Біозахист із застосуванням штамів lactobacillus rhamnosus

Реферат: Винахід стосується штаму Lactobacillus rhamnosus DSM23035. Крім того, даний винахід стосується протигрибкової композиції, яка містить штам Lactobacillus rhamnosus DSM23035, та UA 115330 C2 (12) UA 115330 C2 щонайменше один штам вибраний з групи Lactobacillus paracasei DSM25612 та DSM24651, а також харчових, кормових і фармацевтичних продуктів, які містять таку протигрибкову композицію, способу одержання таких харчових, кормових і фармацевтичних продуктів, способу зменшення вмісту дріжджів і пліснявих грибів у таких харчових, кормових і фармацевтичних продуктах і застосування цієї протигрибкової композиції. UA 115330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується галузі біозахисту, зокрема, штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 з реєстраційним номером DSM23035. Крім того, даний винахід стосується протигрибкової композиції, яка містить цей штам, протигрибкової композиції, яка містить цей штам і щонайменше один штам Lactobacillus paracasei, харчових, кормових і фармацевтичних продуктів, які містять таку протигрибкову композицію, способу одержання таких харчових, кормових і фармацевтичних продуктів, способу зменшення вмісту дріжджів і пліснявих грибів у таких харчових, кормових і фармацевтичних продуктах і застосування цієї протигрибкової композиції. Рівень техніки винаходу Протягом багатьох років молочнокислі бактерії використовувалися для збільшення терміну зберігання харчових продуктів. У процесі бродіння молочнокислі бактерії виробляють молочну кислоту й інші органічні кислоти, що знижує значення pH харчового продукту, роблячи його непридатним для росту небажаних мікроорганізмів, таких як патогенні бактерії, дріжджі і грибки. Крім того, деякі молочнокислі бактерії виробляють метаболіти, які мають протимікробну активність. У Європейській патентній заявці № EP0221499 описані протигрибкові властивості штаму Lactobacillus rhamnosus NRRL-B-15972, який здатний інгібувати ріст різних пліснявих грибів при культивуванні на агаризованому середовищі з додаванням огіркового соку. Європейська патентна заявка № EP0576780 стосується штаму Lactobacillus rhamnosus LC705, який здатний інгібувати ріст Penicillium, Cladosporium, Fusarium і Candida на середовищі, приготованому на основі молочної сироватки з додаванням казеїнового гідролізату і дріжджового екстракту. Європейська патентна заявка № EP1442113 стосується суміші Propionibacterium jensenii і Lactobacillus sp., яка має протимікробну активність, таких як Lactobacillus rhamnosus, для застосування для біозахисту. Проте все ще існує потреба в біозахисних агентах з поліпшеною протигрибковою дією у вигляді окремих штамів або в комбінації з іншими біозахисними штамами. Суть винаходу Метою даного винаходу є створення нових штамів молочнокислих бактерій, які є високоефективними біозахисними агентами. У результаті широкого скринінгу і досліджень авторами даного винаходу було виявлено, що деякі штами Lactobacillus rhamnosus мають значно сильнішу дію проти дріжджів і пліснявих грибів порівняно з комерційними біозахисними культурами, які є на ринку, а також широко використовуваним хімічним консервантом сорбатом калію. Автори даного винаходу також виявили, що визначена група молочнокислих бактерій, знаходячись в комбінації з іншою групою молочнокислих бактерій, має значну синергічну протимікробну дію. Протимікробна дія цих об'єднаних двох груп бактерій несподівано виявилася сильнішою, ніж сума окремих дій цих двох груп бактерій. Короткий опис креслень На фіг. 1 показаний ріст пліснявих грибів у йогурті з жирністю 1,5 %, ферментованому тільки TM заквашувальною культурою YF-L901 (верхній ряд), разом з HOLDBAC YM-B (середній ряд) і разом з Lactobacillus rhamnosus CHCC5366. Досліджувані контамінанти додані в концентраціях, вказаних в тексті, були наступними (зліва направо): Penicillium brevicompactum (M1), Penicillium commune (M6), Aspergillus versicolor (M7) і Penicillium crustosum (M10), відповідно. Йогурти інкубували при температурі 7±1 °C протягом 45 діб. На фіг. 2 показана кількість клітин ізоляту Debaryomyces hansenii, доданого в йогурт з жирністю 1,5 %, ферментований тільки заквашувальною культурою YF-L901 (контроль) або TM TM разом з наступними штамами: HOLDBAC YM-B (HoldBac YM-B), HOLDBAC YM-C (HoldBac YM-C) або Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (CHCC 5366). Йогурти зберігали при температурі 7±1 °C і аналізували через відповідні інтервали часу. На фіг. 3 показаний ріст пліснявих грибів на чашках з молоком, ферментованим тільки заквашувальною культурою (контроль, перша фотографія), разом з Lb. paracasei CHCC14676 (друга фотографія), разом з Lb. rhamnosus CHCC5366 (третя фотографія) або разом з комбінацією Lb. paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC5366 (четверта фотографія). Досліджувані контамінанти додані в концентраціях, вказаних в тексті, були наступними (від лівого верхнього за годинниковою стрілкою до лівого нижнього на чашці): Penicillium nalgiovense, Penicillium commune, Aspergillus versicolor і Penicillium crustosum, відповідно. Чашки інкубували при температурі 7±1 °C протягом 12 діб. 1 UA 115330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На фіг. 4 показаний ріст (1) Penicillium solitum, (2) Р. palitans, (3) Р. discolor, (4) Р. spathulatum, (5) Р. commune, (6) Р. crustosum, (7) Р. paneum, (8) Р. roqueforti в контрольному йогурті (ліва колонка), в йогурті, виготовленому з 0,023 % сорбату калію (середня колонка), і в йогурті, виготовленому з 1E+0,7 КУО/г CHCC5366 (права колонка) після 60 діб інкубації при температурі 7 °C, при інокуляції в концентрації приблизно 1000 спор на чашку. На фіг. 5 показаний ріст Mucor ssp. на грецькому йогурті, приготованому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою (ліва чашка), або з молока, ферментованого в присутності Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (права чашка). На фіг. 6 показаний ріст пліснявого гриба Rhizopus stolonifer на грецькому йогурті, приготованому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою (К, тобто TM контроль), заквашувальною культурою і HOLDBAC YM-B (YM-B), заквашувальною культурою і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366) або заквашувальною культурою і комбінацією Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5366+14676). На фіг. 7 показаний ріст Saccharomyces cerevisiae на білому розсольному сирі, виготовленому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою (контроль); TM заквашувальною культурою і HOLDBAC YM-B (YM-B); або заквашувальною культурою, Lactobacillus paracasei CHCC14676 і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676). На фіг. 8 показаний ріст Kluyveromyces marxianus на білому розсольному сирі, виготовленому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою (контроль); TM заквашувальною культурою і HOLDBAC YM-B (YM-B); або заквашувальною культурою, Lactobacillus paracasei CHCC14676 і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676). На фіг. 9 показаний ріст Penicillium commune на білому розсольному сирі, виготовленому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою (К, тобто контроль); TM заквашувальною культурою і HOLDBAC YM-B (YM-B); або заквашувальною культурою, Lactobacillus paracasei CHCC14676 і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676). На фіг. 10 показаний ріст Р. crustosum на білому розсольному сирі, виготовленому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою (К, тобто контроль); заквашувальною TM культурою і HOLDBAC YM-B (YM-B); або заквашувальною культурою і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366). На фіг. 11 показаний ріст пліснявого гриба Penicillium paneum в йогурті з жирністю 1,5 %, виготовленому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою (К, тобто TM контроль), заквашувальною культурою і HOLDBAC YM-B (YM-B), заквашувальною культурою і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366) або заквашувальною культурою і комбінацією Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5366+14676). На фіг. 12 показаний ріст пліснявого гриба Penicillium crustosum в йогурті з жирністю 1,5 %, виготовленому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою (верхній ряд), TM заквашувальною культурою і HOLDBAC YM-B (другий ряд), заквашувальною культурою і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (третій ряд) або заквашувальною культурою і комбінацією Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (нижній ряд). Досліджуваний контамінант додавали в концентраціях 100 спор на чашку й інкубували йогурти при температурі 7±1 °C (ліва колонка), 12±1 °C (центральна колонка) або 22±1 °C (права колонка) протягом 36 діб. Докладний опис винаходу Визначення Використовуваний тут термін "молочнокисла бактерія" означає грампозитивну мікроаерофільну або анаеробну бактерію, яка зброджує цукри з утворенням кислот, зокрема молочної кислоти, як переважно продукованої кислоти. Найбільш широко використовувані в промисловості молочнокислі бактерії виявлені в роді "Lactobacillales", який включає в себе Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., PseudoLeuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp. і Enterococcus spp. Вони часто використовуються як харчові культури окремо або в комбінації з іншими молочнокислими бактеріями. Мається на увазі, що термін "харчовий продукт" також включає сир. Мається на увазі, що термін "сир" включає будь-який сир, включаючи тверді, напівтверді і м'які сири, такі як сири наступних видів: Домашній, Фета, Чедер, Пармезан, Моцарела, Ементаль, Данбо, Гауда, Едам, сири типу Фета, блакитні сири, розсольні сири, Камамбер і брі. Фахівцеві в даній галузі техніки відомо, як з коагулянта одержати сир, способи можна знайти в літературі, див., наприклад, Kosikowski, F. V., and V. V. Mistry, "Cheese and Fermented Milk Foods", 1997, 3rd Ed. F. V. Kosikowski, L. L. C. Westport, CT. У даному винаході сир, що має концентрацію NaCl нижче 1,7 % (за масою), називається "слабосолений сир". 2 UA 115330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Молочнокислі бактерії, включаючи бактерії видів Lactobacillus sp. і Lactococcus sp., як правило, надходять в молочну промисловість у вигляді заморожених або ліофілізованих культур для одержання виробничої закваски або у вигляді так званих культур для прямого внесення у ванну (DVS), призначених для безпосередньої інокуляції в ферментаційний чан або ванну для виробництва молочного продукту, такого як кисломолочний продукт або сир. Такі культури молочнокислих бактерій звичайно називаються "заквашувальні культури" або "закваски". Використовуваний тут термін "мезофільний" стосується мікроорганізмів, які найкраще ростуть при помірних температурах (15 °C-40 °C). Найбільш широко застосовувані в промисловості мезофільні бактерії включають в себе Lactococcus spp. і Leuconostoc spp. Термін "мезофільне бродіння" стосується тут бродіння при температурі від приблизно 22 °C до приблизно 35 °C. Термін "мезофільний кисломолочний продукт" стосується кисломолочних продуктів, які одержані шляхом мезофільного бродіння мезофільної заквашувальної культури і включають в себе такі кисломолочні продукти, як пахта, кисле молоко, сквашене молоко, сметана, сквашені вершки і прісний сир, такий як кварк, сир і вершковий сир. Використовуаний тут термін "термофільний" стосується мікроорганізмів, які найкраще ростуть при температурах вище 43 °C. Найбільш широко використовувані в промисловості термофільні бактерії включають Streptococcus spp. і Lactobacillus spp. Термін "термофільне бродіння" стосується бродіння при температурі вище приблизно 35 °C, наприклад, від приблизно 35 °C до приблизно 45 °C. Термін "термофільний кисломолочний продукт" стосується кисломолочних продуктів, які одержані шляхом термофільного бродіння термофільної заквашувальної культури і включають в себе такі кисломолочні продукти, як йогурт з непорушеним згустком, йогурт з порушеним згустком і питний йогурт. Під терміном "молоко" розуміється секрет молочної залози, що одержується шляхом доїння будь-якого ссавця, такого як корови, вівці, кози, буйволи або верблюди. У переважному варіанті здійснення винаходу молоко є коров'ячим молоком. Термін "молоко" також включає в себе розчини білка/жиру, виготовлені з рослинних матеріалів, наприклад, соєве молоко. Термін "молочний субстрат" стосується будь-якого сирого і/або переробленого молочного матеріалу, який може бути підданий бродінню згідно зі способом даного винаходу. Так, придатні молочні субстрати включають в себе без обмежень розчини/суспензії будь-яких молочних або молокоподібних продуктів, що містять білок, таких як цільне молоко або молоко зі зниженим вмістом жиру, знежирене молоко, пахта, відновлене сухе молоко, згущене молоко, сухе молоко, молочна сироватка, сироватковий пермеат, лактоза, маточна рідина від кристалізації лактози, концентрат сироваткового білка або вершків. Очевидно, що молочний субстрат може бути одержаний від будь-якого ссавця, наприклад, являти собою практично чисте молоко ссавців або відновлений молочний порошок. Перед бродінням молочний субстрат може бути гомогенізований і пастеризований згідно зі способами, відомими з рівня техніки. Використовуваний тут термін "гомогенізація" означає інтенсивне перемішування з одержанням розчинної суспензії або емульсії. Якщо гомогенізація проводиться перед бродінням, то вона може бути проведена таким чином, щоб розбити молочний жир на частинки дрібнішого розміру так, щоб він більше не відділявся від молока. Це може бути виконано шляхом примусового пропущення молока під високим тиском через маленькі отвори. Використовуваний тут термін "пастеризація" означає обробку молочного субстрату, що приводить до зменшення або усунення присутності живих організмів, таких як мікроорганізми. Переважно, пастеризація досягається шляхом підтримки визначеної температури протягом визначеного періоду часу. Визначена температура, як правило, досягається шляхом нагрівання. Температура і тривалість можуть бути вибрані для того, щоб убити або інактивувати визначені бактерії, наприклад, шкідливі бактерії. Після цього може слідувати етап швидкого охолоджування. Термін "бродіння (зброджування)» в способах даного винаходу означає перетворення вуглеводів у спирти або кислоти завдяки дії мікроорганізму. Переважно, бродіння в способах даного винаходу включає в себе перетворення лактози в молочну кислоту. Процеси бродіння, що використовуються у виробництві молочних продуктів, добре відомі, і фахівцеві в даній галузі техніки добре відомо як вибрати придатні умови процесу, такі як температура, вміст кисню, кількості і властивості мікроорганізму(ів), а також часу процесу. Очевидно, що умови бродіння вибираються таким чином, щоб забезпечити здійснення даного винаходу, тобто одержання молочного продукту в твердій (наприклад, сир) або рідкій (наприклад, кисломолочний продукт) формі. 3 UA 115330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перевагою композицій даного винаходу є те, що небажані мікроорганізми, вибрані з грибків, бактерій і їх сумішей, наприклад, на харчових, кормових і фармацевтичних продуктах, а також у людей і тварин, можуть бути пригнічені. Зокрема, передбачається запобігання і/або інгібування росту грибків, таких як дріжджі і плісняві гриби. Таким чином, в переважному варіанті здійснення винаходу термін "протимікробний" потрібно розуміти як "протигрибковий". Термін "небажані мікроорганізми" стосується таких мікроорганізмів, як бактерії і грибки, такі як дріжджі, які є патогенними і/або здатні викликати псування харчових, кормових або фармацевтичних продуктів. Перевагою композицій даного винаходу є те, що небажані мікроорганізми, вибрані з грибків, бактерій і їх сумішей, наприклад, на харчових, кормових і фармацевтичних продуктах, а також у людей і тварин, можуть бути пригнічені. Зокрема, передбачається запобігання і/або інгібування росту грибків, таких як дріжджі і плісняві гриби. Терміни "інгібувати" і "інгібування" відносно дріжджів і пліснявих грибів означають, наприклад, що ріст або кількість або концентрація дріжджів і пліснявих грибів, наприклад, у харчових продуктах і/або на поверхні харчових продуктів, що містять штами даного винаходу, є меншими, ніж в харчових продуктах і/або на поверхні харчових продуктів, які не містять таких штамів. У даному контексті термін "мутант" потрібно розуміти як штам, одержаний зі штаму даного винаходу за допомогою, наприклад, генної інженерії, радіаційного опромінення і/або хімічної обробки. Переважно, щоб мутант являв собою функціонально еквівалентний мутант, наприклад, мутант, який має практично аналогічні або поліпшені властивості (наприклад, це стосується протигрибкових властивостей) порівняно з вихідним штамом. Такий мутант є частиною даного винаходу. Зокрема, термін "мутант" стосується штаму, одержаного шляхом впливу на штам даного винаходу будь-якої загальноприйнятої процедури мутагенезу, включаючи обробку хімічним мутагеном, таким як етилметансульфонат (ЕМС) або N-метил-N'нітро-N-нітрогуанідин (NTG), УФ випромінювання або спонтанне виникнення мутацій. Мутант може бути підданий дії декількох процедур мутагенезу (під однією процедурою потрібно розуміти один етап мутагенезу з подальшим етапом скринінгу/відбору), але в даний момент є переважним провести не більше 20, або не більше 10, або не більше 5 процедур (або етапів скринінгу/відбору). У мутанта, що є переважним в цей час, менше 5 %, або менше 1 %, або навіть менше 0,1 % нуклеотидів у бактеріальному геномі замінені іншим нуклеотидом або видалені порівняно з вихідним штамом. Потрібно вважати, що терміни, використовувані в однині, в контексті опису даного винаходу (особливо в контексті наступної формули винаходу) включають як однину, так і множину, якщо прямо не вказане інше або якщо це явно не суперечить контексту. Терміни "що включає", "що має", "що включає в себе" і "що містить" потрібно розглядати як необмежувальні терміни (тобто, які означають "що включають без обмежень"), якщо не вказано інше. Вказівка діапазонів значень у даному описі є тільки коротким способом індивідуальної вказівки кожного окремого значення, що знаходиться в межах цього діапазону, якщо не вказане інше, і кожне окреме значення є включеним в опис, як якби воно було окремо в ньому указане. Всі описані тут способи можуть бути здійснені в будь-якому придатному порядку, якщо прямо не вказане інше або якщо це явно не суперечить контексту. Використання будь-якого або всіх прикладів або виразів (наприклад, "такий як"), які вказують на приклади, наведених в даній заявці, призначене виключно для кращого розкриття даного винаходу і не накладає обмежень на об'єм винаходу, якщо не заявлене інше. Жодне формулювання в описі не повинне розглядатися як вказівка на будь-який незаявлений елемент як необхідний для здійснення винаходу. Здійснення і аспекти винаходу Автори даного винаходу провели скринінг 200 кандидатів з Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei і Lactobacillus rhamnosus з метою знайти штами, найбільш ефективні проти широкого спектра мікроорганізмів, таких як дріжджі і плісняві гриби. Скринінг проводили в модельній системі, що імітує настільки, наскільки це можливо, мезофільні кисломолочні продукти в середовищі на основі молока, до якого додавали відповідну заквашувальну культуру разом з біозахисними кандидатами або без них і яке піддавали зброджуванню в умовах, що використовуються для мезофільних кисломолочних продуктів. Досліджувані організми виділяли з мезофільних кисломолочних продуктів. Як TM очищені молочнокислі бактерії з культур HOLDBAC (Danisco А/S, Данія), так і повні культури TM TM HOLDBAC YM-B і HOLDBAC YM-C, що містять як молочнокислі бактерії, так і пропіоновокислі бактерії, використовували як показник вихідного рівня біологічного захисту. Ця модельна система описана в Європейській патентній заявці № EP11161609.0. Було виявлено, що сімнадцять кандидатів із Lactobacillus paracasei і Lactobacillus rhamnosus в більшості випадків інгібують 12 індикаторних грибків, а також продемонстрували кращий 4 UA 115330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рівень біологічного захисту, ніж контрольні молочнокислі бактерії, при випробуванні при температурі 25 °C. Випробування на йогурті показали, що один штам Lactobacillus rhamnosus - штам Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, який був депонований в Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під реєстраційним номером DSM23035, значно краще інгібує дріжджі і плісняві гриби, ніж комерційно доступна біозахисна культура. Інгібуюча дія штаму на дріжджі і плісняві гриби може бути визначена шляхом зберігання кисломолочних продуктів при придатній температурі протягом придатного періоду часу зберігання, як описано в прикладах нижче. Як правило, придатна температура, при якій потрібно здійснювати даний спосіб, залежить від температури, при якій, як правило, зберігається і/або виробляється конкретний харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт. Температура, при якій, як правило, зберігаються ці продукти, становить від 5 °C до 26 °C, переважно ця температура становить 8 °C. Час зберігання при цій температурі залежить від часу, протягом якого харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт, як правило, зберігається (терміну зберігання). Час зберігання звичайно становить 5-65, переважно 7-60 діб, більш переважно 7-28 діб, і ще більш переважно час зберігання становить приблизно 21 добу. Відповідно, в першому аспекті даний винахід стосується штаму Lactobacillus rhamnosus, вибраного з групи, що складається зі штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, який був депонований в Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під реєстраційним номером DSM23035, і одержаних з нього мутантних штамів. Таким чином, крім вищезгаданого депонованого штаму, даний винахід також стосується мутантів, які були одержані з цього штаму, тобто вони були одержані з використанням депонованого штаму CHCC5366 як вихідного матеріалу. Мутантний штам може бути одержаний з депонованого штаму, наприклад, за допомогою генної інженерії, радіаційного опромінення, УФ випромінювання, хімічної обробки і/або способів, які індукують зміни в геномі. Відповідно до даного винаходу мутант буде інгібувати і/або запобігати росту деяких бактерій або грибків, переважно пліснявих грибів. Переважно, щоб мутант мав практично 80 % або більше, щонайменше 90 % або більше, щонайменше 95 % або більше, або навіть до 100 % протигрибкової активності порівняно зі своїм вихідним штамом, що визначається, наприклад, в аналізі, описаному в прикладі 1, з використанням одного з пліснявих грибів Р. brevicompactum, Р. commune, А. versicolor, D. hansenii або Р. crustosum як контрольний організм, ріст якого необхідно інгібувати. Для фахівця в даній галузі техніки очевидно, що використовуючи депонований штам як вихідний матеріал, фахівець в даній галузі техніки може за допомогою стандартного мутагенезу або методів повторного виділення легко одержати його додаткові мутанти або похідні, які зберігають описані тут характерні ознаки і переваги. Відповідно, термін "мутантні штами, одержані з нього" в першому аспекті стосується мутантних штамів, одержаних з використанням депонованого штаму як вихідного матеріалу. Другий аспект стосується протигрибкової композиції, яка містить щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus відповідно до першого аспекту даного винаходу, переважно, штам Lactobacillus rhamnosus CHCC5366. При випробуванні штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 в комбінації з різними штамами Lactobacillus paracasei несподівано було виявлено, що ці комбінації виявилися навіть ефективнішими, ніж кожний з цих штамів нарізно, навіть коли загальні концентрації клітин були однаковими. В одному варіанті здійснення даний винахід стосується комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC12777. В іншому варіанті здійснення винахід стосується комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676. Ці комбінації, мабуть, виявилися ефективнішими, ніж контрольні культури TM TM HOLDBAC YM-B і HOLDBAC YM-C (Danisco, Данія). Таким чином, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується протимікробних і, більш переважно, протигрибкових композицій, які містять штам Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, який був депонований в Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під реєстраційним номером DSM23035, або одержаний з нього мутант і щонайменше один штам Lactobacillus paracasei. Переважно щонайменше один штам Lactobacillus paracasei вибраний з групи, яка складається зі штаму Lactobacillus paracasei CHCC14676 з реєстраційним номером DSM25612, штаму Lactobacillus paracasei CHCC12777 з реєстраційним номером DSM24651 і мутантних штамів, одержаних з цих депонованих штамів. Таким чином, в одному аспекті даний винахід стосується протимікробної і, більш переважно, протигрибкової композиції, яка містить штам Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 або одержаний 5 UA 115330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з нього мутант і штам Lactobacillus paracasei CHCC12777 або одержаний з нього мутант. В іншому аспекті даний винахід стосується протимікробної і, більш переважно, протигрибкової композиції, яка містить щонайменше штам Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 або одержаний з нього мутант і штам Lactobacillus paracasei CHCC14676 або одержаний з нього мутант. Переважно, комбінація штаму Lactobacillus paracasei і штаму Lactobacillus rhamnosus в композиціях даного винаходу при здійсненні своєї протимікробної і/або протигрибкової активності діє синергічно. Протигрибкова композиція, як правило, містить бактерії в концентрованому вигляді, включаючи заморожені, висушені або ліофілізовані концентрати, які, як правило, мають 4 12 концентрацію життєздатних клітин в діапазоні від 10 до 10 КУО (колонієутворювальних 4 одиниць) на грам композиції, зокрема щонайменше 10 КУО на грам композиції, як, наприклад, 5 6 7 щонайменше 10 КУО/г, наприклад, щонайменше 10 КУО/г, як, наприклад, щонайменше 10 8 9 КУО/г, наприклад, щонайменше 10 КУО/г, як, наприклад, щонайменше 10 КУО/г, наприклад, 10 11 щонайменше 10 КУО/г, як, наприклад, щонайменше 10 КУО/м. Таким чином, композиція даного винаходу переважно знаходиться в замороженій, висушеній або ліофілізованій формі, наприклад, як культура для прямого внесення у ванну (DVS). Однак композиція даного винаходу також може являти собою рідину, яка виходить після суспендування заморожених, висушених або ліофілізованих клітинних концентратів у рідкому середовищі, такому як вода або ФСБ-буфер. Коли композиція даного винаходу являє собою суспензію, концентрація 4 12 життєздатних клітин знаходиться в діапазоні від 10 до 10 КУО (колонієутворювальних 4 одиниць) на мілілітр композиції, зокрема щонайменше 10 КУО/мл композиції, як, наприклад, 5 6 7 щонайменше 10 КУО/мл, наприклад, щонайменше 10 КУО/мл, як, наприклад, щонайменше 10 8 9 КУО/мл, наприклад, щонайменше 10 КУО/мл, як, наприклад, щонайменше 10 КУО/мл, 10 11 наприклад, щонайменше 10 КУО/мл, як, наприклад, щонайменше 10 КУО/мл. Як додаткові компоненти композиція може містити кріопротектори і/або стандартні добавки, включаючи поживні речовини, такі як дріжджовий екстракт, цукри і вітаміни, наприклад, вітамін А, С, D, K або вітаміни групи B. Придатні кріопротектори, які можуть бути додані в композиції даного винаходу, являють собою компоненти, які поліпшують переносимість мікроорганізмами низьких температур, такі як маніт, сорбіт, триполіфосфат натрію, ксиліт, гліцерин, рафіноза, мальтодекстрин, еритрит, треїт, трегалоза, глюкоза і фруктоза. Інші добавки можуть включати в себе, наприклад, вуглеводи, смакоароматичні добавки, мінерали, ферменти (наприклад, сичужний фермент, лактаза і/або фосфоліпаза). У композиціях даного винаходу, які містять штам Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і штам Lactobacillus paracasei, співвідношення між штамом Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і штамом Lactobacillus paracasei, наприклад, співвідношення концентрації або кількості бактерій Lactobacillus rhamnosus і концентрації або кількостей бактерій Lactobacillus paracasei, переважно становить від 1:100 до 100:1, переважно від 1:10 до 10:1. Протигрибкова композиція даного винаходу може застосовуватися з будь-яким харчовим, кормовим і фармацевтичним продуктом, який схильний до мікробіального псування і/або контамінації дріжджами і пліснявими грибами. До таких продуктів належать, без обмежень, фрукти і овочі, включаючи продукти їх переробки, зерно і продукти переробки зерна, молочні продукти, м'ясо, м'ясо птиці і морепродукти. В особливо переважних варіантах здійснення винаходу композиція застосовується з молочним продуктом і/або м'ясом і м'ясом птиці. У переважному варіанті здійснення винаходу композиції даного винаходу застосовуються як добавка при приготуванні молочних продуктів, таких як йогурт, сир, сметана, вершковий сир і тому подібне. У переважному варіанті здійснення винаходу композиції даного винаходу застосовуються проти грибків, таких як дріжджі і плісняві гриби. Це означає, що композиції застосовуються для інгібування і/або запобігання росту грибків, що викликає контамінацію в процесах в молочній промисловості, зокрема, в процесах зброджування молока. Композиції даного винаходу можуть застосовуватися, наприклад, для інгібування і/або запобігання росту дріжджів, таких як дріжджі родів Klyveromyces (наприклад, K. marxianus, K. lactis), Pichia (наприклад, Р. fermentans), Yarrowia (наприклад, Y. lipolytica), Candida (наприклад, С. sake) і тому подібне; або пліснявих грибів, таких як плісняві гриби родів Penicillium (наприклад, Р. nalgiovense, Р. commune, Р. crustosum, Р. brevicompactum, Р. glabrum), Mucor spp., Cladiosporium ssp., Aspergillus (наприклад, А. versicolor), Debaryomyces (наприклад, D. hansenii) і тому подібне. Особливо переважним є застосування композицій даного винаходу для інгібування і/або запобігання росту видів Klyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica, Penicillium nalgiovense, Cladiosporium ssp., Penicillium commune, Mucor ssp., Penicillium brevicompactum, Aspergillus versicolor, Penicillium crustosum, Kluyveromyces lactis і/або Debaryomyces hansenii. 6 UA 115330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Протигрибкова композиція згідно з другим аспектом даного винаходу може також застосовуватися як фармацевтичний продукт, переважно продукт для лікування інфекцій, викликаних патогенними грибками, такими як патогенні дріжджі. У третьому аспекті даний винахід стосується харчового, кормового або фармацевтичного продукту, що містить штам Lactobacillus rhamnosus відповідно до першого аспекту даного винаходу або протигрибкову композицію згідно з другим аспектом даного винаходу. У переважному варіанті здійснення винаходу харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт являє собою харчовий продукт. У більш переважному варіанті здійснення винаходу такий харчовий продукт вибраний з групи, яка складається з фруктів і продуктів переробки фруктів, овочів і продуктів переробки овочів, зерна і продуктів переробки зерна, молочних продуктів, м'яса, м'яса птиці і морепродуктів, а також їх сумішей. У ще більш переважному варіанті здійснення винаходу харчовий продукт являє собою молочний продукт, переважно мезофільний або термофільний кисломолочний продукт, такий як прісний сир, йогурт, сметана або сир. В іншому переважному варіанті здійснення винаходу харчовий продукт являє собою м'ясо або м'ясо птиці. У переважному варіанті здійснення винаходу харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт являє собою фармацевтичний продукт. Переважно, фармацевтичний продукт являє собою продукт, придатний для введення протигрибкової композиції згідно з другим аспектом даного винаходу людині або тварині для пригнічення патогенних мікроорганізмів і полегшення симптомів, пов'язаних з патогенними мікроорганізмами. Приклади таких симптомів включають в себе симптоми, пов'язані з кандидозом. У такому варіанті здійснення винаходу фармацевтичний продукт може являти собою одиничну лікарську форму, що містить протигрибкову композицію. Переважно, одинична лікарська форма є капсулою або таблеткою. Однак одинична лікарська форма також може бути придатною для нанесення на слизову оболонку або шкіру і, таким чином, знаходитися у вигляді пасти, крему, мазі і тому подібного. У четвертому аспекті даний винахід стосується способу одержання харчового, кормового або фармацевтичного продукту відповідно до третього аспекту даного винаходу, що включає в себе додавання щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus відповідно до першого аспекту або протигрибкової композиції згідно з другим аспектом даного винаходу під час виготовлення харчового, кормового або фармацевтичного продукту. Переважно, даний спосіб також включає в себе етап регулювання технологічних параметрів під час процесу виготовлення таким чином, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus залишалася постійною або підвищувалася. У переважному варіанті здійснення винаходу концентрація щонайменше одного штаму 6 6 Lactobacillus rhamnosus становить щонайменше 110 КУО/г або кожного щонайменше 110 5 КУО/мл харчового, кормового або фармацевтичного продукту, або кожного щонайменше 110 2 КУО/см поверхні харчового, кормового або фармацевтичного продукту. Переважно, 6 концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus становить щонайменше 510 6 КУО/г або кожного щонайменше 510 КУО/мл харчового, кормового або фармацевтичного 5 2 продукту, або кожного щонайменше 510 КУО/см поверхні харчового, кормового або 7 фармацевтичного продукту, наприклад, щонайменше 110 КУО/г або кожного щонайменше 7 110 КУО/мл харчового, кормового або фармацевтичного продукту, або кожного щонайменше 6 2 110 КУО/см поверхні харчового, кормового або фармацевтичного продукту, наприклад, 7 7 щонайменше 510 КУО/г або кожного щонайменше 510 КУО/мл харчового, кормового або 6 2 фармацевтичного продукту, або кожного щонайменше 510 КУО/см поверхні харчового, кормового або фармацевтичного продукту. Коли харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт виробляється шляхом додавання композиції, яка містить штам Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 або одержаний з нього мутант і щонайменше один штам Lactobacillus paracasei, концентрація штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 або одержаного з нього мутанта і/або концентрація щонайменше одного штаму 6 Lactobacillus paracasei становить кожного щонайменше 110 КУО/г або кожного щонайменше 6 110 КУО/мл харчового, кормового або фармацевтичного продукту, або кожного щонайменше 5 2 110 КУО/см поверхні харчового, кормового або фармацевтичного продукту. Переважно, концентрація штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 або одержаного з нього мутанта і/або концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei становить кожного 6 6 щонайменше 510 КУО/г або кожного щонайменше 510 КУО/мл харчового, кормового або 7 UA 115330 C2 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2 фармацевтичного продукту, або кожного щонайменше 510 КУО/см поверхні харчового, кормового або фармацевтичного продукту. У ще одному варіанті здійснення винаходу концентрація штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 або одержаного з нього мутанта і/або концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei становить кожного 8 8 щонайменше 110 КУО/г або кожного щонайменше 110 КУО/мл харчового, кормового або 7 2 фармацевтичного продукту, або кожного щонайменше 110 КУО/см поверхні харчового, кормового або фармацевтичного продукту. У переважному варіанті здійснення винаходу технологічні параметри регулюються під час процесу виготовлення таким чином, щоб концентрація штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (або одержаного з нього мутанта) і щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei підвищувалася або залишалася постійною. Протигрибкову композицію даного винаходу найпростіше застосовувати шляхом змішування з і/або нанесення на харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт, що змішується, але вона також є ефективною при нанесенні на поверхню твердих харчових продуктів або введенні всередину таких продуктів, наприклад, за допомогою ін'єкції. В інших варіантах здійснення винаходу композиція може застосовуватися в складі маринаду, панірування, товчених спецій, глазурі, суміші барвників і тому подібного, при цьому ключовим критерієм є те, щоб протигрибкова композиція була доступна на поверхні, схильній до бактеріального псування і контамінації дріжджами і пліснявими грибами. В інших варіантах здійснення винаходу композиція може бути опосередковано приведена в контакт з поверхнею харчового продукту шляхом нанесення композиції на упаковку харчового продукту і потім приведення цієї упаковки в контакт з поверхнею харчового продукту. Необхідна для застосування оптимальна кількість буде залежати від складу конкретного харчового продукту, що підлягає обробці, і способу нанесення композиції, що застосовується, на поверхню харчового продукту, але вона може бути визначена за допомогою нескладних експериментів. У найбільш переважному варіанті здійснення винаходу спосіб включає один або декілька етапів бродіння, і щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus або протигрибкова композиція можуть бути додані в харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт до, під час або після цих одного або декількох етапів бродіння. Переважно, спосіб включає зброджування субстрату, такого як молочний субстрат, в присутності щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus даного винаходу протягом періоду часу, достатнього для виявлення протигрибкової активності щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus даного винаходу. Ця протигрибкова активність має ефект інгібування розвитку дріжджів і/або пліснявих грибів в продукті, ферментованому щонайменше одним штамом. У ще більш переважному варіанті здійснення винаходу спосіб включає зброджування молочного субстрату заквашувальною культурою, що містить щонайменше один штам родів, вибраних з Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus і Leuconostoc, наприклад, щонайменше один штам Lactobacillus bulgaricus і щонайменше один штам Streptococcus thermophilus, або, наприклад, щонайменше один штам Lactococcus lactis subsp. lactis щонайменше один штам Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, і щонайменше один штам Lactococcus lactis subsp. diacetylactis. У п'ятому аспекті даний винахід стосується харчового продукту, що одержується способом відповідно до четвертого аспекту даного винаходу. У шостому аспекті даний винахід стосується застосування штаму Lactobacillus rhamnosus відповідно до першого аспекту даного винаходу або протигрибкової композиції згідно з другим аспектом даного винаходу для приготування харчового, кормового або фармацевтичного продукту. Переважно, харчовий продукт, що одержується із застосуванням штаму Lactobacillus rhamnosus відповідно до першого аспекту даного винаходу або протигрибкової композиції згідно з другим аспектом даного винаходу, являє собою сир, такий як Домашній, Фета, Чедер, Пармезан, Моцарела, Ементаль, Данбо, Гауда, Едам, сир типу Фета, блакитний сир, розсольний сир, Камамбер або Брі. В останньому аспекті даний винахід стосується застосування штаму Lactobacillus rhamnosus відповідно до першого аспекту даного винаходу або протигрибкової композиції згідно з другим аспектом даного винаходу для інгібування росту дріжджів і пліснявих грибів, зокрема, в харчових і кормових продуктах. Варіанти здійснення даного винаходу описані нижче шляхом наведення необмежувальних прикладів. Приклади Приклад 1: Контрольне зараження йогурту, який містить Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 8 UA 115330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для візуальної оцінки інгібуючої дії штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 на різні плісняві гриби Р. brevicompactum, Р. commune, А. versicolor і Р. crustosum одержували йогурт з жирністю 1,5 %: Гомогенізоване молоко (з жирністю 1,5 %) піддавали термічній обробці при температурі 95 °C±1 °C протягом 5 хв у пляшках об'ємом 1 л на водяній бані і негайно охолоджували. Комерційну заквашувальну культуру (F-DVS YF-L901, одержану від Chr. Hansen А/S, Данія) TM інокулювали в кількості 0,02 %. Потім молоко інокулювали HOLDBAC YM-B (20 DCU/100 л) 7 або Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (110 КУО/мл) і одну пляшку, інокульовану тільки заквашувальною культурою, використовували як контроль. Молоко зброджували при температурі 43 °C±1 °C доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,1. Одержаний йогурт розливали по чашках (100 г) і зберігали при температурі 7 °C±1 °C. На наступний день після приготування йогурту в чашках інокулювали в двох повторностях різними пліснявими грибами як поверхневими контамінантами в одну точку на поверхні йогурту в кількості 100 спор на точку. Ріст пліснявих грибів оцінювали візуально після зберігання протягом 45 діб при температурі 7 °C±1 °C. Результати випробування йогурту наведені на фіг. 1, на якій видно, що Р. brevicompactum (M1), Р. commune (M6), А. versicolor (M7) і Р. crustosum (M10) добре ростуть на йогурті, виготовленому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою YF-L901 (верхній TM ряд) або заквашувальною культурою і культурою HOLDBAC YM-B (середній ряд). На відміну від цього, коли під час бродіння в молоці був присутнім Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (нижній ряд), ріст всіх пліснявих грибів, що досліджуються, був інгібований. Приклад 2: Кількісне визначення інгібуючої дії Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 проти Debaryomyces hansenii Для кількісного визначення інгібуючої дії Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 на D. hansenii одержували йогурт: Гомогенізоване молоко (з жирністю 1,5 %) піддавали термічній обробці при температурі 95 °C±1 °C протягом 5 хв у пляшках об'ємом 1 л на водяній бані. Молоко негайно охолоджували. Кожну пляшку інокулювали комерційною заквашувальною культурою (F-DVS YF-L901, одержаною від Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 0,02 %. Потім молоко інокулювали TM TM HOLDBAC YM-B (20 DCU/100 л) або HOLDBAC YM-C (10 DCU/100 л) або Lactobacillus 7 rhamnosus CHCC5366 (110 КУО/г) і одну пляшку, інокульовану тільки заквашувальною культурою, використовували як контроль. Молоко зброджували при температурі 43 °C±1 °C доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,05. Одержаний йогурт розливали по чашках (приблизно 75 мл) і зберігали при температурі 7 °C±1 °C. На наступний день після приготування йогурту чашки в двох повторностях інокулювали дріжджами в кількості 0,75 мл на чашку з одержанням кінцевої концентрації 20 КУО/м. Дріжджі рівномірно розподіляли в йогурті. Чашки зберігали під кришкою при температурі 7±1 °C і аналізували через відповідні інтервали часу для визначення рівня контамінації D. hansenii шляхом посіву 1 мл йогурту і подальшого 1-кратного розведення в пептонно-сольовому розчині на агар з дріжджовим екстрактом, глюкозою і хлорамфеніколом (YGC) з подальшою інкубацією в аеробних умовах протягом 5 діб при температурі 25 °C. Як показано на фіг. 2, ріст D. hansenii пригнічувався в присутності штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, коли його вводили разом із заквашувальною культурою YF-L901 перед зброджуванням. Цей штам викликав значно сильніше інгібування, ніж комерційні культури TM TM HOLDBAC YM-B і HOLDBAC YM-C. Приклад 3: Напівкількісне визначення інгібуючої дії Lb. paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC5366 окремо і в комбінації на різні плісняві контамінанти Для напівкількісного визначення інгібуючої дії Lb. paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC5366 окремо і в комбінації використовували аналіз на агарі, що має схожість із процесом виробництва йогурту: Гомогенізоване молоко (з жирністю 1,5 % (маса/об'єм)) піддавали термічній обробці при температурі 95 °C протягом п'яти хвилин і негайно охолоджували. Комерційну заквашувальну культуру (F-DVS YC-350, одержану від Chr. Hansen А/S, Данія) інокулювали в кількості 0,02 % і молоко розливали по пляшках об'ємом 220 мл. Потім пляшки інокулювали Lb. paracasei CHCC14676, Lb. rhamnosus CHCC5366 і комбінацією цих двох штамів, відповідно, із загальною 7 концентрацією 110 КУО/мл. Одну пляшку, інокульовану тільки заквашувальною культурою, використовували як контроль. Крім того, у всі пляшки додавали 5 % індикатора pH бромкрезоловий пурпурний і бромкрезоловий зелений, щоб одержати уявлення про швидкість закислення середовища і одержати синій/зелений колір середовища, що надалі зробило 9 UA 115330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 легшим виявлення росту досліджуваних дріжджів і пліснявих грибів. Всі пляшки інкубували на водяній бані при температурі 43±1 °C і проводили бродіння в цих умовах доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,1. Після бродіння пляшки відразу охолоджували на льоду і енергійно струшували, щоб зруйнувати згусток. Потім ферментоване молоко нагрівали до температури 40 °C і додавали 40 мл стерильного 5 % розчину агару, який був розплавлений і охолоджений до 60 °C. Цей розчин наливали в стерильні чашки Петрі і сушили ці чашки на столі з ламінарним потоком повітря протягом 30 хвилин. Відповідне розведення суспензій повністю пророслих спор вибраних пліснявих грибів Penicillium nalgiovense (10x), Penicillium commune (100x), Aspergillus versicolor (100x) і Penicillium crustosum (100x) наносили в точку на чашках. Чашки інкубували при температурі 7 °C і аналізували на наявність росту пліснявих грибів через відповідні постійні інтервали часу. Результати аналізу на агарі наведені на фіг. 3, на якій видно, що всі використовувані в аналізі плісняві гриби дуже добре росли на чашках з агаром з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою (контроль). Однак на чашках з агаром з молока, в якому під час бродіння був присутнім Lb. paracasei CHCC14676 або Lb. rhamnosus CHCC5366, ріст всіх пліснявих грибів значно зменшувався. Крім того, коли в молоці під час бродіння Lb. paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC5366 були присутніми в комбінації, ще сильніше інгібування спостерігалося для посіяних на чашки Penicillium commune, Aspergillus versicolor і Penicillium crustosum. Приклад 4: Контрольне зараження йогурту, який містить Lb. rhamnosus CHCC5366 і сорбат калію Пастеризоване молоко, що містить 0,17 % жиру, використовували для приготування трьох різних партій йогурту, із застосуванням комерційної заквашувальної культури, вказаної в прикладі 1. Цю заквашувальну культуру інокулювали в кількості 0,013 %. Перед бродінням в 7 першу партію додавали сорбат калію (0,023 %), Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (110 КУО/г) додавали у другу партію, в той час як третю партію використовували як контроль, що містить тільки заквашувальну культуру. Бродіння здійснювали при температурі 43 °C доти, поки значення pH не досягало 4,55. Після того, як значення pH досягало 4,55, йогурт зберігали при температурі 7 °C. Три різні типи йогурту розподіляли по маленьких чашках по приблизно 100 г в кожну і поверхню інокулювали кожним з наступних пліснявих грибів, раніше виділених із зіпсованих кисломолочних продуктів, в кількості, що забезпечує кінцеву концентрацію 1000 спор на чашку: Penicillium solitum, Penicillium palitans, Penicillium discolor, Penicillium spathulatum, Penicillium commune, Penicillium crustosum, Penicillium paneum, Penicillium roqueforti. Йогурти інкубували при температурі 7 °C протягом 60 діб, ріст різних пліснявих грибів оцінювали візуально за допомогою фотографування в кінці 60-денного періоду. Результати, наведені на фіг. 4, показують, що присутність Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 різко зменшує розростання і утворення типового зеленого/синього забарвлення різних пліснявих грибів у йогурті під час зберігання протягом 60 діб при температурі 7 °C. Було виявлено, що інгібуюча дія Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 на величину розростання і утворення забарвлення пліснявих грибів була значно сильніша, ніж дія, що викликається додаванням 0,023 % сорбату калію. Приклад 5: Контрольне зараження грецького йогурту, який містить комбінацію Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 Для візуальної оцінки інгібуючої дії комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 на Mucor ssp. грецький йогурт одержували таким чином: Пастеризоване молоко (з жирністю 1,5 %) інокулювали комерційною заквашувальною культурою (F-DVS YF-L901, одержаною від Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 0,02 %. Одну партію, інокульовану тільки заквашувальною культурою, використовували як контроль. Іншу 6 партію додатково інокулювали комбінацією штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (510 6 КУО/г) і штаму Lactobacillus paracasei CHCC14676 (510 КУО/г). Молоко зброджували при температурі 43 °C±1 °C до кінцевого значення pH 4,55 (6-7 годин). Потім йогурт охолоджували до температури 25 °C±1 °C із зворотним тиском 2 бар і зберігали при температурі 6 °C±1 °C. 10 UA 115330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На наступний день після приготування йогурту Mucor ssp. інокулювали як поверхневий контамінант в чашки йогурту в двох повторностях шляхом нанесення однієї точки на поверхню йогурту з концентрацією при інокуляції 100 спор на точку. Ріст пліснявих грибів оцінювали візуально після зберігання протягом 15 діб при температурі 22 °C±1 °C. Результати випробування грецького йогурту подані на фіг. 5, і вони показують, що Mucor ssp. добре росте на йогурті, приготованому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою (ліва чашка). На відміну від цього, коли під час бродіння в молоці були присутніми Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (права чашка), ріст Mucor ssp. був інгібований. Приклад 6: Друге контрольне зараження грецького йогурту, який містить комбінацію Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 Для візуальної оцінки інгібуючої дії комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 на плісняву чорного хліба Rhizopus stolonifer грецький йогурт одержували таким чином: Пастеризоване молоко (з жирністю 1,5 %) інокулювали комерційною заквашувальною культурою (F-DVS YF-L901, одержаною від Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 0,02 %. Потім TM молоко додатково інокулювали HOLDBAC YM-B (10 DCU/100 л), штамом Lactobacillus 7 rhamnosus CHCC5366 (110 КУО/г) або комбінацією штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 6 6 (510 КУО/г) і штаму Lactobacillus paracasei CHCC14676 (510 КУО/г). Одну партію, інокульовану тільки заквашувальною культурою, використовували як контроль. Молоко зброджували при температурі 43 °C±1 °C до кінцевого значення pH 4,55 (6-7 годин). Потім йогурт охолоджували до температури 25 °C±1 °C зі зворотним тиском 2 бар і зберігали при температурі 6 °C±1 °C. На наступний день після приготування йогурту Rhizopus stolonifer інокулювали як поверхневий контамінант в чашки йогурту в двох повторностях шляхом нанесення однієї точки на поверхню йогурту з концентрацією при інокуляції 100 спор на точку. Ріст пліснявих грибів оцінювали візуально після зберігання протягом 42 діб при температурі 7 °C±1 °C. Результати випробування грецького йогурту подані на фіг. 6, і вони показують, що Rhizopus stolonifer добре росте на йогурті, приготованому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою ("К", тобто контроль) або заквашувальною культурою і культурою TM HOLDBAC YM-B (YM-B). Однак в присутності Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366) ріст Rhizopus stolonifer значно інгібувався. Коли в молоці під час бродіння були присутніми як Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, так і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5366+14676), то ріст Rhizopus stolonifer інгібувався майже повністю. Приклад 7: Контрольне зараження білого розсольного сиру, який містить комбінацію Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 Для кількісної оцінки інгібуючої дії комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 проти Saccharomyces cerevisiae одержували білий розсольний сир: Пастеризоване і стандартизоване молоко інокулювали комерційною заквашувальною культурою (F-DVS SafeIT-1, одержаною від Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 40 Од. на 1000 л TM молока. Потім молоко додатково інокулювали HOLDBAC YM-B (10 DCU/100 л) або 6 комбінацією штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (510 КУО/г) і штаму Lactobacillus 6 paracasei CHCC14676 (510 КУО/г). Одну партію, інокульовану тільки заквашувальною культурою, використовували як контроль. Молоко при температурі 36 °C±1 °C обробляли сичужним ферментом (Chy-Max plus, одержаним від Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 220 мл на 1000 л протягом 90 хвилин перед розрізанням. При значенні pH 6,0 згусток перекачували в форми і залишали для осушування до кінцевого значення pH 4,8-4,7 (20-24 години). Сир переносили в жерстяні форми з холодним розсолом (8 %) і зберігали при температурі 5 °C±1 °C. На наступний день після приготування білого розсольного сиру жерстяні форми в двох повторностях інокулювали дріжджами в кінцевій концентрації 20 КУО/мл. Дріжджі рівномірно диспергували в розсолі. Чашки зберігали під кришкою при температурі 7 °C±1 °C протягом періоду часу до 40 діб і 10 г аналізували через відповідні інтервали часу на рівень контамінації Saccharomyces cerevisiae шляхом посіву відповідного 1-кратного розведення в пептонносольовому розчині на агар з дріжджовим екстрактом, глюкозою і хлорамфеніколом (YGC) з подальшою інкубацією в аеробних умовах протягом 5 діб при температурі 25 °C. Як показано на фіг. 7, ріст Saccharomyces cerevisiae пригнічувався в присутності комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676, коли її вводили разом із заквашувальною культурою SafeIT-1. Ці штами викликали значно сильніше інгібування, ніж TM комерційно доступна культура HOLDBAC YM-B. 11 UA 115330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Приклад 8: Друге контрольне зараження білого розсольного сиру, який містить комбінацію Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 Для кількісної оцінки інгібуючої дії комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 проти Kluyveromyces marxianus білий розсольний сир одержували, як описано в прикладі 1, за винятком того, що жерстяні форми інокулювали Kluyveromyces marxianus як дріжджовим контамінантом. Як показано на фіг. 8, ріст Kluyveromyces marxianus пригнічувався в присутності комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676, коли її вводили разом із заквашувальною культурою SafeIT-1. Ці штами викликали значно сильніше інгібування, ніж TM комерційно доступна культура HOLDBAC YM-B. Приклад 9: Третє контрольне зараження білого розсольного сиру, який містить комбінацію Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 Для візуальної оцінки інгібуючої дії комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 проти Р. commune білий розсольний сир одержували, як описано в прикладі 1. Через 7 днів після приготування білого розсольного сиру сир витягували з розсолу й інокулювали його в двох повторностях Р. commune як поверхневий контамінант в три точки на поверхні сиру з кінцевою концентрацією 100 спор на точку. Ріст двох різних ізолятів Р. commune оцінювали візуально після зберігання протягом 12 діб при температурі 7 °C±1 °C і, потім, протягом 16 діб при температурі 12 °C±1 °C. Результати випробування білого розсольного сиру подані на фіг. 9, і вони показують, що два ізоляти Р. commune добре ростуть на білому розсольному сирі, виготовленому з молока, інокульованого тільки заквашувальною культурою (ліва фотографія). На відміну від цього, коли при виготовленні сиру використовувалися Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (права фотографія), ріст Р. commune значною мірою інгібувався. Приклад 10: Контрольне зараження білого розсольного сиру, який містить Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 Для візуальної оцінки інгібуючої дії Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 проти Р. crustosum одержували білий розсольний сир: Пастеризоване і стандартизоване молоко інокулювали комерційною заквашувальною культурою (F-DVS SafeIT-1, одержаною від Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 40 Од. на 1000 л TM молока. Потім молоко додатково інокулювали HOLDBAC YM-B (10 DCU/100 л) або штамом 7 Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (110 КУО/г). Одну партію, інокульовану тільки заквашувальною культурою, використовували як контроль. Молоко при температурі 36 °C±1 °C обробляли сичужним ферментом (Chy-Max plus, одержаним від Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 220 мл на 1000 л протягом 90 хвилин перед розрізанням. При значенні pH 6,0 згусток перекачували в форми і залишали для осушування до кінцевого значення pH 4,8-4,7 (20-24 години). Сир переносили в жерстяні форми з холодним розсолом (8 %) і зберігали при температурі 5 °C±1 °C. Через 7 днів після приготування білого розсольного сиру сир витягували з розсолу й інокулювали його в двох повторностях Р. crustosum як поверхневий контамінант в три точки на поверхні сиру з кінцевою концентрацією 100 спор на точку. Ріст ізоляту Р. crustosum оцінювали візуально після зберігання протягом 11 діб при температурі 12 °C±1 °C і, потім, протягом 16 діб при температурі 12 °C±1 °C. Результати випробування білого розсольного сиру подані на фіг. 10 і вони показують, що ізолят Р. crustosum добре росте на білому розсольному сирі, виготовленому з молока, інокульованого тільки заквашувальною культурою (ліва фотографія). На відміну від цього, коли при виготовленні сиру використовувався Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (права фотографія), ріст Р. crustosum був інгібований. Приклад 11: Контрольне зараження йогурту, який містить Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і CHCC14676, Penicillium paneum Для візуальної оцінки інгібуючої дії штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, окремо або в комбінації з Lactobacillus paracasei CHCC14676, проти пліснявого гриба Р. paneum одержували йогурт з жирністю 1,5 %: Гомогенізоване молоко (з жирністю 1,5 %) піддавали термічній обробці при температурі 95 °C±1 °C протягом 5 хв у пляшках об'ємом 1 л на водяній бані і негайно охолоджували. Комерційну заквашувальну культуру (F-DVS YF-L901, одержану від Chr. Hansen А/S, Данія) TM інокулювали в кількості 0,02 %. Потім молоко інокулювали HOLDBAC YM-B (20 DCU/100 л) 7 або Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (110 КУО/мл) окремо або комбінацією Lactobacillus 12 UA 115330 C2 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6 rhamnosus CHCC5366 (510 КУО/мл) і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (510 КУО/мл). Одну пляшку, інокульовану тільки заквашувальною культурою, використовували як контроль. Молоко зброджували при температурі 43 °C±1 °C доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,1. Одержаний йогурт розливали по чашках (100 г) і зберігали при температурі 7 °C±1 °C. На наступний день після приготування йогурт у чашках інокулювали в двох повторностях різними пліснявими грибами як поверхневими контамінантами в одну точку на поверхні йогурту в кількості 100 спор на точку. Ріст пліснявих грибів оцінювали візуально після зберігання протягом 28 діб при температурі 7 °C±1 °C. Результати випробування йогурту наведені на фіг. 11, на якій видно, що Р. paneum добре росте на йогурті, виготовленому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою TM YF-L901 або заквашувальною культурою і культурою HOLDBAC YM-B. На відміну від цього, коли під час бродіння в молоці був присутній Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, ріст Р. paneum був сильно уповільнений, а комбінація Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 викликала ще сильніше інгібування росту Р. paneum. Приклад 12: Контрольне зараження йогурту, який містить Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і CHCC14676, при різних температурах зберігання Для візуальної оцінки інгібуючої дії штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, окремо або в комбінації з Lactobacillus paracasei CHCC14676, на пліснявий гриб Р. crustosum при різних температурах зберігання одержували йогурт з жирністю 1,5 %: Гомогенізоване молоко (з жирністю 1,5 %) піддавали термічній обробці при температурі 95 °C±1 °C протягом 5 хв у пляшках об'ємом 1 л на водяній бані і негайно охолоджували. Комерційну заквашувальну культуру (F-DVS YF-L901, одержану від Chr. Hansen А/S, Данія) TM інокулювали в кількості 0,02 %. Потім молоко інокулювали HOLDBAC YM-B (20 DCU/100 л) 7 або Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (110 КУО/мл) окремо або комбінацією Lactobacillus 6 6 rhamnosus CHCC5366 (510 КУО/мл) і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (510 КУО/мл). Одну пляшку, інокульовану тільки заквашувальною культурою, використовували як контроль. Молоко зброджували при температурі 43 °C±1 °C доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,1. Одержаний йогурт розливали по чашках (100 г) і зберігали при температурі 7 °C±1 °C. На наступний день після приготування йогурт в чашках інокулювали в двох повторностях Penicillium crustosum як поверхневий контамінант в одну точку на поверхні йогурту в кількості 100 спор на точку. Ріст пліснявих грибів оцінювали візуально після зберігання протягом 36 діб при температурі 7 °C±1 °C, 12 °C±1 °C або 22 °C±1 °C. Результати випробування йогурту наведені на фіг. 12, на якій видно, що Р. crustosum добре росте на йогурті, виготовленому з молока, ферментованого тільки заквашувальною культурою TM YF-L901 або заквашувальною культурою і культурою HOLDBAC YM-B при всіх температурах зберігання. На відміну від цього, коли під час бродіння в молоці був присутній Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 один або в комбінації з Lactobacillus paracasei CHCC14676, ріст Р. crustosum повністю запобігався при зберіганні як при 7 °C±1 °C, так і при 12 °C±1 °C протягом 36 діб. При зберіганні при 22 °C±1 °C ріст Р. crustosum був сильно уповільнений в присутності Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і ще сильніше уповільнений в присутності комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676. Депонування і експертне рішення Заявник просить, щоб зразки депонованих мікроорганізмів, перерахованих нижче, до дати винесення рішення про видачу патенту могли бути доступні тільки експерту. Штам Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 був депонований 14.10.2009 в Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig під реєстраційним номером DSM23035. Штам Lactobacillus paracasei CHCC12777 був депонований 15.03.2011 в Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig під реєстраційним номером DSM24651. Штам Lactobacillus paracasei CHCC14676 був депонований 02.02.2012 в Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig під реєстраційним номером DSM25612. Депонування було проведене відповідно до Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Посилання EP0221499 EP0576780 EP1442113 US5378458 13 UA 115330 C2 EP11161609.0 Kosikowski, F.V. and Mistry, V.V., "Cheese and Fermented Milk Foods", 1997, 3rd Ed. F.V. Kosikowski, L.L.C. Westport, CT 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Штам Lactobacillus rhamnosus, вибраний з групи, яка складається зі штаму Lactobacillus rhamnosus, який був депонований в Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під реєстраційним № DSM23035, призначений для одержання протигрибкової композиції. 2. Протигрибкова композиція, яка містить щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus за п. 1. 3. Протигрибкова композиція, яка містить щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus за п. 1 і щонайменше один штам Lactobacillus paracasei. 4. Протигрибкова композиція за п. 3, в якій щонайменше один штам Lactobacillus paracasei вибраний з групи, яка складається з Lactobacillus paracasei з реєстраційним № DSM24651, Lactobacillus paracasei з реєстраційним № DSM25612. 5. Харчовий продукт, який містить штам Lactobacillus rhamnosus за п. 1 або протигрибкову композицію за будь-яким з пп. 2-4. 6. Харчовий продукт за п. 5, який містить штам Lactobacillus rhamnosus за п. 1 в кількості, ефективній для надання протигрибкових властивостей цьому харчовому продукту. 7. Харчовий продукт за п. 5 або 6, де цей харчовий продукт вибраний з групи, яка складається з фруктів і продуктів переробки фруктів, овочів і продуктів переробки овочів, зерна і продуктів переробки зерна, молочних продуктів, м'яса, м'яса птиці і морепродуктів, а також їх сумішей. 8. Харчовий продукт за п. 7, де цей харчовий продукт являє собою молочний продукт, і цей молочний продукт являє собою мезофільний або термофільний кисломолочний продукт, такий як йогурт. 9. Кормовий продукт, який містить штам Lactobacillus rhamnosus за п. 1 або протигрибкову композицію за будь-яким з пп. 2-4. 10. Фармацевтичний продукт, який містить штам Lactobacillus rhamnosus за п. 1 або протигрибкову композицію за будь-яким з пп. 2-4. 11. Спосіб одержання харчового продукту, який включає додавання щонайменше одному штаму Lactobacillus rhamnosus за п. 1 або протигрибкової композиції за будь-яким з пп. 2-4 в харчовий продукт під час його виготовлення і регулювання технологічних параметрів під час процесу виготовлення таким чином, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus залишалася постійною або підвищувалася. 12. Спосіб за п. 11, де концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus 6 6 становить щонайменше 110 КУО/г або кожного щонайменше 110 КУО/мл харчового 5 2 продукту, або щонайменше 110 КУО/см поверхні харчового продукту. 13. Спосіб за п. 11, який включає (a) додавання протигрибкової композиції за будь-яким з пп. 2-4 під час виготовлення харчового продукту так, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і/або 6 щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei становила кожного щонайменше 110 КУО/г 6 5 2 або щонайменше 110 КУО/мл харчового продукту, або щонайменше 110 КУО/см поверхні харчового продукту, і (b) регулювання технологічних параметрів під час процесу виготовлення таким чином, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і/або щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei підвищувалася або залишалася постійною. 14. Спосіб за будь-яким з пп. 11-13, де даний спосіб включає одну або декілька стадій бродіння. 15. Спосіб за п. 14, який включає зброджування молочного субстрату заквашувальною культурою, що містить щонайменше один штам родів, вибраних з Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus і Leuconostoc. 16. Спосіб одержання кормового продукту, що включає додавання щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus за п. 1 або протигрибкової композиції за будь-яким з пп. 2-4 в кормовий продукт під час його виготовлення і регулювання технологічних параметрів під час процесу виготовлення таким чином, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus залишалася постійною або підвищувалася. 17. Спосіб за п. 16, де концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus 6 6 становить щонайменше 110 КУО/г або кожного щонайменше 110 КУО/мл кормового 5 2 продукту, або щонайменше 110 КУО/см поверхні кормового продукту. 14 UA 115330 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 18. Спосіб за п. 16, який включає (а) додавання протигрибкової композиції за будь-яким з пп. 2-4 під час виготовлення кормового продукту так, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і/або 6 щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei становила кожного щонайменше 110 КУО/г 6 5 2 або щонайменше 110 КУО/мл кормового продукту, або щонайменше 110 КУО/см поверхні кормового продукту, і (b) регулювання технологічних параметрів під час процесу виготовлення таким чином, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і/або щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei підвищувалася або залишалася постійною. 19. Спосіб за будь-яким з пп. 16-18, де даний спосіб включає одну або кілька стадій бродіння. 20. Спосіб за п. 19, який включає зброджування молочного субстрату заквашувальною культурою, що містить щонайменше один штам родів, вибраних з Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus і Leuconostoc. 21. Спосіб отримання фармацевтичного продукту, що включає додавання щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus за п. 1 або протигрибкової композиції за будь-яким з пп. 2-4 в фармацевтичний продукт під час його виготовлення, і регулювання технологічних параметрів під час процесу виготовлення таким чином, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus залишалася постійною або підвищувалася. 22. Спосіб за п. 21, де концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus 6 6 становить щонайменше 110 КУО/г або кожного щонайменше 110 КУО/мл фармацевтичного 5 2 продукту, або щонайменше 110 КУО/см поверхні фармацевтичного продукту. 23. Спосіб за п. 22, який включає (а) додавання протигрибкової композиції за будь-яким з пп. 2-4 під час виготовлення фармацевтичного продукту так, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і/або щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei становила кожного 6 6 щонайменше 110 КУО/г або щонайменше 110 КУО/мл фармацевтичного продукту, або 5 2 щонайменше 110 КУО/см поверхні фармацевтичного продукту, і (b) регулювання технологічних параметрів під час процесу виготовлення таким чином, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і/або щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei підвищувалася або залишалася постійною. 24. Спосіб за будь-яким з пп. 21-23, де даний спосіб включає одну або кілька стадій бродіння. 25. Спосіб за п. 24, який включає зброджування молочного субстрату заквашувальною культурою, що містить щонайменше один штам родів, вибраних з Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus і Leuconostoc. 26. Харчовий продукт, який одержується способом за будь-яким з пп. 11-15. 27. Застосування штаму Lactobacillus rhamnosus за п. 1 або протигрибкової композиції за будьяким з пп. 2-4 для приготування харчового продукту. 28. Застосування штаму Lactobacillus rhamnosus за п. 1 або протигрибкової композиції за будьяким з пп. 2-4 для приготування кормового продукту. 29. Застосування штаму Lactobacillus rhamnosus за п. 1 або протигрибкової композиції за будьяким з пп. 2-4 для приготування фармацевтичного продукту. 30. Застосування штаму Lactobacillus rhamnosus за п. 1 або протигрибкової композиції за будьяким з пп. 2-4 для інгібування росту дріжджів і пліснявих грибів. 15 UA 115330 C2 16 UA 115330 C2 17 UA 115330 C2 18 UA 115330 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 19