Спосіб гідролізу лігноцелюлози з одночасним виробленням ферментів

Реферат: Винахід належить до способу деградації лігноцелюлозної біомаси, при якому ефективність гідролізу біомаси посилюється в присутності механічно або хімічно обробленого мікроорганізму, здатного продукувати відповідні гідролітичні ферменти. Деградація лігноцелюлозної біомаси відбувається за допомогою спільно вироблених коктейлів ферментів. UA 105343 C2 (12) UA 105343 C2 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої відноситься винахід У даному винаході запропоновано спосіб біотехнологічного виробництва мономерних сполук, таких як цукри та/або етанол, з лігноцелюлозної сировини. Попередній рівень техніки Внаслідок обмеженості ресурсів мінерального палива й вимог щодо зменшення викидів CO 2, у хімічній індустрії здійснюється пошук більш надійних виробничих шляхів для виготовлення цінних хімічних речовин, таких як рідке паливо й продукти базової хімії. Частина стратегії сфокусована на перетворенні лігноцелюлозної біомаси на різноманітні хімічні речовини або паливо, таке як етанол. Лігноцелюлозна біомаса містить целюлозу (~25-40% мас./мас. сухої реч.), геміцелюлозу (~15-25% мас./мас. сухої реч.) і лігнін (~15-30% мас./мас. сухої реч.) як основні компоненти та мінорні кількості інших вуглеводів, смол, білків і неорганічних сполук. Конкретна композиція будь-якої сировини може бути визначена за описом Sluiter et al., 2008. Серед форм рослинної біомаси лігноцелюлозна біомаса, отримана з будь-яких відходів лісового й сільського господарства, таких як деревні відходи й солома зернових є особливо придатними для перетворення на цінні хімічні речовини й паливо внаслідок їхньої доступності, низької вартості і природозберігаючого виробництва. Крім того, аналіз життєвого циклу технологічних процесів, які використовують лігноцелюлозну сировину, демонструє знижений викид парникових газів у порівнянні із процесами, які використовують іншу сировину. Були описані різні варіанти способів перетворення лігноцелюлозної біомаси на етанол та інші продукти базової хімії (Pejo et al., 2008). Для реалізації цих способів у промисловому масштабі є особливо доцільним перенесення максимальної кількості енергії, вуглецю й маси, які утримуються в відновлюваній сировині, у кінцеві продукти. У той же час жоден з описаних способів перетворення не був реалізований у повній мірі. Типовими процесами біотехнологічного перетворення лігноцелюлозного матеріалу (наприклад, соломи) на цінні продукти (наприклад, етанол) є: механічне подрібнення, фізикохімічна попередня обробка, ферментативний гідроліз, ферментація й вилучення продукту. Ключовий бар'єр у реалізації вироблення етанолу із целюлози в промислових масштабах полягає в ефективному за вартістю ферментативному гідролізі попередньо обробленої лігноцелюлози за умов високих концентраціях твердих речовин. Гідроліз целюлозної фракції був ідентифікований як одна з основних перешкод у перетворенні лігноцелюлози на етанол. У той же час ціна й ефективність ферментів, які потрібні для ефективного гідролізу біомаси є основними вузькими місцями. Перетворення деревного або сільськогосподарського лігноцелюлозного матеріалу на цукри й далі на етанол є складним процесом, який охоплює кілька стадій, включаючи послідовні комбінації механічного подрібнення біомаси, гідротермічної попередньої обробки, ферментативного або хімічного гідролізу біомаси, мікробної ферментації гідролізатів біомаси й вилучення етанолу дистиляцією або за допомогою технологічних еквівалентів. Механічне подрібнення біомаси Типові стадії подрібнення включають механічну обробку, таку як нарізання, розчавлювання або розмелення сировини, які, як правило, вимагають значного споживання енергії й значних виробничих витрат. Сировину розрізають або товчуть до часток розміром від 0,5 мм до 2 см, що дає однорідну суспензію у водній фазі. Суспендування часток сировини в суспензію, яка може піддаватися перекачуванню, і яка може бути перенесена в подальші типові процеси, вимагає великих кількостей води, що додатково збільшує виробничі витрати способу (Tolan, 2002). Попередня обробка Перетворення лігноцелюлозного матеріалу на продукти, такі як етанол, часто включає стадію фізико-хімічної попередньої обробки. Мета попередньої обробки полягає у видаленні й відділенні геміцелюлози від целюлози, у руйнуванні й видаленні лігнінової оболонки, зменшенні кристалічності целюлози, збільшенні доступної площі поверхні целюлози, і/або збільшенні розміру пор целюлози для полегшення проникнення гідролізуючих агентів (Tolan,2002; Wyman et al., 2005). Стадія попередньої обробки бажано мобілізує пентозну фракцію зазначеної біомаси, при цьому також підсилює ступінь переварювання твердої целюлозовмісної фракції (Wyman et al., 2005). Стадію попередньої обробки часто проводять із використанням водної суспензії. Переважно така суспензія має високий вміст твердих речовин, на які в сухій масі сировини припадає порядку 20-40% (мас./мас.). Спосіб попередньої обробки часто включає гідротермічну обробку біомаси за підвищеного тиску (~ 100-250 °C) за відсутності або в присутності кислотних (тобто H2SO4, HСl, H3PO4) або основних (тобто NH4OH, NaOH, KOH, вапна) каталізаторів, які додаються в концентраціях від 0,1 до 15% мас./мас. сировини (Kumar et al., 2009a; Kumar et al., 2009b; Kumar et al., 2009c, Wyman et al., 2005). Час реакції варіює від 10 с до 2 год. для 1 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 забезпечення ефективної трансформації компонентів біомаси при приготуванні до гідролізу й ферментації біомаси. Альтернативні стратегії попередньої обробки включають м'які гідротермічні обробки з використанням органічних розчинників або іонних рідин для зменшення непіддатливості біомаси та для солюбілізації лігнінового й целюлозного компонентів біомаси. Ці останні варіанти попередньої обробки часто є більш дорогими та мають обмежену ефективність. Chandra et al. (2007) пишуть, що гідротермічна попередня обробка за відсутності або в присутності розведеної кислоти є кращим способом зменшення непіддатливості біомаси до гідролізу, оскільки даний спосіб надає рухливості геміцелюлозі й частково деполімеризує лігнін без солюбілізації. Крім того, даний спосіб у результаті дає аморфні волокна целюлози з великою площею поверхні, яка є ідеальною для ферментативного гідролізу. Залежно від природи каталізаторів і застосованого профілю температури, попередня обробка також може привести до утворення розчинних інгібіторів, включаючи оцтову кислоту, цукор (наприклад, фурфурол, HMF) або продуктів деградації лігніну, які можуть зменшувати ефективність подальших процесів гідролізу й ферментації (Margeot et al., 2009). Для збільшення ефективності гідролізу й ферментації надосадову рідину після попередньої обробки необхідно відкидати або її необхідно детоксифікувати (Tolan, 2002). Гідроліз попередньо обробленої біомаси Розпад суспензії попередньо обробленої біомаси на ферментовані мономерні цукри може бути виконаний гідролізом або за допомогою кислоти, або за допомогою ферментів. Ферментативний гідроліз є більш селективним і менш енергоємним, ніж порівнювані хімічні (наприклад, на основі кислоти) методики, отже, забезпечують більш сприятливі економічні показники процесу й потенційно більш високий вихід етанолу в ході ферментації. Ферментні системи й суміші більш ніж однієї ферментативної активності. У цьому сенсі придатними ферментними системами є ферментні системи, які перетворять полімерні цукри, такі як целюлоза й геміцелюлоза, на мономери гексоз (тобто на глюкозу) і пентоз (тобто на ксилозу), які, як правило, мають активності целюлаз, геміцелюлаз і бетаглюкозидаз. Ферментні системи, які мають активності целюлаз і бета-глюкозидаз, часто одержують у занурених культурах грибів, наприклад, Trichoderma sp. і/або Aspergillus sp. Залишок грибної біомаси, як правило, відокремлюють від ферментаційного середовища й відкидають. Ферментаційне середовище потім концентрують, стабілізують і для транспортування виготовляють із неї продукт із отриманими ферментами. Ферментативний гідроліз біомаси, як правило, проводять за умов, за яких загальна доза ферменту становить 1-5 % мас./мас. (10-20 FPU/г целюлози) сировини. Залежно від режиму дозування й конкретного складу ферментів прикладної ферментної системи, біомаса гідролізується за температури 40-55 °C протягом 1-7 днів. Аж до приблизно 80-90% мас./мас. полімерних цукрів, які містяться в біомасі, перетворюються на їх відповідні мономери. Згідно Kristensen et al. (2009) ферментативний гідроліз біомаси часто проводять за більш низького вмісту твердих речовин 10-20 % мас./мас. Вміст сухої речовини вище 15% мас./мас. часто призводить до значних втрат на виході мономерних цукрів. Цей ефект зумовлений проблемами, пов'язаними з гомогенним перемішуванням суспензій з високим вмістом твердих речовин, які призводять до нерівномірного розподілу ферментів. Крім того, нагромадження кінцевих продуктів, таких як целобіоза й глюкоза, вивільнених у процесі ферментативного гідролізу, може призвести до специфічного інгібування активностей целюлаз і бета-глюкозидаз (Xiao et al., 2004a). Cardona & Sanchez (2007) описують застосування попередньо обробленої надосадової рідини й/або отриманих раніше гідролізатів біомаси як субстрату для росту й індукції при виробленні ферментів грибами. Howard et al. (2003) описує пряме застосування виснаженого рідкого ферментаційного середовища після грибної ферментації для гідролізу. Rao et al. (1985) описують використання цільної суспензії грибної ферментації для ефективного гідролізу целюлозних субстратів. Для вироблення гідролітичних ферментів використовували штучні середовища, які не дозволяли адаптувати системи гідролітичних ферментів для конкретної сировини й/або для варіанта попередньої обробки. Інший недолік способу, описаного Rao et al. (1985), полягає в тому, що спосіб обмежений секретованими ферментними активностями, оскільки нічого робиться для полегшення вивільнення несекретованих або пов'язаних із клітинною поверхнею ферментів. При використанні для гідролізу біомаси ферментних систем, отриманих з Trichoderma, активності позаклітинних бета-глюкозидаз найчастіше є швидкість- і вихід-лімітованими внаслідок відносно низької питомої активності й значного інгібування кінцевим продуктом, глюкозою, вивільненою в ході процесу (Xiao et al., 2004a), Shewale, 1982). Xiao et al., 2004a), 2 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Shewale, 1982).Отже, препарати або суміші целюлаз, як правило, доповнюються альтернативними бета-глюкозидазними (BGL) активностями, продукованими, наприклад, Aspergillus niger (Seidle et al., 2004). Стандартні режими дозувань для препаратів BGL рекомендують додавання від 0,01 до 2 одиниць целобіази (CBU) на г целюлози для поліпшення кінетики гідролізу й збільшення виходу мономерних цукрів (Chauve et al., 2010). Альтернативні стратегії усунення технічної проблеми гідролізу біомаси за більш високих концентрацій твердих речовин включають способи, у яких ферментативний гідроліз і ферментацію проводяться одночасно (SSF). Ферментація етанолу Промислове виробництво етанолу традиційно проводять за допомогою дріжджів S. cerevisiae. Не дуже давно для ефективного використання цукрів, отриманих із сирого лігноцелюлозного матеріалу, які не є глюкозою, були розроблені нові мікробні штами (або дріжджів, або бактерій). Використання пентоз і всіх гексоз поліпшує економіку виробництва етанолу. Вилучення продукту Етанол, як правило, вилучається з ферментаційного середовища за допомогою відомих способів дистиляції й/або ректифікації. Проблема, яка повинна бути вирішена Звичайні способи деградації біомаси є або неефективними, або залежать від додавання окремо вироблених ферментів або ферментних сумішей, придатних для деградації конкретної біомаси, що потребує додаткового часу й витрат. Отже, завдання даного винаходу полягає в забезпеченні поліпшеного способу деградації біомаси, такої як лігноцелюлозна біомаса в обхід цих недоліків. Сутність винаходу У даному винаході пропонується спосіб деградації попередньо обробленої лігноцелюлозної біомаси, який передбачає стадії: c) культивування мікроорганізму, здатного виробляти, щонайменше, один фермент, який проявляє целюлолітичну і/або геміцелюлолітичну активність в ростовому середовищі, з одержанням таким чином збагаченої мікроорганізмом суспензії, яка містить, щонайменше, один зазначений фермент; d) обробки мікроорганізму й/або збагаченої мікроорганізмом суспензії стадії c); e) гідролізу попередньо обробленої біомаси продуктом стадії d) у реакторі для одержання розчинних цукрів. У деяких випадках попередньо оброблена лігноцелюлозна біомаса була отримана з лігноцелюлозної біомаси за допомогою фізико-хімічної обробки. Існує можливість того, що ростове середовище стадії с) містить лігноцелюлозну біомасу, яка попередньо була оброблена. У окремому втіленні вищевказаного, кінцеве ростове середовище, у якому культивується мікроорганізм, містить частину попередньо обробленої суспензії, так, щоб спосіб деградації лігноцелюлозної біомаси включав стадії: a) фізико-хімічної попередньої обробки лігноцелюлозної біомаси для одержання попередньо обробленої суспензії; b) розділення попередньо обробленої суспензії стадії а) на дві частини, частину А і частину В; c) включення частини А до сирого ростового середовища для одержання кінцевого ростового середовища, і культивування, щонайменше, одного мікроорганізму, здатного продукувати, щонайменше, один фермент, який проявляє целюлолітичну й геміцелюлолітичну активність у кінцевому ростовому середовищі, з одержанням за допомогою цього збагаченої мікроорганізмом суспензії, яка містить зазначений, щонайменше, один фермент; d) обробки мікроорганізму й/або збагаченої мікроорганізмом суспензії стадії с); е) гідролізу біомаси частини В і продукту частини d) у реакторі для одержання розчинних цукрів. Гриби є кращими мікроорганізмами в стадії с). Обробка стадії d) може відбуватися фізично або механічно або хімічно або за допомогою комбінації вищевказаного. Розчинні цукри, отримані на стадії е), необов'язково можуть бути піддані подальшим способам перетворення, таким як вироблення етанолу. Із цією метою може бути проведений поділ на тверду фазу/рідку фазу так, щоб одержати збагачену цукром рідку фазу, яка містить розчинні цукри. У даному винаході пропонується поліпшений спосіб гідролізу лігноцелюлозної біомаси. У даному винаході описаний спосіб гідролізу й ферментації для виробництва етанолу із залишків лігноцелюлозної біомаси (приклад якого показаний на Фіг. 1), який включає ефективне використання ферментів, вироблених разом з ним. 3 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно із даним винаходом, вироблення гідролітичних ферментів включене в даний процес, бажано в безпосередній близькості від процесу гідролізу. Потім повну ферментаційну суспензію, яка містить розчинні ферментні системи й грибну біомасу, використовують для гідролізу лігноцелюлозної сировини на складові цукри. Спільне вироблення зазначених ферментних систем, за допомогою частини попередньо обробленої сировини як ферментаційного середовища зумовлює оптимальну гнучкість варіантів сировини й попередньої обробки. У ключовому аспекті винаходу несподівано було виявлено, що фізична або механічна або хімічна обробка мікробної біомаси, зокрема механічна фрагментація грибної біомаси перед ферментативним гідролізом, буде призводити до прискорення кінетики гідролізу й кращого виходу мономерних цукрів (наприклад, глюкози) у порівнянні з використанням ферментаційної надосадової рідини або поживного середовища без обробки мікробної біомаси або за допомогою тільки компонентів розчинних гідролітичних ферментів, які утримуються в очищеній надосадовій рідині ферментаційного поживного середовища. Докладний опис винаходу Даний винахід охоплює поліпшений спосіб деградації біомаси, такої як лігноцелюлозна біомаса. Біомаса, яка зазнає обробки способом запропонованим даним винаходом, може бути біомасою, описаною нижче. До такої відноситься біомаса, яка містить великі частки або шматки, такі як деревні відходи, кукурудзяна солома, макуха цукрової тростини, солома злаків, і, отже, механічне подрібнення необов'язково може бути проведене до здійснення конкретного способу даного винаходу. В іншому випадку основна частина часток біомаси, наприклад, 90% або більша кількість часток, є досить малими, і можуть бути оброблені в суспензії, тобто вони мають діаметр не більше ніж 2 см, краще не більше ніж 0,5 см, ще краще, не більше ніж 2 мм, так що механічне подрібнення не потрібне. Однак, у випадку проведення подрібнення, його проводять у такий спосіб: Механічне подрібнення Згідно із кращим втіленням винаходу, будь-яка лігноцелюлозна біомаса буде піддана грубому подрібненню, з використанням обладнання, такого як молот або кульовий млин або дробарка або будь-якого іншого типу або комбінації таких апаратів, які є придатними для нарізання залишків біомаси на шматки, у яких 90% або більша кількість часток має діаметр не більше ніж 2 мм, що призводить до одержання біомаси з малим розміром часток. Попередня обробка Ціль попередньої обробки полягає в дестабілізації й/або частковому гідролізі полімерних структур (малих часток) біомаси. Біомаса, яку піддають попередній обробці, як правило, є сухою, тобто не суспендованою у рідкій фазі. Цю біомасу потім переносять у реакційний посуд за допомогою будь-якої системи транспортування, відомої в даній галузі, такої як, наприклад, конвеєрна стрічка або гвинтовий транспортер. Біомасу, яка складається із дрібних часток, переносять у стійкий до тиску посуд й потім піддають попередній обробці. Продукт стадії попередньої обробки синонімічно називають «суспензією» або «попередньо обробленою біомасою» або «попередньо обробленою лігноцелюлозною біомасою» або «суспензією попередньо обробленої біомаси». Попередня обробка може бути хімічною попередньою обробкою, тобто обробкою за допомогою кислоти або лугу. Бажано, така обробка може бути проведена в присутності кислотного каталізатора, який у необмежуючому прикладі може бути обраний з поміж H2SO4, H2NO3, HCl, H3PO4, SO2. В найкращому втіленні кислотою є H2SO4. Кислотний каталізатор може бути застосованим в концентраціях 0-10% мас./мас. сухої реч. сировини. У більш кращому втіленні винаходу концентрацію кислоти корегують до 0,1-3 % мас./мас. сухої реч. сировини. В іншому випадку попередня обробка може бути термічною обробкою, наприклад, експонуванням за температури вищої за 80 °C. Однак найкраще, щоб хімічна й термічна обробки були об'єднані. У ще кращому втіленні винаходу гідротермічна попередня обробка може бути проведена або за атмосферного тиску, або під тиском вище атмосферного. Попередня обробка в присутності кислотного каталізатора також може бути введенням гарячої пари під тиском, що створює температуру від 120 до 250 °C. За цих умов біомаса може бути попередньо обробленою в інтервалі від 0,1 до 60 хв. перед подальшим процесуванням і необов'язковою стадією нейтралізації, якою може бути внесення вапна або будь-якого іншого лугу, так щоб pН реакційного середовища стало рівним 3,5-6. В іншому аспекті винаходу механічне подрібнення й попередня обробка можуть бути проведені одночасно: у цьому випадку бажано суху біомасу транспортують у посуд для попередньої обробки, де вона в цей час контактує з водою. Гідротермічна попередня обробка може бути механічно об'єднаною зі стадією подрібнення біомаси, так щоб попередню обробку 4 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можна було провести в періодичному або безперервному режимі. Як необмежуючий приклад режиму безперервної попередньої обробки, можна навести попередню обробку, проведену в закритому стійкому до тиску посуді, обладнаному механізмом гвинтового конвеєра. В іншому кращому втіленні винаходу гідротермічну попередню обробку проводять у режимі парового вибуху, під час якого біомасу піддають ін'єкції гарячої пари вище атмосферного тиску. Індукований парою тиск краще буде становити 1-30 атм. (120-250 °C), вплив якого зазначена біомаса буде зазнавати протягом 0,1-60 хв. Після цього тиск у реакційному посуді різко знижують, за допомогою перенесення попередньо обробленої біомаси у вторинний посуд для збору. Необмежуючим прикладом реакційного посуду для проведення попередньої обробки паровим вибухом може бути реактор-паровий генератор (Autoclave Engineers, Ери, Пенсільванія), що складається з реактора з паровою сорочкою, яка складається із труби «Hastelloy», закритої двома кульовими клапанами. Асоційовані електричні нагрівачі, розташовані на всіх відкритих, не покритих сорочкою поверхнях реактора, контролюють задану температуру попередньої обробки. Пряма ін'єкція пари також використовується для швидкого надання біомасі температури попередньої обробки. Для підтримування потрібної температури попередньої обробки тиск пари корегується й контролюється. Усі попередньо оброблені матеріали виходять через змінний мундштук на дні реактора й збираються в нейлоновій сумці, яка підтримується товстостінним випарником із сорочкою й охолодженням. Бажано, щоб час і температура обробки обирались таким чином, щоб максимальна кількість складових біомаси гідролізувались до складених мономерів найбільш ефективним і економічним способом без вироблення значних кількостей продуктів деградації, таких як фурфурол. Звичайно фракція лігніну попередньо обробленої сировини буде перебувати в діапазоні 1070% мас. лігніну/мас. сух. реч. попередньо обробленої сировини. Вміст лігніну попередньо обробленої сировини може бути визначено способами, відомими фахівцям у даній галузі, такими як, наприклад, не обмежуючись перерахованим, ті які, описані в: http://www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.html. Після зазначених варіантів попередньої обробки вміст сухої твердої речовини отриманої суспензії біомаси буде становити близько 10-50 % мас./мас. сухої реч. сировини. Первинна мета обраної стратегії попередньої обробки полягає у виборі найбільш енергетично ефективного й рентабельного способу, за допомогою якого лігноцелюлозна біомаса буде приготовлена так, щоб більша частина пентозної фракції солюбілізувалася, а целюлозні волокна були доступні для ферментних систем, які будуть використані у подальших гідролітичних процесах. Перенесення біомаси в конкретні типові процеси буде здійснюватися відкачуванням або винятково самопливом. Базовий спосіб даного винаходу У даному винаході пропонується спосіб деградації попередньо обробленої лігноцелюлозної біомаси, який включає стадії: c) культивування мікроорганізму, здатного виробляти, щонайменше, один фермент, який проявляє целюлолітичну і/або геміцелюлолітичну активність в ростовому середовищі, з одержанням шляхом цього збагаченої мікроорганізмом суспензії, яка містить зазначений, щонайменше, один фермент; d) обробки мікроорганізму й/або збагаченої мікроорганізмом суспензії стадії c); e) гідролізу попередньо обробленої біомаси продуктом стадії d) у реакторі для одержання розчинних цукрів. Бажано, щоб у цьому способі попередньо оброблена лігноцелюлозна біомаса була отримана з лігноцелюлозної біомаси за допомогою фізико-хімічної обробки, такої як попередня обробка, описана вище. В найкращому втіленні винаходу ростове середовище стадії c) містить лігноцелюлозну біомасу, яка бажано була попередньо обробленою. Різні ферментні активності, такі як, не обмежуючись перерахованим, целюлолітичні й геміцелюлолітичні активності, разом утворюють ферментну систему, тобто ферментні системи є сумішами більше ніж однієї ферментативної активності. Більш ніж одна із цих активностей у деяких випадках може бути присутньою в одній і тій же поліпептидній молекулі, однак, більш типово, якщо ферментна система містить суміш декількох, наприклад, більше ніж двох, тобто більше ніж трьох, різних ферментних поліпептидів, де кожний має, щонайменше, одну потрібну активність, так що об'єднані активності утворюють ферментну систему. Способи й системи, описані даним винаходом, відрізняються від задумів попереднього рівня техніки. У даному винаході пропонуються спільне вироблення ферментів, де послідовно для гідролізу біомаси використовуються попередньо оброблена біомаса й суспензія мікроорганізму, 5 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отримана в стадії d). Неочікувано було показано, що присутність надосадової рідини попередньої обробки не впливає на подальші процедури гідролізу й ферментації. Крім того, як не дивно, але було показано, що застосування цільної ферментаційної суспензії, яка містить міцелій і надосадову рідину, отримані при виробленні ферменту, демонструє високу ефективність при гідролізі біомаси в порівнянні лише з надосадовою рідиною, отриманою при виробленні ферменту, або в порівнянні з порівнюваними комерційними ферментними препаратами. Крім того продемонстровано, що фізична й/або механічна й/або хімічна обробка мікроорганізму зазначеного у описі стадії d) забезпечує оптимальну активацію ферментних систем екстра- і внутрішньоклітинного гідролізу, які діють синергійно в подальших гідролітичних процесах, що призводить до оптимальної деградації лігноцелюлозної сировини в мономерні цукри, такі як глюкоза й ксилоза. Вироблення ферментів (стадія c) Вироблення ферментів згідно зі стадією (c) характеризується наступним: суспензія попередньо обробленої лігноцелюлозної біомаси на першій стадії інокулюється мікроорганізмом, який може бути мікроорганізмом, який відноситься до бактерій, археїв, дріжджів або грибів, і який здатний забезпечувати целюлолітичні й/або геміцелюлолітичні ферментативні активності. Целюлолітична активність є активністю, здатною деградувати, наприклад, гідролізувати, целюлозу, наприклад, здатна гідролізувати деякі або всі глікозидні зв'язки в ній. Геміцелюлолітична активність, є активністю, здатною деградувати, наприклад, гідролізувати, геміцелюлозу, наприклад, здатна гідролізувати деякі або всі глікозидні зв'язки в ній. Констуктивні блоки геміцелюлози включають ксилан, глюкуроноксилан, арабіноксилан, глюкоманан і ксилоглюкан. У необмежуючому прикладі зазначені ферментативні активності включають екзо- і ендоцелюлази (тобто целобіогідролазу (СBH) I, II, ендоглюканазу (EG) I-IV, бета-глюкозидазу (BGL), екзо- і ендогеміцелюлази (тобто ксиланазу, ксилозидазу, ксилобіазу, арабіназу, арабінофукозидазу, мананазу, манозидазу, галактазу й галактозидазу) і естерази (Howard et al., 2003, Lynd et al., 2002). Таким чином, у кращому втіленні винаходу, щонайменше, один фермент із целюлолітичною і/або геміцелюлолітичною активністю має одну або декілька активностей, обраних із групи, яка включає целобіогідролазу I типу або II типу (CBH I або CBH II), ендоглюканази типів I, II, III і IV (EGI, EGII, EGIII, EGIV), бета-глюкозидази (BGL), естерази, екзогеміцелюлази й ендо-геміцелюлази. Є ще більш бажаним, щоб екзо-геміцелюлазу й ендогеміцелюлазу було обрано з поміж ксиланази, ксилобіази, арабінази, арабінофукозидази, мананази, манозидази, галактази й галактозидази. Необмежуючі приклади бактерій, які проявляють зазначені ферментні активності, які, відповідно, можуть бути використані згідно із даним винаходом, включають Actinobacter sp., Agrobacterium sp., Bacillus sp., Burkholdria sp., Clostridia sp., Caldicellulosiruptor sp., Cellvibrio sp., Halobacterium sp., Pseudomonas sp., Paenibacillus sp., Xanthomonas sp. і Thermobifida sp. (Howard et al. 2003, Maki et al., 2009). Необмежуючі приклади архей, які проявляють зазначені ферментні активності, які, відповідно, краще можуть бути використані згідно із даним винаходом, включають Pyrochoccus sp., Sulphobolus sp., Staphylothermus sp. і Thermococcus sp., (Maki et al., 2009). Гриби в цілому є найкращими мікроорганізмами для даного винаходу. Спосіб запропонований даним винаходом бажано може бути проведений так, щоб мікроорганізм був грибом, який бажано вибирають із групи, яка складається з: Trichoderma sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. і Talaromyces sp. Необмежуючі приклади грибів, які проявляють зазначені ферментні активності, які можуть бути, відповідно, краще використані згідно із даним винаходом, включають Aspergillus sp., Chaetomium sp., Chrysosporium sp., Fusarium sp., Humicola sp., Orpinomyces sp., Pencillium sp., Phanerochaete sp., Piromyces sp., Talaromyces sp., Trametes sp. і Trichoderma sp. Найкращим є гриб, обраний з поміж Trichoderma sp. і Talaromyces sp. Вибір організму, здатного продукувати фермент, може бути визначений вуглеводневою композицією попередньо обробленої сировинної суспензії, кількістю ферментних активностей, властивих конкретним організмам і біофізичними характеристиками, які охоплюють параметри, такі як температурна стабільність, селективність субстрату, питома активність і стійкість до інгібіторів. Для індукції вироблення ферментів зазначені мікроорганізми будуть інкубуватися за придатної для росту температури, яка може, як правило, варіювати від 14 до 102 °C, бажано в діапазоні 28 - 102 °C, залежно від використаного мікроорганізму. Час інкубації до початку вироблення ферменту може варіювати значним чином залежно від типу мікроорганізму (Lynd et al., 2002), а попередньо оброблена сировина може бути протестована способами, описаними 6 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Xiao et al. (2004b) або Bobey and Ederer (1981). У кращому аспекті даного винаходу, вироблення ферменту досягається за допомогою гіперпродукуючого целюлазу штаму міцеліального гриба Trichoderma reesei (анаморф: Hypocrea jecornia). Необмежуючим прикладом такого організму є штам Rut-C30 Trichoderma ressei (Lynd et al., 2002, Szijarto et al., 2004). У ще одному кращому аспекті винаходу грибні ферментні системи виробляються на попередньо обробленій біомасі, як єдиному значимому джерелі вуглецю. Бажано це здійснюється із грибами, такими як Trichoderma reesei. Стартові культури Trichoderma reesei можуть бути вирощені на попередньо обробленій суспензії до початку спороутворення, що можна кількісно оцінити за допомогою способів, таких як спектрофотометричні вимірювання при OD600 нм. Гриб потім вирощують протягом 3-7 днів за умов постійного перемішування при 50-250 об./хв., рН, температури, а також за умов контролю кисню. Для одержання максимальної кількості ферменту й біомаси критичною є інкубація гриба при 30 °C і при рН~5 протягом усієї ферментації. На 5 день, як правило, досягається максимальне вироблення біомаси й ферменту, що дозволяє продовжити обробку. Ростове середовище, як правило, містить джерело вуглецю, джерело азоту, необов'язково вітаміни й мікроелементи. Джерело вуглецю надається в кількості 1-30% мас./об., більш бажано 1-10 % мас./об. і ще більш бажано 1-8% мас./об. середовища для культивування. Джерела вуглецю можуть містити нативну або попередньо оброблену лігноцелюлозну біомасу, таку як дерево, солому зернових, макуху, просо й целюлозу, і сиру паперову пульпу, отриману в целюлозно-паперовому виробництві. Альтернативні джерела вуглецю можуть містити очищену целюлозу, пульпу, молочну сироватку, меласу або цукри, такі як глюкоза й лактоза. Може бути використана комбінація джерел вуглецю, у якій одним джерелом вуглецю є продукт стадії b) або її еквівалентів, а додатковим джерелом вуглецю є будь-що із описаного вище в даному абзаці. Джерело азоту надається в кількості 0,1-10% мас./об., більш бажано 0,1-8% мас./об. і навіть більш бажано 0,1-4% мас./об. середовища для культивування. Джерела азоту включають соєву експелерну макуху, рідкий кукурудзяний екстракт, дріжджовий екстракт, зелене борошно (мелену траву), пшеничні висівки, бардові й неорганічні солі амонію. Вітаміни й мікроелементи можуть бути надано в кількості 0-5% мас./об., більш бажано, 0,001-1% мас./об. середовища для культивування. Мінерали, які збагачують середовище для культивування можуть включати солі Fe, Mn, Zn і Co, тоді як вітаміни, які додаються в середовище для культивування можуть включати комплекси вітаміну В, біотин, коальбумін. Точні композиції середовищ для культивування й фізичні умови для ефективного росту продуцентів ферментів-целюлаз відомі фахівцям у даній галузі. Кінцевий добір ростового середовища буде залежати від використовуваного мікроорганізму. У кращому втіленні винаходу, як біомаса мікроорганізму, так і виснажене середовище для ферментації, яке містить залишкову лігноцелюлозну біомасу й основну частину ферментних активностей целюлаз і геміцелюлаз, будуть використані в подальшій стадії обробки біомаси. У даному винаході несподівано було встановлено, що значимі пропорції активностей целюлаз і геміцелюлаз зберігаються на залишковій попередньо обробленій сировинній біомасі й продукованій грибній біомасі. Ще більш цікавою виявилася демонстрація того, що гідроліз біомаси був більш ефективним при використанні цільної фермент-утримуючої суспензії (надосадової рідини й міцелію/біомаси) у порівнянні з експериментами, у яких для гідролізу використовували тільки утримуючу фермент надосадову рідину або комерційні препарати ферментів. Це необов'язково може бути досягнуте поділом суспензії біомаси, отриманої попередньою обробкою на два потоки, так щоб одна частина пройшла стадію с), а інша прямо направлялася на стадію е). Автори несподівано виявили, що частина попередньо обробленої біомаси може бути піддана впливу ростового середовища мікроорганізму. Зрозуміло, що в такий спосіб мікроорганізм здатний продукувати ферменти, придатні для деградації попередньо обробленої біомаси. Тому в даному винаході також пропонується в межах кращого втілення, спосіб деградації лігноцелюлозної біомаси, який включає стадії: a) фізико-хімічної попередньої обробки лігноцелюлозної біомаси для одержання попередньо обробленої суспензії; b) поділу попередньо обробленої суспензії стадії а) на дві частини, частину А и частину В; c) включення частини А до сирого ростового середовища для одержання кінцевого ростового середовища, і культивування, щонайменше, одного мікроорганізму, здатного продукувати, щонайменше, один фермент, який проявляє целюлолітичну й геміцелюлолітичну активність у кінцевому ростовому середовищі, з одержанням шляхом цього збагаченої мікроорганізмом суспензії, яка містить зазначений щонайменше один фермент; d) обробки мікроорганізму й/або збагаченої мікроорганізмом суспензії стадії с); 7 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 е) гідролізу біомаси частини В и продукту частини d) у реакторі для одержання розчинних цукрів. Блок-схема способу представлена на Фігурі 1. У кращому втіленні даного способу частина А є меншою частиною попередньо обробленої суспензії, отриманою на стадії а), яка, бажано, становить від 1 до 20% (маси сухої твердої речовини), краще від 1 до 5% (маси сухої твердої речовини), і найкраще від 1 до 5% (маси сухої твердої речовини). Тверда речовина є твердотільними частками, тобто частками, які не солюбілізуються в рідкій фазі за умов, які використовуються у способі. Обробка мікроорганізму (стадія (d) Несподівано було встановлено, що фізична й/або механічна й/або хімічна обробка ферментаційної суспензії в стадії d) перед стадією гідролізу е) і впливом на оброблений продукт на стадії е), буде поліпшувати кінетику гідролізу біомаси, що призведе до більш високого виходу розчинних цукрів (Фігура 2). Мають на увазі, що більш високий вихід розчинних цукрів може бути отриманий після 72 год. за умов, описаних у прикладі 4, при дії стадії c) на продукт стадії d), а не у випадку, коли стадія d) опускається. У документах попереднього рівня техніки (Rao et al., 1985) така обробка не описана. Контрольні експерименти, у який комерційний препарат целюлази (Celluclast, «Novozymes», Данія) / BGL (Novo 188, «Novozymes», Данія) був механічно оброблений перед гідролізом лігноцелюлози не привели до поліпшення кінетики гідролізу лігноцелюлози або до більш високого виходу розчинних цукрів. В одному втіленні мікроорганізм, отриманий на стадії культивування с) виділяють після стадії культивування, наприклад, центрифугуванням або за допомогою інших процедур, добре відомих у даній галузі. У даному втіленні виділений мікрорганізм піддають впливу стадії d). Однак, в альтернативному й кращому втіленні винаходу, цільна суспензія, яка містить мікроорганізм, тобто продукт культивування стадії с), який містить мікроорганізм і ростове середовище, фізично й/або механічно й/або хімічно обробляється перед гідролізом біомаси. Використання для гідролізу біомаси суспензії, яка містить мікроорганізм, а не тільки надосадової рідини суспензії, яка містить мікроорганізм, дозволяє більш ефективно дозувати фермент у подальших процесах гідролізу біомаси, що несподівано виявили автори винаходу. Обробка може бути фізичною, механічною, хімічною або їх комбінацією. У кращому здійсненні винаходу на практиці, суспензію, яка містить мікроорганізм, піддають перемішуванню за підвищеної швидкості ротора у ферментаційному посуді. У ще одному кращому здійсненні даного винаходу на практиці, суспензію, яка містить мікроорганізм, накачують і фрагментують у трубопроводі, який містить гомогенізатор «ultrathorax». Кожне із цих втілень може бути особливо корисним, якщо мікроорганізмом є гриб, так що обробка включає обробку грибного міцелію. Механічну обробку можна провести в такий спосіб: можна виявити на мікроорганізм або 3 суспензію мікроорганізму вплив з витратами енергії на одиницю об'єму 1-500 кВт/м , бажано - 13 3 200 кВт/м , і ще більш бажано 1-100 кВт/м , бажано тривалістю 0,1-60 хв., більш бажано 1-30 хв., ще краще 1-10 хв. Механічна обробка може бути обрана з поміж обробки міксером, обробки гомогенізатором, і обробки млином. Така механічна обробка може виявляти механічне напругу зсуву або, роздроблюючу силу на мікроорганізм і може розривати або руйнувати клітинні мембрани й/або клітинні стінки, або грибний міцелій або їх частини. Кілька таких обробок можуть бути об'єднані один з одним. Розрив або руйнування клітинних структур, таких як клітинні мембрани й/або клітинні стінки, або грибний міцелій або їх частини, можуть бути перевірені способами, добре відомими фахівцям у даній галузі, наприклад, мікроскопією. У кращому здійсненні даного винаходу на практиці, суспензію, яка містить мікроорганізм, обробляють, тобто фрагментують за підвищеної швидкості імпелера наприкінці циклу вироблення ферменту. Ефективність механічного процесу контролюється відносним градієнтом енергії, застосованої до біомаси мікроорганізму в реакційному посуді. В іншому випадку напруга зсуву, яка приводить до збільшення активності гідролітичних ферментів, може бути індукована закачуванням ферментаційної суспензії, яка містить мікроорганізм, із посуду для ферментації в посуд для гідролізу. Суспензію, яка містить мікроорганізм можна захитати й фрагментувати в трубопроводі. Таким чином, мікроорганізм може бути фрагментовано. В одиницях швидкостей зрушення на суспензію, яка містить мікроорганізм, виявляють вплив за 1600 - 50000 1/с, більш бажано 1600 - 27000 1/с, а ще більш бажано 1600 - 10000 1/с. Ця обробка підходить для індукції й підвищення активності гідролітичних ферментів. Цю обробку можна провести протягом періоду часу від 0,01 до 100 С. В іншому випадку суспензія, яка містить мікроорганізм, може бути гомогенізована за 8 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 високого тиску або оброблена ультразвуком або оброблена іншими обладнанням, відомим фахівцям у даній галузі як таким, що індукує високу напругу зрушення, таким як «Ultraturax». У кращому здійсненні винаходу на практиці суспензію, яка містить мікроорганізм піддають перемішуванню за підвищеної швидкості ротора у ферментаційному посуді. У ще одному з кращих здійснень винаходу на практиці суспензію, яка містить мікроорганізм накачують у трубопровід. Таким чином, мікроорганізм може бути фрагментованим. В одиницях швидкостей зрушення на суспензію, яка містить мікроорганізм, впливають із 1600 - 50000 1/с, краще 1600 27000 1/с, а ще краще 1600 - 10000 1/с, для індукування збільшення гідролітичної активності ферменту протягом періоду часу від 0,01 до 100 с. Читачеві буде зрозуміло, що винахід включає конкретну комбінацію значень, описаних у даному документі. Наприклад, будь-яку конкретну швидкість зрушення або діапазон швидкостей зрушення, описаних у даному документі, слід розуміти як конкретно описану разом з будь-яким конкретним часом здійснення такої обробки (хв. або с), описаними у даному документі. Також, будь-який вплив з витратами енергії на одиницю об'єму, або діапазон впливів з витратами енергії на одиницю об'єму, описаних у даному документі, слід розуміти як конкретно описаний разом з будь-яким конкретним часом застосування такого впливу (хв. або с), описаний у даному документі. Також частиною винаходу є ті із втілень, у яких продукт впливу з витратами енергії на 3 одиницю об'єму (кВт/м ) і час (хв.) еквівалентні будь-якому продукту, описаному в даному документі. Також частиною винаходу є ті із втілень, у яких продукт швидкості зрушення (1/с) і час (с) еквівалентні кожному із продуктів, описаних у даному документі. У конкретному втіленні винаходу методи механічного або хімічного лізису поєднуються, що підвищує ефективність кожного зі способів. У конкретному здійсненні винаходу на практиці мікроорганізм або суспензію, яка містить мікроорганізм, змішують із поверхнево-активною речовиною, найкраще з Triton X-100, у концентраціях 0,01-2 % мас./мас. сухої реч. міцелію, ще краще 0,01-1% мас./мас. сухої реч. міцелію, а ще краще 0,01-0,5 % мас./мас. сухої реч. міцелію. Потім суміш мікроорганізм/активнуактивна-поверхнево-активна речовина краща піддають описаному вище процесу фрагментації, який особливо придатний, наприклад, у випадку, якщо організм є грибом, для фрагментації міцелію. (поверхнево-активні речовини або детергенти - це нічим особливим не обмежений клас органічних сполук, які, як правило, містять як гідрофобні групи, так і гідрофільні групи, і, таким чином, мають амфіфільний характер). В іншому кращому здійсненні винаходу на практиці мікроорганізм або суспензію, яка містить мікроорганізм, змішують із органічним розчинником, який містить який-небудь з поміж амінів, ефірів і спиртів, наприклад, етанол у концентраціях 1-30% мас./об., бажано 1-20% мас./об. і навіть ще краще 1-5% мас./об. Потім суміш мікроорганізм/поверхнево-активну речовину піддають описаному вище процесу фрагментації, який особливо придатний, наприклад, у випадку, коли організм є грибом, для фрагментації міцелію. Конкретна потужність впливу на суспензію може бути отримана або підвищеною швидкістю імпелера посуду для ферментації, шляхом накачування ферментаційної суспензії із джерела в цільовий посуд, або за допомогою гомогенізації під високим тиском в особливому реакційному посуді. Додавання хімічних агентів, таких як солі, органічні розчинники, ферменти й поверхневоактивні речовини значно знижує потужність, необхідну для досягнення ефективного лізису міцелію й вивільнення внутрішньоклітинних ферментних компонентів. В іншому аспекті винаходу механічна обробка здійснюється хімічним лізисом, який може бути проведений додаванням неорганічних солей (осмолізом), ферментів, органічних розчинників і/або поверхнево-активних речовин. В одному конкретному аспекті винаходу лізис клітин міцелію індукується додаванням 0,01-10 М, краще 0,01 -5 М, і ще краще 0,1-1 М неорганічних солей, таких як NaCl, KCl або інших агентів хімічного стресу, таких як (NH2)2CO, CH6ClN3. В іншому конкретному аспекті винаходу реактив хімічного лізису може містити заряджену або незаряджену поверхнево-активну речовину (Biotechnol Lett. (1980) 2, pp.43-48 ), таку як Tween-80 (незаряджену), Triton X-100 (незаряджену), SDS (негативно заряджену) або CTAB (позитивно заряджену), які вносяться в концентраціях 0,1-3 % мас./мас. сухої реч. мікробної біомаси, краще 0,1-1% мас./мас. сухої реч. мікробної біомаси, а ще краще 0,5-1% мас./мас. сухої реч. мікробної біомаси, відповідно. В іншому аспекті винаходу реактив хімічного лізису може містити фермент або ферментну систему, таку як хітиназа (Plant Pathol. (200) 49, pp. 573-589), які застосовують у концентраціях 0,01-10% мас./мас. сухої реч. мікробної біомаси, краще 0,01-1% мас./мас. сухої реч. міцелію, а ще краще 0,01-0,1% мас./мас. сухої реч. міцелію, відповідно, з подальшою інкубацією при 2070 °C протягом 0,1 - 72 год., відповідно. 9 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У конкретному втіленні винаходу на практиці методи механічного або хімічного лізису поєднуються, що, як вважається, підвищує ефективність кожного зі способів. У конкретному здійсненні винаходу на практиці мікроорганізм змішують із поверхневоактивною речовиною, найбільш бажано з Triton X-100 у концентраціях 0,01-5 мас./мас. сухої реч. біомаси мікроорганізмів, краще 0,01-1% мас./мас. сухої реч. біомаси мікроорганізмів. Потім на суміш мікроорганізму/поверхнево-активної речовини впливають з витратами енергії на одиниці 3 3 об'єму 1-500 кВт/м , краще 1-200 кВт/м протягом 0,1 - 60 хв. для ефективної обробки. В іншому кращому здійсненні винаходу на практиці біомасу мікроорганізмів змішують із органічним розчинником, який містить який-небудь з поміж амінів, ефірів і спиртів, наприклад, етанол у концентраціях 5-40% мас./об., краще 20-40% мас./ об. чи навіть, ще краще, 30-35% мас./об. Потім на суміш мікроорганізму/органічного розчинника впливають з витратами енергії 3 3 на одиниці об'єму 1-500 кВт/м , краще 1-200 кВт/м протягом 0,1 - 60 хв. для ефективної обробки. Конкретна потужність впливу на суспензію може бути отримана або підвищеною швидкістю імпелера посуду для ферментації, шляхом накачування ферментаційної суспензії із джерела в цільовий посуд, або за допомогою гомогенізації під високим тиском в особливому реакційному посуді. Додавання хімічних агентів, таких як солі, органічні розчинники, ферменти й поверхневоактивні речовини знижує потужність, необхідну для досягнення ефективного лізису міцелію й вивільнення внутрішньоклітинних ферментних компонентів. Несподівано було виявлено, що вивільнення активностей внутрішньоклітинних ферментів з фермент-продукуючого організму може підвищити ефективність гідролізу застосованою ферментною системою, так, що можуть бути застосовані режими з більш низькими дозами целюлаз і бета-глюкозидаз. Дані винаходу несподівано продемонстрували, що фрагментована або, в іншому випадку, фізично, або механічно, або хімічно оброблена перед гідролізом міцеліальна біомаса визволить стільки бета-глюкозидази (BGL) скільки, в інакшому випадку, необхідно буде додати ззовні для одержання схожого виходу гідролізу. Фрагментування й додавання активностей BGL ззовні мають кумулятивний ефект, що дає більш високі виходи цукрів і поліпшену кінетику оцукрювання. Вивільнення пов'язаних з міцелієм ферментних активностей також дозволяє знизити дозування целюлаз без ризику погіршити кінетику гідролізу або вихід розчинних цукрів з лігноцелюлозної біомаси. У цілому, задуми, описані в даному документі, демонструють, що використання попередньо обробленої сировини, у вигляді єдиного ростового середовища, забезпечує виробництво ферментних систем, які дуже гарно адаптовані для розкладання цього конкретного лігноцелюлозного матеріалу. Отже, локальне вироблення ферментів, описане в даному винаході, передбачає максимальну гнучкість при виборі лігноцелюлозної сировини й варіантів попередньої обробки. Крім того, використання цільної виснаженої ферментаційної суспензії для подальших процесів гідролізу біомаси передбачає більш ефективний режим дозування, який підвищує вихід продукту й ефективність витрат на ферменти. Дозування ферментів у процесах гідролізу також можуть бути знижені шляхом вивільнення внутрішньоклітинних ферментних активностей з фермент-продукуючих організмів, стимулюючи ефективність позаклітинних ферментних систем. Якщо для вироблення ферментів використовується гриб, то ціль стадії обробки d) полягає в руйнуванні всіх частин гриба, наприклад, грибного міцелію. Гідроліз біомаси (стадія (е) Для завершення розкладання лігноцелюлозної сировини попередньо обробленої біомаси у ферментовану, мономерні гексозні (тобто глюкозу) і пентозні (тобто ксилозу) цукри, виснажену ферментаційну суспензію (надосадову рідину й міцелій) зі спільного вироблення ферментів додають разом з попередньо обробленою біомасою в реактор для гідролізу біомаси. Як добре відомо, гексози є моносахаридами із шістьма атомами вуглецю, пентози є моносахаридами з п'ятьма атомами вуглецю. У необмежуючому прикладі суспензія попередньо обробленої біомаси, яка має вміст твердої речовини аж до 30%, бажано 15-30% (мас./мас.), може бути гідролізована в періодичному режимі. Для фахівців у даній галузі є очевидним, що дозування системи гідролітичних ферментів, температура інкубації, тривалість обробки, необов'язкові режими підживлення для гідролізу біомаси й ефективність гідролізу власне пов'язані з конкретними застосованими ферментною системою й сировиною. У конкретному втіленні винаходу гідроліз суспензії попередньо обробленої біомаси буде здійснений ферментними системами, виробленими зазначеним міцеліальним грибом 10 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Trichoderma reesei. У цьому випадку попередньо оброблену суспензію змішують із виснаженою й необов'язково фрагментованою ферментаційною суспензією, яка містить, системи гідролітичних ферментів. Кращий режим дозування лігноцелюлозної сировини за цих умов перебуває в діапазоні 0,1-1% мас. ферменту/мас. сировини або 1-20 FPU/г целюлози, яка міститься в сировині (Zu et al., 2009). Гідроліз попередньо обробленої біомаси виконується за температур 45-55 °C і за тривалості обробки в діапазоні 18-72 год. В особливо кращому втіленні даного винаходу періодичний гідроліз попередньо обробленої соломи зернових виконується при дозуваннях ферментів у діапазоні 0,25-0,8 % мас. ферменту/сухої твердої речовини попередньо обробленої сировини з або без збагачення додатковою бета-глюкозидазою і за температури 50-53 °C протягом 72 год. Дивно, але навіть режими з низькими дозуваннями ферментів дають більше 50% мас./мас. відносно загальної кількості цукрів, які могли б бути отримані з поміж тих, що містяться в зазначеній сировині. Ці високі виходи цукрів за низьких режимів дозування ферментів можуть бути досягнуті внаслідок об’єднаного із процесом вироблення ефективних ферментних систем, як було описано вище. До даного винаходу необов'язково включене додавання бета-глюкозидази на стадії е) даного способу. Бажано, якщо реакція гідролізу відрізняється тим, що розчинні цукри, отримані на стадії е) містять мономерні С5- і/або С6-цукри, бажано глюкозу й/або ксилозу. У кращому втіленні даного винаходу гідролізат біомаси, який містить збагачену цукрами надосадову рідину, і тверді лігніновмісні відходи будуть зазнавати процедури розділення на рідку фазу/тверду фазу, яка може бути виконана, наприклад, центрифугуванням, фільтрацією або просто декантуванням самопливом. Зрозуміло, що розчинні цукри є всіма цукрами, які бажано можуть бути виявлені у рідкій фазі, якщо було проведено розділення на рідку фазу/тверду фазу, як відомо фахівцям. Ферментація гідролізатів біомаси Необов'язковий додатковий аспект даного винаходу полягає у ферментації гідролізату біомаси, отриманого на стадії е). Таким чином, у винахід також включений спосіб, описаний вище, який додатково відрізняється тим, що здійснюється подальший процес із збагаченою цукрами фазою. У конкретному втіленні здійснюється подальший процес із збагаченою цукрами рідкою фазою до етанолу. Мікроорганізми можуть бути застосовані в контексті даного винаходу для перетворення гідролізатів біомаси, які містять пентози й гексози, на етанол. Бажано, якщо на даній стадії використовується збагачена цукрами рідка фаза, отримана на стадії е), яка має високий вміст цукрів, що піддаються ферментації, бажано порядку 15-50% мас./об. Вміст цукрів у даному контексті означає вміст усіх пентоз і гексоз. У кращому втіленні винаходу гідролізат біомаси має вміст цукрів 16-25% мас./об. У ще кращому втіленні винаходу, гідролізат біомаси також містить додаткові поживні речовини (тобто білки, солі й цукри) перенесені із процесів спільного вироблення ферментів. Ферментація гідролізату біомаси до етанолу може бути виконана за допомогою мікробних штамів, які демонструють надійність у способі, високу стійкість до інгібіторів/етанолу, надійний вихід продукту за високої і низької концентрації цукрів. Необмежуючі приклади організмів, які можуть конвертувати цукри в етанол, включають пекарські дріжджі S. cerevisiae, Pichia stipitis, Hansenula polymorpha, Clostridium acetobutylicum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Zymomonas mobilis, E. coli, Klebsiella oxytoca, і Fusarium oxysporum. Критеріями відбору варіантів способу й підбору організму є надійність способу, стійкість до продукту/інгібіторів/температури та, відповідно, високий вихід етанолу (Fischer et al., 2008; Matsushika et al., 2009). Етанольна ферментація може бути проведена за температур у діапазоні 28 - 70 °C протягом 10 -48 годин залежно від температурного оптимуму й ефективності ферментації використовуваного мікроорганізму (Matsushika et al., 2009). З описів попереднього рівня техніки відомо, що теоретичні межі перетворення для перетворення гексоз на етанол можуть становити 51% мас./мас. (тобто 1 г глюкози на 0,51 г етанолу) для дріжджів (Matsushika et al., 2009). Згідно з даним документом несподівано було встановлено, що попередня обробка не впливає на ефективність гідролізу біомаси й процеси ферментації. Ферментації гексоз дріжджовими штамами можуть бути проведені за температур 28 - 35 °C, рН 4 - 6 і можуть бути закінчені протягом 10 -48 годин. У результаті ферментації виходить суспензія, яка містить дріжджову біомасу й близько 0,5 -25% мас./об. етанолу залежно від початкової концентрації цукрів у гідролізаті біомаси й ефективності перетворення пентозних і 11 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гексозних цукрів. Видалення етанолу Видалення етанолу з ферментаційних рідин може бути виконане різними способами, відомими фахівцям у даній галузі. Однією з таких процедур є процес звичайної дистиляції й ректифікації, що використовує устаткування, яке застосовується в пивоварній і хімічній промисловості, таке як дистиляційні колони. Ці технології добре розвинені в промисловості, та власне відомі й альтернативні обладнання (Leland, 2008, Cardona and Sanchez, 2007). У альтернативних втіленнях винаходу етанол видалено за допомогою відпарювальної технології, необмежувальними прикладами якої є відпаровування в вакуумі, відпаровування газом, випаровування розпилюванням. Практичні здійснення даного винаходу можуть давати вихід етанолу 90-100% об./ об. Це продукт необов'язково може бути змішаний з добавками або в іншому випадку оброблений для складання продукту, який буде доставлений кінцевому споживачеві. Визначення термінів: У даному винаході використовується кілька термінів, які визначені нижче. Термін «біомаса» і «лігноцелюлозна біомаса» відноситься до будь-якого целюлозного або лігноцелюлозному матеріалу й включає матеріали, які містять целюлозу, та які необов'язково також містять геміцелюлозу, лігнін, крохмаль, полісахариди, олігосахариди й/або моносахариди. Біомаса також може містити додаткові компоненти, такі як білки, ліпіди, воски, фенольні смоли й стероїди. Біомаса, загалом, може бути отримана з одного джерела, або містити суміш, отриману з більше, ніж одного джерела; наприклад, біомаса могла б містити суміш пшеничної полби й соломи, або суміш трави й листя. Необмежуючими прикладами біомаси є біоенергетичні культури, сільськогосподарські культури, тверді міські відходи, тверді промислові відходи, шлам паперового виробництва, сміття, деревні відходи й відходи лісового господарства. Зокрема, необмежуючі приклади чистої біомаси включають вівсяну полбу, качани кукурудзи, залишки сільськогосподарських культур, таких як кукурудзяна листова обгортка, кукурудзяна солома, трава, пшениця, пшенична солома, ячмінь, ячмінна солома, сіно, рисова солома, просо, брудний папір, макуха сахарної тростини, сорго, соя, компоненти, отримані при перемелюванні зерна, дерева, гілки, коріння, листя, деревні стружки, дерев’яна тирса, кущі, городина, фрукти, квіти та перегній. Термін «механічне подрібнення» відноситься до будь-якого способу механічного зменшення розміру часток біомаси. Необмежуючими прикладами застосування подрібнення є молотове перемелювання або дроблення. Термін «попередньо оброблена біомаса» позначає біомасу, яка була піддана фізико-хімічній обробці перед оцукрюванням. Обробки, такі як попередні обробки, далі будуть описані в даному документі. Термін «лігноцелюлозний» відноситься до композиції, яка містить як лігнін, так і целюлозу. Лігноцелюлозний матеріал також може містити геміцелюлозу. Термін «целюлозний» відноситься до композиції, яка містить целюлозу. Термін «оцукрювання» або «гідроліз біомаси» відноситься до вироблення цукрів, які піддаються ферментації, з полісахаридів. Термін «цукор, який піддається ферментації» відноситься до олігосахаридів і моносахаридів, які можуть бути використані мікроорганізмом як джерело вуглецю у процесі ферментації для вироблення таких продуктів, як етанол. Термін «гідролізат» відноситься до продукту оцукрювання, який містить цукри, вироблені в процесі оцукрювання, решти негідролізованої біомаси, і ферменти, які використовуються для гідролізу біомаси. Термін «суспензія» відноситься до суміші нерозчинного матеріалу й рідини. Термін «суспензія, яка піддається змішуванню» відноситься до суспензії, яка стає фактично гомогенною під дією системи перемішування. «Змішуваність» відноситься до цієї властивості суспензії. Термін «ретельно перемішана суспензія» відноситься до стану, при якому компоненти суспензії фактично рівномірно розподілені (гомогенно) по всій суспензії. Під «масою сухої речовини» або «мас. сух. реч.» мають на увазі вагу біомаси, з якої видалена вся або майже вся вода. Маса сухої речовини, як правило, вимірюється згідно зі стандартом E1756-01 Американського товариства із випробувань і матеріалів (ASTM) (Стандартний спосіб визначення загальної кількості твердих речовин у біомасі) або стандарту T412 om-02 Технічної Асоціації целюлозно-паперової промисловості, Inc. (TAPPI) (вологість у пульпі, папері й картоні). Термін «маса сухої речовини» (мас. сух. реч.) або «суха речовина» (сух. реч.) відноситься 12 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до загальної кількості сухої речовини біомаси, доданої в реактор періодичної або подживлюваної періодичної системи, розрахованої на момент додавання, як відсоток від загальної маси реакційної композиції в реакторі наприкінці прогону. Термін «ферменти оцукрювання» або «гідролізуючі ферменти» може відноситься до системи ферментів оцукрювання, яка містить один або більшу кількість ферментів (у якій бажано більше одного ферменту), яка використовується для гідролізу полімерної біомаси, за допомогою якого в гідролізаті вивільняються олігосахариди й/або моносахариди. Система ферментів оцукрювання включає один або кілька ферментів, обраних із групи «глікозидаз», які гідролізують будь-які зв'язки ди-, оліго- і полісахаридів і розглядаються в класифікації ферментів EC 3.2.1.x загальної групи «гідролаз» (EC 3.). Крім того, можуть бути присутніми додаткові ферменти, які можуть належати до даної групи, або можуть не належати до неї. Глікозидази придатні для даного способу можуть бути впорядковані за тими компонентами біомаси, які вони гідролізують. Глікозидази, придатні для даного способу включають глікозидази, які гідролізують целюлозу (наприклад, целюлази, ендоглюканази, екзоглюканази, целобіогідролази, бетаглюкозидази), глікозидази, які гідролізують геміцелюлозу, і які називаються геміцелюлазами (наприклад, ксиланази, ендоксиланази, екзоксиланази, бета-ксилозидази, арабіноксиланази, мананази, галактази, пектинази, глюкуронідази) і глікозидази, гідролізуючі крохмаль (наприклад, амілази, α-амілази, β-амілази, глюкоамілази, α-глюкозидази, ізоамілази). Крім того, корисним може бути додавання інших активностей до системи ферментів оцукрювання, таких як пептидази (EC 3.4.x.y), ліпази (EC 3.1.1.x і 3.1.4.x), лігнінази (EC 1.11.1.x) і феруоілестерази (EC 3.1.1.73) для полегшення вивільнення полісахаридів від інших компонентів біомаси. У даній галузі добре відомо, що мікроорганізми, які продукують ферменти, які гідролізують полісахариди, часто демонструють якусь активність, таку як деградація целюлози, яка каталізується декількома ферментами або групою ферментів, які мають різні субстратні специфічності. Таким чином, «целюлаза» з мікроорганізму може включати групу ферментів, усі або деякі з яких можуть вносити вклад у целюлозодеградуючу активність. Комерційні або некомерційні ферментні препарати, такі як целюлаза, можуть містити багато ферментів, залежно від схеми очищення, яка використовується для одержання ферменту. Таким чином, ферменти оцукрювання, які використовуються в даному способі, включають, щонайменше, одну «целюлазу», і дана активність може бути каталізована більше ніж одним ферментом. У деяких випадках, ферменти оцукрювання, які використовуються в даному способі можуть містити, щонайменше, одну геміцелюлазу, звичайно залежно від типу попередньо обробленої біомаси, яка використовуються в даному способі. Наприклад, як правило, немає необхідності використовувати геміцелюлазу, якщо оцукрювана біомаса попередньо оброблена кислотою і її, як правило, включають, якщо оцукрювану біомасу попередньо обробляють за нейтральних або лужних умов. Ферменти оцукрювання можуть бути отримані комерційно, прикладом є целюлаза ® ® «Spezyme CP» («Genencor International», Рочестер, Нью-Йорк) і ксиланаза «Multifect » («Genencor»). Крім того, ферменти оцукрювання можуть бути отримані біологічно, у тому числі за допомогою рекомбінантних мікроорганізмів. Для використання в даному способі можуть бути розроблені нові ферменти для оцукрювання. SSF означає одночасне оцукрювання й ферментацію. Приклади Використані наступні терміни: «ВЕРХ» — високоефективна рідинна хроматографія, «C» — градус Цельсія, «кПа» — кілопаскаль, «м» — метр, «мм» — міліметр, «кВт» — кіловат, «мкм» — мікрометр, «мкл» — мікролітр, «мл» — мілілітр, «л» — літр, «хв.» — хвилина, «мМ» — миллимоль, «см» — сантиметр, «г» — грам, «кг» — кілограм, «мас.» -маса, «год.» -година, «темп.» або «Т» — температура, «теор.» — теоретичний, «попередньо оброб.» - попередня обробка, «DWB» — маса сухої речовини біомаси, «ASME» — американське товариство інженерів-механіків, «s.s.» — нержавіюча сталь, «in”» — дюйм, «PSD» — розподіл часток за розмірами, «D-50» — діаметр часток, де 50% від сукупного об’єму часток менше цього розміру, «D-95» позначає діаметр часток, де 95% сукупного об’єму часток менше цього розміру, «об./хв.» — обороти за хвилину. Сірчану кислоту, гідроксид амонію, оцтову кислоту, ацетамід, дріжджовий екстракт, глюкозу, ксилозу, сорбіт, MgSO4 7H2O, фосфорну кислоту й лимонну кислоту придбали в «Sigma-Aldrich» (Сент-Луїс, Міссурі). Композиція біомаси вимірюється кожним зі стандартних методів, добре відомих у даній галузі, таких як ASTM E1758-01 «Стандартний спосіб визначення вуглеводів за допомогою ВЕРХ». Приклад 1. Визначення мономерних цукрів Для визначення прогресу гідролізу соломи, зразки збирають через відповідні інтервали й 13 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вміст розчинних цукрів визначали за допомогою ВЕРХ. Розчинні цукри (такі як глюкоза, целобіоза, ксилоза, ксилобіоза, галактоза, арабіноза й маноза) в оцукреному розчині вимірювали за допомогою ВЕРХ («Agilent Technologies», УпалоАлто, Каліфорнія). Моносахариди вимірювали прямо в гідролізаті. Нерозчинну речовину видаляли з гідролізату за допомогою центрифуги. рН розділеної рідини корегували, за необхідності, за допомогою сірчаної кислоти. Відділену рідину розбавляли, за необхідності, потім фільтрували крізь 0,2 мкм шприцевий фільтр прямо в ампулу для ВЕРХ. Для аналізу загальних розчинених цукрів 10 мл розведеного зразка поміщали в ампулу під тиском і додавали 349 мкл 75% H2SO4. Ампулу запечатували й поміщали в автоклав на годину для гідролізу всіх цукрів до моносахаридів. Зразки охолоджували й корегували рН карбонатом натрію до необхідного значення рН, потім зразки фільтрували в ампули для ВЕРХ і аналізували за допомогою ВЕРХ. Після прогону, визначали концентрації в зразку виходячи із стандартних кривих для кожної із сполук. Приклад 2. Фізико-хімічна попередня обробка пшеничної соломи Пшеничну солому перемелювали до розміру часток менше, ніж 2 см. Потім перемелену солому змішували з водою й додавали H2SO4 як каталізатор попередньої обробки з подальшою гідротермічною обробкою під високим тиском. Отриману суспензію попередньо обробленої сировини потім використовували для вироблення гідролітичного ферменту й для процесу оцукрювання в подальших процесах. Приклад 3. Вироблення гідролітичних ферментів за допомогою попередньо обробленої сировини Ферменти гідролізу (тобто целюлази й геміцелюлази) для перетворення лігноцелюлозного матеріалу на цукри, які його складають, були отримані в занурених культурах міцеліального гриба Trichoderma reesei. В основній стадії культивування, посівні культури вирощували в 2 л колбі, що перемішується, заповненій 400 мл культурального поживного середовища, яке було доповнене 2% мас./об. попередньо обробленої біомаси (див. приклад 2) і 0,5% об./об. рідкого кукурудзяного екстракту. Середовище інокулювали препаратом грибних спор, що мають оптичну щільність (OD) при 600 нм рівну 10. Культури в колбах, що перемішуються, вирощували протягом 48 годин при 30 °C і рН 5 за постійного перемішування 250 об./хв. Для біореакторів з робочим об’ємом 5 л було проведене масштабування посівної культури. Композиція культурального середовища була ідентичною до комбінації первинної посівної культури. Кожний біореактор інокулювали 10% об./об. первинної посівної культури. Культуру вирощували при 30 °C (pH 5) протягом 48 годин за постійного перемішування 350 об./хв. Основне вироблення ферментів проводили в 150 л біореакторі з робочим об’ємом 100 л. Культуральні середовища були ідентичними до середовищ попередніх посівних культур. Однак для вироблення гідролітичних ферментів додавали 8% мас./об. попередньо обробленої біомаси й 2% об./об. рідкого кукурудзяного екстракту. Культуральне поживне середовище інокулювали 5% об./об. вторинної посівної культури. Фермент-продукуючий гриб Trichoderma reesei потім вирощували при 30 °C за умов постійного перемішування при 350 об./хв. Ріст ініціювали протягом 5 днів за константного значення pO2 25% для забезпечення оптимального вироблення ферментів за аеробних умов. Через 5 днів даних умов культивування збирали цільну ферментвмісну суспензію, яка включає залишки попередньо обробленої біомаси, виснажене ферментаційне поживне середовище й грибний міцелій. Концентрацію загального розчинного ферменту (білка) у ферментаційному поживному середовищі (надосадовій рідині) визначали методом Бредфорда із використанням бичачого сироваткового альбуміну як еталона для порівняння (Bradford, M., 1976). У подальших експериментах із гідролізу використовували або надосадову рідину, яка містить фермент, або цільну ферментаційну суспензію (надосадова рідина + попередньо оброблена біомаса + грибний міцелій). Приклад 4. Гідроліз соломи Попередньо оброблену пшеничну солому гідролізували або за допомогою системи целюлаз, яка містить (i) надосадову рідину, описану в прикладі 3, (ii) повну грибну суспензію (грибний міцелій + біомаса + надосадова рідина) або (iii) повну грибну суспензію, при цьому грибний міцелій був фрагментований перед гідролізом соломи. Експерименти із гідролізу також необов'язково були проведені в присутності бета-глюкозидази (BGL), яка додавалася ззовні. Реакції гідролізу проводили в реакційному об’ємі 1 л з 20% мас./мас. сухої реч. попередньо обробленої соломи за 50 °C протягом 72 годин у середовищі, pH якого було скориговано до 5. Режим дозування гідролітичних ферментів становив 0,5% маси целюлази/маси попередньо 14 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обробленої соломи. Дозування ферментів було прив'язане до загальної концентрації білків у виснаженій ферментаційному поживному середовищі згідно з визначенням у прикладі 2. Необов'язково реакції проводили з додаванням активності BGL (Novo 188, «Novozymes», Данія). Активність BGL вносили в кількості 2 одиниці целобіази (CBU)/мг целюлази. CBU визначали згідно з описом Prior et al. (2008). Реакції оцукрювання проводили в біореакторній системі за постійного перемішування (50 об./хв.) для забезпечення рівномірних умов реакцій. У конкретних експериментах ферментаційну суспензію, яка містить гідролітичні ферменти фрагментували за підвищеної швидкості імпелера (L5M, «Silverson Machines Ltd.») до 8000 об./хв. протягом 30 хвилин перед подальшим процесом гідролізу лігноцелюлози. Для визначення кінетики гідролізу й виходу глюкози зразки забирали через 3, 7, 24 і 48 годин. Явне вивільнення глюкози вимірювали методом ВЕРХ як описано вище. Результати різних варіантів гідролізу представлені на Фіг. 2. Дані на Фіг. 2 указують на те, що фрагментація грибної біомаси перед гідролізом поліпшує кінетику гідролізу й підвищує кінцевий вихід глюкози, якщо для гідролізу попередньо обробленої соломи використовується суспензія гриба Trichoderma, яка містить фермент (див. приклад 3) без збагачення BGL, d. Експерименти із гідролізу попередньо обробленої соломи, проведені тільки зі збагаченої BGL ферментаційним поживним середовищем (надосадовою рідиною) продемонстрували схожу кінетику гідролізу й кінцевий вихід глюкози, що й у реакціях, проведених із цільної фрагментованою ферментаційною суспензією у відсутності BGL. Реакція гідролізу із фрагментованою цільною ферментаційною суспензією (тобто грибним міцелієм, біомасою й надосадовою рідиною), додатково збагаченою BGL, продемонструвала найкращі кінетику гідролізу й вихід глюкози в порівнянні з усіма іншими дослідженими гідролітичними процесами. Цей дивний ефект може бути наслідком вивільнення внутрішньоклітинних і/або пов'язаних з поверхнею мікроорганізму ферментних активностей, які діють синергійно із системами розчинних целюлаз у ферментаційному поживному середовищі. Опис фігур Фіг. 1: Спосіб перетворення біомаси на етанол, який передбачає перенесення міцелію з місця вироблення ферментів. L= лігнін, P= пентоза, H= гексоза. Фіг. 1 є блок-схемою, яка ілюструє спосіб біоочистки, який застосовується для перетворення лігноцелюлози на етанол через ферментацію відповідно до даного винаходу. Фіг. 2: Вивільнення глюкози з попередньо обробленої соломи. Умови гідролізу: 20% мас./мас. сухої реч. попередньої біомаси, дозування целюлази: 0,5% мас. розчинного ферменту/мас. попередньо обробленої біомаси, необов'язкове дозування BGL: 2 CBU/мг целюлози. Відбір зразків в 3, 7, 24, 48, 72 год. Гідроліз біомаси проводили або за допомогою поживного середовища, яке містить фермент, або за допомогою фрагментованої/нефрагментованої ферментаційної суспензії (надосадова рідина поживного середовища + біомаса + грибний міцелій) за відсутності або у присутності додаткової активності BGL. Джерела інформації: Chauve et al. (2010) Biotechnology for Biofuels 2010, 3:3 Bradford, M. (1976), Anal. Biochem. 72:248-254 Prior B.A., Day D.F. (2008) Appl. Biochem. Biotechnol. 146(1-3), pp. 151-64 Pejo, E.T., Oliva, J.M. and Ballestros, M. (2008) Realistic approach for full-scale bioethanol production from lignocellulose: a review J. Sci& Indust. Research 67, pp. 874-884 Howard, R.L., Abotsi, E., van Rensburg, J. Howard, S. (2003) Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. Afri. J. Biotechnol. 2, pp. 602-619 Sluiter, B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton, and D. Crocker (2008) Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass. Laboratory Analytical Procedure (LAP) Technical Report NREL/TP-510-42618, http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdf Kumar R, Mago G, Balan V, Wyman CE. (2009a) Physical and chemical characterizations of corn stover and poplar solids resulting from leading pretreatment technologies. Bioresour. Technol. 100(17), pp.3948-62. Kumar R, Wyman CE. (2009b) Effects of cellulase and xylanase enzymes on the deconstruction of solids from pretreatment of poplar by leading technologies. Biotechnol Prog. 2009, 25(2), pp. 30214. Kumar R, Wyman CE. (2009c) Effect of additives on the digestibility of corn stover solids following pretreatment by leading technologies. Biotechnol Bioeng. 2009, Apr 15; 102(6):1544-57. Wyman CE, Dale BE, Elander RT, Holtzapple M, Ladisch MR, Lee YY. (2005) Comparative sugar recovery data from laboratory scale application of leading pretreatment technologies to corn stover. 15 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Bioresour. Technol. 96(18), pp. 2026-32. Chandra, R.R., Bura, R., Mabee, W.E., Berlin, A., Pan, X:, Saddler, J.N. (2007) Substrate Pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 108, pp. 67-93. Margeot, A., Han-Hägerdahl, B., Edlund, M., Slade, R., Monot, F. (2009) New improvements for lignocellulosic ethanol. Curr. Opin.Biotechnol. 20, pp. 1-9. Chandrakant, P., Bisaria, V. S. (1998) Simultaneous bioconversion of cellulose and hemicellulose to ethnaol. Crit. Rev. Biotechnol. 18, pp. 295-331 Xiao, Z., Zhang, X., Gregg, D.J., Saddler, J.N. (2004a) Effects of sugar inhibition on cellulose and beta-glucosidase during enzymatic hydrolysis of softwood substrates. Appl. Biochem. Biotechnol. 113116, pp. 1115-1125 Hodge, D.B., Karim, M.N., Schell, D.J., Mcmillan, J.D. (2009) Model-based fed-batch for highsolids enzymatic cellulose hydrolysis. Appl Biochem Biotechnol. 152, pp. 88-107 Reith, J.H., den Uli, H., van Veen, H., de Laat, W.T.A.M., Niessen, J.J., de Jong, E., Elbersen, H.W., Weusthuis, R., van Dijken, J.P., Raamsdonk, L. (2002) Co-prodcution of bioethanol, electrcity, and heat from biomass residues. In: Twelfth European Conference and Technology Exhibition on Biomass for Energy, Industry and Climate Protection, Amsterdam, The Netherlands. Palmquist, E., Hahn-Hägerdahl (2000a) Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. I: inhibition and detoxification Bioresource Technology 74, pp 17-24 Palmquist, E., Hahn-Hägerdahl (2000b) Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: inhibitors and mechanisms of inhibition. Bioresource Technol. 74, pp. 25-33 Jing, X., Zhang, X. and Bao, J. (2009) Inhibition Performance of Lignocellulose Degradation Products on Industrial Cellulase Enzymes During Cellulose Hydrolysis Applied Biochemistry and Biotechnology 159, pp. 696-707 Xiao, Z., Storms, R. and Tsang, A. (2004b) Microplate-based filter paper assay to measure total cellulase activity. Biotechnology and Bioengineering 88:832-837 Bobey, D., Ederer, G.M. (1981) Rapid detection of yeast enzymes by using 4-methylumbelliferyl substrates J.Clin.Microbiol.,pp. 2, 393-394 Maki, M., Leung, K.T., Qin, W. (2009) The prospects of cellulose producing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass. Int. J. Biol. Sci. 5, pp. 500-516 Lynd, L.R., Weimer, P.J., van Zyl, W.H., Pretorius, I.S. (2002) Microbial cellulose utilisation: Fundamentals and biotechnology. Microbiol. and Molecular. Biology Rev. 66, pp. 506-577 Shewale JG. Beta-Glucosidase: its role in cellulase synthesis and hydrolysis of cellulose. (1982) Int J Biochem. 14, pp. 435-43 Seidle, H.F., Marten, I., Shoseyov, O., Huber, R.E. (2004), Physical and kinetic properties of the family 3 beta-glucosidase from Aspergillus niger which is important for cellulose breakdown. The Protein J. 23, pp. 11-23 Szijarto, N., Szengyel, Z., Liden, G., Reczey, K. (2004) Dynamics of cellulase prodcution by glucose grown cultures of trichoderma reesei RUT-C30 as a response to addition of cellulose Appl. Biochem. Biophys. 115, pp. 115-124 Kristensen, J.B., Felby, C., Jorgensen, H. (2009) Yield-determining factors in high-solids enzymatic hydrolysis of lignocellulose Biotech. for Biofuels 2, pp. 1-22 Fischer, C.R., Klein-Marcuschamer, D., Stephanopoulos, G. (2008) Selection and optimization of microbial hosts for biofuels production. Metab. Eng. 10(6), pp. 295-304. Shaw A.J., Podkaminer K.K., Desai S.G., Bardsley J.S., Rogers S.R., Thorne P.G., Hogsett D.A., Lynd L.R. (2008) Metabolic engineering of a thermophilic bacterium to produce ethanol at high yield. Proc. Natl. Acad. Sci. 105(37), pp. 13769-74 Campell, J.A., Hansen, R.W., Wilson, J.R. (1999) Cost effective colorimetric microtitre plate enzymic assays for sucrose, glucose and fructose in sugarcane tissue extracts. J. Sci. Food. Agicult. 79, pp. 232-236 Matsushika A, Inoue H, Murakami K, Takimura O, Sawayama S. (2009) Bioethanol production performance of five recombinant strains of laboratory and industrial xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae. Bioresour Technol. 2009 Apr;100(8):2392-8. Nigam JN. (2001) Ethanol production from hardwood spent sulfite liquor using an adapted strain of Pichia stipitis. J Ind Microbiol Biotechnol. 26(3), pp. 145-50. Laplace JM, Delgenes JP, Moletta R, Navarro JM. (1992) Alcoholic glucose and xylose fermentations by the coculture process: compatibility and typing of associated strains. Can J Microbiol. 38(7), pp. 654-8 Tolan, J.S. (2002): Iogens process for producing ethanol from cellulosic biomass. Clean Technol. Environ. Policy. 3, pp. 339-345 16 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Cardona, C.A., Sanchez, O.J. (2007) Fuel ethanol production: Process design trends and integration opportunities Bioresource Technol. 98, pp. 2415-2457 Jorgensen, H., Vibe-Pedersen, J.,Larsen, J., Felby C. (2006) Liquefaction of lignocellulose at high-solids concentrations. Biotechnology and Bioengineering 96, pp. 862 - 870 Chadha B.S., Kanwar S.S., Saini H.S., Garcha H.S. (1995) Hybrid process for ethanol production from rice straw. Acta Microbiol Immunol Hung. 42(1):53-9. Hennessey, S.M. Seapan, M., Elander, R.T., Tucker, M.P. (2006) Process for concentrated biomass saccharification WO2009/045651Acta Leland, Microbiol8) Separation technologies for recovery and dehydration of alcohols from fermentation broth. Biofuel, Biorpod.Bioref. 2, pp. 553-588 Rao, M., Desphpande, V., Seeta, R., Srinivasan, M.C., Mishra, C. (1985) Hydrolysis of sugarcane Bagasse by mycelium biomass from penicillium funiculosum. Biotechnol. Bioengineer 27, 00. 107072. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб деградації попередньо обробленої лігноцелюлозної біомаси, який передбачає стадії: c) культивування мікроорганізму, здатного виробляти щонайменше один фермент, який проявляє целюлолітичну і/або геміцелюлолітичну активність в ростовому середовищі, з одержанням за допомогою цього збагаченої мікроорганізмом суспензії, яка містить зазначений щонайменше один фермент; d) обробки мікроорганізму й/або збагаченої мікроорганізмом суспензії стадії с) за допомогою 3 (і) механічної обробки, що включає вплив з витратами енергії на одиницю об'єму 1-500 кВт/м , 3 3 краще - 1-200 кВт/м , і ще краще 1-100 кВт/м , бажано тривалістю від 0,1 до 60 хв., краще від 1 до 30 хв., ще краще від 1 до 10 хв.; і/або (іі) механічної обробки, вибраної з-поміж обробки міксером, обробки гомогенізатором і обробки млином; і/або (ііі) механічної обробки, яка включає перекачування ферментаційної суспензії, яка містить мікроорганізм, із посуду для ферментації в посуд для гідролізу; e) гідролізу попередньо обробленої біомаси продуктом стадії d) у реакторі для одержання розчинних цукрів. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що попередньо оброблену лігноцелюлозну біомасу одержують із лігноцелюлозної біомаси за допомогою фізико-хімічної обробки. 3. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що ростове середовище стадії с) містить лігноцелюлозну біомасу, яка бажано була попередньо оброблена. 4. Спосіб деградації лігноцелюлозної біомаси, який передбачає стадії: а) фізико-хімічної попередньої обробки лігноцелюлозної біомаси для одержання попередньо обробленої суспензії; b) розділення попередньо обробленої суспензії стадії а) на дві частини, частину А і частину В; c) включення частини А в сире ростове середовище для одержання кінцевого ростового середовища і культивування щонайменше одного мікроорганізму, здатного продукувати щонайменше один фермент, який проявляє целюлолітичну й геміцелюлолітичну активність у кінцевому ростовому середовищі, з одержанням за допомогою цього збагаченої мікроорганізмом суспензії, яка містить зазначений щонайменше один фермент; d) обробки мікроорганізму й/або збагаченої мікроорганізмом суспензії стадії с), де зазначена обробка включає механічну обробку, яка є однією або декількома з-поміж наступних: 3 (і) механічної обробки, яка включає вплив з витратами енергії на одиницю об'єму 1-500 кВт/м , 3 3 краще - 1-200 кВт/м , і ще краще - 1-100 кВт/м , бажано тривалістю від 0,1 до 60 хв., краще від 1 до 30 хв., ще краще від 1 до 10 хв.; і/або (іі) механічної обробки, вибраної з-поміж обробки міксером, обробки гомогенізатором, і обробки млином; і/або (ііі) механічної обробки, яка включає перекачування ферментаційної суспензії, яка містить мікроорганізм, із посуду для ферментації в посуд для гідролізу; e) гідролізу біомаси частини В і продукту частини d) у реакторі для одержання розчинних цукрів. 17 UA 105343 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що механічна обробка на стадії d) включає вплив з 3 3 витратами енергії на одиницю об'єму 1-500 кВт/м , краще - 1-200 кВт/м , і ще краще - 1-100 3 кВт/м , бажано тривалістю від 0,1 до 60 хв., краще від 1 до 30 хв., ще краще від 1 до 10 хв. 6. Спосіб за будь-яким з пп. 4, 5, який відрізняється тим, що механічну обробку на стадії d) вибирають з-поміж обробки міксером, обробки гомогенізатором і обробки млином, де механічна обробка може бути механічною напругою зсуву або прикладеною до мікроорганізму силою подрібнення і може розривати або руйнувати клітинні мембрани й/або структури клітинних стінок. 7. Спосіб за будь-яким з пп. 4-6, який відрізняється тим, що механічною обробкою на стадії d) є нагнітання ферментаційної суспензії, яка містить мікроорганізм, із посуду для ферментації в посуд для гідролізу. 8. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що, якщо стадія d) є нагнітанням, то швидкість зрушення, якої зазнає суспензія, яка містить мікроорганізм, перебуває в діапазоні від 1600 до 50000 1/с, краще від 1600 до 27000 1/с, а ще краще від 1600 до 10000 1/с. 9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що обробка завершується за період від 0,01 до 100 с. 10. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що обробка включає обробку ультразвуком. 11. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що стадія d) включає хімічну обробку, яка є обробкою одним або декількома хімічними агентами, бажано вибраними із групи, яка складається з солей, органічних розчинників, поверхнево-активних речовин і ферментів. 12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що стадія d) включає механічну обробку за пп. 5-9, і обробку одним або декількома хімічними агентами за п. 11. 13. Спосіб за будь-яким з пп. 4-12, який відрізняється тим, що частина А є мінорною частиною попередньо обробленої суспензії, отриманої на стадії а), бажано від 1 до 20 % (маси сухої речовини), краще від 1 до 5 % (маси сухої речовини) і найкраще від 1 до 5 % (маси сухої речовини). 14. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що мікроорганізм є грибом, який бажано вибирають із групи, яка складається з Trichoderma sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. і Talaromyces sp., а краще вибирають із групи, яка складається з: Trichoderma sp. і Talaromyces sp. 15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що мікроорганізмом є Trichoderma sp., краще Trichoderma reesei. 16. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що щонайменше один фермент із целюлолітичною і/або геміцелюлолітичною активністю має одну або кілька активностей, вибраних із групи, яка складається з: целобіогідролази типу І або типу II (СВН І або СВН II), ендонуклеази типу І, II, III або IV (EG), бета-глюкозидази (BGL), естерази, екзогеміцелюлази й ендо-геміцелюлази. 17. Спосіб за п. 16, згідно з яким екзо-геміцелюлазу й ендо-геміцелюлазу бажано вибирають зпоміж ксиланази, ксилозидази, ксилобіази, арабінази, арабінофукозидази, мананази, манозидази, галактази й галактозидази. 18. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що бета-глюкозидазу додають на стадії e). 19. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що розчинні цукри, отримані на стадії e), містять мономерні С5 - і/або С6-цукри, бажано глюкозу й/або ксилозу. 20. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що розчинні цукри стадії e) далі перетворюються на етанол. 18 UA 105343 C2 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 19