМ, муцин-1, епітеліальний глікопротеїн-2 і новленій вірусній мембрані, взаємодіють через специфічний антиген ободової кишки. механізм гідрофобної взаємодії із внутрішньою Переважними антигенами для таких патогенів гідрофобною ділянкою двошарової мембрани і/або є внутрішні мембранні протеїни. Проте, для застоодин з одним. Такий вірус переважно є мембрансування у цьому винаході також можуть застосовмісним вірусом, таким як більшість оболонкових вуватись модифіковані антигени немембранних вірусів. Переважним вірусами, які використовупротеїнів або їх частини, які містять захисні епітоються як джерело природних вірусних ліпідів, є пи, які отримуються злиттям зтрансмембранною віруси грипу, вірус лісу Семлікі або параміксовірупослідовністю. Трансмембранні послідовності або си. послідовності з мембранними анкерами добре Переважно спосіб одержання відновленої вівідомі у цій галузі і засновані на генетичній геомерусної мембрани, описаної у цьому винаході, трії трансмембранних молекул ссавця. Трансмемвключає очищення такої відновленої вірусної мембранна послідовність, як правило, складається із брани. Методики очищення відновлених вірусних нитки, що містить приблизно 10-30, зазвичай примембран відомі у цій галузі і включають, наприблизно 20 амінокислот, більшість з яких має гідклад, диференційне центрифугування і центрифурофобні бічні ланцюги. Трансмембранні послідовгування в градієнті густини і/або хроматографію ності відомі своїм широким розмаїттям протеїнів, (гель-проникаюча хроматографія, іонообмінна кожен з яких є придатним до застосування. і/або хроматографію за спорідненістю). ДетергенПриклади послідовностей з мембранним анкетами є амфіфільні молекули з поверхневою активрами, які можуть використовуватись згідно з винаністю. Придатними детергентами є ті детергенти, ходом, включають, наприклад, послідовності, похіякі легко розчиняють вірусні мембранні компонендні від CD8, ІСАМ-2, IL-8R, CD4 і LFA-1. ти, але які не денатурують злитий протеїн, вірусну Переважно трансмембранну послідовність одеркапсиду і/або капсидні протеїни, наприклад цвітжують з вірусного внутрішньомембранного протеїтер-іонні детергенти, такі як октаетиленгліколь ну, який природно існує всередині вірусної меммоно-N-додециловий ефір. брани. Приклади включають трансмембранну Гідрофобні взаємодії є наслідком нековалентділянку глікопротеїну G людського респіраторного них неелектростатичних сил притягання між гідсинцитіального вірусу (РСВ) (наприклад, амінокирофобним речовинами, присутніми у водному сеслоти 38-63) або трансмембранну ділянку нейраредовищі. Відповідно до ще одного варіанту мінідази вірусу грипу (наприклад, амінокислоти 7винахід стосується фармацевтичної композиції, 27). яка в якості активного інгредієнта містить відновВідповідно до ще одного аспекту цей винахід лену вірусну мембрану згідно з винаходом і фарстосується способу одержання відновленої вірусмацевтично прийнятний носій. Також до складу ної мембрани, яка включає всі або деякі із вказафармацевтичної композиції можуть включатися них етапи: (а) змішування амфіфільного ад'юванфармацевтично прийнятні стабілізуючі агенти, та, вірусного злитого протеїну, необов'язкового осмотичні агенти, буферні агенти, диспергуючі додаткового антигену і ліпідів у розчині, який місагенти і подібні. Переважна форма залежить від тить детергент; (b) зменшення концентрації детервибраного способу призначення і терапевтичного гента за умов, які забезпечують відновлення вірузастосування. Фармацевтичним носієм може бути сної мембрани, яка містить подвійний ліпідний будь-яка сумісна нетоксична речовина, здатна 17 87269 18 доставляти відновлені вірусні мембрани в організм тиди, на якому показані природні вірусні ліпіди, які пацієнта. Приклади фармацевтично прийнятних реагують з нінгідрином, а також нінгідринносіїв для інтраназальної доставки включають реактивні ліпопептиди. Були отримані двомірні воду, буферні сольові розчини, гліцерин, полісорхроматограми: система 1 СНСІ3/метанол/Н2O бат 20, кремофор EL і водні суміші каприлу з кап65/25/4, система 2 N-бутанол/оцтова кислота/вода риловим гліцеридом, і можуть бути містити буфери 2/1/1, забарвлені завдяки дериватизації нінгідридля забезпечення нейтрального рівня рН. Приклановим забарвлювачем. Сайти, які містять зразки, ди фармацевтично прийнятних носіїв для паренпозначались як "точка". теральної доставки включають стерильний забуФігура 3: Електронна мікрофотографія відновферений 0.9% розчин NaCI або 5% розчин лених вірусних мембран, які містять ліпопептиди глюкози, необов'язково доповненої 20% альбумізгідно з цим винаходом негативно заряджений ном. Препарати для парентерального призначення маркер з використанням фосфомолібдату амонію. повинні бути стерильними. Парентеральний спосіб Мембрани мають 100-200нм в діаметрі. призначення поліпептиду або антитіла відповідає Фігура 4: ІgА титри з носа і легень після двох відомими методикам, наприклад, ін'єкції або інфуінтраназальних вакцинацій з використанням зії внутрішньовенним, інтраперитонеальним, внутA/Panama/2007/99, з інтервалом 14 днів між вакрішньом'язовим, внутрішньоартеріальним шляхом цинами; титри визначали через. З тижні після або шляхом введення всередину уражених тканин. останньої вакцинації. Пре-імунні титри віднімали. Відновлені вірусні мембрани переважно признаЗастосовували стандартну наявну на ринку субчають у вигляді болюсних ін'єкцій. Типова фармаодиничну вакцину, віросоми, одержані відповідно цевтична композиція для внутрішньом'язової ін'єкдо патенту ЕР 0538437, або відновлені вірусні ції містить, наприклад, 1-10мл забуференого мембрани, які містять ліпопептиди згідно з винафосфатом сольового розчину і від 1 до 100мкг, ходом. Дослід проводили на групі, яка включала переважно 15-45мкг (протеїну антигену) відновле10 мишей. них вірусних мембран згідно з винаходом. При Фігура 5: IgG титри крові після двох інтраназапероральному призначенні активний інгредієнт льних вакцинацій, з інтервалом 14 днів між вакциможе призначатися у вигляді рідких дозованих нами; титри визначали через 3 тижні після останформ, таких як еліксири, сиропи і суспензії. Рідкі ньої вакцинації. Пре-імунні титри віднімали. В дозовані форми для перорального призначення якості вакцин застосовували віросоми, одержані можуть містити барвник і смакову добавку для відповідно до патенту ЕР 0538437, або відновлені підвищення прийнятності для пацієнта. Методики вірусні мембрани, які містять ліпопептиди згідно з для одержання композицій для парентерального, винаходом. Чотири різні вакцинні препарати, коперорального або інтраназального призначення жен з яких містить антиген з одного штаму вірусу, добре відомі з галузі техніки і детально описані в застосовували для вакцинації 4 груп з 10 мишей. ряді джерел, включно з, наприклад [Pharmaceutical Фігура 6: Активність злиття відновлених вірусScience Ремінгстона (15-е вид., Mack Publishing, них мембран згідно з винаходом. Відновлені вірусEaston, PA, 1980) (повністю включений в цей опис ні мембрани, які містять піренфосфоліпід, змішув якості посилання)]. Відповідно до ще одного асвали з порожніми стромами еритроцитів, і злиття пекту винахід стосується способу вакцинації або визначали відповідно до цього опису. профілактики, або терапії інфекційного захворюФігура 7: IgG титри крові після разової внутрівання або пухлини призначенням суб'єкту, який шньом'язової вакцинації; титри визначали через 3 потребує такого лікування або профілактики тератижні після останньої вакцинації. Пре-імунні титри певтично або профілактично ефективної кількості віднімали. В якості вакцин застосовували віросо(фармацевтичної композиції, яка містить) відновми, одержані відповідно до патенту ЕР 0538437, лених вірусних мембран згідно з винаходом. Винаабо відновлені вірусні мембрани, які містять ліпохід також стосується відновлених вірусних мемпептиди згідно з винаходом. Дослід проводили на бран для застосування в якості лікарського засобу, групі, яка включала 10 мишей. переважно лікарського засобу для вакцинації або Фігура 8: Аналіз градієнта цукрози при густині профілактики чи терапії інфекційних захворювань рівноваги у відновлених вірусних мембранах із або пухлин. Винахід також стосується застосуванштаму вірусу A/Wyoming, який показує один пік ня відновлених вірусних мембран для одержання густини у відновленому матеріалі; ліпопептиди лікарського засобу для вакцинації або профілактивідновлювали із фракцій 4, 5 і 6. ки чи лікування інфекційних захворювань або пухФігура 9: IgG титри крові після інтраназальної лин. вакцинації на 0 і 14-й день у групі з 10 мишей. АнФігура 1: Схематичне зображення градієнту тиген отримували із штаму вірусу цукрози, який використовували для аналізу фізичA/Panama/2007/99, мембрани містили Nного зв'язку між ліпопептидами, протеїном і ліпіпальмітоїл-S-2,3(біспальмітоїлокси)-пропілдами ад'ювант-вмісних відновлених вірусних мемцистеїніл-серил-(проліл)3-пролін. бран. Фігура 10: ІgА титри з носа і легенів у групі з 10 Фігура 2: Двомірна тонкошарова хроматограма мишей після двох інтраназальних вакцинацій відліпідів і ліпопетидів, відновлених з інтерфейсу цуновленими мембранами штаму A/Panama/2007/99, крози 10/40% на градієнтах як показано на Фігурі 1. які містять ліпопептид N-пальмітоїл-SБлок А: контрольний зразок, відновлені вірусні 2,3(біспальмітоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серилмембрани без ліпопептиду, на якому показані нін(проліл)3-пролін. з інтервалом у 14 днів; титри вигідрин-реактивні природні вірусні ліпіди. Блок В: значали через 3 тижні після останньої вакцинації. відновлені вірусні мембрани, які містять ліпопепПре-імунні титри віднімали. 19 87269 20 Приклади було виявлено 6% ліпопептиду. 85% вірусного Приклад 1: Відновлення відновленої вірусної ліпіду, 94% ліпопептиду і 60% протеїну вірусної мембрани, яка містить ліпопептид N-пальмітоїл-Sмембрани, якими навантажений такий градієнт, як 2,3(біспальмітоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серилвиявилось, були зв'язані з тонким шаром віднов(лізил)3-лізин, природні ліпіди вірусу грипу і протеленої вірусної мембрани. їни мембрани вірусу грипу. Для аналізу ліпідної композиції такого тонкого Вірус грипу отримували вирощуванням вірусу, шару відновлювали два зразки відновлених вірусотриманого у Всесвітньому центрі грипу або Амених мембран, одержаних відповідно до вищеопириканській колекції культур типових тканин саного протоколу або за відсутності доданого лі(АТСС), з використанням методик, відомих фахівпопептиду, із суміші 40/10% проміжного шару цям у цій галузі техніки, наприклад вирощуванням градієнту цукрози як описано вище, і екстрагували вірусу на яйцях з ембріоном або на культивованих сумішшю CHCL3/MeoH відповідно до [Folch et al. клітинах. Після цього вірус очищували, переважно (1957)]. Екстраговані ліпіди і ліпопептиди аналізудиференційним центрифугуванням або центрифували з допомогою двомірної тонкошарової хромагуванням градієнту густини або обома способами, і тографії з СНСІ3/метанол/Н2О 65/25/4 в якості після цього може деактивуватися бетапершого елюента, з наступним використанням пропіолактоном або формальдегідом відповідно суміші N-бутанол/оцтова кислота/вода 2/1/1, і задо традиційних методик. барвлювали шляхом дериватизації нінгідриновим Очищений і концентрований вірус грипу штаму забарвлювачем (планшет сприскували 2% нінгідA/Panama/2007/9 (1500нмоль фосфоліпід) інкубурином в N-бутанолі і інкубували при 80°С протягом вали з 1мл детергенту окта(тиленгліколь)-n10 хвилин). Результати були наведені на Фігурі 2 і додециловий моноефір (С12Е8) (Boehringer, чітко вказують на фізичний зв'язок природних ліпіMannheim, Німеччина) при концентрації 100ммоль дів вірусу з ліпопептидами. (потрібна концентрація, яка перевищує критичну Електронні мікрофотографії віросом, зібрані із концентрацію міцел) протягом 10 хвилин при темтонкого шару градієнта, показані на Фігурі 3 і чітко пературі 4°С, в ізотонічному буфері при нейтральвказують на частинки, розмір яких відповідає віруному рН: 145ммоль NaCI, 2.5ммоль HEPES (N-2су, а також на антигенні піки, які є характерними гідроксиетилпіперазин-N-2-етаносульфонової кисдля вірусів грипу. лоти), 1ммоль етилендіамінтетраоцтової кислоти Приклад 2: Експерименти з інтраназальною EDTA, рН 7.4 (Буфер А). Після цього вірусну нукімунізацією з використанням відновлених вірусних леокапсиду і матричні протеїни видаляли центримембран, які містять ліпопептид N-пальмітоїл-в2,3(біспальмітоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серилфугуванням при 100,000´g протягом 30 хвилин (лізил)3-лізин, природні ліпіди вірусу грипу і протепри температурі 4°С. Гранули видаляли, а надоїни мембран вірусу грипу. садову рідину змішували з сухим ліпопептидом у Інтраназальну вакцинацію відновленими віруспіввідношенні 0.5мг ліпопептиду на 750нмоль сними мембранами, які містять гемагглютинін вівірусного ліпіду, і перемішували, доки ліпопептид русу грипу і N-пальмітоїл-S-2,3(біспальмітоїлокси)не розчиниться. Після цього додавали 128мг пропіл-цистеїніл-серил-(лізил)3-лізин, порівнювали BioBeads SM-2 (Bio-Rad) до кожних 350 мікролітрів з інтраназальним призначенням стандартної субсуміші, і детергент видаляли інтенсивним струшуодиничної вакцини або віросомної вакцини, одерванням суміші і гранул протягом однієї години. жаної відповідно до ЕР0538437. Мишей Balb/C Після цього рідину переносили до інших 64 мг таімунізували інтраназальним закапуванням 10 мікких гранул і продовжували струшувати протягом ролітрів антигену, який містить 5мкг протеїнів віру10 хвилин. Одержана мутна поверхнева рідина су грипу, на 0-й і 14-й день. Зразки крові брали на містить вірусні мембрани і може застосовуватись 0-й, 14-й і 35-й день, назальні і легеневі рідини для вакцинації з наступним очищенням або без збирали на 35-й день. Порівнювали декілька різнього. них штамів вірусу грипу. Кожну мишу імунізували Для аналізу фізичного зв'язку між ліпідами, ліодним видом штаму. Легеневі рідини збирали запопептидами і вірусними протеїнами мутну суміш, вдяки ін'єкції 1.5мл фосфатно-буферного сольовояка містила відновлені вірусні мембрани, завантаго розчину в легені через шприц, з'єднаний із тражували поверх дискретного градієнта цукрози, хеєю, після чого здійснювали відсмоктування 1мл який містить 1мл «підкладинкового» шару, що рідини. Рідини з носа отримували шляхом ін'єкції складається з 40% розчину цукрози (мас./об.) в 0.5мл фосфатного буферного сольового розчину у буфері А, і 4мл верхнього шару, що складається з зворотному напрямку через трахею у носоглотку, 10% розчину цукрози (мас./об.) у буфері А (як попри цьому промивні рідини збирають біля ніздрів. казано на Фігурі 1). Обидва градієнти центрифугуДебріс і клітинні компоненти негайно видаляли із вали протягом 90 хвилин при 100.000 gmax, і збизмивної рідини центрифугуванням, і додавали сурали зразки із 40%-ої підкладинки та проміжного міш інгібітора протеази (хемстатин, антіпейн, леушару між 40% підкладинкою і 10% верхнім шаром, пептин, пепстатин, кінцева концентрація а також з верхнього шару. У цих градієнтах неінко1мікрограм/мл, із 1000 x концентрованого матковорпоровані вірусні протеїни переміщуються у підго розчину у сухому ДМСО), після чого зразки закладинку під час центрифугування, а ліпіди і ліпоморожували у рідкому азоті і зберігали при -20 пептиди, не присутні у відновлених мембранах, градусах Цельсія до проведення аналізу. Зразки переміщуються у верхню частину градієнта, і віданалізували з допомогою ІgА в носі і легенях і IgG новлені вірусні мембрани можуть бути знайдені у твердофазним імуноферментним аналізом (ELISA) проміжному шарі (Фігура 1). 15% вірусного ліпіду було виявлено біля поверхні градієнту, так само як 21 87269 22 щодо протеїнів грипу. Результати наведені на Фідення. Результати, показані на Фігурі 6, чітко вкагурі 4 і Фігурі 5. зують на сильно виражену активність зв'язування у Приклад 3: Активність злиття мембран у відвідновленої вірусної мембрани. новленої вірусної мембрани, яка містить ліпопепПриклад 4: Експерименти із внутрішньом'язотид N-пальмітоїл-S-2,3(біспальмітоїлокси)-пропілвою імунізацією з використанням відновлених віцистеїніл-серил-(лізил)3-лізин, природні ліпіди вірусних мембран. які містять ліпопептид Nрусу грипу, мічені піреном фосфатидилхоліни і пальмітоїл-S-2,3(біспальмітоїлокси)-пропілпротеїни мембран вірусу грипу. цистеїніл-серил-(лізил)3-лізин, природні ліпіди віОчищений і концентрований вірус грипу штаму русу грипу і протеїни мембран вірусу грипу, порівA/Panama/2007/9 (1500нмоль фосфоліпіду) інкубуняно з імунізацією з використанням віросом, одервали з 1мл окта (етиленгліколь)-n-додециловим жаних відповідно до ЕР 0538437. моноефіром (С12Е8) при концентрації 100ммоль 25мкл антигену вірусу грипу (5мкг протеїну) протягом 10 хвилин при температурі 4°С, в ізотопризначали ін'єкцією у м'язи однієї із задніх ніг нічному буфері при нейтральному рН: 145ммоль миші Balb/C на 0-й день. Зразки крові брали на 0-й NaCI, 2.5ммоль HEPES, 1ммоль EDTA, рН 7.4 і на 14-й день. Для одержання вакцини використо(Буфер А). Після цього вірусну нуклеокапсиду і вували вірус штаму A/Panama/2007/99. Зразки матричні протеїни видаляли центрифугуванням аналізували IgG ELISA щодо гемагглютиніну вірусу грипу. Результати показані на Фігурі 7. при 100,000´g протягом 30 хвилин при температуПриклад 5: Фізичні характеристики функціонарі 4°С. Гранули видаляли, а надосадову рідину льно відновлених вірусних мембран, які містять змішували з сухим ліпопептидом і пірен-міченим мембранні протеїни вірусу A/Wyoming, на основі фосфоліпідом у співвідношенні 0.5мг ліпопептиду рівноважного центрифугування градієнту густини. на 150нмоль 1-гексадеканоїл-2-(1-пірендеканоїл)Відновлені мембрани вірусних мембран, які sn-гліцеро-S-фосфатиділхоліну на 750нмоль вірумістять ліпопептид N-пальмітоїл-Sсного ліпіду, і перемішували, доки ліпопептид пі2,3(біспальмітоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серилрен-мічений фосфоліпід не розчиняться. Після (лізил)3-лізин, отримані як описано у прикладі 1, цього додавали 128мг BioBeads SM-2 (Bio-Rad) до завантажували поверх 10-60% мас./об, градієнту кожних 350 мікролітрів суміші, і детергент видаляцукрози і центрифугували при 50000об./хв. у ротоли інтенсивним струшуванням суміші і гранул прорі Бекмана SW55 протягом 16 годин. У цьому різтягом однієї години. Після цього рідину переносиновиді градієнта ліпіди і ліпопептиди залишається ли до інших 64мг таких гранул і продовжували зверху, тоді як протеїни переміщуються до найниструшувати протягом 10 хвилин. жчої фракції. Зразки градієнта аналізували рефраДля аналізу злиття мембран мембрани-мішені ктометрією для визначення протеїну і фосфоліпіпорожніх стром еритроцитів одержували із конценду. Результати, показані на Фігурі 8, свідчать, що, тратів червоних клітин (кров групи В, резус фактор по суті, весь вірусний протеїн і більшість вірусного негативний) за методом Стека і Канта [Steck and ліпіду одночасно очищуються на єдиному піку. Kant (1974)]. Злиття визначали при концентрації Також ліпопептиди відновлювались лише із фрак0.06моль фосфоліпідів із стром еритроцитів і цій 4, 5 і 6. Ці дані вказують на те, що відновлені 1мкмоль віросомної фосфоліпіди у буфері, що мембрани представляють собою частинки густимістить 140ммоль NaCI, 15ммоль цитрату натрію ною приблизно 1.12г/мл. при рН 5.1. Змішування ліпідів контролювали за Приклад 6: Експерименти із інтраназальною рахунок розведення руrРС. З цією метою визначаімунізацією з використанням відновлених вірусних ли флуоресцентність піренового ексімера при збумембран, які містять ліпопептид N-пальмітоїл-Sдженні і випроміненні хвиль довжиною 345нм (сму2,3(біспальмітоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серилга пропускання 2нм) і, відповідно, 490нм (смуга (пропіл)3-пролін, природні ліпіди вірусу грипу і пропропускання 16нм) у присутності відбиваючого теїни мембран вірусу грипу. фільтра 475нм у вихідному промені. Фонову флуоМембрани одержували з A/Panama/2007/99 як ресцентність визначали при нескінченому розвеописано у прикладі 1 вище і використовували для денні зонда, яке досягалось додаванням 35мкл імунізації мишей як описано у прикладі 2. ELISA 0.2моль С12Е8. Зміни у флуоресценції співвідноIgG титри у сироватці, а також титри ІgА з носу і сили зі ступенями злиття (f) обчисленням легень показані на Фігурах 9 і 10. Ці дані вказують f=100´(Е0-Е)/(Е0-Еy), де Ε відповідає флуоресценна те, що лізинові і пролінові похідні N-пальмітоїлції ексімера у будь-який момент часу, а Е0 та Еy, S-2,3(біспальмітоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серилу відповідно, представляють інтенсивності флуоревикликають приблизно однакове посилення імунсценції при довжині хвиль 490нм в нульовий моної відповіді. мент часу і після додавання С12Е8, при цьому обидва значення мають поправку на ефект розве 23 87269 24 Таблиця Ліпопептиди, особливо придатні для одержання відновлених вірусних мембран згідно з винаходом N-пальмітоїл-S-2,3(біспальмітоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серил-серин S-2,3(біспальмітоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серил-серин N-пальмітоїл-S-2,3(біспальмітоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серил-(лізил)3-лізин S-2,3(біспальмітоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серил-(лізил)3-лізин N-пaльмiтoїл-S-2,3(бicoлeoїлoкcи)-пpoпiл-циcтeїнiл-cepил(лiзил)3-лiзин S-2,3(бісолеоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серил-(лізил)3-лізин N-пaльмiтoїл-S-2,3(бicмipиcтoїлoкcи)-пpoпiл-циcтeїнiл-cepил-(лiзил)3-лiзин S-2,3(бісміристоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серил-(лізил)3-лізин N-пальмітоїл-S-3(пальмітоїлокси)-пропіл-цистеїніл-серил-(лізил)3-лізин N-пальмітоїл-S-2,3 гідроксипропіл-цистеїніл-серил-(лізил)3-лізин N-пaльмiтoїл-S-2,3(бicпaльмiтoїлoкcи)-пpoпiл-циcтeїнiл-cepил-(пpoлiл)3-пpoлiн N-пaльмiтoїл-S-2,3(бicnaльмiтoїлoкcи)-пpoпiл-циcтeїнiл-cepил-(глютaмiнiл)3-глютамінова кислота Література 1. Arkema, A. (2000) Vaccine 18: 1327-1333 2. Böttcher C.J.F, Van Gent С Μ., Fries С. J. (1961) Anal Chim Acta 24: 203-204 3. Bungener, L (2002) Vaccine 20: 323-338 4. Cox J.C. , Sjolander A. , Barr I.G. (1998) Adv Drug Delivery 32: 247-271 4. Dinarello, С. A. (1978) J. Infect. Dis. 138: 760-767 5. Folch, H. et al. (1957) J. Bid. Chem 226,497-509 6. Glück, R. et al., (1994) J Infect Dis 181: 1129-1132 7. Hernandez, L. D: et al., (1996) Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 12: 627-661 8. Janeway, С. et al. (2001) Immunobiology, 5th edition, Garland Publishing, New York 9. Kohashi, O. et al. (1980) Infect. Immun. 20: 70-75 10. Kotani, S. et al., (1976), Biken J. 19: 9-13 11. Morein et al. (1984) Nature 308: 457-460 12. Ogra PL, Faden H, Welliver RC (2001) Clin Microbiol Rev 14: 430-445 13. Powell, M. F. et al., (1988) 5: 528-532 14. Ribi, Ε. Ε. (1979) Cancer Res. 39: 4756-4759 15. Steck, T. L. and Kant, J. A. (1974) Meth. Enzym. 31: 172-180 16. Stegmann Т., Morselt H.W.M., Booy F.P., Van Breemen J.F.L.Scherphof G., Wilschut J.(1987) EMBO J 6: 2651-2659 17. Weijzen S, et al., (2002) J. Immunol 169: 42374238 25 87269 26 27 87269 28 29 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 87269 Підписне 30 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Adjuvant-containing reconstructed viral membrane, method for producing reconstructed viral membrane and pharmaceuticals composition containing reconstructed viral membrane

Автори англійською

STEGMANN ANTONIUS JOHANNES HENDRIKUS, WILSCHUT JAN CHRISTIAAN, VAN BERKUM JOHANNES HENRICUS GERARDUS

Назва патенту російською

Функционально восстановленная вирусная мембрана, содержащая адъювант, способ получения восстановленной вирусной мембраны и фармацевтическая композиция, содержащая восстановленную вирусную мембрану

Автори російською

Стегманн Антониус Йоханнес Хендрикус, Вилсхут Ян Кристиан, ван Беркум Йоханнес Хенрикус Герардус

МПК / Мітки

МПК: A61K 39/002, A61K 9/133, A61K 39/39, A61P 31/12, A61K 39/125, A61K 39/12, A61K 39/02

Мітки: відновленої, вірусну, відновлену, фармацевтична, композиція, яка, відновлені, мембрани, містить, мембрану, спосіб, ад"ювант, вірусної, одержання, вірусні, містять, функціонально

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/15-87269-funkcionalno-vidnovleni-virusni-membrani-shho-mistyat-adyuvant-sposib-oderzhannya-vidnovleno-virusno-membrani-ta-farmacevtichna-kompoziciya-yaka-mistit-vidnovlenu-virusnu-membranu.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Функціонально відновлені вірусні мембрани, що містять ад’ювант, спосіб одержання відновленої вірусної мембрани та фармацевтична композиція, яка містить відновлену вірусну мембрану</a>

Подібні патенти