Спосіб ферметативного одержання пептидів

СОЮЗ СОЗЕТСНИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК (51) 4 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО Д^ЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3 2 1 7 9 5 1 / 2 3 - 0 4 {ЪЬ) PCT/DK 80/00020 (О КОЛ. 80) (22) 0 5 . 1 2 . 8 0 \Ъ\) U43/79 '32) 06.04.79 ( 3 J ) DK ( 4 6 ) 2 9 . 0 2 . 8 8 . Бюл. # 8 С 07 К 5 / 0 6 , 5 / 0 8 , 5/10, 7 / 0 6 , 7 / 1 2 , С 12 Р 71/00 компонент (СК) в растворе в присутствии фермента. В качестве АКК используют выбранные из группы соединения Н-В-ОН (К указано выше)*, амид с необязательно й-замещенной АК формулы H-B-NHR3; сложный зфир АК формулы H-B-0h 4 , где В указано выше; (71) Карлсберг Биотехнолоджн Лтд А/С ( Ш ) (72) Джек Таанинг Йохансен и Фред Видлер (DK) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Isova j . 9 Оиог М. Syntes of •pe-ptiols vith proteolitic enzyms.Bull. Chen. S o c , Japan, 1977, 50, 2762-65. Патент Великобритании J 15331 29s f кл. С 07 С 103/52, опублик. 1978. (54) СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение относится к пептидам, в частности к способу ферментативного получения пептидов общей формулы А-В, где А=И-концевой L-аминокислотный остаток или пептидный остаток состава 2-6 L-аминокислот, содержащий L-аминокислоту (АК) на его С-терминалт>ном конце и необязательно защитную группу ка N-терминальном конце; B-L-амннокислотный остаток, который может быть С-терминально защищен, применяемых в синтезе биологически активных соединений. Цель изобретения - упрощение процесса. Синтез пептидов ведут из аминокислотной (ЛКК) и субстратной г~ алкил. В качестве СК используют выбранное из группы соединение: сложный эфир аминокислоты или пептида, или депсипептида формулы А - OR, ; амид АК или пептида формулы А-КН г или пептид формулы А,-X, где А указано выше; R -С,-С4-алкил, бензил или йб-дезамино-фрагмент Gly, Ala или Pne; A,=L-AK или ди-пентапептид; X=L-AK. Процесс целесообразно проводить в дисперсии или в водном растворе, содержащем до 20% органического растворителя (низшего алканола, диметилформамида или полиэтиленгликоля) при рН 7,6-10,5, 25-А5°С и исходной концентрации СК 0,01-0,15 моль и АКК 0„05-3 моль с последующим выделением необязательного защищенного пептида, после чего при необходимости отлепляют группы К 3 и ГЦ с помощью серинкарбоксипептидазного энзима ( карбоксилелтидаза-Y из дрожжей или карбоксипептидазы CP-1-I или СР-2-1 из проростков ячменя). Способ обеспечивает возможность проведения .процесса в широком интервале рН 7,610,5 при меньшем расходе фермента (до 2-25 ммоль). 2 з,п. ф-лы, Ї6 табл„ t 378785 Изобретение относится к способам ферментативного получения пептидов, который может быть использован в синтезе биологически активных соединений. Цель изобретения - упрощение процесса ферментативного синтеза пептидов. Исходные материалы, JQ Кароопепсидаэу-Y, получаемую из хлебопекарных дрожжей, выделяли с помощью хроматограЛии средства, предложенной Иохансеном» и производили в виде лиоЛилизированного порошка ^5 (10% фермента в лимонно-кислом натрие).Перед использованием фермент обессоливали на установке "Sephadex 025 fine" (1,5 -25 с м ) , уравновешивали и вымывали дистиллированной во- 20 дой. Концентрацию фермента определяли спектрофотометрически при условии 2 K f f , ІМерк). Применяли растворительН Ю СИСТему 0ЧС1 3 {°Л\ з ^ ї ' г ) з Ч У *0Н(СН,С00Н)Н,0 ( U : W : l ) . Пятна визуально проверяли на тушение флуоресценции для оценки состава реагентов , Состав реагентов определяли количественно на установке обращения фазы HPLC с помощью столба RF-8,10 мкм (Мерк) и хроматографа Хькшетт Пакард 1084, снабженного регистратором переменной длины волны (модель 79875А). Разделение обеспечивали при использовании соответствующих удельных градиентов в системах вымывания, составляющих от 10% CH 3 CN в І 0 ммоль НаАс (т>Н 4) до 100% СН 3 СК или от 10 ммоль WaAc (pll 4) до 100% CK 3 fN. Последнюю систему использовали для таких соединений, как Bz-Ala-Gly-OH, Bz-Ala-Ma-OH, Bz-Ala- Ser-OH, и соответствующих амидов. Скорость про5\„„ =14,8. Приготавливали основтекания 3 мл/мин, температура столба ной раствор с концентрацией 7 мг/мл 25 47'С, рабочая длина волны 260 нм. ( П О мкмоль) > хранившийся при -21 С, Выходы определяли из молярного оталиквотными порциями по 250-500 мл. ношения реагентов, которое находили Использовали бензоилаланинметиловый по интегрированным площадям под пикаэфир (Ba-Aia-OMe), выпускаемый фирми вымывания. мой "Бахем", Лишталь, Швейцария. БоИдентификация продуктов. 30 ро-трифторидный эфировый комппекс Пятна идентифицировали методами (для синтеза), растворители и реаккохроматографии тонких слоев с сооттивы (все аналитической чистоты) ветствующими стандартными соединениприобретали у фирмы "Мерк", Дармями. Некоторые продукты идентифициштадт, ФРГ. Все аминокислоты, аминоровали с помощью сочетания метода кислотные амиды и их производные 35 HPLC и аминокислотного анализа. Для закупали у фирмы "Сигма КемикалКомэтого из смеси реакции через К) мич пани", Сан-Луис, США, Харбобензилзабирали аликвотные пробы объемом оксифенилаланинметиловый эфир (Z-Phe1 мл и реакцию останавливали доОМе) изготавливали в соответствии бавлением 250 мкл 6 М НС1, После этос процедурой Ямада и др. и использо- 40 го рН доводили до 4 с помощью ИаОН вали в виде сиропа, Фенилаланингиди смесь разделяли методом HPLC с поразид, аланингидразид и аланингидрамощью оборудования фирмы "Уотерс", зидгидрохлорид изготавливали из эфивключающего два насоса, программное ров в соответствии с описанием Лосустройство составления растворителей се и др. Нескорректированные т.пл. ^5 модели 660, инжектор модели Ь'бК, ресоставляли 86-88 и 184-185°С (по гистратор переменной длины волны моизвестным данным 82-83 и 184-18^°С дели 450, совмещенный с самописцем соответственно). Асларагинамиддигид(радиометр EEC Ы ) , или по известным на подходящей длине волны от 2 5 5 до данным Л4-215°С). Другие исходные 280 нм. Хроматографию осуществляли материалы приобретали у указанных методом обратной фазы с помощью фирм или производили аналогичным об- 55 столба "Уотерс С-І8м-Бондапак" в разом. системе вымывания 20 об.% ГЕАР (триметиламмониефосфатныи бусЪер) в метаОпределение выходных продуктов. ноле с соответствующими градиентами Чистоту определяли количествени скоростью потока 1,5-2,0 мл/мин. но с помощью TLC на силикагеле 60 137878b Буферный раствор ТЕ АР изготавливали по методике Ривьера, Во многих случаях удовлетворительные результаты обеспечивали в системе 0,! К НАс, рН 3, 20 об./,, и 0,1 К НАс, гН 3 в метаноле. Вытекающий поток, содержащий JJацилдипептиды, собирали вручную и доводили до сухости путем лиофилп10 зацни или на установке "Бшхи Роговап" при 35-А5°С. Малые пробы остатков гидролизовали в 6 М НС1 при 11о"с в вакууме з течение 36 ч. Испаренные гидролизаты анализировали 15 на аминокислотном анализаторе типа "Даррум Д-500". Синтез со свободными аминокислотами в качестве аминовон компоненты. П р и м е р ! . 2 мл 0,6 М раствора 20 валина 0,1 М КС1, 1 М KDTA при рН 9,8 смешивают со !00 мкл (0,5 ммоль) 1 М раствора Bz-Ala-OMe (растворенных в 96%-ном этаноле). Реакцию прово- дят в рН-стате при 35°С и рН 9,8, ) 25 причем значение рН поддерживают постоянным путем автоматического добавления 0,5 М NaOH. Реакцию инициируют добавлением 0,7 мг карбоксипептидазы-У (I50 0/мг, производство "Де Форенеде Брижерье"). После про- 30 текания реакции в течение 30 мин, реакцию останавливают с помощью доведения рН до I при посредстве 6 М НС1. Продукт реакции очищают и выделяют с помощью хроматографии при высоком 35 давлении. Выход Bz-Ala-Val-OH составляет 40%. Количественный анализ аминокислоты после гидролиза продукта в 6 М НС1 в течение 24 ч дает соответственно 1,0 моль аланина и 1,0 моль валина. pax выше 45 "С, снижение активности Лермента и неферментативный гидролиз эфиров становятся неприемлемыми. При более низких температурах при рН до 10,0 гидролиз эфиров был пренебрежимо мал в течение 10 мин реакции. Однако он становился существенным при снижении скорости ферментативной реакции, когда длительность реакции возрастала до 2-5 ч. Выход Bz-Ala-Val-OH увеличивался при возрастании концентрации аминоРОН компоненты. Обратная зависимость наблюдалась между выходом и концентрацией субстратной компоненты для Bz-Ala-ОМе. Это обстоятельство с учетом зависимости выхода от высокой концентрации фермента позволяет найти оптимальное отношение субстрата к концентрации фермента. В присутствии 0,5 М валина субстрат Bz-Ala-DMe быстро преобразовывался (в течение 20 мин) в 38% Bz-AJaVal-OH и 62% Bz-Ala-ОН. Эти цифры показывают также, что дипептид не гидролизовался при рН 9,7 в присутствии избыточного валина. Если pi! доводили до 5-8, то весь Bz-Ala-ValOH гидролизовался за несколько секунд. Такое избирательное поведение CPD-Y при высоких рН является свойством, имеющим важное значение при синтезе пептидов. П р и м е р 2 . 2 мл раствора З М лизина, 0,1 М КС1, 1 мМ EDTA при рН 9,8 смешивают с 400 мкл 100%-ного метанола и 100 мкл (0,1 ммоль) 1 И Z-Phe-OMe (растворенного в 100%-ном метаноле). Реакцию проводят аналогично примеру 1, ионизируя добавлением 0,7 мг карбоксипептидазы-У. ЧеВлияние рН, температуры и конценрез 30 мин рЫ доводят до 1 с помотрации субстратной компоненты, амищью 6 М НС1. Продукт реакции очищают новой компоненты и CPD-Y на выход и выделяют способом хроматографии Bz-Ala-Va]-OH+CH3OH изучали с по45 высокого давления. Выход Phc-Lys-OH мощью іпти серий экспериментов, продостигает 60%, Количественный анаведенных аналогично описанной пролиз аминокислот, производившийся анацедуре. И каждом из экспериментов логично примеру 1, показал, что в изменяли один из указанных параметпродукте содержался I моль лизина и ров при постоянстве остальных четы50 1 моль фекилаланина. рех: 0,6 М валии; 55 ммоль Kz-Ala-OMe; Пептиды, представленные в табл.1, 4,5 мкмоль CFD-Y; рН 9,7; 35°С. Попроизводили из указанных исходных лученные результаты показали, что материалов аналогично примерам I и диапазон оптимальных значении рН 2, Эксперименты выполняли в радиодовольно узок и составляет всего „ метрическом рН-стате, а выходы опре0,5 ед. рН, возрастание температуры деляли на установке HPLC. Поддержиреакиии приводит к почти линейному вали значения: 4,5 мкМ CPD-Y; Р Ц возрастанию синтеза нз-за относитель9 /• TS°r но слабого гидролиза. При температу П78785 Синтез с амидами аминокислот в качестве аминовои компоненты. П р и м е р з . 2 мл раствора 0,6 М метионинамида (Met-NH a ), 0,1 М КС1, 1 мМ Е1)ТА при рН 9,8 смешивают со 100 мкл (0,1 ммоль) раствора I M Bz-Ala-OMe в 96%-ном метаноле. Реакцию проводят аналогично примеру 1, инициируя добавлением 0,7 мг карбокt o сииептидазы-Y, Через 30 мин после начала реакции значение рН доводят до 1 с помощью б М НС1. Продукт реакции очищают и выделяют способом хроматографии высокого давления. Вы15 ход Bz-Ala-Met-NH 2 95%. Количественный аминокислотный анализ, проводившийся так же, как в примере 1, показал, что продукт содержал 1,0 моль Ala, 1,0 ноль Met и 1,0 моль Ш3 . 20 В течение 20 мин субстрат почти полностью превращался в дипептид (95%), а 5% гидролизовалосъ до Bz-Ala0Н. является верхним пределом, после которого выход сразу уменьшается. Аналогично примерам 3 и А пептиды, приведенные в табл. 2, приготавливают из указанных исходных материалов. Эксперименты выполняют в следующих условиях: 4 мкМ CPD-Y; рН 9,6; 35 С. Концентрация субстрата приведена в табл. 2. Л р и м е р 5. Синтез с аминокислотными гидразидами в качестве аминовой компоненты. Аналогично примерам 3 и 4 пептиды, приведенные в табл,3 приготавли-. вали из указанных исходных материалов. Эксперименты проводили при 35°С, рН 9,6 в присутствии А,5 мкМ CFD-Y. И р и м е р 6. Синтез с аминокислотными эфирами в качестве аминовой компоненты. Эксперименты с аминокислотными эфирами проводят так же, как в приН р и м е р А . 2 м л раствора 0,4 М 25 мерах 1-А: в радиометрическом рНстате при рН от 9,0 до 9,7 и 23-35 С, валинамида (Val-NH a ) 9 0,1 М КС1, Продукты и выход определяют с помо1 мМ EDTA при рН 9,5 смешивают со щью HPLC. Концентрация CPD-Y состав100 мкл (0,1 ммолъ) раствора I M Бгляла от 4,5 до 11 мкМ. А1а-0Ме в 96%-ном метаноле. Реакций проводят, как в примере 1. Продукт 30 В табл. 4 приведены пептиды, пореакции Bz-Ala-Val-HH a осаждают во лучаемые из указанных исходных матевремя реакции. Через 20 мин после нариалов. Видно, что в отдельных случала реакции рН доводят до I и осачаях имела место некоторая олигомеридок выделяют центрифугированием.Прозация. Поскольку выходы обычно очень дукт растворяют в 1 мл 96£-ного мета-35 высоки, то аминокислотные эфиры можнола, очищают и выделяют способом но считать пригодными для дальнейшехроматографии высокого давления. Выго ограничения олигомеризации. ход Bz-Ala-Val-NH^ составляет 95% э в то время как в примере I при исП р и м е р 7. L- и D-стереоизопользовании свободной аминокислоты в 40 меры в качестве аминовой компоненкачестве аминовои компоненты, он ты. был равен только 40%. КоличественПептиды, приведенные в табл. 5. ный анализ аминокислоты, проводившийбыли получены из исходных продуктов ся так же, как в примере ], показал, так же, как в примерах 1-А и 6. что продукт содержал 1,0 моль Ala, Видно, что включаются только L45 1,0 моль Val и 1,0 моль NH3» изомеры. В результате процесс С Т А Н О Зависимость протекания реакции от В И Т С Я экономичным,поскольку исключазначения рН и от концентрации валинется необходимость очистки исходных амида , аминокислот для получения чистого L-изомера. Реакцию проводили аналогично опи50 санному синтезу, причем постоянные П р и м е р е . Изменения субстратпараметры составляли: 0,6 М валинаминой эфирной группы. да; 55 мМ Pz-Ala-OMe; 4,5 мкМ CPD-Y; Пептиды^ приведенные в табл. 6, рН 9,7; 35°С. " * были получены из указанных исходных материалов так же, как в примерах Полученные результаты показали, что выход практически не зависит от 55 1-А. концентрации валинамида. Результаты доказывают гибкость Эффективное значение рН валинамипредлагаемого способа по отношению да не превышает 9, значение рН 9,8 к выбору субстратов. 1378785 мере ], Видно, что Bz-Ala-Leu-NH3 П р и м е р 9. Депсигтептиды Б качерез 20 мин полностью преобразовычестве субстратов. вался в 68% Bz-Ala-Leu-OH и 32% Как в примерах 3 и 4» пептиды, B^-Ala-OH. Аминокислотный анализ среприведенные в табл. 7, были получеды реакции показал, что Bz-Ala-0H ны из указанных исходных материалов. образуется главным образом в резульПроцесс проводили в присутствии тате отщепления Leu-NIL от Bs-Ala4,5 мкМ СП1-Г при рИ 7,6 25 °С. Leu-№2. Из табл. 7 видно, что обеспечиваются очень высокие выходы. П р и м е р 15. Сравнение пептид10 но-эфирных субстратов с К-концевыми П р и м е р 10, Пептиды в качестзащитными группами и без них. ве субстратных компонент. Так же, как в примерах 3 и 4, пепПептиды, приведенные в табл. 8, тиды, приведенные в табл. 12,были были получены так же, как в примерах получены в следующих условиях: 50 мМ 1-4. Эксперименты проводили в радио15 субстрата, 5 мкМ СРЛ-Y, рН 9,5, 25°С. метрическом рН-ст^те; выходы определяли с помощью HPLC. Постоянно поддерП р и м е р 16, Синтез в присутстживали следующие параметры: 4-25 мкМ вии органических растворителей. СРС-У, рН 7,6 при 25°С. -Так же, как в примерах 1-4 и 6, Зависимость синтеза пептидов от 20 пептиды, приведенные в табл. 13-15. были получены из указанных исходных рН. В тех случаях» когда синтезируемые материалов при указанных концентрапептиды являются неподходящими субциях органических растворителей» стратами для CPD-Y, синтез может выПоддерживали следующие условия: полняться при значениях рН предпоч50 мМ субстрата, 5 мкМ CPD-Y, рН 9,6, 25 тительно 9-10,5, 30°С. П р и м е р 11. Так же, как в при П р и м е р W . Нерастворимая мерах 1 и 3, пептиды, приведенные в (лишенная подвижности) карбоксипептабл. 9, были получены в рН-стате сидаза-ї. при указанных значениях рН. CPD-Y присоединяли к реактиву 30 Опыты проводили при 25*С в при"Конкавалин-А-Сефароза 4в", выпускасутствии 15 М7смоль CPD-Y. емому фирмой "Фармациа Файн КемиДругие аминовые компоненты. калз", после чего формировали переП р и м е р а , Пептиды, привекрестные связи между HPD-Y и Конкаденные в табл. ]0, были получены так валином А с глутаральдегидом, как же t как в примерах 3 и 4, Эксперимен-35 описано Хсиас и Ройером. Концентрация CPD-Y составила j мг на расфаты выполняли в рН-стате, выходы опресованную Сефарозу. деляли с помощью HPLC. Опыты проводили рН 4,5 мкМ CPD-Y, рН 9,5, 25°С. Пептиды, приведенные в табл. 16, I р и м е р 13. Синтез пептидов I 40 были получены так же, как в примерах с ячменными карбокснпептидазами. 1 и 3, при следующих условиях: Ь0 м М Прорастающий ячмень, например, субстрата, 0,25 мл геля CPD-Y (5 мкм в виде солода содержит две различные CPD-YJ; рН 9,7; 35°С. После удалекарбоксипептидазм, обозначаемые \ ния фермента путем фильтрации продукСР-1-1 и СР-2-1. 45 ты и выходы определяли с помощью СР—1—1 и СР-2-1 изолировали по HPLC. методике Рэн; пептиды, приведенные в табл. 11, были получены так же, П р и м е р І 8. Амиды пептидов в как в примерах 1-4, из указанных искачестве субстратов. ходных материалов. Поддерживали слеРаствор Ь мл Вг-А1а~Ъеи-Ш г в дующие условия: 6 мкМ СР-1-1 или 50 0,10 М KCL, 1 мл EDTA в присутствии СР-2-1, рН 8.0, 25°С. 10%-ного диметилформамида при рН П р и м е р 14. Диамкдация пептид10,0, 25°С смешивали с 0,25 М валинных амидов при катализе карбоксипепамида. тидазой. Реакцию инициировали добавлением К 2 мл раствора 3 5 мМ Bz~Ala-Leu55 40 м CPD-Y и проводили аналогично М ЯН г в 0,1 М КС1, 1 мМ EDTA (рН 9,7, примерам 3 и 4. Bz-Ala-Leu-Yal-NH a 25°О в 10%-ном диметилформамиде выделяли методом HPLC с выходом подобавляли 2 мг CPD-Y. Результаты рядка 65%. определяли с помощью HPLC, как в при 7 9 1378785 10 Реакцию повторяли с использованиСтупенчатый синтез мет-энкеЛалием Bz-Ala-Flu -ЫН в качестве субстка при использовании в качестве исратной компоненты. Bz-Ala-Phe-Yal-ЇШ ходного вещества 5 і Bz-Aj g - O t и выделяли методом 4PLC с выходом п о - ч в присутствии CPD-Y в качестве катарядка 44%. лизатора проводили по следующей схеме: синтез мет-энкефалина с испольП р и м е р 19 Синтез мет-энкезованием в качестве катализатора фалина. CPD-Y; выход для каждой стадии приведен в скобках. Bz-Arg-Oet рН 9,6 \ рН 9,6 CPD-У H-Tyr~-NH2 -NH 2 (85°/o> c p 2-Y Н-Туг-Gly-Gly-Phe-Met-OH (95%) pH8,0 / Trypsin BZ-Arg-Tyir-Gly-Giy-Phc-Met-OH pH9,5 t CPD-Y 1 (75%V H-Mei-OH Bz-Arg-Tyr-OH (90%) " EiOH/HCl Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-Oet (80%) | FtOH/HCl Bz-Arg-Tyr-Oei (80%) pH 9,0 СРЯ-Y I H-Gly-Oel Bz-Arg-Tyf-Gly-Gly-Pbe-OH pH 9,5 CPD-У Bz-Arg-Tyr-Gly-Gly-0et(60°/a) B; CPD-У, (95%) (65%) pH-8,0 Стадии катачизируемой C^B-Y конденсации и деамидирования проводили в чистой водной фазе, а Bz-Arg был 35 выбран в качестве солюбилизирующеи защитной іруппьї, которая может быть удалена на последней стадии с помощью трипсина. После расширения пептида под воздействием амида амино40 кислоты с последующим деамидированием, следующий пепгидно-слохноэфирный субстрат синтезировали с помощью абсалютированного этанола и безводной НС]. После каждой стадии реагенты 45 выделяли методом препаративной HPLC. Таким способом могут быть также регенерированы избыток аминной компоненты и побочные продукты гидролиза Предлагаемый способ позволяет уп- 50 ростить процесс ферментативного получения пептидов за счет использования экчопептидач вместо применявшихся ранее ферментов, каждый из которых проявлял доминирующую или по мень шей мере значительную эндопептидазную 55 активность, что позволяет расширить набор аминных и субстратных компонент, использовать ферментативный процесс для синтеза многозвенных биологически активных пептидов, например энкефалина, значительно сократить использование защитных групп, проводить стеноспецидшческий синтеч, снизить расход фермента до концентрации 2-25 мкмоль, проводить процесс в бопее широком диапазоне рН (7,6-і0,5Ї с получением стабильного высокого выхода целевого продукта, Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я 1, Способ ферментативного получения пептидов общей формулы А-В, где А:И - концевой защищенный L-аминокислотный остаток или пептидный остаток состава 2-6 L-аминокислот, содержащий L-аминокислоіу на его С-терминальном конце и необязательно защитную группу на ^-терминальном конце, В:У - аминокислотный остаток, который может быть С-терминально защищен, путем взаимодействия аминокислотной и субстратной компонент в растворе в присутствии фермента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, 1378785 u с целью упрощения процесса,в качестве субстратной компоненты ИСПОЛЬЗ У Ю Т компоненту, выбранную из группы, содержащей сложные эфиры аминокислот-, сложные эфиры пептидов и депсипептидов формулы A-OR,, где значения А указаны выше, Р., - С < -С 4 ~алкил, бензил или альфа-дезамино-фрагмент Gly, Ala или Phe; амиды аминокислот \Q или пептидов формулы A-NH^, где значения А указаны выше, пептиды формулы А,~Х, где А д - L-аминокислота или ди-лентапептид, X - L-аминокислота, а в качестве аминной компоненты ис15 попьзуют компоненту, выбранную из группы, содержащей аминокислоты общей формулы Н-В-ОН, где значения В указаны выше, амиды необязательно N-замещеннон аминокислоты формулы 2п H-B-NHR 3 , где -значения Б указаны выше, R 3 - водород, оксигруппа, амино, С,-С^-алкил, сложные эфиры аминокислоты формулы H-B-OR., где значения В указаны выше, R - С,-С.-ал- 25 кил, и процесс ведут в присутствии L-специфического серии- или тиоалкил карбоксипептидазного энзима, который вводят в реакционную массу в концентрации от 2 до 25 мкмопь, процесс ведут в водном растворе или дисперсии при рН 7,6-10,5, 25~45°С при исходной концентрации субстратной компоненты 0,01-0,15 моль, аминной компоненты, 0,05-3,000 моль с последующим выделением необязательно защищенного пептида, после чего в случае необходимости отщепляют группы R. или К 4 с помощью серинкарбоксипелтидазного энзима, 2, Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве карбоксипептидазного энзима используют карбоксипептидазу-У из дрожжей, карбоксипептидаз СР—1—1 или СР-2-1 из проростков ячменя. 3. Способ по п, 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что используют водный раствор, содержащий 0-20% органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из низшего алканола, диметилформамида или полиэтиленгликоля. Т а б л и ц а 1 Синтез пептидов с катализацией кярбоксипептидазой-Y ппн использовании свободных аминокислот в качестве аминовой компоненты Субстрат (концентрация) 1 Bz-Ala-OMe (55 мМ) Аминовая компонента (концентрация) 2 Продукт Выход, % 4 3 Глицин (3,0 М) Bs-Ala-Gly-OH 62 Алании (1,9 М) Вг-АЪа-А1,а-ОН 65 Валин (0,Ь М) Bz-ALa-Val-0H (пример 1) 40 Лейцин (0,17 М) Фенилаланин (0,16 М) Bz-ALa-Leu-OH Bz-ALa-Phe-OH 24 Серии (3,2 М) Bz-ALa-Ser-OH Треонил (0,7 М) Bz-ALa-Thr-OH Метионин (0,6 Н ) Bz-ALa-Met-OH Лизин (J,5 M) Bz-ALa-Lys-OH Аргинин (6,8 м) Bz-ALa-Arg-OH Аспарагиновая кислота (1,0 М) Bz-ALa-^sp-OH 27 50 24 46 56 26 0* 1378785 13 u Продолжение табл. 1 1 ' _j Аспарагин J (0,b М) Глутаминовая .кислота (1,2 М ) з J. 4 Bz-ALa-Asn-OK 5 Bz-ALa-Glu-QH Q Метиловый эфир глутамнновой кислоты (1,0 М ) Bz-Ala-Gl\i( OMe) -OR Bz-Ala-He-OH 40 Bz-Ala-Сіп-0И 20 0~трет-6утиловый эфир аспаргиновои кислоты (0,3 М) Bz-Ala-Asp/O^ u/-0H 30 Триптофан (0,05 М) Bz-Ala-Trp-OH 10 Гистидин (1,0 М) Z-Phe-OMe (55 мМ) Изолеицин (0,35 М) Глутанин (0,5 М) Bz-Ala-OMe (50 мМ) 30 Bz-Ala-His-OH 15 1 6' Валин (0,6 М) Z-Phe-Val-OH Лизин (3,0 М) Z-Phe-Lys-OH 60 Валин (0,6 М) Bz-Phe-Gly-Val-OH АО Глицин (2,0 М) Z-Ala-Gly-OH 30 Алании (0,7 М ) ' S-Ala-Ala-OH 60 Лейцин (0,15 М ) Z-Ala-Leu-0H (пример 2) Bz-Phe-Gly-ОМє (ЗО мМ) Z-A]a-OMe (10 мМ) 21 І Лизин (1,5 М) Z-Ala-Lys-OH 60 Bz-Gly-OMe (20 мМ) Глицин (2,0 М) Ez-Gly-Gly-OH 63 (50 мМ Алании (0,8 М) Bz-Phe-Ala-OH 85 Z-Ala-Ala-Gly-OH 40 Z-Ala-Ala-Leu-OH О Фенилаланин (0,15 М) 2-АЛа-А1а-РЬе-0Н О Глицин (2,0 М) Z-Ala-Phe-Gly-O? 35 Лейцин (0,15 М) Z-Ala-Phe-Leu-OH О Лейцин (0,15 М) Z-Ala-Ser-Leu~OH 2-А1а-А1оГлицин (2,0 М) -ОМе (10 мМ) Лейцин'(0,15 М) -OMe (10 мМ) Z-Ala-Eer-ЭМе (10 мМ) 15 1378785 16 Продолжение табл, | 25 Z-Ala-Val-Lys-OH 60 Глицин (2,0 М) Z-Ala-NLeu-Gly-OH 60 Z-ALa-NLeu-Ieu-OH 16 Глицин (2,0 М) Z-ALa-Met-Gly-OH 50 Лейцин (0,15 М) Z-ALa~Met~Lpn-OH 15 Глицин (2,0 М) Z-Ala-Trp-Gly-OH 23 Лейцин (0,15 М) Z-Ala-Trp-Leu-OH Фенилаланин (0,15 М) Z-Ala-Trp-Phe-OH 0 Лизин (1,5 М) Z-Ala-Trp-Lys-OH 36 Лейцин 0,15 М Z-Ala-Ala-Tyr-Leu-OH 0 Лизин (1,5 М ) Z-Ala-Ala-Tyr-Lys-OH 23 Алании (1,7 М / Z-Ala-Met-ОМе (10 мМ) Z-Ala-Val-Cu-OH Лейцин (О,15 м) Z-Ala-Nheu-ОМе (10 мМ) Лейцин (0,15 М) Лизин (1,5 М) Z-ALa-Val-ОМе (10 мМ) Z-Ala~Ala-Tyr-Ala-OH 31 -ОМе (10 мМ' Z-Ala-Trp-ОМе (10 мМ) Z-Ala-Ala-Туг-ОМе (10 мМ) • 3 Т а б л и ц а 2 Синтез пептидов при использовании аминокислотных амидов в качестве аминовой компоненты; катализатор - карбоксипептидаэа-Y Субстрат (концентрация) 1 Bz-Ala-OMe (55 мМ) Аминовая компонента (концентрация) 2 Продукт Выход, X А 3 Глицинамид (0,3 М) Bz-Ala-Gly-NH, 90 Серинамид (0,3 М ) Bz-Ala-Ser-NH0 г 2 Bz-Arg-OEt (75 мМ) Тирозинамид ( 0 , 2 М) B?-Tyr-OEt (50 мМ) Валинамид ( 0 , 2 5 М) Bz-Tyr-Val-NH 94 Глицинамид ( 0 , 5 5 М) Bz-Tyr-Gly-ЫН 2 82 Лейцинамид (0,25 М) Z-Pro-Leu-NH 2 0 Гистидинамид ( 0 , 2 М) Bz-Gly-His-I4H 2 20 Глицинамид ( 0 , 5 5 М) Bz-Gly-Glv-NF, 95 Лейцинамид ( 0 , 2 5 М) Bz-Gly-Leu-KH г 94 Лейцинамид (0,15 м) Z-Ala-Phe-Leu-NH Z-Pro-OMe (50 мМ) Bz-Gly-OMe (100 мМ) Z-Ala-Hie-ОМе (10 мМ) 52 2 95 19 1378785 20 Продолжение табл.2 Глицинамид 10,15 м) Z-Ala-Trp-ОМе (10 мМ) Z-Thr-Pro-ОМе (25 мМ) Z-Ala-Ala-Leu-NH2 100 Лейцинамид (0,15 М) Z-Ala-Ser-Leu-HH2 95 Z-Ala-Ser-Gly-ТЇНд 70 Лейцинамид (0,15 М) Z-Ala-Val-Leu-NK2 8A Z-Ala-Val-Gly-NH^ 100 Лейцинамид (0,15 М) Z-Ala-NLeu-Leu-NHa 100 Z-Ala-NLeu-Gly-Шд 100 Глицинамид (0,15 М ) Z-Ala-Met-Gly-NH г 95 Глицинамид (0,15 М) Z-AIa-Trp-Gly-NH2 84 Лейцинамид (0,15 м) Z-Ala-Met- -ОМе (10 мМ) 100 Глицин амид (0,15 М) Z-Ala-NLeu-Leu (10 мМ) Z-Ala-Ala-Rly-NH2 Глицинамид (0,13 М ) Z-Ala-Val-ОМе (10 мМ) Глицинамид (0,15 М) Глицинамид (0,15 М ) Z-Ala-Ser-ОМе (10 мМ) 84 Лейцинамид (0,15 М/ Z-Ala-AJ a-ОМе (10 мМ) Z-Ala-Phe-Gly-NHa Z-AJ.a-Trp-Leu-NH Валинамид (0,2 М ) Z-Thr-Pro-Val-KH2 ' " 89 95 Z-Ala-Ala-Туг-ОМе - (10 мМ) Глнцинамид (0,15 М) Z-Ala-Ala-Tyr-Gly-NH2 100 Лейцинамид (0,15 М) Z-Ala-Ala-Tyr-Leu-NK2 100 Z-Tyr-Gly-Gly-OMe (20 мМ) Фенилаланинамид (0,2 M) Z-Tyr-Glv-Gly-Phe-NH 40 2 * Продукт осаждался. T а б л и ц а З Катализированный карбоксипептидазой-Y синтез пептидов с аминокислотными гидразидами в качестве аминовой компоненты Субстрат (концентрация) Аминовая компонента (концентрация) Br-Ala-ОМе Аланингидразид (0,6 М) Bz-Ala-Ala-NH-NH, 37 Фенилаланингидразид (0,3 М) Bz-Ala-Phe-NH-NH 80 Продукт Выход 21 1378785 22 Т а б л и ц а 4 Катализированный карбоксипепсидаэой-Y синтез пептидов с аминокислотными эфирами в качестве аминовой компоненты Субстрат (концентрация) 1 Bz-Ala-OMe (50 мМ) Аминовая компонента (концентрация) 2 Продукт Выход, % 4 3 Глициноэтиловый эфир (0,5 М) Bz-Ala-Gly-OH Bz-Ala-Gly-Gly-OH Глицинпропиловый эфир (0,5 М) Bz-Ala-GHy-OH 89. Глицинизопропиловыи эфир ( 0 s 5 M) Bz-Ala-Gly-OH 90 Глицинбутиловый эфир (0s5 M ) Bz-Ala-Gly-OH 80 Bz-Ala-Leu-OH Bz-Ala-Leu-Le-a-OH Bs-Ala-Leu-Leu~Leu-0H Bz-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-0H 85 Лейцинметиловый эфир '(0,5 М) • Лейцинэтиловый эфир (0,25 M) Bz-Ala-Leu-OH Bz-Ala-Leu-Leu-OH Лейцин--Ь-бутиловый эфир (0,25 М) Bz-Ala-Leu-OH 100 50 0 Фенил ал анинметиловыи эфир (0,25 М) Bz-Ala-Phe-OH Bz~Ala-Phe-Phe-OH Bz-Ala-Phe-Phe-Phe-OH Фенилаланинэтнловыи эфир (0,15 М) Bz-Ala-Phe-OH Bz-Ala-Phe-Phe-OH 70 Метиловый эфир (у-t-Bu) глутаминовой кислоты (0,5 М) Bz-Ala-Glu(tf-t-Bu)-OH 35 y t-бутиловый эфир глутаминовой кислоты (0,25 М) -t-Bu)-OH Метионинметиловый эфир (0,2 М ) Метионинэтиловый эфир (0,2 М) 80 Bz-Ala-Met-OH Bz-Ala-Met-Met-OH Bz-Ala-Met-Met-Met-OH 86 Bz-Ala-Met-Met-Met-Met-' -0И Bz-Ala-Met-OH A0 1378785 23 24 Продолжение табл.4 4 3 2 1 Метионинизопропиловый эфир (0,2 М) Bz-Ala-Met-0H Валинметиловый эфир (0,7 М) Bz-Ala-Val-OH Bz-Ala-Val-Val-OH 85 Серинметиловый эфир (0,5 М) Bz-Ala-Ser-0H 50 Bz-Ala-Tyr-0H 25 Bz_-Ala-Arg-0H 0 8 і Тирозинметиловый эфир (0,5 М) Аргининметиловый эфир (6,5 М) Аргинин (N0 2 ) метиловый эфир (0,5 М) Br-Ala-Arg(U02)-0H 40 Гистидинметиловый эфир (0,5 М) Bz-Ala-His-OH 26 Треонинметиловый э