Штам lactobacillus rhamnosus 37 для виготовлення пробіотиків

Реферат: Штам Lactobacillus rhamnosus 37 для виготовлення пробіотиків первісно депонований та зберігається у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. Заболотного НАН України, за реєстраційним № IMB В 7486: родина Lactobacillaceae, рід Lactobacillus, вид Lactobacillus rhamnosus. UA 104982 U (12) UA 104982 U UA 104982 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини та біотехнології, зокрема до виготовлення препаратів на основі живих мікроорганізмів, призначених для використання у складі пробіотиків, що виявляють лікувальну та профілактичну дію при шлунково-кишкових захворюваннях, нормалізують мікробіоценоз кишечнику. Аналогом корисної моделі є (Патент № 54994, опубл. 25.11.2010 p., бюл. № 22, Lactobacillus rhamnosus 26) для виготовлення пробіотичного препарату, ізолят виділений від кота. Недоліком аналога є те, що його антагоністична активність проти більшості збудників кишкових захворювань у новонароджених тварин не досліджена, генотипування не проведене. В основу корисної моделі поставлено задачу отримати штам Lactobacillus rhamnosus, який виявляв би виразний антагонізм до збудників масових шлунково-кишкових захворювань у тварин, зумовлених, зокрема, Yersinia enterocolitica. Штам Lactobacillus rhamnosus 37 для виготовлення пробіотиків первісно депонований та зберігається у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. Заболотного НАН України, за реєстраційним № IMB В 7486: родина Lactobacillaceae, рід Lactobacillus, вид Lactobacillus rhamnosus. Штам Lactobacillus rhamnosus 37 для виготовлення пробіотиків депонований 10.12.2014 р. за реєстраційним № IMB В 7486, характеризується такими властивостями: 1. Культуральні властивості. Хемоорганотроф. Росте в аеробних, анаеробних та мікроаерофільних умовах. Оптимальна для росту температура 37-38 °C. 2. Ферментативні властивості. Штам Lactobacillus rhamnosus 37 розкладає з утворенням кислоти без газу лактозу, рамнозу, мелібіозу, фруктозу, трегалозу, глюкозу, галактозу, меліцитозу. Не змінює целобіозу, інозит, сахарозу рафінозу, рибозу. Згортає знежирене молоко протягом 16-24 годин. При цьому утворюється в'ялий згусток. Штам Lactobacillus rhamnosus 37 остаточно ідентифікований за допомогою молекулярногенетичного дослідження, зокрема секвенуванням отриманих до 16 S р. ДНК ампліфікантів. 3. Біологічні властивості. Штам Lactobacillus rhamnosus 37 непатогенний для тварин. Не викликає проявів захворювання у білих мишей, морських свинок, вагітних щурів, кролів при інтраперитонеальному введенні їм 1 млрд. мікробних тіл, не обумовлює негативних наслідків при згодовуванні 10-15 млрд.м.кл. новонародженим телятам, не викликає морфологічних змін у моношарі клітинних культур (НЕК, МДБК, СНЕВ). 4. Антагоністичні властивості. Штам Lactobacillus rhamnosus 37 виявляє виразний антагонізм по відношенню до Yersinia enterocolitica, E.coli, P.vulgaris, L.monocitogenes, St.aureus, P.aeruginosa. Визначення антагоністичної активності Lactobacillus rhamnosus 37 щодо Yersinia enterocolitica 3 У чашки Петрі заливали по 15 см МПА, підсушували його у термостаті при 37 °C. У якості тест-культур використовували лабораторні та польові штами Yersinia enterocolitica (серотип 0:3), Yersinia enterocolitica (серотип 0:9), Yersinia enterocolitica (серотип 0:8), Yersinia enterocolitica (серотип 0:6.30). Добові культури тест-мікроорганізмів змивали з поверхні МПА фізіологічним 3 розчином і доводили густину бактеріальної суспензії до 10 млрд.м.кл./см . Суспензії тесткультур вносили по 0,1 мл в чашки Петрі з МПА і розтирали шпателем по поверхні агару. Через 20-30 хв після посіву в агарі вирізали стерильною металевою трубкою лунки діаметром 6 мм на відстані 2 см від краю чашки (по 4 лунки в кожній чашці). В лунки вносили по 0,1 мл 24-годинної мікробної культури. Інкубували в термостаті 24 год. за температури 37 °C. Результат враховували через 24 години. Визначали діаметр зони затримки росту тест-мікроорганізму навколо лунки. При відсутності ознак затримки росту, мікроорганізми вважали стійкими відносно досліджуваного штаму; в разі затримки росту до 15 мм - малочутливими; при затримці росту від 15 до 25 мм чутливими. Досліджені штами Yersinia enterocolitica виявились чутливими до Lactobacillus rhamnosus 37. Діаметр затримки росту штамів Yersinia enterocolitica становив: Yersinia enterocolitica (серотип 0:3) - 24±0,6 Yersinia enterocolitica (серотип 0:9) - 14±0,36 Yersinia enterocolitica (серотип 0:6,3) - 12±0,85 5. Адгезивна активність. Штам Lactobacillus rhamnosus 37 має високу адгезивну активність відносно еритроцитів крові ВРХ, свині, морської свинки, кроля. Середній показник адгезії (СПА) складає 4,5. Визначення адгезивної активності штаму Lactobacillus rhamnosus 37 до еритроцитів крові морської свинки. 1 UA 104982 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Кров відбирали із порожнини серця морської свинки. Еритроцити двічі відмивали буферним розчином фосфату натрію (рН 7,2-7,3) шляхом центрифугування зі швидкістю 1000 об/хв. На 3 вказаному буфері готували суспензію еритроцитів концентрацією 100 млн/см . На предметне скло наносили краплю буферного розчину, в якому суспендували по одній краплі суміші 3 еритроцитів та мікроорганізмів 1 млрд.м.кл./см . Предметне скло з дослідним матеріалом поміщали у вологу камеру на 30 хв за температури 37 °C, потім препарат висушували при 37 °C, фіксували сумішшю спирт-ефіру та фарбували за методом Романовського-Гімзи. Препарати вивчали під світловим мікроскопом. Результати оцінювали, визначаючи середній показник адгезії (СПА) - кількість мікроорганізмів, що прикріпилися до 1 еритроциту. Аналізували не менше 25 еритроцитів, враховуючи не більше 5 еритроцитів в 1 полі зору. Середній показник адгезії штаму Lactobacillus rhamnosus 37 до еритроцитів крові морської свинки склав 4,38. 6. Чутливість до антибіотиків. Штам Lactobacillus rhamnosus 37 чутливі до цефтриаксону, гентаміцину, тетрацикліну, еритроміцину, амоксицикліну, лінкоміцину, ципрофлоксацину, офлоксацину, стрептоміцину, стійкий до цефазоліну, поліміксину, помірно резистентний до канаміцину, неоміцину. Стійкий до дії жовчі. 7. Стабільність генетичних властивостей. Властивості Lactobacillus rhamnosus 37 (культуральні, антагоністичні, адгезивні, чутливість до лікарських засобів) зберігаються у знежиреному молоці за температури +4 - +5 °C протягом шести місяців. При періодичному посіві культури на знежиреному молоці протягом шести місяців ознак дисоціації не виявляється. Об'єкт даного дослідження Lactobacillus rhamnosus 37 був ізольований з фекалій (ректальна проба) теляти 23-добового віку, що належало благополучному щодо шлунково-кишкових захворювань господарству. Штам Lactobacillus rhamnosus 37 виділений шляхом посіву серійних розведень досліджуваного матеріалу на середовище МРС. -3 -7 Матеріал (ректальна проба), розбавлений стерильним 0,85-ним розчином NaCl (10 -10 ) у 3 дозі 0,1-0,2см , наносили на поверхню агаризованого МРС - середовища та рівномірно розподіляли за допомогою стерильного шпателя. Інкубували посіви за аеробних умов при температурі 37 °C протягом 48 год. Штам Lactobacillus rhamnosus 37 виділений із розведення -5 10 . На щільному МРС середовищі формуються колонії розміром 0,9-1,0 мм білуватого кольору з шорсткою поверхнею. У рідкому середовищі МРС, середовищі Хотінгера утворює дрібнозернистий осад. Капсул та спор не утворює. Нерухливий. При мікроскопії пофарбованих препаратів виявляються грампозитивні поліморфні палички, розміром 4-6 мкм х 0,5-0,7 мкм, розташовані переважно короткими ланцюжками. Штаму Lactobacillus rhamnosus 37 зберігається у знежиреному молоці за температури +4 +6 °C та пересівів з інтервалом у 30-35 діб, тривале зберігання (протягом року) - у ліофілізованому стані. В процесі ліофілізації використовується захисне середовище такого складу: цукроза - 35,0, желатин - 4,0, вода - 61,0, рН 6,8. Штам Lactobacillus rhamnosus 37 може використовуватися для виготовлення пробіотиків, які застосовуються для терапії та профілактики шлунково-кишкових захворювань у тварин. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 Штам Lactobacillus rhamnosus 37 для виготовлення пробіотиків первісно депонований та зберігається у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. Заболотного НАН України, за реєстраційним № IMB В 7486: родина Lactobacillaceae, рід Lactobacillus, вид Lactobacillus rhamnosus. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2