Спосіб одержання нативного колагену

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения коллагена - белка животного происхождения. Получаемый согласно способу продукт, способствующий интенсивной регенерации кожи, используется как активный компонент в составе косметических кремов против старения, фармацевтических препаратов для заживления ран, аппликационных средств для лечения ожогов, а также в составе материалов, используемых для изготовления заменителей кожи и искусственных органов. В настоящее время известные способы получения нативного коллагена обычно включают три основных этапа; измельчение сырья, очистку от балластных веществ, экстракцию и последующую очистку коллагена [1, 2, 3]. Основным отличием известных способов являются условий и средства экстракции нативного коллагена, которая бывает солевой [1] и кислотной [2], причем последняя может быть модифицирована введением фермента кислотно-ферментная экстракция [3, 4, 5]. Ближайшими аналогами заявляемого способа являются способы получения коллагена [3, 4, 5] путем кислотно-ферментной экстракции с использованием пепсина. Эти способы состоят из следующих основных этапов: измельчение сырья животного происхождения, удаление балластных веществ, кислотно-ферментативная обработка при экстракции коллагена с использованием пепсина, очистка коллагена, включающая инактивацию и удаление пепсина, многократное осаждение и очистку коллагена и получение конечного продукта. К недостаткам известных способов относятся значительная трудоемкость и продолжительность этапов экстракции и очистки коллагена. Прототипом заявляемого изобретения является способ получения, осуществляемый по следующей схеме [5]: 1) постепенное измельчение предварительно высушенного сырья животного происхождения до консистенции пудры; 2) экстракция коллагена путем обработки смесью уксусной кислоты и раствором пепсина в соляной кислоте при соотношении пепсина к сырью 1 : 10; 3) очистка коллагена путем: - инактивации пепсина с помощью смеси ТРИС с хлористым натрием; удаления пепсина при трехкратном осаждении (pH 7,4) с последующим трехкратным центрифугированием; - отмывки от солей при диализе против уксусной кислоты (1 : 50) сначала в течение 72 часов, а затем трижды по 24 часа; 4) получение конечного продукта. Недостатками способа-прототипа являются многооперационность и значительная продолжительность, объясняемая следующими условиями и режимами осуществления способа; - предварительная сушка и измельчение сырья в два этапа; - проведение многократного осаждения и центрифугирования для удаления инактивированного пепсина; - трехкратная отмывка от солей общей продолжительностью 144 часа; - общее технологическое время более 14 суток; - большой расход дорогостоящего фермента пепсина (соотношение к сырью 1 : 10). Поставленная задача заключается в разработке способа получения коллагена, обеспечивающего упрощение технологической схемы и сокращение времени при одновременном снижении расходов дорогостоящих реагентов. Для решения поставленной задачи предложен способ получения коллагена, который включает следующие операции: измельчение сырья животного происхождения; - очистка от балластных веществ смесью фосфа тного буфера и ЭДТА, pH 8,0; - экстракция коллагена путем обработки смесью уксусной кислоты, формиата натрия, пепсина при соотношении фермента к сырью 1 : (100 - 200) и соляной кислоты (до pH 2,5); - очистка коллагена путем инактивации пепсина при обработке изотоническим раствором (pH 7,4) с одновременным осаждением коллагена; - получение конечного продукта. Технологическое время составляет 173 часа (более 7 суток). Сравнение нового способа со способомпрототипом показывает следующие отличия: введение операции предварительной очистки путем удаления балластных веществ (глюкозаминогликанов и неколлагеновых белков) позволяет избежать загрязнение конечного продукта коллагена; - осуществление экстракции коллагена путем введения дополнительно формиата натрия способствует значительному сокращению расхода пепсина и повышению выхода коллагена; - очистка коллагена путем его осаждения в изотоническом растворе в одну стадию при одновременной инактивации пепсина обеспечивает существенное упрощение технологии в отличие от способа-прототипа, где пепсин осаждают и удаляют путем многократного продолжительного диализа и центрифугирования; - этап измельчения влажного сырья в новом способе до грубого помола значительно оперативнее аналогичного этапа в способепрототипе, где сырье сначала сушат, а затем постепенно измельчают до консистенции пудры; - сокращение в расходе реагентов, в частности дорогостоящего фермента пепсина. 'Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного исполнения способа. Пример 1. 1. Сначала проводят механическое измельчение сырья, отмытого до нейтральных значений pH (7,0), конечный размер частиц 0,3 0,5см. 2. Очистку от балластных веществ осуществляют смесью 0,1М фосфатного буфера pH 8,0 с 0,05М/л ЭДТА, которой заливают измельченное сырье при соотношении буфера к сырью 5 : 1. Полученную после выдерживания в течение 24 часов кашицу отжимают через ткань и промывают, а надосадочную жидкость удаляют. 3. Экстракцию коллагена проводят из полученной кашицы, которую заливают пятикратным 0,5М раствором уксусной кислоты, содержащей 0,1М формиат натрия, а затем добавляют по каплям концентрированную соляную кислоту до pH 2,5. После чего вводят пепсин в соотношении фермента к сырью 1 : 150. Экстракцию проводят в течение 96 часов. 4. Очистку коллагена осуществляют следующим образом: полученную массу о тжимают через ткань, осадок удаляют, а в оставшуюся жидкость вводят 1,0М NaOH до получения изотонического раствора (pH 7,5) и выдерживают 3 часа на холоде. Выпавший осадок представляет собой коллаген, а пепсин, оставшийся в надосадочной жидкости, удаляют при декантации. 5. Конечный продукт получают п утем отмывки осажденного коллагена на капроновом фильтре до полного избавления от cолей и остатков пепсина, после чего коллаген обрабатывают дважды трехкратным объемом этанола и сушат на воздухе. Выход коллагена 3,3% по отношению к исходному сырью. Пример 2. 1. Сначала проводят механическое измельчение сырья, отмытого до нейтральных значений pH (7,0), конечный размер частиц 0,3 0,5см. 2. Очистку от балластных ве ществ осуществляют смесью 0,01М фосфатного буфера pH 8,0 с 0,07М/л ЭДТА, которой заливают измельченное сырье при соотношении буфера к сырью 5 : 1. Полученную после выдерживания в течение 24 часов кашицу отжимают через ткань и промывают, а надосадочную жидкость удаляют. 3. Экстракцию коллагена проводят из полученной кашицы, которую заливают пятикратным 0,5М раствором уксусной кислоты, содержащей 0,07М формиат натрия, а затем добавляют по каплям концентрированную соляную кислоту до pH 2,5. После этого вводят пепсин при соотношении фермента к сырью 1 : 200. Экстракцию проводят в течение 96 часов. 4. Очистку коллагена осуществляют следующим образом: полученную массу о тжимают через ткань, осадок удаляют, а в оставшуюся жидкости вводят 1,0М NaOH до получения изотонического раствора (pH 7,5) и выдерживают 3 часа на холоде. Выпавший осадок представляет собой коллаген, а пепсин, оставшийся в надосадочной жидкости, удаляют при декантации. 5. Конечный продукт получают п утем отмывки осажденного коллагена на капроновом фильтре до полного избавления от солей и остатков пепсина, после чего коллаген обрабатывают дважды трехкратным объемом этанола и сушат на воздухе. Выход коллагена - 3,0% по отношению к сырью. Пример 3. 1. Сначала проводят механическое измельчение сырья, отмытого до нейтральных значений pH (7,0), конечный размер частиц 0,3 1,5см. 2. Очистку от балластных ве ществ осуществляют смесью 0,01М фосфатного буфера pH 8,0 с 0,03М/л ЭДТА, которой заливают измельченное сырье при соотношении буфера к сырью 5 : 1. Полученную после выдерживания в течение 24 часов кашицу отжимают через ткань и промывают, а надосадочную жидкость удаляют. 3. Экстракцию коллагена проводят из полученной кашицы, которую заливают пятикратным 0,5М раствором уксусной кислоты, содержащей 0,05М формиат натрия, а затем добавляют по каплям концентрированную соляную кислоту до pH 2,5. После этого вводят пепсин при соотношении фермента к сырью 1 : 100. Экстракцию проводят в течение 72 часов. 4. Очистку коллагена осуществляют следующим образом: полученную массу отжимают через ткань, осадок удаляют, а в оставшуюся жидкость вводят 1,0М NaOH до получения изотонического раствора (pH 7,5) и выдерживают 3 часа на холоде. Выпавший осадок представляет собой коллаген, а пепсин, оставшийся в надосадочной жидкости, удаляют при декантации. 5. Конечный продукт получают путем отмывки осажденного коллагена на капроновом фильтре до полного избавления от солей и остатков пепсина, после чего коллаген обрабатывают дважды этанолом и сушат на воздухе. Выход коллагена - 2,9% по отношению к исходному сырью. При осуществлении предложенного способа были испытаны разнообразные условия вышеуказанных операций и определено, что оптимальными для достижения положительного результата являются параметры, представленные в примерах 1, 2, 3 и заявленные в формуле изобретения. Полученный продукт представляет собой высокоочищенный коллаген I и III типов с сохраненной нативной структурой и недеградированными 1() и 1() и 2-компонентами. Молекула соответствует ателлоколлагену, т.е. лишена телопептидов с N- и C-конца, размер которых составляет 25А и 75А соответственно. Препарат представляет волокнистую массу белого цвета или цвета слоновой кости. В 1г препарата содержится 98% коллагена (2% представлены углеводами, являющимися интегральной частью молекулы). Предложенная совокупность признаков заявляемого способа обеспечивает достижение следующего положительного эффекта: технологическое время сокращается вдвое по сравнению с прототипом, при этом значительно упрощается схема осуществления способа и снижается расход дорогостоящих реагентов.