Спосіб одержання ферментного препарату інвертази

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для применения препарата в кондитерской промышленности, в производстве безалкогольных напитков, получения фруктозы или/и глюкозофруктозных сиропов и как биохимический препарат. Наиболее важным и ответственным этапом получения инвертазы из дрожжей представляется процесс дезинтеграции клеточных стенок, где. в основном, и локализована инвертаза, точнее, одна из изоформ этого фермента. Среди физических методов разрушения клеток с целью выделения ферментов известны: криогенное измельчение [Заявка ФРГ № 39087379, опубл. 20.09.90], дезинтеграция в градиенте давления [Спет. Process.-1988,51, №2,с. 170-172], обработка ультразвуком [BTF Biotech. - Forum. -1989. - 6, № 1 - с. 1213]. Известен также способ баллистической дезинтеграции дрожжей до степени разрушения не более 15-20 мас.%, проводимой в процессе культивирования, в начале и в конце логарифмической фазы роста [Авт.св. СССР № 1471559]. Дальнейшее выделение и очистку инвертазы из фильтрата проводят осаждением органическими растворителями ["Прикл. биох. и микробиология. - 1976. - 12, № 5. - с. 709-714], ультрафильтрацией, диализом и хроматографией [Патент ГДР № 282239, опубл. 5.09.90], хроматографией на ДЭАЭ -целлюлозе и гельфильтрацией на сефадексе G-200 ["Прикл. биох. и микробиология. -1980. - 14, № 4. с. 528-537] фильтрацией на Pellіcon Filtration Unit и осаждением сульфатом аммония ["Prep. Bіochem" - 1989. 19, № 4-е. 283-319]. Наиболее близким техническим решением к предложенному является биотехнический способ получения инвертазы [Заявка Франции № 2607148, опубл. 27.05.88], включающий приготовление из активных хлебопекарных дрожжей суспензии концентрацией 10% СВ, дезинтеграцию ее в дробилке посредством стеклянных шариков, имеющих диаметр 0,5-1,2 мм, при непрерывном перемешивании со скоростью вращения вала 2500-4000 мин -1 и расходе суспензии 16 л/ч, сепарацию, фильтрацию через сложный фильтр, концентрирование приблизительно 1/10, диафильтрацию при разбавлении концентрата водой 1:1 3-8 раз и стерилизацию в комбинированной установке ультра- и микрофильтрации, стабилизацию глицерином. Причиной усложнения технологического процесса получения инвертазы в известном способе, связанного с тем, что после дезинтеграции и сепарации полупродукт ферментного препарата недостаточно очищается от мелких остатков дезинтегрированных клеток, являются слишком жесткие условия дезинтеграции, которые приводят к тому, что сам выделяемый фермент частично денатурируется вследствие повышения температуры в рабочей зоне разрушения и возможности механического разрушения комплекса инвертазы с участками клеточных стенок, что приводит к диссоциации субъединиц фермента и уменьшению его активности. Задачей предлагаемого изобретения является усовершенствование известного способа дезинтеграции, а также концентрирования и очистки полученного препарата инвертазы, направленное на улучшение качества ферментного препарата, уменьшение стадий его очистки и снижение потерь при выделении. Техническим результатом использования предполагаемого изобретения является следующее: при заявляемых параметрах разрушения клеток снижается вероятность денатурации инвертазы, т.е. потерь активности, а полученный препарат после диафильтрации можно сконцентрировать до 1 /20 по объему. Потребительские свойства объекта изобретения, связанные с техническим результатом, состоят в улучшении качества получаемого после дезинтеграции полупродукта, который менее "загрязнен" мелкими остатками клеточных стенок, органеллами клеток и высокомолекулярными веществами, для отделения которых требуются дополнительные стадии очистки, аппаратура и энергозатраты, сам фермент остается в нативном виде, после ультрафильтрации продукт более концентрированный. Достигается технический результат тем, что по способу выделения инвертазы из дрожжей, включающему приготовление дрожжевой суспензии, ее дезинтеграцию, отделение дрожжевой пасты, ультрафильтрационное концентрирование и диафильтрацию, согласно изобретению, суспензию дрожжей готовят концентрацией не более 8% СВ, дезинтеграцию проводят на баллистическом дезинтеграторе в рециркуляционном режиме в течение 2-5 мин до достижения степени дезинтеграции 40-60%, после отделения известным способом дрожжевой пасты ультрафильтрационную очистку супернатанта проводили в режиме непрерывной диафильтрации с кратностью диафильтрации 1. После диафильтрации осуществляют концентрирование до 1/20 исходного объема. При заявленных параметрах дезинтеграции разрушениеклеток происходит не столь полно, вследствие чего температура в зоне разрушения клеток ниже, чем снижает* вероятность денатурации инвертазы, сам фермент остается в нативном виде. Проведение диафильтрации из разбавленной суспензии обеспечивает большую эффективность удаления низкомолекулярных примесей за счет ослабления самозадерживающих свойств примембранного гелевого слоя. Стадии фильтрации через слоистый фильтр под давлением, стерилизация методом микрофильтрации и стабилизации глицерином отсутствуют. Срок хранения полученного препарата при температуре 0-5°С -1 год. Заявляемые параметры проведения процесса подобраны авторами экспериментально. Оптимальной степенью дезинтеграции дрожжевой суспензии является величина 40-60%, т.к. при более низком проценте разрушения выход фермента в среду снижается, а при более интенсивной дезинтеграции происходит частичная инактивация инвертазы (что отражается в уменьшении активности дезинтеграта), а также значительно усложняется процесс дальнейшей очистки ферментного препарата за счет необходимости введения дополнительных стадий (в прототипе - это стадия фильтрации под давлением через слоистый фильтр). Требуемую степень дезинтеграции можно достичь, изменяя не только продолжительность обработки и частоту вращения ротора, но и количество микрошариков, скорость протока и концентрацию суспензии, причем скорость потока зависит как от частоты вращения ротора, так и от концентрации суспензии: при одних и тех же условиях скорость протока будет тем выше, чем ниже концентрации. При максимально возможной производительности дезинтегратора (скорости протока) и высокой (9-13% СВ) концентрации суспензии вследствие конструктивных особенностей дезинтегратора не удается достичь равномерного разрушения клеточных стенок, что подтверждается данными микроскопирования. Часть клеток разрушается полностью и при этом частично инактивируется инвертаза, другие клети остаются целыми или почти целыми, что отражается на выходе фермента в среду. Оптимальной является концентрация 5-8% СВ. При заявляемых параметрах достигается равномерная дезинтеграция клеточных стенок примерно у 40-60% клеток, активность супернатанта увеличивается в 7-15 раз по сравнению с контролем, а его качество позволяет исключить стадию фильтрации. Ультрафильтрационную очистку супернатанта проводят в режиме непрерывной диафильтрации с кратностью диафильтрации 1. После диафильтрации проводят концентрирование до 1/20 исходного объема супернатанта. Такой способ позволяет более эффективно очистить препарат за счёт ослабления самозадерживающих свойств примембранного гелевого слоя. Способ получения ферментного препарата инвертазы осуществляют следующим образом. Готовят дрожжевую суспензию концентрацией 3-8% СВ, дезинтеграцию проводят на баллистическом дезинтеграторе ФУГ-1 в рециркуляционном режиме при скорости протока 0,5-2,0 л/мин в течение 2-5 мин до достижения степени дезинтеграции 40-60%; после отделения дрожжевой пасты очистку супернатанта дезинтеграта осуществляют в режиме непрерывной диафильтрации с кратностью диафильтрации 1, концентрирование очищенного препарата осуществляют до 1/20 исходного объема супернатанта. Срок хранения полученного препарата при температуре 0-5°С -1 год.