Спосіб продукування гормону росту

1. Спосіб продукування гормону росту, який включає в себе стадію культивування клітин клітинної лінії, експресуючої гормон росту в клітинне культуральне середовище, що не містить компонентів, одержаних з сироватки тварин, середовище, що містить цинк в концентрації в інтервалі від 0,2 мкМ до 1,75 мкМ і мідь в концентрації в інтервалі від 10 нМ до 75 нМ. 2. Спосіб за п. 1, де середовище додатково містить іони заліза в концентрації в інтервалі від 1 до 10 мкМ. 3. Спосіб за пп. 1 і 2, де середовище містить цинк в концентрації 0,2 мкМ. 4. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де середовище містить цинк в концентрації 0,5 мкМ. 5. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де середовище містить цинк у вигляді сульфату цинку. 6. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де середовище містить мідь в концентрації 25 нМ. 7. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де середовище містить мідь у вигляді сульфату міді. 8. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де середовище містить іони заліза в концентрації 5 або 6 мкМ. 9. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де середовище містить іони заліза у вигляді цитрату заліза і/або нітрату заліза. 10. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де середовище додатково містить компоненти базисного середовища. 11. Спосіб за п. 10, де базисне середовище являє собою модифіковане Дульбекко середовище Голка (DMEM). 12. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де гормон росту експресується під контролем металотіонеїнового (МТ) промотору. 13. Спосіб за п. 12, де металотіонеїновий промотор являє собою мишачий МТ-1-промотор. UA (21) a200706101 (22) 28.10.2005 (24) 11.10.2010 (86) PCT/EP2005/055637, 28.10.2005 (31) 04105451.1 (32) 02.11.2004 (33) EP (31) 60/624,885 (32) 04.11.2004 (33) US (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) КАСАТОРРЕС ЕРНАНДЕС ХОСЕ, ES, МАРТІН П'ЄРА КАРЛОС, ES (73) АРЕС ТРЕЙДІНГ С.А., CH (56) WO9808934 A, 05.03.98. EP0369458 A, 23.05.90. US6162643 A, 19.12.2000. US5324656 A, 28.06.94. GB2196348 A, 27.04.88. US6103529 A, 15.08.2000. US6048728 A, 11.04.2000. US5316938 A, 31.05.94. US5122469 A, 16.06.92. RUTHERFORD JULIAN C ET AL: "Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells." EUKARYOTIC CELL, vol. 3, no. 1, February 2004 (2004-02), pages 1-13. MILES A T ET AL: "Induction, regulation, degradation, and biological significance of mammalian metallothioneins" CRITICAL REVIEWS IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 35, no. 1, February 2000 (2000-02), pages 35-70. BALAMURUGAN KUPPUSAMY ET AL: "Metalresponsive transcription factor (MTF-1) and heavy metal stress response in Drosophila and mammalian cells: a functional comparison" BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 385, no. 7, July 2004 (2004-07), pages 597-603. BITTEL DOUG ET AL: "The DNA binding activity of metal response element-binding transcription factor-1 is activated in vivo and in vitro by zinc, but not by other transition metals" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 273, no. 12, 20 March 1998 (199803-20), pages 7127-7133. 2 (19) 1 3 92157 4 14. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який додатково включає в себе стадію одержання гормону росту з культури клітин. 15. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який додатково включає в себе стадію очищення гормону росту. 16. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який додатково включає в себе стадію складання композиції очищеного гормону росту з фармацевтично прийнятним носієм для одержання фармацевтичної композиції. 17. Спосіб або застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де гормон росту являє собою гормон росту людини. 18. Застосування середовища, як визначено в будь-якому з пп. 1-11, для продукування гормону росту. 19. Застосування середовища, як визначено в будь-якому з пп. 1-11, для підтримування клітин в культурі протягом фази продукування гормону росту. 20. Застосування за п. 18 або 19, де гормон росту являє собою гормон росту людини. 21. Застосування за будь-яким з пп. 18, 19, де клітини являють собою мишачі клітини С127. Даний винахід належить до галузі культивування клітин ссавців в умовах відсутності в культурі сироватки, зокрема, винахід пов'язаний з культивуванням клітин, продукуючих рекомбінантні білки, такі, наприклад, як гормон росту людини (hGH). Даний винахід пов'язаний з середовищем, яке не містить сироватки, призначеним для росту і підтримки клітин ссавця в культурі. Клітинна культура широко використовується в цей час для одержання різних біологічно активних продуктів, таких як вірусні вакцини, моноклональні антитіла, імуномодулятори, які не є антитілами, фактори росту поліпептидів, гормони, ферменти, пухлиноспецифічні антигенні і так далі. Вказані речовини продукуються нормальними або трансформованими і генетично модифікованими клітинами. У минулому культуральне середовище для культивування клітин доповнювали сироваткою, яка служила універсальною поживною речовиною для росту і підтримки всіх ліній клітин ссавця, які продукують біологічно активні продукти. Імунна сироватка містить гормони, фактори росту, транспортні білки, фактори прикріплення і розпластання, поживні речовини, мікроелементи і так далі. Культуральне середовище звичайно містило приблизно до 10% тваринної сироватки, такої як ембріональна бичача сироватка (FBS), також звана ембріональною сироваткою теляти (FCS). Незважаючи на широке застосування, сироватка має множину обмежень в застосуванні. Вона містить високі рівні множини білків, що впливають на обмеження процентної кількості білка, який представляє інтерес, продукованого клітинами. Дані білки, одержані з сироватки, повинні бути відділені від продукту під час виконання стадій процесу, такого як виділення білка, який представляє інтерес, що утрудняє спосіб і збільшує витрати. Побічна дія BSE (губкоподібна енцефалопатія великої рогатої худоби), трансмісивного нейродегенеративного захворювання великої рогатої худоби з тривалим латентним або інкубаційним періодом, ставить питання про регуляторну участь використання сироватки тваринного походження в продукуванні біологічно активних продуктів. Отже, існує велика потреба в розробці альтернативного середовища, що не містить сироватку тварини, яке підтримує ріст клітин і зберігає їх в процесі продукування біологічно активних продуктів. Як правило, культуральне клітинне середовище містить множину компонентів різних категорій, таких як амінокислоти, вітаміни, солі, жирні кислоти і інші сполуки: Амінокислоти: Наприклад, в патенті США №6048728 (Inlow і ін.) описано, що в середовищі для культивування клітин можуть бути використані наступні амінокислоти: аланін, аргінін, аспарагінова кислота, цистеїн, глутамінова кислота, глутамін, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, пролін, серин, триптофан, тирозин, треонін і валін. Вітаміни: в патенті США №2003/0096414 (Ciccarone і ін.) або в патенті США №5811299 (Renner і ін.) описано, наприклад, що в середовищі для культивування клітин можуть бути використані наступні вітаміни: біотин, пантотенат, холін хлорид, фолієва кислота, міоіноцитол, ніацинамід, піридоксин, рибофлавін, вітамін В12, тіамін, путресцин. Солі: в патенті США №6399381 (Blum і ін.), наприклад, описане середовище, яке містить СаСl2, KСl, MgCl2, NaCl, мононатрійфосфат, двоосновний натрій фосфат, селеніт натрію, CuSO4, ZnCl2. Іншим прикладом документа, в якому описані неорганічні солі, які можуть бути використані в середовищі для культивування клітин, є Патент США №2003/0153042 (Arnold і ін.), в якому описане середовище, яке містить СаСl2, KСl, MgCl2, NaCl, мононатрійфосфат, двоосновний фосфат натрію, СuСІ2, 2Н2О, ZnCl2. Жирні кислоти: жирні кислоти, про які відомо, що вони використовуються в культуральному середовищі, являють собою арахідонову кислоту, лінолеву кислоту, олеїнову кислоту, лауринову кислоту, міристинову кислоту, так само як і метилбетациклодекстрин, див., наприклад, Патент США №5045468 (Darfler). Треба зазначити, що циклодекстрин по суті не є ліпідом, але він здатний утворювати комплекс з ліпідами, і, таким чином, він 5 використовується для підвищення розчинності ліпідів в середовищі для культивування клітин. ; Іншими компонентами, що застосовуються, зокрема, в середовищі для культивування клітин, яке не містить імунної сироватки, є такі сполуки як глюкоза, глутамін, Na-піруват, інсулін або етаноламін (див., наприклад, ЕР 274445), або захисний агент, такий як Pluronic® F68. Pluronic® F68 (відомий також як Poloxamer 188) являє собою блокувальний співполімер етиленоксиду (ЕО) І пропіленоксиду (РО). Стандартні "базисні середовища" також відомі фахівцеві в даній галузі. Такі середовища вже містять декілька компонентів середовища, згаданого вище. Прикладами таких середовищ, які знайшли широке застосування, є модифіковане Дульбeкко середовище Голка (DMEM), DMEM F12 (1:1), поживна суміш Ham's Nutrient mixture F-10, середовище RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), середовище MCDB 131, або середовище William's Medium E. Дані комерційні середовища доступні, наприклад, від Gibco, Invitrogen. Метали, такі як цинк (Zn) і мідь (Сu), залучені до метаболічних взаємодій (Vallee і Falchuk, 1993 або Lindner, 1991). Цинк грає суттєву роль в структурі і функції великої кількості макромолекул і більшості ферментативних реакцій. Він грає роль каталізатора, співкаталізатора або структурну роль в специфічному зсіданні білків. Ζn-ΑΤΦ "необхідний для синтезу піридоксин-5-фосфату і динуклеотиду флавінаденозин (FAD), двох коферментів, необхідних для біогенного синтезу аміну і метаболізму моноаміноксидази. Активність цинку в запобіганні пошкодженню біологічних структур вільними радикалами може здійснюватися завдяки декільком факторам: підтримці відповідного рівня металобілків, які також є пастками від вільних радикалів, як суттєвий компонент супероксидцисмутази, як захисний агент для тіолів і в запобіганні взаємодії хімічних груп із залізом з утворенням вільних радикалів. У доповнення до цього, наявність Zn запобігає перекисному окисленню ліпідів. Цинк також є ефектором полімеризації тубуліну і діє in vitro на утворення і стабілізацію актинового волокна. Цинк є також компонентом мотиву цинкових пальців ДНКзв'язаних білків, які є загальним мотивом в транскрипційних білках. Іони цинку існують головним чином у вигляді комплексів з білками і нуклеїновими кислотами і беруть участь у всіх аспектах проміжного метаболізму, трансмісії і регуляції експресії генетичної інформації, зберіганні, синтезі і дії пептидних гормонів і структурній підтримці хроматину і біологічних мембран. Мідь також є важливим мікроелементом для функціонування багатьох клітинних ферментів. Іони міді можуть приймати особливі окислювально-відновні стани, окисляючи Сu (II) або відновлюючи Сu (І), дозволяючи металу грати ведучу роль в клітинній фізіології як каталітичного кофактора в окислювально-відновній хімії ферментів. Мідь функціонує в групі оксидаз, які включають в себе цитохром-С-оксидазу, тирозиназу, дофамін 92157 6 Р-монооксигеназу, аміноксидази і лізилоксидазу. Мідь бере участь також в мітохондріальному диханні, гомеостазі заліза як компонента церулоплазміну, у видаленні вільних радикалів і поперечному зв'язуванні еластину. Середовище, що не містить сироватку, яке включає в себе іони металу, такі як іони цинку або міді, відоме фахівцям в даній галузі, наприклад, з Патенту ОДА №6048728 (Inlow і ін.), Патенту США №4767704 (Cleveland і ін.) або Міжнародної заявки WO 01/16294 (Life Technologies Inc.) Однак в цих документах не наведено даних про ефект збільшення продуктивності при додаванні цих іонів в певних концентраціях в стандартне продукуюче середовище. Для удосконалення і постачання біологічно активних продуктів, таких як лікувальні білки або вакцини, необхідний великий вихід продукту. Відповідними клітинами, що широко застосовуються для одержання поліпептидів, є клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО). Клітини СНО уперше були культивовані Puck (J.Exp.Med. 108, 945, 1958) з матеріалу біопсії яєчника самиці китайського хом'ячка. З цих первинних клітин було одержано декілька ліній клітин з різними характеристиками. Одна з цих ліній клітин СНО, СНО-K1, являє собою пролінзалежну лінію і є диплоїдною по дигідрофолатредуктазному гену (DHFR). Іншою лінією, одержаною з вказаної лінії клітин, є лінія клітин СНО, дефіцитна по DHFR (СНО DUK ВИ) (PNAS 77, 1980, 4216-4220), яка характеризується втратою функції DHFR внаслідок мутації в одному DHFR-гені і подальшою втратою іншого гена. Наступними клітинами, які часто використовуються для продукування білків, призначених для введення в людський організм, є лінії клітини людини, такі як лінія клітин фібросаркоми людини НТ1080 або лінія ембріональних клітин нирки людини 293. Мишача лінія клітин С127 також часто застосовується для продукування рекомбінантних білків (Carter і ін., 1989; Ока і Rupp, 1990). Одним з лікувальних білків, який представляє інтерес, є гормон росту. Гормон росту людини (hGH), відомий також як соматропін (INN) або соматотропін, являє собою білковий гормон, продукований і секретований соматотропними клітинами передньої частки гіпофіза. Гормон росту людини грає ключову роль в соматичному рості в дитячому віці і в метаболізмі в період повноліття за допомогою його впливу на метаболізм білків, вуглеводів і ліпідів. Гормон росту людини являє собою одиничний поліпептидний ланцюг, що складається зі 191 амінокислоти (Bewly і др, 1972), яка має два дисульфідних зв'язки, один між Cys-53 і Cys-165, який створює велику петлю в молекулі, і інший - між Cys-182 і Cys-189, який створює малу петлю поблизу С-кінцевої ділянки. Послідовність ДНК, яка підтвердила амінокислотну послідовність білка, була описана Martial і ін. (1979). Очищений hGH, в його ліофілізованій формі, являє собою білий аморфний порошок. Він легко розчиняється (в 7 концентрації >10мг/л) у водних буферах при рН в інтервалі від 6,5 до 8,5. У розчині hGH існує переважно як мономер, з незначною фракцією у вигляді димерів і олігомерів з великою молекулярною вагою. При певних умовах hGH може бути індукований у вигляді, який утворює більшу кількість димерів, тримерів і вищих олігомерів. Відомо декілька похідних hGH, включаючи похідні природного походження, варіанти і продукти метаболізму, продукти деградації переважно біосинтетичного hGH і генно-інженерних похідних hGH, що одержуються генетичними способами. Одним з прикладів похідного hGH природного походження є GH-V, різновид гормону росту, виявленого в плаценті. Інший представник генного локусу описаний у Chen і ін. (1989). Будь-яке похідне hGH, включаючи похідні, пристосовані до тривалого перебування в організмі, можуть бути використані для цілей даного винаходу, поки у них зберігається біологічна активність hGH. Метіоніл-hGH був першою формою hGH, одержаною за допомогою технології рекомбінантної ДНК. Дана сполука є насправді похідним hGH, що має додатковий залишок метіоніну на N-кінцевій ділянці (Goeddel і ін., 1979). Описаний виявлений як в гіпофізі, так і в кровотоку різновид hGH природного походження, званій 20-K-hGH (Lewis і ін., 1978; Lewis і ін., 1980). Дана сполука, у якої бракує 15 амінокислотних залишків, від Glu-32 до Gln-46, з'являється при альтернативному сплайсингу месенджеррибонуклеїнової кислоти (DeNoto і ін., 1981). Дана сполука має багато які, але не всі біологічні властивості hGH. 20-K-hGH виробляється в гіпофізі і секретується в кров. Він становить приблизно 5% гормону росту, який виробляється дорослою людиною, і приблизно 20% гормону росту, який виробляється в дитячому віці. Він має таку ж стимулюючу ріст активність, що і гормон росту, і, як було виявлено, має величину ліполітичної активності, більшу або рівну активності форми в 22кДа. Він зв'язується з рецепторами гормону росту з афінністю, рівною афінності гормону росту в 22кДа, і має одну десяту частку лактогенної (пролактиноподібної) біологічної активності в порівнянні з гормоном в 22кДа. На відміну від гормону в 22кДа, 20-k-hGH має слабку антиінсулінову активність. Деяка кількість похідних hGH є результатом протеолітичної модифікації молекули. Початковий шлях метаболізму молекули hGH включає протеоліз. Область hGH навколо залишків 130-150 надзвичайно схильна до протеолізу, і виявлено декілька похідних hGH, що мають однониткові розриви або делеції в даній області (Thorlacus-Ussing, 1987). Дана область розташовується у великій петлі hGH, і розщеплення пептидного зв'язку приводить до виникнення двох ланцюгів, які сполучені за допомогою дисульфідного зв'язку біля Cys-53 і Cys-165. Було виявлено, що багато які з цих дволанцюгових утворень мають підвищену біологічну активність (Singh і ін., 1974). Багато які похідні гормону росту людини були одержані штучно за допомогою ферментів. Ферменти трипсин і субтилі 92157 8 зин, а також інші ферменти були використані для модифікації hGH в різних місцях по всій довжині молекули (Lewis і ін., 1977; Graff і ін., 1982). Одне таке похідне, зване дволанцюговим анаболічним білком (2-САР), одержали за допомогою контрольованого протеолізу hGH трипсином (Becker і ін., 1989). Було виявлено, що 2-САР має біологічні властивості, абсолютно відмінні від тієї інтактної молекули hGH, в якій стимулююча ріст активність молекули hGH в основному зберігалася, а дія на вуглеводний метаболізм в основному була анульована. Аспарагінові і глутамінові залишки в білках у відповідних умовах схильні до реакцій дезамінування. Було показано, що гіпофізарний hGH піддається даному типу реакцій, які приводять до перетворення Asn-152 на аспарагінову кислоту, а також, в меншій мірі, до перетворення Gin-137 на глутамінову кислоту (Lewis і ін., 1981). Виявлено, що дезамідований hGH має змінену чутливість до протеолізу під дією ферменту субтилізину, що вказує на те, що дезамідування може мати фізіологічне значення в спрямованому протеолітичному розщепленні hGH. Відомо, що біосинтетичний hGH деградує при певних умовах зберігання, приводячи до дезамідування у іншого аспарагіну (Asn-149). Це являє собою основний сайт дезамідування, але дезамідування у Asn-152 також спостерігалося (Becker і ін., 1988). Дезамідування у Gln-137 в біосинтетичному hGH не виявляли. Метіонінові залишки в білках чутливі до окислення в основному сульфоксидом. Обидва, і який виробляється гіпофізом, і біосинтетичний hGH піддаються сульфоксидуванню у Met-14 і Met-125 (Becker і ін., 1988). Було виявлено, що окислення у Met-170 відбувається в hGH, що виробляється гіпофізом, але не в біосинтетичному hGH. Обидва, і дезамідований hGH, і Met-14-сульфоксид-hGН, як було виявлено, проявляють повну біологічну активність (Becker і ін., 1988). Одержані усічені форми hGH, кожний за допомогою дії ферментів або за допомогою генетичних способів, У 2-САР, генерованого за допомогою контрольованої дії трипсину, видалені перші вісім залишків біля N-кінцевої ділянки hGH. Інші усічені варіанти hGH одержані за допомогою модифікації гена перед його експресією у відповідного хазяїна. Перші 13 залишків були видалені, даючи в результаті похідне, що має особливі біологічні властивості (Gertler і ін., 1986), в якому поліпептидний ланцюг не роз'єднаний. Хоч гормон росту людини спочатку був одержаний з гіпофізів, взятих у трупів, дані препарати не були електрофоретично гомогенними, і антитіла, що з'являються в сироватці пацієнтів, оброблених препаратами приблизно 50% чистоти, імуногенетично класифікувалися як неактивні компоненти. Технологія рекомбінантних ДНК дає можливість без обмеження продукувати hGH в цілому ряді різних систем. Очищенню hGH з культурального середовища сприяє наївність лише невеликої кількості домішкових білків. Фактично було показано, що hGH може бути очищений в масштабі лабораторії за допомогою однієї стадії 9 очищення на колонці HPLC з оберненою фазою (Hsiung et al.(1989). Рекомбінантний гормон росту людини, rhGH, був продукований виробником Serono International S.A. як SEROSTIM®, і було одержане прискорене схвалення FDA на застосування цього продукту для лікування пацієнтів з втратою ваги і виснаженням серед хворих СНІДом. SAIZEN® являє собою рекомбінантний гормон росту людини, призначений для дітей з дефіцитом GH, при синдромі Тернера у дівчинок, а також при хронічній нирковій недостатності у дітей. PROTROPIN®, одержаний Genentech, Inc. (South San Francisco, CA), незначно відрізняється по структурі від природної послідовності hGH, має додатковий залишок метіоніну поблизу N-кінцевої ділянки. Рекомбінантний hGH головним чином постачається у флаконах, що містять hGH плюс додатковий наповнювач, наприклад, гліцин і маніт, в ліофілізованій формі. Передбачений супутній розчинник у флаконі дає можливість пацієнту одержувати продукт бажаної концентрації до введення дози. Рекомбінантний hGH може також постачатися іншими добре відомими способами, такими як попередньо заповнений шприц, і так далі. В основному не спостерігали значної відмінності у фармакокінетиці або біологічній активності природної рекомбінантної послідовності hGH, рекомбінантного N-метіоніл-hGH або продукованого гіпофізом людини субстрату (Мооrе і ін., 1988; Jorgensson і ін., 1988). Беручи до уваги різні медичні свідчення, при яких використовується гормон росту, існує необхідність в дійовому і надійному способі продукування значної кількості його в культурі клітин, зокрема, в способі, в якому використовується культура клітин, яка не містить сироватки. Середовище, яке не містить сироватки, було описане в даній галузі. Наприклад, в патенті США №6162643 описане базальне середовище, яке не містить сироватки, НЕСК-109, що іменується, яке містить незначні кількості сульфату міді і хлориду цинку. Дане середовище спеціально призначене для первинної і вторинної культур звичайних клітин людини, таких як кератиноцид, з метою генерації тканини для трансплантації людині. Експресія рекомбінантних білків людини в лінії клітин in vitro в даному Патенті США не згадується. У патенті США №5324656 описане базальне середовище, яке не містить сироватки, так зване MCDB120 і MCDB131M, яке містить незначні кількості сульфату міді і хлориду цинку. Дане середовище спеціально призначене для культивування in vitro м'язових сателітних клітин людини з метою запобігання диференціюванню даних клітин. Продукування рекомбінантних білків людини не передбачене в рамках цього документа. У документі GB 2 196 348 описане синтетичне середовище для культивування in vitro клітин гібридоми і мієломи. Середовище містить мідь, цинк і іони заліза. Культивування клітин гібридоми і мієломи в даному середовищі проводиться виключно з метою одержання моноклональних антитіл. 92157 10 У патенті США №6103529 запропонований склад для культивування in vitro клітин тваринного походження в культуральному клітинному середовищі, яке не містить сироватки. Клітини тваринного походження можуть бути використані для продукування вірусів, моноклональних антитіл, гормонів або факторів росту. Однак продукування гормону росту в даному документі не передбачене. : У патенті США №6048728 описане середовище, яке не містить білків, для культивування клітин, що включає в себе Co-, Zn- і Fe-іони для культивування клітин тваринного походження, з тим, щоб одержувати, наприклад, натуральні або рекомбінантні продукти, такі як антитіла. Продукування таких продуктів за допомогою клітин, що культивуються, не включає в себе гормони росту або фактори росту, які згадуються виключно як складові середовища, яке не містить сироватки, для збільшення росту клітин в культурі. У патенті США №5316938 описане біохімічно охарактеризоване середовище для культивування для клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО), яке містить цитрат залоза, сульфат цинку і сульфат міді, і зване WCM5. Середовище спеціально призначене і для продукування антитіла і tPA в клітинах СНО. У патенті США №5122459 описаний спосіб продукування рекомбінантних білків в культуральному середовищі, яке не містить сироватки, що містить іони цинку і заліза, особливо придатному для культивування клітин СНО. Продукування гормону росту не передбачалося в цьому документі. Таким чином, проблема, яка лежить в основі даного винаходу, пов'язана із забезпеченням середовища, яке не містить сироватки, для культивування клітин, для ефективного продукування гормону росту, зокрема гормону росту людини (hGH). Даний винахід заснований на удосконаленні середовища для культивування клітин, яке не містить компонентів, що одержуються з сироватки тваринного походження, і в той же час високоефективного для росту клітин і підтримки клітин ссавців в культурі!, зокрема, яка дає можливість продукування рекомбінантних білків. Таким чином, в першому аспекті винахід пов'язаний з середовищем для культивування клітин, що не містить компонентів, одержаних з сироватки тваринного походження, яке містить цинк і/або мідь в незначних кількостях. Переважно середовище згідно з винаходом до цього містить іони заліза в незначних кількостях. У другому аспекті винахід пов'язаний зі способом продукування білка, який включає в себе стадію експресії культивованою клітиною білка, що представляє інтерес, в середовищі згідно з винаходом. Третій аспект винаходу пов'язаний з використанням середовища згідно з винаходом для продукування білка, який представляє інтерес. Четвертий аспект винаходу пов'язаний з використанням середовища згідно з винаходом для підтримки клітин в культурі протягом фази продукування бажаного поліпептиду. 11 На Фіг.1 показаний профіль продуктивності rhGH, одержаний в фазі продукування при безперервному додаванні різних елементів по 10мкМ в культуральне середовище DMEM (RB = ролерфлакон, Н1-Н14= дні від 1 до 14 фази продукування); На Фіг.2 показані середні величини продуктивності rhGH, виражені в мг rhGH на ролер-флакон, одержані в фазі продукування при безперервному додаванні металів (нікель, барій, кобальт, хром) по 10мкМ в культуральне середовище DMEM; На Фіг.3 показані середні величини продуктивності rhGH, збільшені в порівнянні з контролем, які одержуються в факторному плані експерименту для тестування комбінацій цинку (Zn 0,5мкМ), міді (Сu 0,02мкМ), селену (Se 0,050мкМ), марганцю (Μn 0,001мкМ) і цитрату заліза (4,8мкМ); На Фіг.4 показані результати факторного плану експерименту для визначення результату змішування металевих мікроелементів (Zn 0,5мкМ, Сu 0,02мкМ і цитрат заліза 4,8мкМ) і амінокислот: глутаміну (Gin 4,8мМ), серину (Set 0,49мМ) і цистеїну (Cys 0,29мМ); На Фіг.5 показана дія різних концентрацій міді в комбінації з цинком і цитратом заліза (Zn 0,5мкМ, Fe цитрат заліза 4,8мкМ) на продуктивність rhGH в DMEM; На Фіг.6 показана дія різних концентрацій цинку в поєднанні з міддю і цитратом заліза (Сu 0,02мкМ, Fe цитрат заліза 4,8мкМ) на продуктивність rhGH в DMEM; і На Фіг.7 показана сумарна дія відносно збільшення продуктивності rhGH, який одержується при додаванні міді, цинку і цитрату заліза (Zn: 1,5 і 0,5мкМ, Сu: 0,02мкМ і цитрат заліза: 4,8мкМ) як добавки до DMEM на основі різних експериментів з продукуючими rhGH клітинами С127. Даний винахід заснований на удосконаленні середовища для культивування клітин, яка не містить сироватки тваринного походження. Згідно з даним винаходом, середовище для культивування клітин, яке не містить сироватку тваринного походження, включає в себе цинк (Zn) в діапазоні концентрацій від 0,2 до 1,75мкМ, і/або мідь (Сu) в діапазоні концентрацій від 10 до 75нМ, і/або іони заліза (Fe) в діапазоні концентрацій від 3 до 10мкМ. Як показано на прикладах нижче, додавання Zn і/або Сu в незначних кількостях до стандартного середовища приводить до збільшення продуктивності клітин, експресуючих секретований білок, що представляє інтерес. Додавання обох металів, і Zn і Сu, у вказаних вище концентраціях приводить до збільшення продуктивності рекомбінантного гормону росту людини (GH) в клітинах С127 до більше ніж 60% від контролю (ті ж клітини, що культивуються в стандартному середовищі DMEM). Коли GHекспресуючі клітини культивували в середовищі, яке містить Zn, Сu і іони Fe у вказаних вище концентраціях, продуктивність збільшувалася приблизно до 70% в порівнянні з контролем. 92157 12 Переважні межі концентрацій іонів металу в середовищі, згідно з винаходом, наступні: Цинк приблизно 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,5, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0/75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1, 1,05, 1,1, 1,15, 1,2, 1,25, 1,3, 1,35, 1,4, 1,45, 1,5, 1,55, 1,6, 1,65, 1,7, 1,75мкМ. Переважно, щоб цинк становив приблизно 0,5мкМ або приблизно 1,5мкМ. Переважно також, щоб цинк включався у вигляді сульфату цинку. Мідь становить приблизно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,70, або 75нМ. Переважно, щоб мідь становила приблизно 25нМ. Переважно також, щоб мідь включалася у вигляді сульфату міді. Іони заліза становлять приблизно 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 4,8, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 або 10мкМ. Переважно, щоб іони заліза становили приблизно 5 або 6мкМ. Іони заліза переважно можуть бути включені у вигляді цитрату заліза і/або нітрату заліза, і, крім того, переважно, щоб цитрат заліза розглядався як такий, що містить велику частину іонів заліза в середовищі культивування клітини. Середовище може містити, наприклад, близько 5мкМ цитрату заліза і близько 1мкМ нітрату заліза. У переважному втіленні, середовище додатково містить компоненти базисного середовища. Переважно, щоб середовище містило модифіковане Дульбекко середовище Голка (DMEM) як базисне середовище. Композиція стандартного середовища DMEM описана в прикладі нижче. Другий аспект даного винаходу пов'язаний зі способом продукування білка, який включає в себе стадію культивування клітини, експресуючої білок, який представляє інтерес, в середовищі згідно з винаходом. Стадія культивування способу згідно з винаходом може бути проведена в будь-яких відповідних зовнішніх умовах, таких як чашки Петрі, Тколби або ролер-флакони, але таким же чином стадія культивування може проводитися в посудині, що має більший об'єм, такій, наприклад, як біореактор. Білок згідно з винаходом може бути експресований при використанні будь-якого промотору, який придатний для конкретного типу культивованої клітини. У особливо переважному втіленні білок експресується з мeталотіонеїнового (МТ) промотору. Якщо для продукування білка використовуються мишачі клітини, як промотор переважним є мишачий промотор МТ-1. Переважно, щоб спосіб додатково включав в себе стадію збору середовища, яке містить білок, що представляє інтерес. У переважному втіленні спосіб додатково включає в себе стадію виділення білка, який представляє інтерес. У іншому переважному втіленні спосіб додатково включає в себе розробку рецептури виділеного білка з фармацевтично прийнятним носієм для одержання фармацевтичної композиції. У третьому аспекті винахід пов'язаний із застосуванням середовища згідно з винаходом для 13 продукування поліпептиду, що представляє інтерес. У четвертому аспекті винахід пов'язаний із застосуванням середовища згідно з винаходом для підтримки клітин в культурі протягом фази продукування поліпептиду, який представляє інтерес. Клітини, що використовуються в рамках різних аспектів даного винаходу, переважно являють собою клітини ссавців. Вони можуть бути клітинами людини або клітинами тварини. Приклади клітин ссавців, які можна культивувати способом згідно з даним винаходом, включають в себе, наприклад, мишачі клітини С127, клітини 3Т3, клітини COS, клітини остеосаркоми людини, клітини MRC-5, клітини ВНК, клітини VERO, клітини СНО (клітини яєчника китайського хом'ячка), клітини НЕК 293, клітини rНЕК 293, клітини нормальних фібробластів людини, стромальні клітини, гепатоцити або клітини PER.C6. Приклади гібридом, які можна культивувати способом згідно з даним винаходом, включають в себе, наприклад, клітини DA4.4, клітини 123А, клітини 127А, клітини GAMMA і клітини 67-9-В. Переважним є культивування мишачих клітин С127 згідно з даним винаходом. Клітини, що культивуються згідно з даним винаходом, можуть рости в суспензії або, у випадку залежних від "прикріплення" клітин, прикріпленими до твердої основи. Мікроносії і диски Fibra-Cel® використовують для культивування клітин ссавців для росту "прикріплених", або "заякорених", клітин, і вони використовуються, в числі загальноприйнятих технологічних платформ, для індустріального продукування білків (див., наприклад, Bohak і ін. 1987; Petti і ін., 1994). Спосіб переважно придатний для продукування поліпептиду, який представляє інтерес. Середовище згідно з винаходом використовують, таким чином, для продукування поліпептиду або білка, що представляють інтерес, який може являти собою будь-який поліпептид, низькомасштабне або великомасштабне продукування якого є бажаним. Поліпептидом, який представляє інтерес, може бути, наприклад, природно секретований білок, звичайний цитоплазматичний білок, звичайний трансмембранний білок або гуманізоване антитіло або антитіло людини. Коли білок, який представляє інтерес, являє собою природний цитоплазматичний або природний трансмембранний білок, білок переважно піддають генно-інженерній модифікації, з тим, щоб він став розчинним і секретованим, тобто за допомогою розміщення сигнального пептиду перед білком або його фрагментом (розчинним або позаклітинним). Поліпептид, який представляє інтерес, може мати будь-яке походження. Переважно, поліпептиди, які представляють інтерес, походять з організму людини, і більш переважно, білки, які представляють інтерес, мають лікувальну дію. Переважно, щоб білок, який представляє інтерес, був вибраний з гормону, цитокінзв'язаного білка, інтерферону, розчинного рецептора або антитіла. Білки з лікувальною дією, які можуть бути продуковані способом згідно з винаходом, включають 92157 14 в себе, наприклад, хоріонічний гонадотропін, фолікулостимулюючий гормон, лутропінхоріогонадотропний гормон, тиреостимулюючий гормон, гормон росту, зокрема гормон росту людини, інтерферони (наприклад, інтерферон бета1а, інтерферон бета-1b), рецептори інтерферону (наприклад, рецептор інтерферону гамма), TNFрецептори р55 і р75 і їх розчинні варіанти, ТАСІрецептор і його Fc-злиті білки, інтерлейкіни (наприклад, інтерлейкін-2, інтерлейкін-11), інтерлейкінзв'язуючі білки (наприклад, інтерлейкін-18зв'язуючий білок), анти-CD 11а-антитіла, еритропоетин, колонієстимулюючий фактор гранулоцитів, колонієстимулюючий фактор гранулоцитівмакрофагів, пептидні гормони гіпофіза, менопаузальний гонадотропін, інсуліноподібні фактори росту (наприклад, соматомедин-С), фактор росту кератиноцитів, одержаний з клітинної лінії гліальних клітин нейротрофічний фактор, тромбомодулін, основний фактор росту фібробластів, інсулін, фактор VIII, соматропін, морфогенетичний білок-2 кістки, фактор росту з тромбоцитів, гірудин, епоіетин, рекомбінантний злитий білок LFA-3/IgG1, глюкоцереброзидазу і мутеїни, фрагменти, розчинні форми, функціональні похідні, їх злиті білки. У переважних втіленнях поліпептид вибраний з групи, яка складається з хоріонічного гонадотропіну (CG), фолікулостимулюючого гормону (FSH), лутропін-хоріогонадотропного гормону (LH), тиреостимулюючого гормону (TSH), гормону росту людини (hGH), інтерферонів (наприклад, інтерферону бета-1а, інтерферону бета-1b), рецепторів інтерферону (наприклад, рецептора гаммаінтерферону), TNF-рецепторів р55 і р75, інтерлейкінів (наприклад, інтерлейкіну-2, інтерлейкіну-11), інтерлейкінзв'язуючих білків (наприклад, інтерлейкін-18-зв'язуючого білка), анти-CD 11а-антитіл і мутеїнів, фрагментів, розчинних форм, функціональних похідних, їх злитих білків. Далі, переважні поліпептиди, які представляють інтерес, включать в себе, наприклад, еритропоетин, колонієстимулюючий фактор гранулоцитів, колонієстамулюючий фактор гранулоцитівмакрофагів, пептидні гормони гіпофіза, менопаузальний гонадодропін, інсуліноподібні фактори росту (наприклад, соматомедин-С), фактор росту кератиноцитів, одержаний з лінії гліальних клітин нейротрофічний фактор, тромбомодулін, основний фактор росту фібробластів, інсулін, фактор VIII, соматропін, морфогенетичний білок-2 кістки, фактор росту з тромбоцитів, гірудин, епоіетин, рекомбінантний злитий білок LFA-3/IgGl, глюкоцереброзидазу і мутеїни, фрагменти, розчинні форми, функціональні похідні, їх злиті білки. Якщо буде розроблена рецептура білка, який представляє інтерес, продукованого способом згідно з винаходом, з фармацевтично прийнятним носієм, то результатом способу буде фармацевтична композиція. Формулювання "фармацевтично прийнятний" має на увазі включення будь-якого носія, який не впливає на ефективність біологічної активності активного інгредієнта і який не токсичний для організму хазяїна, якому даний препарат вводиться. Наприклад, для парентерального введення актив 15 ний білок(білки) може бути взятий в форму стандартної дози для ін'єкцій, в поєднанні з носієм, таким як фізіологічний розчин, розчин декстрози, сироватковий альбумін і розчин Рінгера. Фармацевтична композиція згідно з винаходом може потім вводитися індивідууму різними способами. Способи введення включають в себе " внутрішньошкірний, трансдермальний (наприклад, повільне введення складу), внутрішньом'язовий, внутрішньочеревинний, внутрішньовенний, підшкірний, оральний, внутрішньочерепний, епідуральний, місцевий, ректальний і інтраназальний способи. Будь-який інший терапевтично ефективний спосіб введення може бути використаний, наприклад, абсорбція через епітеліальні або ендотеліальні тканини, або з використанням генної терапії, при якій пацієнту вводиться молекула ДНК, яка кодує активний агент (наприклад, за допомогою вектора), що приводить до того, що активний агент експресується і секретується in vivo. Крім того, білок(білки) згідно з винаходом може бути введений разом з іншими компонентами біологічно активних агентів, таких як фармацевтично прийнятні поверхнево-активні речовини, наповнювачі, носії, розчинники і середовища для ліків. Для парентерального введення (наприклад, внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язового) активний білок(білки) повинен входити в рецептуру як розчин, суспензія, емульсія або ліофілізований порошок, разом з фармацевтично прийнятним парентеральним наповнювачем (наприклад, вода, фізіологічний розчин, розчин декстрози) і добавками, які підтримують ізотонічність (наприклад, маніт) або хімічну стабільність (наприклад, консерванти і буфери). Склад стерилізують за допомогою технологій, які звичайно використовуються. Згідно з даним винаходом, значна перевага віддається використанню середовища згідно з винаходом для продукування гормону росту. GH може бути нативним, тобто GH природного походження. Переважно, щоб GH, який повинен бути продукований, був гормоном людини. Оскільки GH є розчинним секретованим білком, він вивільняється в супернатант клітинної культури або за допомогою його природного сигнального пептиду, або за допомогою гетерологічного сигнального пептиду, тобто сигнального пептиду, одержаного з іншого секретованого, білка, який може бути більш ефективним в експресуючій системі, що конкретно застосовується. Термін "гормон росту" використовується в даному документі як синонім терміну "GH". Даний термін включає в себе природний або нативний GH, рекомбінантно продукований GH, а також різні GH, детально описані в розділі "Основи винаходу". Термін "GH", що використовується в даному документі, додатково включає в себе мутеїни, функціональні похідні, активні фракції, злиті білки, пермутовані по колу білки і солі GH. GH переважно являє собою гормон росту людини, але може також бути іншою різновиду, зокрема гормоном росту ссавців. Використовуваний в даному документі термін "мутеїни" належить до аналогів GH, в яких один 92157 16 або більше амінокислотних залишків природного GH замінені іншими амінокислотними залишками або видалені, або один або більше амінокислотних залишків додані до природної послідовності GH, без значного зменшення активності результуючих продуктів в порівнянні з GH дикого типу. Дані мутеїни одержують за допомогою відомого синтезу і/або за допомогою техніки сайтспецифічного мутагенезу, або будь-якими іншими придатними для цього технічними прийомами. Мутеїни, відповідно до даного винаходу, включають в себе білки, що кодуються нуклеїновою кислотою, такою як ДНК або РНК, які в жорстких умовах гібридизуються з ДНК або РНК, що кодують GH. ДНК, що кодують GH, відомі з попереднього рівня техніки. Термін "жорсткі умови" належить до умов гібридизації і послідовного промивання, які фахівець в даній галузі традиційно відносить до "жорстких". Див. Ausubel і ін., Current Protocols in Molecular Biology, вище, Interscience, N.Y., §§6.3 і 6.4 (1987, 1992). He обмежуючись даними прикладами, жорсткі умови включають в себе умови промивання при 12-20°С нижче розрахункової Тm гібриду при вивченні, наприклад, в 2 SSC і 0,5% SDS протягом 5 хвилин, 2 SSC і 0,1% SDS протягом 15 хвилин; 0,1 SSC і 0,5% SDS при 37°С протягом 30-60 хвилин і потім, 0,1 SSC і 0,5% SDS при 68°С протягом 30-60 хвилин. Фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що жорсткі умови залежать також від довжини послідовностей ДНК, олігонуклеотидних зондів (наприклад, в 10-40 основ) або суміші олігонуклеотидних зондів. Якщо використати суміш зондів, переважним є використання тетраметилхлоридамонію (ТМАС) замість SSC. Див. Ausubel, вище. Ідентичність, яка визначається за допомогою порівняння послідовностей, відображає взаємозв'язок між ι двома або більше поліпептидними послідовностями або двома або більше полінуклеотидними послідовностями. «Взагалі ідентичність заснована на точній відповідності одного нуклеотиду іншому або однієї амінокислоти, іншій двох полінуклеотидів або двох поліпептидних послідовностей, відповідно, по всій довжині послідовностей, що порівнюються. Для послідовностей, між якими немає точної відповідності, можна визначити "% ідентичності". Звичайно дві послідовності, які треба порівняти, вирівнюють для одержання максимальної кореляції між послідовностями. Даний спосіб може включати в себе вставки "гепів" в будь-якій одній або обох послідовностях, що збільшують ступінь вирівнювання. % ідентичності можна визначити по всій довжині кожної зі послідовностей, які порівнювали (так зване глобальне вирівнювання), що, зокрема, зручно для послідовностей однакової або дуже схожої довжини, або більш короткої, ніж довжина (так зване локальне вирівнювання), яка визначається, що більше придатне для послідовностей нерівної довжини. Способи порівняння ідентичності і гомології двох або більше послідовностей добре відомі в даній галузі. Так, наприклад, програми, що є в розпорядженні Wisconsin Sequence Analysis Package, версія 9.1 (Devereux J і ін., 1984), наприклад, про 17 грами BESTFIT і GAP, можуть бути використані для визначення % ідентичності між двома полінуклеотидами і % ідентичності і % гомології між двома поліпептидними послідовностями. У програмі BESTFIT використовується алгоритм "локальної гомології" Smith і Waterman (1981), і вона краще усього виявляє єдину область подібності між двома послідовностями. Інші програми для визначення ідентичності і/або подібності між послідовностями також відомі в даній галузі, наприклад, сімейство програм BLAST (Altschul SF і ін., 1990, Altschul SF і ін., 1997, доступні на домашній сторінці NCBI на www.ncbi.nhn.nih.gov) і FASTA (Pearson WR, 1990). Будь-який такий мутеїн переважно має послідовність амінокислот, яка в достатній мірі повторює послідовність GH, так, щоб він мав в основному активність, подібну GH. Один тип активності GH являє собою його здатність зв'язуватися з GHрецептором. Доти, поки мутеїн має істотну зв'язуючу активність з GH-рецептором (GHR), він може розглядатися як такий, що має істотно подібну GH активність. Таким чином, можна визначити те, чи має будь-який даний мутеїн істотно схожу зі GH активність, за допомогою стандартних експериментів, включаючи, наприклад, простий конкурентний сендвіч-аналіз такого мутеїну, для визначення того, чи зв'язується він з відповідним чином міченим GHR або клітинами, експресуючими GHR, такий аналіз як радіоімунологічний аналіз або ELISA. У переважному втіленні будь-який такий мутеїн має щонайменше 40% ідентичності або гомології з амінокислотною або ДНК-послідовністю GH. Такі послідовності відомі в даній галузі, наприклад, DeNoto і ін., 1981 або Martial і ін., 1979. Більш переважно, він має щонайменше 50%, щонайменше 60%, щонайменше 70%, щонайменше 80% або, найбільш переважно, щонайменше 90% або 95% ідентичності або гомології з амінокислотною або ДНК-послідовністю GH. Переважні заміни для мутеїнів згідно з даним винаходом являють собою ті, які відомі як "консервативні" заміни. Консервативні амінокислотні заміни поліпептидів GH можуть включати в себе синонімічні амінокислоти в межах групи, яка має досить схожі фізико-хімічні властивості, так, щоб при замінах між представниками в межах групи зберігалася біологічна функція молекули (Grantham, 1974). Ясно, що вставки і делеції амінокислот також можуть мати місце у визначених вище послідовностях без зміни їх функції, зокрема, якщо вставки або делеції складаються тільки з декількох амінокислот, наприклад, менше тридцяти, і переважно, менше десяти, і не видаляються або не заміняються амінокислоти, які необхідні для функціональної конформації, наприклад, залишки цистеїну. Білки і мутеїни, продуковані за допомогою таких делецій і/або вставок, входять в об'єм, що охоплюється даним винаходом. Термін "злитий білок" належить до поліпептиду, що містить GH, або мутеїну, або його фрагменту, злитому з іншим білком, який, наприклад, має тривалий час перебування в рідкому середовищі організму. GH може, таким чином, бути злитий з 92157 18 іншим білком, поліпептидом або іншим, наприклад, з імуноглобуліном або його фрагментом. Fcділянки IgG придатні для одержання злитих з імуноглобуліном білків. Злиті з Ig білки описані, наприклад, в патентах ЕР 314 317 А1 (Genentech) або ЕР 0 325 224 А2 (Zymogenetics Inc.). Під "активними фракціями" GH або мутеїнів і злитих білків в даному винаході передбачений будь-який фрагмент або попередники поліпептидного ланцюга білкової молекули, окремо або разом з асоційованими молекулами або зв'язаними з ними залишками, наприклад, цукром або фосфатними залишками, або агрегати білкової молекули або залишки цукру сам по собі, що визначають вказану фракцію, мають по суті схожу з GH активність. Якщо GH згідно з винаходом буде використовуватися як фармацевтична композиція, така фармацевтична композиція може бути використана для лікування і/або запобігання ряду захворювань або порушень. Такі захворювання або порушення переважно пов'язані з недостатнім ендогенним продукуванням GBL Очищений GH може бути використаний, наприклад, для лікування і/або попередження дефіциту GH, виснаження при СНІДі, ліподистрофії (званої також синдромом HARS-HIV асоційованої дистрофією/дисметаболізмом), або синдрому укороченої тонкої кишки, зокрема, в педіатрії. Крім того, захворювання, при яких може бути показане введення гормону росту, включають в себе цироз печінки, нестачу росту у дорослих, атеросклероз, хворобу Крона і неспецифічний виразковий коліт, остеоартрит, серцеву кахексію, застійну серцеву недостатність, хронічну ниркову недостатність, відновлення або мобілізацію клітин крові, чоловічу безплідність, мобілізацію гематопоетичних стовбурових клітин, множинний склероз, інсульт, множинну системну атрофію або злоякісну пухлину. Маючи тепер повний опис даного винаходу, фахівець в даній галузі оцінить, що подібне можна відтворити в межах широкого кола еквівалентних параметрів, концентрацій і умов без відступу від суті і рамок винаходу і без надмірного експериментування. Незважаючи на те, що даний винахід описаний у зв'язку з його специфічними втіленнями, потрібно розуміти, що можливі і інші модифікації. Дана заявка має на увазі будь-які варіації, застосування або пристосування винаходу, що загалом відповідають принципам даного винаходу і включають такі відступи від даного опису, які підпадають під звичайну практику в рамках галузі, до якої належить винахід, і які можуть бути використані відносно основних ознак, сформульованих вище в даному документі, в об'ємі, який охоплюється прикладеною формулою винаходу. Всі посилання, вказані в даному документі, включаючи журнальні статті або короткі огляди, опубліковані або неопубліковані в США, або іноземна заявка на патент, опублікована в США, або іноземні патенти, або будь-які інші посилання повністю включені в даний опис за допомогою посилання, включаючи всі дані,, таблиці, креслення і текст, представлені у вказаних посиланнях. Крім 19 того, повний зміст посилань, згадуваних документів, що цитуються в рамках посилань, наведених в даному документі, також в повному об'ємі включені в даний опис за допомогою посилання. Посилання на відомі стадії способу, традиційно використовувані стадії способів, відомі способи або традиційно використовувані способи ніяким чином не означає, що будь-який аспект, опис або втілення даного винаходу вже були розкриті, описані або рекомендовані в релевантній галузі. Вищевикладений опис специфічних втілень повинен настільки ґрунтовно розкривати загальну природу винаходу, щоб інші могли, застосовуючи знання в межах даної галузі (включаючи вміст посилань, вказаних в даному документі), без великих зусиль модифікувати і/або адаптувати для різних застосувань дані специфічні втілення без надмірного експериментування, без ухиляння від основної концепції даного винаходу. Отже, така адаптація і модифікації передбачені в рамках еквівалентних втілень, розкритих на основі концепції і методів, представлених в даному документі. 92157 20 Повинно бути зрозуміло, що фразеологія або термінологія даного документа служить для опису, а не обмеження винаходу, так що термінологія або фразеологія даного опису повинні інтерпретуватися фахівцем в даній галузі лише як керівництво, яке в поєднанні з навичками рядового фахівця в даній галузі дозволять реалізувати винахід. Приклад: Удосконалення нового продукуючого середовища, яке не містить сироватки, для С127 клітин, експресуючих hGH 1. Вступ У даному дослідженні описана експериментальна робота, пов'язана з удосконаленням продукуючого і культурального середовища (DMEM, модифіковане Дульбекко середовище Голка) за допомогою додавань слідових кількостей елементів металів. Внаслідок даного удосконалення було одержане разюче збільшення продуктивності rhGH в культурі клітин С127. У наступній таблиці 1 представлений сумарний ефект композиції DMEM і удосконалення, які продемонстровані в рамках даного прикладу. 21 92157 22 23 2. Матеріали і способи Реагенти і розчини Всі хімічні реагенти були одержані від Merck®: сульфат цинку (ZnSQ4·7H2O), сульфат міді (CuSO4·5H2O), хлорид барію (ВаСl2-2Н2О), хлорид кобальту (СоСl2·6Н2О), хромсульфат калію (K[Сr(SО6Н4)2(Н2О)2] 6Н2О), нітрат нікелю (Νi(ΝO3)2·6Η2Ο), селеніт натрію (Na2SeO3·5H2O). Цитрат заліза (FeC6H5O7 Sigma®, номер за каталогом F3388) використали як джерело заліза. Суміш мікроелементів для ростового середовища (100000Х) надана JRH® Biosciences. Всі розчини мікроелементів для дослідів готували у вигляді концентрованих розчинів в дистильованій воді і стерилізованих шляхом фільтрування через 0,2мкМ фільтр. Додавання різних аналізованих добавок (розчини металів і т.д.) в різних експериментах проводили безпосередньо в свіже культуральне середовище. Культури клітин Генетично модифіковані мишачі клітини С127 (АТСС CRL 1616) використовували для експресії рекомбінантного гормону росту людини (rhGH). Вектор заснований на BPV69T, що містить множинно клонований сайт pBR322 і шні-ген rhGH в 1,6 т.п.н. під контролем мишачого промотору металотіонеїну-1 (МТ-1). У експериментах використали культури, одержані в Working Cell Bank з різних серій, продукуючих rhGH. Культуру клітин інкубували при 36°С±0,5°С і 0,4об./хв. в 2125см2 ролер-флаконах, що містять 375мл±15мл культурального середовища, або в 1700см см2 ролер-флаконах, що містять 300мл культурального середовища. 92157 24 Культуральне середовище Культуральним середовищем, яке використовується для фази продукування rhGH, було DMEM з 4,5г/л глюкози, забуференої бікарбонатом натрію (3,7г/л). Титрування rhGH Вимірювання rhGH в культуральному середовищі проводили щодня за допомогою титрування HPLC із оберненою фазою: Матеріали Synchropak RP4, 100 4,6мм внутрішній діаметр, 300Å Cat# C4R103-10 (Eichrom). Resource RPC 1мл, 30мм 6,4мм внутрішній діаметр, 15мкм, арт. 17-31, Amersham Biosciences. Symmetry 300, 50мм 4,6 внутрішній діаметр, С4 5мкМ, Ρ/Ν 186000287 (Waters). Реагенти Трифтороцтова кислота (ТФО) (Pierce, Cat#28904 або еквівалент). Ацетонітріл (ACN) (Merck 1,00030 або еквівалент). Очищена вода, PW (наприклад, вода MilliQ, або еквівалент). Гелій Розчини Рухома фаза А: ТФО 0,08% в Н2О (об./об.) До необхідної кількості об'єму води PW в градуйованій колбі додавали ТФО згідно з наступною таблицею. Збовтували і прикріпляли етикетку. Об'єм фази А 1л 0,5л 0,25л Oб'єм води MILLIQ 1л 0,5л 0,25л Об'єм ТФО 0,8мл 0,4мл 0,2мл 25 92157 Рухома фаза В: ТФО 0,08% в ацетонітрилі (об./об.) До необхідної кількості об'єму PW води в об'ємній колбі додавали ТФО, згідно з наступною таблицею. Збовтували і прикріпляли етикетку. Об'єм фази В 1л 0,5л 0,25л Об'єм ACN 1л 0,5л 0,25л Об'єм ТФО 0,8мл 0,4мл 0,2мл Параметри хроматографії: Елюювання градієнтом: спочатку сумішшю фаза А/фаза В 60/40, в кінці фаза А/фаза В 20/80. Градієнт завершується за 5 хвилин (невеликі варіації залежать від обладнання, що використовується) Об'єм інжекції 50 мікролітрів Реєстрація: УФ-поглинання при 215нм. Калібрувальна крива: стандартний зразок rhGH при 10, 50, 100,120 і 150мкг/мл Концентрацію зразка r-hGH визначали за допомогою порівняння з концентрацією стандартного зразка r-hGH. Продуктивність GH Продуктивність виражається як мг rhGH на ролер-флакон. Приблизні дані являють собою концентрацію rhGH при зборі клітин (що вимірювали за допомогою HPLC) і повну кількість ролерфлаконів при зборі клітин. Звичайно ролер-флакон під час фази збору містить приблизно 109 клітин. 3. Результати У перших серіях експериментів аналізували дію високої концентрації кобальту (20мкМ СоСl2·6Н2О) при періодичному додаванні його в культуральне середовище. Додавання кобальту проводили під час двох замін середовища на початковій стадії (промивання і РМ=продукуюче середовище, тобто 0 точка фази збору) і в проміжній стадії (збори 6 і 7) фази продукування в одній серії. Результати (не показані) свідчать про те, що промотор активний і може бути модульований. Збільшення продуктивності додатково підтверджували при використанні інших металевих елементів. Проводили аналіз, відповідно, з барієм (ВаСl2·2Н2О), кобальтом (СоСl2·6Н2О), хромом (K[Сr(SО6Н4)2(Н2О)2] 6Н2О) і нікелю (Ni(NO3)2·6H2O), в концентраціях і 10мкМ, що безперервно додавалися в середовище. Результати даного експерименту зображені на фігурах 1 і 2. На Фіг.1 показана кількість hGH, секретована експресуючими hGH клітинами С127, при культивуванні в середовищі, що містить аналізовані елементи протягом часу експерименту (14 днів). На Фіг.2 показані середні значення продуктивності, 26 що досягаються для кожного аналізованого елемента. Одержана середня продуктивність продовжує збільшення процентного співвідношення в порівнянні з контролем, тобто величиною без слідових кількостей елементів, в межах між 1,1% для барію і 32,4% для кобальту. Також було зазначено, що продуктивність rhGH росте від 9% до 32,5% в порівнянні з зольною величиною при безперервному способі введення кобальту в іі з періодичним. Ні барій, ні хром не викликали збільшення продуктивності при досліджуваних концентраціях в DMEM. Вимірювання в присутності слідових кількостей окремих елементів DMEM доповнювали мікроелементами Zn, Cu, Se і Со в концентраціях, представлених нижче в таблиці 2. Дані концентрації відповідають концентраціям елементів металів в середовищі росту. Збільшення продуктивності rhGH, що досягається за допомогою додавання в DMEM слідових кількостей елементів, показане в таблиці 2. Таблиця 2 Збільшення продуктивності rhGH в процентах при вивченні ефекту іонів металів в DMEM при вказаних концентраціях в мкМ Іон Zn Сu Se Co Концентрація (мкМ) 1,50300 0,02560 0,11400 0,00840 % Збільшення продуктивності 12,10% 37,50% -3,10% -3,20% Треба зазначити, що у випадку цинку оцінювана концентрація в 1,5мкМ є причиною феномена "відлущування", тобто відділення клітинного моношару від пластичного субстрату ролерфлаконів. У деяких випадках даний пілінг веде до втрати культури на останніх стадіяхі збору клітин (особливо між зборами клітин 12-14). Феномен відлущування може бути одержаний при використанні відповідних посудин для культури клітин, таких як ролер-флакони компанії Coming® під торговою маркою Cellbind®. Вимірювання взаємодії між металами Засновуючись на дії міді і цинку на рівень продукування hGH, проводили план факторних експериментів для перевірки можливої комбінованої дії металів. Статистичний аналіз результатів показаний в таблиці 3. Спостерігали стійкий синергічний ефект відносно продуктивності (р