Біозахист з використанням штамів lactobacillus paracasei

Реферат: Винахід стосується штаму Lactobacillus paracasei, для одержання протигрибкової композиції вибраний з групи, що складається з штаму Lactobacillus paracasei DSM25612. Крім того, даний винахід стосується протигрибкової композиції, яка містить штам Lactobacillus paracasei DSM25612 та щонайменше один штам з Lactobacillus rhamnosus DSM24616, DSM24652, DSM23035, харчових, кормових або фармацевтичних продуктів, які містять таку протигрибкову композицію, способу виготовлення таких харчових, кормових і фармацевтичних продуктів, способу зниження вмісту дріжджів і плісняви в таких харчових, кормових і фармацевтичних продуктах і застосувань протигрибкової композиції. UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Даний винахід стосується галузі біозахисту, зокрема, штаму Lactobacillus paracasei CHCC14676 з № доступу DSM25612. Більше того: даний винахід стосується протигрибкової композиції, яка містить штам, протигрибкової композиції, яка містить штам і щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus, харчових, кормових і фармацевтичних продуктів, які містять таку протигрибкову композицію, способу виготовлення таких харчових, кормових і фармацевтичних продуктів, способу зниження вмісту дріжджів і плісняви в таких харчових, кормових і фармацевтичних продуктах і застосувань протигрибкової композиції. Передумови винаходу Протягом багатьох років молочнокислі бактерії використовували для збільшення терміну зберігання харчових продуктів. У ході ферментації молочнокислі бактерії утворюють молочні кислоти й інші органічні кислоти, таким чином знижуючи pH харчового продукту, роблячи несприятливим ріст небажаних мікроорганізмів, таких як патогенні бактерії, дріжджі і гриби. Крім того, деякі молочнокислі бактерії утворюють також метаболіти з протимікробною активністю. Патентна заявка США № US2011/0045134 стосується використання Lactobacillus paracasei для надання протигрибкових властивостей ферментованим молочним продуктам. Європейська Патентна заявка № EP1442113 стосується сумішей Propionibacterium jensenii і Lactobacillus sp., таких як Lactobacillus paracasei, з протимікробною активністю для використання для біозахисту. Однак, все ще існує необхідність в біозахистних засобах для поліпшеного протигрибкового ефекту в формі окремих штамів або в комбінації з іншими біозахистними штамами. Короткий виклад суті винаходу Метою даного винаходу є надання нових штамів молочнокислих бактерій з високою ефективністю як біозахистних засобів. Автори даного винаходу за допомогою широкого скринінгу і дослідження виявили, що конкретні штами Lactobacillus paracasei мають значуще вищий ефект проти дріжджів і плісняви порівняно з комерційними біозахистними культурами на ринку. Автори даного винаходу, крім того, виявили, що конкретна група молочнокислих бактерій при комбінації з іншою групою молочнокислих бактерій має значний синергічний протимікробний ефект. Протимікробний ефект двох комбінованих груп бактерій, несподівано, перевищує суму окремих ефектів двох груп бактерій. Короткий опис креслень На Фіг. 1 зображений ріст плісняви в йогурті з 1,5 % жиру, ферментованому за допомогою заквашувальної культури YF-L901 окремо (верхній ряд), разом з HOLDBAC™ YM-B (середній ряд) і разом з Lactobacillus paracasei CHCC14676. Цільові забруднювачі додавали в концентраціях, згаданих в тексті зліва направо: Penicillium brevicompactum (M1), Penicillium commune (M6), Aspergillus versicolor (M7) і Penicillium glabrum (M8), відповідно. Йогурти інкубували при 7±1 °C протягом 61 доби. На Фіг. 2 зображені підрахунки клітин ізоляту Debaryomyces hansenii, доданого до йогурту з 1,5 % жиру, ферментованого за допомогою заквашувальної культури YF-L901 окремо (контроль) або разом з культурою HOLDBAC™ YM-B (FloldBac YM-B), разом з культурою FIOLDBAC™ YM-C (HoldBac YM-C) або зі штамом Lactobacillus paracasei CHCC14676 (14676). Йогурти зберігали при 7±1 °C і аналізували у придатні інтервали. На Фіг. 3 показаний ріст плісняви на чашках, одержаних з молока, ферментованого за допомогою заквашувальної культури окремо (контроль, перша фігура), разом з Lb. Paracasei CHCC14676 (друга фігура), разом з Lb. rhamnosus CHCC5366 (третя фігура) або разом з комбінацією Lb. Paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC5366 (четверта фігура). Цільові забруднювачі додавали в концентраціях, згаданих в тексті, зверху зліва, рухаючись за годинниковою стрілкою вниз ліворуч на чашці: Penicillium naigiovense, Penicillium commune, Aspergillus versicolor і Penicillium crustosum, відповідно. Потім чашки інкубували при 7±1 °C протягом 12 діб. На Фіг. 4 показаний ріст плісняви на чашках, одержаних з молока, ферментованого за допомогою заквашувальної культури окремо (контроль, перша фігура), разом з Lb. Paracasei CHCC14676 (друга фігура), разом з Lb. rhamnosus CHCC14226 (третя фігура) або разом з комбінацією Lb. Paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC14226 (четверта фігура). Цільові забруднювачі додавали в концентраціях, згаданих в тексті, зверху зліва, рухаючись за годинниковою стрілкою вниз ліворуч на чашці: Penicillium naigiovense, Penicillium commune, Aspergillus versicolor і Penicillium crustosum, відповідно. Потім чашки інкубували при 7±1 °C протягом 12 діб. 1 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фіг. 5 показаний ріст Mucor ssp. на грецькому йогурті, одержаному з молока, ферментованого за допомогою тільки заквашувальної культури (ліва склянка) або з молока, ферментованого в присутності Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (права склянка). На Фіг. 6 показаний ріст плісняви Rhizopus stolonifer на грецькому йогурті, одержаному з молока, ферментованого за допомогою тільки заквашувальної культури (R, тобто контроль), за допомогою заквашувальної культури і HOLDBAC™ YM-B (YM-B), за допомогою заквашувальної культури і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366), або за допомогою заквашувальної культури і комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5366+14676). На Фіг. 7 показаний ріст Penicillium brevicompactum (M1), Penicillium commune (M6), Aspergillus versicolor (M7) і Penicillium glabrum (M8) на сметані, одержаній з молока, ферментованого за допомогою тільки заквашувальної культури (верхній ряд); за допомогою заквашувальної культури і HOLDBAC™ YM-B (середній ряд); або за допомогою заквашувальної культури і комбінації Lactobacillus paracasei CHCC14676 і Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 (нижній ряд). На Фіг. 8 показаний ріст D. hansenii на сметані, одержаній з молока, ферментованого за допомогою тільки заквашувальної культури (контроль); за допомогою заквашувальної культури і HOLDBAC™ YM-B (YM-B); або за допомогою заквашувальної культури, Lactobacillus paracasei CHCC14676 і Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 (12697+14676). На Фіг. 9 показаний ріст Saccharomyces cerevisiae на білому розсільному сирі, одержаному з молока, ферментованого за допомогою тільки заквашувальної культури (контроль); за допомогою заквашувальної культури і HOLDBAC™ YM-B (YM-B); або за допомогою заквашувальної культури, Lactobacillus paracasei CHCC14676 і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676). На Фіг. 10 показаний ріст Kluyveromyces marxianus на білому розсільному сирі, одержаному з молока, ферментованого за допомогою тільки заквашувальної культури (контроль); за допомогою заквашувальної культури і HOLDBAC™ YM-B (YM-B); або за допомогою заквашувальної культури, Lactobacillus paracasei CHCC14676 і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676). На Фіг. 11 показаний ріст Penicillium commune на білому розсільному сирі, одержаному з молока, ферментованого за допомогою тільки заквашувальної культури (R, тобто контроль); із заквашувальною культурою і HOLDBAC™ YM-B (YM-B); або за допомогою заквашувальної культури, Lactobacillus paracasei CHCC14676 і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676). На Фіг. 12 зображений ріст плісняви Penicillium paneum в йогурті з 1,5 % жиру, одержаному з молока, ферментованого за допомогою заквашувальної культури окремо (R, тобто контроль), за допомогою заквашувальної культури і HOLDBAC™ YM-B (YM-B), за допомогою заквашувальної культури і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366), або за допомогою заквашувальної культури і комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5366+14676). На Фіг. 13 показаний ріст плісняви Penicillium crustosum в йогурті з 1,5 % жиру, одержаному з молока, ферментованого за допомогою заквашувальної культури окремо (верхній ряд), за допомогою заквашувальної культури і HOLDBAC™ YM-B (другий ряд), за допомогою заквашувальної культури і Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (третій ряд) або за допомогою заквашувальної культури і комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (нижній ряд). Намічений забруднювач додавали в концентраціях 100 спор/склянка, і йогурти інкубували при 7±1 °C (лівий стовпчик), 12±1 °C (центральний стовпчик) або 22±1 °C (правий стовпчик) протягом 36 діб. Докладний опис винаходу Визначення: Як застосовують в цьому документі, термін "молочнокисла бактерія" означає грампозитивну, мікроаерофільну або анаеробну бактерію, яка ферментує цукри з утворенням кислот, включаючи молочну кислоту як переважну кислоту, яка утворюється. Найбільш придатні з промислової точки зору молочнокислі бактерії виявлені всередині порядку "Lactobacillales", який включає в себе види Lactococcus, види Streptococcus, види Lactobacillus, види Leuconostoc, види Pseudoleuconostoc, види Pediococcus, види Brevibacterium і види Enterococcus. Їх часто використовують як харчові культури окремо або в комбінації з іншими молочнокислими бактеріями. Термін "харчовий продукт" призначений, щоб включати в себе також сир. Термін "сир" розуміють як такий, що включає в себе будь-який сир, включаючи тверді, напівтверді і м'які 2 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 сири, такі як сири наступних типів: домашній, бринза, чедер, пармезан, моцарела, ементаль, данбо, гауда, едам, сири типу бринзи, блакитні сири, розсільні сири, камамбер і брі. Фахівцеві в даній галузі відомо, як перетворювати згусток в сир, способи можна виявити в літературі, див., наприклад, Kosikowski, F. V., і V. V. Mistry, "Cheese and Fermented Milk Foods", 1997, 3rd Ed. F. V. Kosikowski, L. L. C. Westport, CT. Як застосовують в цьому документі, сир, що має концентрацію NaCl нижче 1,7 % (мас./мас.), позначають як "сир з низьким вмістом солі". Молочнокислі бактерії, включаючи бактерії видів Lactobacillus і Lactococcus, в нормі постачаються для молочної промисловості або в формі заморожених, або в формі ліофілізованих культур для розмноження виробничої закваски, або в формі так званих "готових до застосування у виробництві наборів" (DVS) культур, призначених для прямої інокуляції в посудину для ферментації або чан для одержання молочного продукту, такого як кисломолочний продукт або сир. Такі культури молочнокислих бактерій, як правило, позначають як "заквашувальні культури" або "закваски". Термін "мезофіл" в цьому документі стосується мікроорганізмів, які найкраще розвиваються при середніх температурах (15 °C-40 °C). Найбільш придатні з промислової точки зору мезофільні бактерії включають в себе види Lactococcus і види Leuconostoc. Термін "мезофільна ферментація" в цьому документі стосується ферментації при температурі між приблизно 22 °C і приблизно 35 °C. Термін "мезофільний кисломолочний продукт" стосується кисломолочних продуктів, одержаних за допомогою мезофільної ферментації мезофільної заквашувальної культури, і включає в себе такі кисломолочні продукти як пахта, кисле молоко, сквашене молоко, сметану, сквашені вершки і свіжий сир, такий як кварк, сир і вершковий сир. Термін "термофільний" в цьому документі стосується мікроорганізмів, які найкраще розвиваються при температурах вище 43 °C. Найбільш придатні з промислової точки зору термофільні бактерії включають в себе види Streptococcus і види Lactobacillus. Термін "термофільна ферментація" в цьому документі стосується ферментації при температурах вище приблизно 35 °C, наприклад, між приблизно 35 °C і приблизно 45 °C. Термін "термофільний кисломолочний продукт" стосується кисломолочних продуктів, одержаних за допомогою термофільної ферментації термофільної заквашувальної культури, і включають в себе такі кисломолочні продукти, як йогурт термостатного способу виробництва, перемішаний йогурт і питний йогурт. Термін "молоко" потрібно розуміти як секрет молочних залоз, одержаний доїнням будь-якого ссавця, такого як корови, вівці, кози, буйволи або верблюди. У переважному варіанті здійснення молоко являє собою коров'яче молоко. Термін молоко включає в себе також розчини білка/жиру, одержані з рослинних матеріалів, наприклад, соєве молоко. Термін "молочний субстрат" являє собою будь-який сирий і/або перероблений молочний матеріал, який можна піддавати ферментації згідно зі способом за винаходом. Таким чином, придатні молочні субстрати включають в себе, але без обмеження, розчини/суспензії будь-яких молочних або подібних молочним продуктів, що містять білок, таких як цільне молоко або молоко з низьким вмістом жиру, знежирене молоко, пахта, розведений порошок молока, згущене молоко, сухе молоко, сироватка, сироватковий пермеат, лактоза, маточна рідина від кристалізації лактози, концентрат сироваткового білка або вершки. Очевидно, що молочний субстрат може походити від будь-якого ссавця, наприклад, будучи по суті чистим молоком ссавця або розведеним порошком молока. Перед ферментацією молочний субстрат можна гомогенізувати і пастеризувати згідно зі способами, відомими в даній галузі. "Гомогенізація", як застосовують в цьому документі, означає інтенсивне перемішування для одержання розчинної суспензії або емульсії. Якщо гомогенізацію проводять до ферментації, її можна провести так, щоб розщеплювати молоко на частинки меншого розміру, так що їх неможливо більше відділяти від молока. Це можна здійснювати за допомогою пропущення молока під високим тиском через малі отвори. "Пастеризація", як застосовують в цьому документі, означає обробку молочного субстрату для зменшення або виключення присутності живих організмів, таких як мікроорганізми. Переважно, пастеризації досягають за допомогою підтримування вказаної температури протягом вказаного періоду часу. Вказаної температури звичайно досягають за допомогою нагрівання. Температуру і тривалість можна вибирати, щоб знищувати або інактивувати конкретні бактерії, такі як небезпечні бактерії. Потім може йти стадія швидкого охолоджування. "Ферментація" в способах за даним винаходом означає перетворення вуглеводів у спирти або кислоти за допомогою дії мікроорганізму. Переважно, ферментація в способах за винаходом включає в себе перетворення лактози в молочну кислоту. 3 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Способи ферментації для використання в одержанні молочних продуктів добре відомі, і фахівцеві в даній галузі відомо, як вибирати придатні умови способу, такі як температура, кисень, кількість і характеристики мікроорганізму(мікроорганізмів) і час процесу. Очевидно, що умови ферментації вибирають таким чином, щоб підтримувати досягнення за даним винаходом, тобто одержувати молочний продукт в твердій (такій як сир) або рідкій формі (такій як кисломолочний продукт). Композиції за винаходом забезпечують ту перевагу, що небажані мікроорганізми, вибрані з грибів, бактерій і їх сумішей, наприклад, в харчових, кормових і фармацевтичних продуктах, і у людини і тварин, можна пригнічувати. Запобігання і/або пригнічення росту грибів, таких як дріжджі і пліснява, є, зокрема, передбаченим. Таким чином, в переважному варіанті здійснення термін "протимікробний" потрібно розуміти як "протигрибковий". Термін "небажані мікроорганізми" в цьому документі стосується мікроорганізмів, таких як бактерії і гриби, такі як дріжджі, які є патогенними і/або здатними погіршувати харчові, кормові або фармацевтичні продукти. Композиції за винаходом забезпечують ту перевагу, що небажані мікроорганізми, вибрані з грибів, бактерій і їх сумішей, наприклад, в харчових, кормових і фармацевтичних продуктах і у людини і тварин, можна пригнічувати. Запобігання і/або пригнічення росту грибів, таких як дріжджі і пліснява, є, зокрема, передбаченим. Терміни "пригнічувати" і "підлягати пригніченню" відносно дріжджів і плісняви означає, наприклад, що ріст або кількість, або концентрація дріжджів і плісняви, наприклад, в харчових продуктах і/або на поверхні харчових продуктів, що містять штами відповідно до даного винаходу, нижча, ніж в харчових продуктах і/або на поверхні харчових продуктів, що не містять таких штамів. У даному контексті, термін "мутант" потрібно розуміти як штам, одержаний зі штаму за винаходом за допомогою, наприклад, генної інженерії, радіоактивного опромінення і/або хімічної обробки. Є переважним, щоб мутант являв собою функціонально еквівалентний мутант, наприклад, мутант, що має по суті такі ж або поліпшені властивості (наприклад, відносно протигрибкових властивостей), як батьківський штам. Такий мутант є частиною даного винаходу. Особливо, термін "мутант" стосується штаму, одержаного піддаванням штаму за винаходом будь-якій загальноприйнятій обробці для мутагенезу, включаючи обробку хімічним мутагеном, таким як етанметансульфонат (EMS) або N-метил-N'-нітро-N-нітрогуанідин (NTG), УФ-світлом, або мутанта, який виник спонтанно. Мутант можна піддавати декільком обробкам для мутагенезу (як одну обробку потрібно розуміти одну стадію мутагенезу з подальшою стадією скринінгу/селекції), однак в цей час є переважним проведення не більше 20, або не більше 10, або не більше 5 обробок (або стадій скринінгу/селекції). У переважному в цей час мутантові менше 5 %, або менше 1 % або навіть менше 0,1 % нуклеотидів в бактеріальному геномі замінено іншим нуклеотидом, або делетовано, порівняно з батьківським штамом. Використання термінів "а" і "an" і "the" і схожих позначень в контексті винаходу (особливо в контексті поданої нижче формули винаходу), що описується, потрібно розуміти як таке, що охоплює як однину, так і множину, якщо в цьому документі не вказано інше або явно не суперечить контексту. Терміни "що включає", "що має", "що включає в себе" і "що містить" потрібно розуміти як необмежувальні терміни (тобто, які позначають "який включає, але без обмеження"), якщо не указано інше. Перелік діапазонів значень в цьому документі призначений тільки, щоб служити способом скорочення індивідуального переліку кожного окремого значення, що потрапляє в межі діапазону, якщо в цьому документі не указано інше, і кожне окреме значення включене в опис, як якби воно було індивідуально наведене в цьому документі. Всі способи, описані в цьому документі, можна здійснювати в будь-якому придатному порядку, якщо в цьому документі не указано інше або іншим чином явно не суперечить контексту. Використання всіх без винятку прикладів або ілюстративних формулювань (наприклад, "такий як"), представлених в цьому документі, призначене тільки для кращого висвітлення винаходу і не встановлює обмеження об'єму винаходу, якщо в формулі винаходу не указано інше. Ніякі формулювання в описі не треба розглядати як такі, що позначають який-небудь не заявлений в формулі винаходу елемент як необхідний для практичного здійснення винаходу. Здійснення і аспекти винаходу Автори даного винаходу провели скринінг серед 200 кандидатів з Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei і Lactobacillus rhamnosus для виявлення найбільш ефективних комбінацій одного або двох штамів проти широкого ряду мікроорганізмів, таких як дріжджі і пліснява. Скринінги проводили в модельному дослідженні, яке наскільки можливо імітує мезофільні кисломолочні продукти, в середовищах на основі молока, до яких додавали відповідну заквашувальну культуру з біозахистними кандидатами або без, і які ферментували в умовах, відповідних мезофільним кисломолочним продуктам. Намічені організми виділяли з 4 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мезофільних кисломолочних продуктів. Очищені молочнокислі бактерії з культур HOLDBAC™ від Danisco А/S, Denmark, так само як повні культури HOLDBAC™ YM-B і HOLDBAC™ YM-C, що містять як молочнокислі бактерії, так і пропіоновокислі бактерії, використовували як відправну точку дослідження. Модельне дослідження описане в Європейській Патентній заявці № EP11161609.0. Виявлено, що сімнадцять кандидатів серед Lactobacillus paracasei і Lactobacillus rhamnosus загалом пригнічують 12 індикаторних грибів так само добре або краще, ніж молочнокислі бактерії, які є вихідною точкою дослідження, при тестуванні при 25 °C. При тестуванні на йогурті показано, що один штам Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei штам CHCC14676, депонований в Німецьку колекцію мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під № доступу DSM 25612, був значно кращим для пригнічення дріжджів і плісняви, ніж комерційно доступні біозахисні культури. Пригнічувальний ефект штаму проти дріжджів і плісняви можна визначати за допомогою зберігання кисломолочних продуктів при придатній температурі протягом придатного часу зберігання, як описано в прикладах нижче. Як правило, придатна температура, при якій потрібно здійснювати цей спосіб, залежить від температури, при якій конкретний харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт звичайно зберігають і/або виготовляють. Температура, при якій продукти звичайно зберігають, становить між 5 °C і 26 °C, переважно, температура становить приблизно 8 °C. Час зберігання при температурі залежить від часу, протягом якого харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт звичайно зберігають (термін зберігання). Час зберігання звичайно становить 5-65, переважно, 7-60 діб, більш переважно, 7-28 діб, і навіть більш переважно час зберігання становить приблизно 21 добу, і більш переважно, аж до 60 діб або більше. Відповідно, перший аспект даного винаходу стосується штаму Lactobacillus paracasei, вибраного з групи, що складається зі штаму Lactobacillus paracasei CHCC14676, депонованого в Німецьку колекцію мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під № доступу DSM 25612, і одержаних з нього мутантних штамів. Таким чином, крім депонованого штаму, згаданого вище, винахід стосується також мутантів, які походять з цього штаму, тобто вони одержані з використанням депонованого штаму CHCC14676 як вихідного матеріалу. Мутантний штам можна одержувати з депонованого штаму, наприклад, за допомогою генної інженерії, опромінення, УФ-світла, хімічної обробки і/або способів, які індукують зміни геному. Мутант за винаходом може пригнічувати і/або запобігати росту конкретних бактерій або грибів, переважно плісняви. Є переважним, щоб мутант надавав по суті щонайменше 80 % або більше, щонайменше 90 % або більше, щонайменше 95 % або більше, або навіть аж до 100 % або більше протигрибкового ефекту порівняно з його батьківським штамом при визначенні, наприклад, в аналізі, як описано в прикладі 1, з використанням одного з видів плісняви Р. brevicompactum, Р. commune, А. versicolor, D. hansenii або Р. glabum як еталонного організму, ріст якого необхідно пригнічувати. Фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що з використанням депонованого штаму як вихідного матеріалу, читач - фахівець в даній галузі - може за допомогою загальноприйнятих способів мутагенезу або повторного виділення загальноприйнятим способом одержувати додаткові його мутанти або похідні, які зберігають описані в цьому документі ознаки і переваги. Відповідно, термін "одержані з нього мутантні штами" з першого аспекту стосується мутантних штамів, одержаних з використанням депонованого штаму як вихідного матеріалу. Другий аспект стосується протигрибкової композиції, яка містить щонайменше один штам Lactobacillus paracasei за першим аспектом винаходу, переважно Lactobacillus paracasei штам CHCC14676. При тестуванні Lactobacillus paracasei штаму CHCC14676 в комбінації з різними штамами Lactobacillus rhamnosus несподівано виявлено, що ці комбінації були навіть кращими, ніж будьякий зі штамів окремо, навіть коли загальні концентрації клітин були ідентичними. В одному варіанті здійснення винахід стосується комбінації Lactobacillus paracasei штаму CHCC14676 і Lactobacillus rhamnosus штаму CHCC5366. В іншому варіанті здійснення винахід стосується комбінації Lactobacillus paracasei штаму CHCC14676 і Lactobacillus rhamnosus штаму CHCC14226. В іншому варіанті здійснення винахід стосується комбінації Lactobacillus paracasei штаму CHCC14676 і Lactobacillus rhamnosus штаму CHCC12697. Ці комбінації, мабуть, є ефективнішими, ніж культури HOLDBAC™ YM-B і HOLDBAC™ YM-C від Danisco, Denmark, які є вихідною точкою дослідження. Відповідно, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується протимікробних і, більш переважно, протигрибкових композицій, які містять Lactobacillus paracasei штам CHCC14676, депонований в German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) під № 5 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 доступу DSM25612 або одержаний з нього мутант і щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus. Переважно, щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus вибраний з групи, яка складається з Lactobacillus rhamnosus штаму CHCC12697 з № доступу DSM24616, Lactobacillus rhamnosus штаму CHCC14226 з № доступу DSM24652, Lactobacillus rhamnosus штаму CHCC5366 з № доступу DSM23035 і мутантних штамів, одержаних з цих депонованих штамів. Один з аспектів винаходу, таким чином, стосується протимікробної і, більш переважно, протигрибкової композиції, яка містить Lactobacillus paracasei штам CHCC14676 або одержаний з нього мутант, і Lactobacillus rhamnosus штам CHCC14226 або одержаний з нього мутант. В іншому аспекті винахід стосується протимікробної і, більш переважно, протигрибкової композиції, яка містить щонайменше Lactobacillus paracasei штам CHCC14676 або одержаний з нього мутант, і Lactobacillus rhamnosus штам CHCC5366 або одержаний з нього мутант. В іншому аспекті винахід стосується протимікробної і, більш переважно, протигрибкової композиції, яка містить щонайменше Lactobacillus paracasei штам CHCC14676 або одержаний з нього мутант, і Lactobacillus rhamnosus штам CHCC12697 або одержаний з нього мутант. Переважно, комбінація штаму Lactobacillus paracasei і штаму Lactobacillus rhamnosus в композиціях за винаходом діє синергічно відносно їх протимікробної і/або протигрибкової активності. Протигрибкова композиція, як правило, містить бактерії в концентрованій формі, включаючи заморожені, висушені або ліофілізовані концентрати, які, як правило, мають концентрацію 4 12 життєздатних клітин, яка лежить в діапазоні 10 -10 КУО (колонієутворювальних одиниць) на 4 грам композиції, включаючи щонайменше 10 КУО на грам композиції, наприклад, щонайменше 5 6 7 10 КУО/г, наприклад, щонайменше 10 КУО/г, наприклад, щонайменше 10 КУО/г, наприклад, 8 9 10 щонайменше 10 КУО/г, наприклад, щонайменше 10 КУО/г, наприклад, щонайменше 10 11 КУО/г, наприклад, щонайменше 10 КУО/м. Таким чином, композиція за винаходом переважно представлена в замороженій, висушеній або ліофілізованій формі, наприклад, в формі готових до застосування у виробництві наборів (DVS) культур. Однак, як застосовують в цьому документі, композиція може також являти собою рідину, одержану після суспендування заморожених, висушених або ліофілізованих концентратів клітин в рідкому середовищі, такому як вода або буфер PBS. Коли композиція за винаходом являє собою суспензію, концентрація 4 12 життєздатних клітин лежить в діапазоні 10 -10 КУО (колонієутворювальних одиниць) на мл 4 5 композиції, включаючи щонайменше 10 КУО на мл композиції, наприклад, щонайменше 10 6 7 КУО/мл, наприклад, щонайменше 10 КУО/мл, наприклад, щонайменше 10 КУО/мл, наприклад, 8 9 10 щонайменше 10 КУО/мл, наприклад, щонайменше 10 КУО/мл, наприклад, щонайменше 10 11 КУО/мл, наприклад, щонайменше 10 КУО/мл. Композиція може як додаткові компоненти містити кріопротектори і/або загальноприйняті добавки, включаючи харчові добавки, такі як дріжджові екстракти, цукри і вітаміни, наприклад, вітамін А, С, D, К або вітаміни сімейства вітаміну В. Придатні кріопротектори, які можна додавати до композицій за винаходом, являють собою компоненти, які поліпшують холодостійкість мікроорганізмів, такі як маніт, сорбіт, триполіфосфат натрію, ксиліт, гліцерин, рафіноза, мальтодекстрин, еритрит, треїт, трегалоза, глюкоза і фруктоза. Інші добавки можуть включати в себе, наприклад, вуглеводи, смакові добавки, мінерали, ферменти (наприклад, сичужний фермент, лактазу і/або фосфоліпази). У композиціях за винаходом, які містять Lactobacillus paracasei штам CHCC14676 і штам Lactobacillus rhamnosus, співвідношення між Lactobacillus paracasei штамом CHCC14676 і штамом Lactobacillus rhamnosus, наприклад, співвідношення концентрації або кількості бактерій Lactobacillus paracasei і концентрації або кількостей бактерій Lactobacillus rhamnosus, переважно становить від 1:100 до 100:1, переважно 1:10-10:1. Протигрибкову композицію за даним винаходом можна використовувати в зв'язку з будьяким харчовим, кормовим і фармацевтичним продуктом, який є схильним до розкладання мікроорганізмами і/або зараженням дріжджами і пліснявою. Вони включають в себе, але без обмеження, фрукти і овочі, включаючи продукти переробки, зерно і продукти переробки зерна, молочні продукти, м'ясо, домашню птицю і морепродукти. В особливо переважних варіантах здійснення композицію використовують в зв'язку з молочним продуктом і/або м'ясом і домашньою птицею. У переважному варіанті здійснення композиції за винаходом призначені для використання як добавка при одержанні молочних продуктів, таких як йогурт, сир, сметана, вершковий сир, білі розсільні сири і т. п. У переважному варіанті здійснення композиції за винаходом використовують проти грибів, таких як дріжджі і пліснява. Це означає, що композиції використовують для пригнічення і/або запобігання росту грибів, що спричиняють зараження в процесах молочної промисловості, зокрема, процесах ферментації молока. Композиції за даним винаходом можна 6 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовувати, наприклад, для пригнічення і/або запобігання росту дріжджів, таких як дріжджі родів Klyveromyces (наприклад, K. marxianus, K. lactis), Pichia (наприклад, Р. fermentans), Yarrowia (наприклад, Y. lipolytica), Candida (наприклад, С. sake), і т. п.; або плісняви, такої як пліснява родів Penicillium (наприклад, Р. nalgiovense, Р. commune, Р. crustosum, Р. brevicompactum, Р. glabrum), видів Mucor, видів Cladiosporium, Aspergillus (наприклад, А. versicolor), Debaryomyces (наприклад, D. hansenii), і т. п. Є особливо переважним використовувати композиції за винаходом для пригнічення і/або запобігання росту видів Klyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica, Penicillium nalgiovense, видів Cladiosporium, Penicillium commune, видів Mucor, Penicillium brevicompactum, Aspergillus versicolor, Penicillium crustosum, Kluyveromyces lactis і/або Debaryomyces hansenii. Протигрибкову композицію за другим аспектом даного винаходу можна також використовувати як фармацевтичний продукт, переважно, продукт для лікування інфекцій патогенними грибами, такими як патогенні дріжджі. У третьому аспекті даний винахід стосується харчового, кормового або фармацевтичного продукту, що містить штам Lactobacillus paracasei за першим аспектом винаходу або протигрибкову композицію за другим аспектом винаходу. У переважному варіанті здійснення харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт являє собою харчовий продукт. У більш переважному варіанті здійснення такий харчовий продукт вибраний з групи, що складається з фруктів і продуктів переробки фруктів, овочів і продуктів переробки овочів, зерна і продуктів переробки зерна, молочних продуктів, м'яса, домашньої птиці і морепродуктів і їх сумішей. У навіть більш переважному варіанті здійснення харчовий продукт являє собою молочний продукт, переважно, мезофільний або термофільний кисломолочний продукт, такий як свіжий сир, йогурт, сметана або сир. В іншому переважному варіанті здійснення харчовий продукт являє собою м'ясо або домашню птицю. У переважному варіанті здійснення харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт являє собою фармацевтичний продукт. Переважно, фармацевтичний продукт являє собою продукт, придатний для введення протигрибкової композиції за другим аспектом даного винаходу людині або тварині для пригнічення патогенних мікроорганізмів і полегшення симптомів, пов'язаних з патогенними мікроорганізмами. Приклади таких симптомів включають в себе симптоми, пов'язані з дріжджовою інфекцією. У такому варіанті здійснення фармацевтичний продукт може являти собою одиничну дозовану форму, що містить протигрибкову композицію. Переважно, одинична дозована форма являє собою капсулу або таблетку. Однак одинична дозована форма може також бути придатною для введення на слизову оболонку або шкіру і, таким чином, може знаходитися в формі пасти, крему, мазі і т. п. Четвертий аспект даного винаходу стосується способу виготовлення харчового, кормового або фармацевтичного продукту за третім аспектом даного винаходу, що включає в себе додавання щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei за першим аспектом або протигрибкової композиції за другим аспектом винаходу в ході виготовлення харчового, кормового або фармацевтичного продукту. Переважно, спосіб також включає в себе стадію контролю параметрів виготовлення в ході виготовлення, так що концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei залишається постійною або збільшується. У переважному варіанті здійснення концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus 6 6 paracasei становить щонайменше 1×10 КУО/г або кожного щонайменше 1×10 КУО/мл 5 2 харчового, кормового або фармацевтичного продукту, або кожного щонайменше 1×10 КУО/см поверхні харчового, кормового або фармацевтичного продукту. Переважно, концентрація 6 щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei становить щонайменше 5×10 КУО/г або 6 кожного щонайменше 5×10 КУО/мл харчового, кормового або фармацевтичного продукту, або 5 2 кожного щонайменше 5×10 КУО/см поверхні харчового, кормового або фармацевтичного 7 7 продукту, наприклад, щонайменше 1×10 КУО/г або кожного щонайменше 1×10 КУО/мл 6 2 харчового, кормового або фармацевтичного продукту, або кожного щонайменше 1×10 КУО/см 7 поверхні харчового, кормового або фармацевтичного продукту, наприклад, щонайменше 5×10 7 КУО/г або кожного щонайменше 5×10 КУО/мл харчового, кормового або фармацевтичного 6 2 продукту, або кожного щонайменше 5×10 КУО/см поверхні харчового, кормового або фармацевтичного продукту. Коли харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт виготовляють за допомогою додавання композиції, яка містить Lactobacillus paracasei штам CHCC14676 або одержаний з 7 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 нього мутант і щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus, концентрація Lactobacillus paracasei штаму CHCC14676 або одержаного з нього мутанта і/або концентрація щонайменше 6 одного штаму Lactobacillus rhamnosus становить кожного щонайменше 1×10 КУО/г або кожного 6 щонайменше 1×10 КУО/мл харчового, кормового або фармацевтичного продукту, або кожного 5 2 щонайменше 1×10 КУО/см поверхні харчового, кормового або фармацевтичного продукту. Переважно, концентрація Lactobacillus paracasei штаму CHCC14676 або одержаного з нього мутанта і/або концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus становить 6 6 кожного щонайменше 5×10 КУО/г або кожного щонайменше 5×10 КУО/мл харчового, 5 2 кормового або фармацевтичного продукту, або кожного щонайменше 5×10 КУО/см поверхні харчового, кормового або фармацевтичного продукту. У наступному варіанті здійснення концентрація Lactobacillus paracasei штаму CHCC14676 або одержаного з нього мутанта і/або концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus становить кожного 8 8 щонайменше 1×10 КУО/г або кожного щонайменше 1×10 КУО/мл харчового, кормового або 7 2 фармацевтичного продукту, або кожного щонайменше 1×10 КУО/см поверхні харчового, кормового або фармацевтичного продукту. У переважному варіанті здійснення параметри виготовлення контролюють в ході виготовлення, так що концентрація Lactobacillus paracasei штаму CHCC14676 (або одержаного з нього мутанта) і щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus збільшується або залишається постійною. Протигрибкову композицію відповідно до даного винаходу найбільш просто використовують за допомогою змішування з харчовим, кормовим або фармацевтичним продуктом і/або нанесення на харчовий, кормовий або фармацевтичний продукт, що змішується, але вона повинна також бути ефективною для обробки поверхні твердих харчових продуктів, або внутрішньої частини таких продуктів, наприклад, за допомогою ін'єкції. В інших варіантах здійснення композицію можна наносити в формі маринаду, панірування, приправ для натирання, глазурі, суміші барвників, і т. п., де ключовими критеріями є те, що протигрибкова композиція є доступною на поверхні, схильній до бактеріального розкладання і зараження дріжджами і пліснявою. В інших варіантах здійснення композицію можна опосередковано приводити в контакт з поверхнею харчового продукту за допомогою нанесення композиції на упаковку харчового продукту і потім застосування упаковки для поверхні харчового продукту. Оптимальна кількість для використання може залежати від складу конкретного харчового продукту, що підлягає обробці, і способу, який використовується для нанесення композиції на поверхню харчового продукту, але його можна визначати простими експериментами. У найбільш переважному варіанті здійснення спосіб включає в себе одну або декілька стадій ферментації, і щонайменше один штам Lactobacillus paracasei, або протигрибкову композицію можна додавати до харчового, кормового або фармацевтичного продукту до, під час або після таких однієї або декількох стадій ферментації. Переважно, спосіб включає в себе ферментацію субстрату, такого як молочний субстрат, в присутності щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei за винаходом протягом періоду часу, достатнього для появи протигрибкової активності щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei за винаходом. Ця протигрибкова активність надає ефект пригнічення розвитку дріжджів і/або плісняви в продукті, ферментованому за допомогою щонайменше одного штаму. У навіть більш переважному варіанті здійснення спосіб включає в себе ферментування молочного субстрату за допомогою заквашувальної культури, що містить щонайменше один штам з родів, вибраних з Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus і Leuconostoc, наприклад, щонайменше один штам Lactobacillus bulgaricus і щонайменше один штам Streptococcus thermophilus або наприклад, щонайменше один штам Lactococcus lactis підвиду lactis, щонайменше один штам Leuconostoc mesenteroides підвиду cremoris і щонайменше один штам Lactococcus lactis підвиду diacetylactis. П'ятий аспект за винаходом стосується харчового продукту, який можна одержувати способом за четвертим аспектом винаходу. Шостий аспект даного винаходу стосується використання штаму Lactobacillus paracasei за першим аспектом або протигрибкової композиції за другим аспектом для одержання харчового, кормового або фармацевтичного продукту. Переважно, харчовий продукт, одержаний за допомогою використання штаму Lactobacillus paracasei за першим аспектом або протигрибкової композиції за другим аспектом, являє собою сир, такий як домашній, бринза, чедер, пармезан, моцарела, ементаль, данбо, гауда, едам, сир типу бринзи, блакитний сир, розсільний сир, камамбер або брі. 8 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Останній аспект винаходу стосується використання штаму Lactobacillus paracasei за першим аспектом або протигрибкової композиції за другим аспектом для пригнічення росту дріжджів і плісняви, зокрема, в харчових і кормових продуктах. Варіанти здійснення даного винаходу описані нижче за допомогою необмежувальних прикладів. Приклади Приклад 1: Дослідження зараження йогурту з Lactobacillus paracasei CFICC14676 Для візуального дослідження пригнічувального ефекту штаму Lactobacillus paracasei CFICC14676 на різні види плісняви, Р. brevicompactum, Р. commune, А. versicolor і Р. glabrum, одержували йогурт з 1,5 % жиру: Гомогенізоване молоко (1,5 % жиру) піддавали тепловій обробці при 95 °C±1 °C протягом 5 хв. в 1 л бутлях у водяній бані і негайно охолоджували. Комерційну заквашувальну культуру (FDVS YF-L901, яку можна одержувати з Chr. Flansen А/S, Denmark) інокулювали при 0,02 %. Потім молоко інокулювали HOLDBAC™ YM-B (20 DCU/100 л) або Lactobacillus paracasei 7 CHCC14676 (1×10 КУО/мл), і один бутель використовували як контроль й інокулювали тільки заквашувальною культурою. Молоко піддавали ферментації при 43 °C±1 °C до досягнення pH 4,60±0,1. Одержаний йогурт розливали в склянки (100 г) і зберігали при 7 °C±1 °C. Через добу після одержання йогурту різну плісняву інокулювали в формі зараження поверхні в двох повторах склянок йогурту з однією плямою на поверхні йогурту з наміченими 100 спорами/пляма. Ріст плісняви оцінювали візуально після зберігання протягом 45 діб при 7 °C±1 °C. Результат тесту йогурту представлений на фігурі 1, що показує, що Р. brevicompactum (M1), Р. commune (M6), А. versicolor (M7) і Р. glabrum (M8) добре ростуть на йогурті, одержаному з молока, ферментованого тільки із заквашувальною культурою YF-L901 (верхній ряд) або із заквашувальною культурою і культурою FIOLDBAC™ YM-B (середній ряд). На відміну від цього, коли Lactobacillus paracasei CHCC14676 був присутнім під час ферментації молока (нижній ряд), ріст всіх тестованих видів плісняви був пригнічений. Приклад 2: Кількісні визначення пригнічувального ефекту Lactobacillus paracasei CHCC14676 проти Debaryomyces hansenii Для кількісної оцінки пригнічувального ефекту Lactobacillus paracasei CHCC14676 на D. hansenii одержували йогурт: Гомогенізоване молоко (1,5 % жиру) піддавали тепловій обробці при 95 °C±1 °C протягом 5 хв. в 1 л бутлях у водяній бані і охолоджували негайно. Комерційну заквашувальну культуру (FDVS YF-L901, яку можна одержувати з Chr. Hansen А/S, Denmark) інокулювали при 0,02 %. Потім молоко інокулювали HOLDBAC™ YM-B (20 DCU/100 л), HOLDBAC™ YM-C (10 DCU/100 л) 7 або Lactobacillus paracasei CHCC14676 (1 × 10 КУО/г), і один бутель використовували як контроль й інокулювали тільки заквашувальною культурою. Молоко ферментували при 43 °C±1 °C до досягнення pH 4,60±0,1. Одержаний йогурт розливали в склянки (100 г) і зберігали при 7 °C±1 °C. Через добу після одержання йогурту в склянки інокулювали в двох повторах 1,00 мл/склянка дріжджів з наміченими 20 КУО/м. Дріжджі рівномірно розподіляли в йогурті. Склянки зберігали під кришкою при 7 °C±1 °C і у відповідні інтервали рівень зараження D. hansenii за допомогою посіву 1 мл йогурту і подальших відповідних 1-кратних розведень, одержаних в сольовому розчині пептону, на агар з дріжджовим екстрактом, глюкозою і хлорамфеніколом (YGC) з подальшою аеробною інкубацією протягом 5 діб при 25 °C. Як проілюстровано на фігурі 2, ріст D. hansenii був пригнічений в присутності штаму Lactobacillus paracasei CHCC14676 при інокуляції разом із заквашувальною культурою YF-L901 перед ферментацією. Штам спричиняв значно вище пригнічення, ніж комерційні культури, HOLDBAC™ YM-B і HOLDBAC™ YM-C. Приклад 3: Напівкількісні визначення пригнічувального ефекту Lb. Paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC5366 окремо і в комбінації проти зараження різними видами плісняви. Для напівкількісних оцінок Lb. Paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC5366 окремо і в комбінації, використовували аналіз на агарі, що нагадує спосіб виготовлення і продукт йогурту: Гомогенізоване молоко (1,5 % жиру мас./об.) піддавали тепловій обробці при 95 °C протягом п'яти хвилин і негайно охолоджували. Комерційну заквашувальну культуру (F-DVS YC-350, яку можна одержувати з Chr. Hansen А/S, Denmark) інокулювали при 0,02 %, і молоко розподіляли по 220 мл бутлях. У бутлі додатково інокулювали Lb. Paracasei CHCC14676, Lb. rhamnosus 7 CHCC5366 і комбінацію двох штамів, відповідно, в загальній концентрації 1×10 КУО/мл. Один бутель без додаткової інокуляції, крім заквашувальної культури, використовували як контроль. 9 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Більше того, 5 % індикатор pH з бромкрезолового пурпурного і бромкрезолового зеленого додавали у всі бутлі для одержання показників швидкості закислення, і для одержання синього/зеленого забарвлення середовища, що полегшувало детекцію подальшого росту дріжджів і плісняви мішеней. Всі бутлі інкубували у водяній бані при 43±1 °C і піддавали ферментації в цих умовах до досягнення pH 4,60±0,1. Після ферментації бутлі негайно охолоджували на льоду й інтенсивно струшували, щоб розбити згусток. Потім кисломолочний продукт нагрівали до температури 40 °C і додавали до 40 мл 5 % стерильного розчину агару, розплавленого і охолодженого до 60 °C. Потім цей розчин розливали в стерильні чашки Петрі, і чашки висушували на робочому столі з ламінарним повітропотоком протягом 30 хв. Суспензії повністю пророслих спор у відповідних розведеннях з вибраних видів плісняви Penicillium nalgiovense (10x), Penicillium commune (100x), Aspergillus versicolor (100x) і Penicillium crustosum (100x) наносили плямами на чашки. Чашки інкубували при 7 °C і перевіряли ріст плісняви у придатні, регулярні інтервали. Результати аналізу на агарі представлені на фігурі 3, яка показує, що всі тестовані види плісняви росли дуже добре на чашках з агаром з молока, ферментованого тільки із заквашувальною культурою (контроль). Однак, коли Lb. Paracasei CHCC14676 або Lb. rhamnosus CHCC5366 були присутніми під час ферментації молока, на одержаних чашках сильно знижувався ріст всіх видів плісняви. Більше того: коли Lb. Paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC5366 були присутніми в комбінації під час ферментації молока, спостерігали навіть сильніше пригнічення, зокрема, для Penicillium commune, Aspergillus versicolor і Penicillium crustosum, нанесених плямами на чашки. Приклад 4: Напівкількісні визначення пригнічувального ефекту Lb. Paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC14226 окремо і в комбінації проти зараження різними видами плісняви Для напівкількісних оцінок Lb. Paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC14226 окремо і в комбінації використовували аналіз на агарі, що нагадує спосіб виготовлення і продукт йогурту: Гомогенізоване молоко (1,5 % жиру мас./об.) піддавали тепловій обробці при 95 °C протягом п'яти хвилин і негайно охолоджували. Комерційну заквашувальну культуру (F-DVS Yoflex® Mild, яку можна одержувати з Chr. Hansen А/S, Denmark) інокулювали при 0,02 %, і молоко розподіляли по 220 мл бутлях. У бутлі додатково інокулювали Lb. Paracasei CHCC14676, Lb. 7 rhamnosus CHCC14226 і комбінацію двох штамів, відповідно, в загальній концентрації 1×10 КУО/мл. Один бутель без додаткової інокуляції, крім заквашувальної культури, використовували як контроль. Крім того, 5 % індикатора pH з бромкрезолового пурпурного і бромкрезолового зеленого додавали у всі бутлі для одержання показників швидкості закислення, і для одержання синього/зеленого забарвлення середовища, що полегшувало детекцію подальшого росту дріжджів і плісняви мішеней. Всі бутлі інкубували у водяній бані при 43±1 °C і піддавали ферментації в цих умовах до досягнення pH 4,60±0,1. Після ферментації бутлі негайно охолоджували на льоду й інтенсивно струшували, щоб розбити згусток. Потім кисломолочний продукт нагрівали до температури 40 °C і додавали до 40 мл 5 % стерильного розчину агару, розплавленого і охолодженого до 60 °C. Потім цей розчин розливали в стерильні чашки Петрі, і чашки висушували на робочому столі з ламінарним повітропотоком протягом 30 хв. Суспензії повністю пророслих спор у відповідних розведеннях з вибраних видів плісняви Penicillium nalgiovense (10x), Penicillium commune (100x), Aspergillus versicolor (100x) і Penicillium crustosum (100x) наносили плямами на чашки. Чашки інкубували при 7 °C і перевіряли ріст плісняви у придатні, регулярні інтервали. Результати аналізу на агарі представлені на фігурі 4, яка показує, що всі тестовані види плісняви росли дуже добре на чашках з агаром з молока, ферментованого тільки із заквашувальною культурою (контроль). Однак, коли Lb. Paracasei CHCC14676 або Lb. rhamnosus CHCC14226 були присутніми під час ферментації молока, на одержаних чашках сильно знижувався ріст всіх видів плісняви. Більше того: коли Lb. Paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC14226 були присутніми в комбінації під час ферментації молока, спостерігали навіть сильніше пригнічення для Penicillium commune, Aspergillus versicolor і Penicillium crustosum, нанесених плямами на чашки. Приклад 5: Дослідження зараження грецького йогурту з Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 в комбінації Для візуального дослідження пригнічувального ефекту Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 в комбінації на види Mucor грецький йогурт одержували по суті таким чином: У пастеризоване молоко з 1,5 % жиру інокулювали комерційну заквашувальну культуру (FDVS YF-L901, яку можна одержувати з Chr. Flansen А/S, Denmark) при 0,02 %. Одну партію, інокульовану тільки заквашувальною культурою, використовували як контроль. В іншу партію 10 UA 115331 C2 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 додатково інокулювали комбінацію Lactobacillus rhamnosus штаму CFICC5366 (5×10 КУО/г) і 6 Lactobacillus paracasei штаму CHCC14676 (5×10 КУО/г). Молоко піддавали ферментації при 43 °C±1 °C до кінцевого pH 4,55 (6-7 годин). Потім йогурт охолоджували до 25 °C±1 °C зі зворотним тиском 2 бар (200000 Па) і зберігали при 6 °C±1 °C. Через добу після одержання йогурту види Mucor інокулювали в формі зараження поверхні в двох повторах склянок йогурту за допомогою нанесення однієї плями на поверхню йогурту з наміченою концентрацією при інокуляції 100 спор/пляма. Ріст плісняви оцінювали візуально після зберігання протягом 15 діб при 22 °C±1 °C. Результати тесту грецького йогурту представлені на фігурі 5, яка показує, що види Mucor добре ростуть на йогурті, одержаному з молока, ферментованого тільки із заквашувальною культурою (ліва склянка). На відміну від цього, коли Lactobacillus rhamnosus CFICC5366 і Lactobacillus paracasei CFICC14676 були присутніми під час ферментації молока (права склянка), ріст видів Mucor був пригнічений. Приклад 6: Друге дослідження зараження грецького йогурту з комбінацією Lactobacillus rhamnosus CFICC5366 і Lactobacillus paracasei CFICC14676 Для візуального дослідження пригнічувального ефекту комбінації Lactobacillus rhamnosus CFICC5366 і Lactobacillus paracasei CFICC14676 на плісняву чорного хліба Rhizopus stolonifer грецький йогурт одержували по суті таким чином: У пастеризоване молоко з 1,5 % жиру інокулювали комерційну заквашувальну культуру (FDVS YF-L901, яку можна одержувати з Chr. Flansen А/S, Denmark) при 0,02 %. У молоко додатково інокулювали FIOLDBAC™ YM-B (10 DCU/100 л), з Lactobacillus rhamnosus штам 7 6 CHCC5366 (1×10 КУО/г), або комбінацію Lactobacillus rhamnosus штам CHCC5366 (5×10 КУО/г) 6 і Lactobacillus paracasei штам CFICC14676 (5×10 КУО/г). Одну партію використовували як контроль й інокулювали тільки заквашувальною культурою. Молоко ферментували при 43 °C±1 °C до кінцевого pH 4,55 (6-7 годин). Потім йогурт охолоджували до 25 °C±1 °C із зворотним тиском 2 бар (200000 Па) і зберігали при 6 °C±1 °C. Через добу після одержання йогурту Rhizopus stolonifer інокулювали в формі зараження поверхні в двох повторах склянок йогурту за допомогою нанесення однієї плями на поверхню йогурту з наміченим зараженням 100 спор/пляма. Ріст плісняви оцінювали візуально після зберігання протягом 42 діб при 7 °C±1 °C. Результати тесту грецького йогурту представлені на фігурі 6, яка показує, що Rhizopus stolonifer добре росте на йогурті, одержаному з молока, ферментованого тільки із заквашувальною культурою ("R", тобто контроль) або із заквашувальною культурою і культурою FIOLDBAC™ YM-B (YM-B). Однак, коли Lactobacillus rhamnosus CFICC5366 (5366) був присутнім, ріст Rhizopus stolonifer був значно пригнічений. Коли Lactobacillus rhamnosus CFICC5366 і Lactobacillus paracasei CFICC14676 обидва були присутніми під час ферментації молока (5366+14676), ріст Rhizopus stolonifer був пригнічений майже повністю. Приклад 7: Дослідження зараження сметани з Lactobacillus paracasei CFICC14676 і Lactobacillus rhamnosus CFICC12697 в комбінації Для візуального дослідження пригнічувального ефекту комбінації Lactobacillus paracasei CFICC14676 і Lactobacillus rhamnosus CFICC12697 на ріст різних видів плісняви сметану одержували по суті таким чином: Пастеризоване молоко з високим вмістом жиру інокулювали гетероферментативною комерційною заквашувальною культурою (F-DVS DSG-2000, яку можна одержувати з Chr. Flansen А/S, Denmark) при 0,01 %. Молоко додатково інокулювали FIOLDBAC™ YM-B (10 6 DCU/100 л) або комбінацією Lactobacillus paracasei CHCC14676 (2,5×10 КУО/г) і Lactobacillus 6 rhamnosus CHCC12697 (2,5×10 КУО/г). Одну партію використовували як контроль і інокулювали тільки заквашувальною культурою. Молоко піддавали ферментації при 28 °C±1 °C до досягнення pH 4,60+0,05, і сметану піддавали подальшій обробці. Сметану перемішували і охолоджували до 20 °C±1 °C і зберігали при 7 °C±1 °C. Через добу після одержання сметани різні види плісняви інокулювали в формі зараження поверхні в двох повторах склянок сметани за допомогою нанесення однієї плями на поверхню сметани з наміченою концентрацією 100 спор/пляма. Ріст плісняви оцінювали візуально після зберігання протягом 61 доби при 7 °C±1 °C. Результати тесту сметани представлені на фігурі 7, яка показує, що Penicillium brevicompactum (M1), Penicillium commune (M6), Aspergillus versicolor (M7) і Penicillium glabrum (M8) добре ростуть на сметані, одержаній з молока, ферментованого тільки із заквашувальною культурою (верхній ряд) або із заквашувальною культурою і культурою HOLDBAC™ YM-B (середній ряд). На відміну від цього, коли Lactobacillus paracasei CHCC14676 і Lactobacillus 11 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 rhamnosus CHCC12697 були присутніми під час ферментації молока (нижній ряд) ріст всієї тестованої плісняви був пригнічений. Приклад 8: Кількісні визначення пригнічувального ефекту комбінації Lactobacillus paracasei CHCC14676 і Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 проти Debaryomyces hansenii в сметані Для кількісної оцінки пригнічувального ефекту комбінації Lactobacillus paracasei CFICC14676 і Lactobacillus rhamnosus CFICC12697 проти Debaryomyces hansenii сметану одержували по суті таким чином: Пастеризоване молоко з високим вмістом жиру інокулювали гетероферментативною комерційною заквашувальною культурою (F-DVS DSG-2000, яку можна одержувати з Chr. Flansen А/S, Denmark) при 0,01 %. Молоко додатково інокулювали FIOLDBAC™ YM-B (10 6 DCU/100 л) або комбінацією Lactobacillus paracasei CFICC14676 (2,5×10 КУО/г) і Lactobacillus 6 rhamnosus CFICC12697 (2,5×10 КУО/г). Одну партію використовували як контроль і інокулювали тільки заквашувальною культурою. Молоко піддавали ферментації при 28 °C±1 °C до досягнення pH 4,60±0,05 і сметану піддавали подальшій обробці. Сметану перемішували і охолоджували до 20 °C±1 °C, і зберігали при 7 °C±1 °C. Через добу після одержання сметани склянки в двох повторах інокулювали 1,00 мл/склянка дріжджів з наміченими 20 КУО/м. Дріжджі рівномірно розподіляли в сметані. Склянки зберігали під кришкою при 7 °C±1 °C і аналізували у придатні інтервали рівень зараження D. hansenii за допомогою посіву 1 мл сметани і подальших відповідних 1-кратних розведень, одержаних в сольовому розчині пептону, на агар з дріжджовим екстрактом, глюкозою і хлорамфеніколом (YGC) з подальшою аеробною інкубацією протягом 5 діб при 25 °C. Як проілюстровано на фігурі 8, ріст D. hansenii був пригнічений в присутності комбінації Lactobacillus paracasei CFICC14676 і Lactobacillus rhamnosus CFICC12697 при інокуляції разом із заквашувальною культурою DSG-2000 перед ферментацією. Штам спричиняв значно вище пригнічення, ніж комерційна культура, HOLDBAC™ YM-B. Приклад 9: Дослідження зараження білого розсільного сиру з Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 в комбінації Для кількісної оцінки пригнічувального ефекту Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 в комбінації проти Saccharomyces cerevisiae, одержували білий розсільний сир: Пастеризоване і стандартизоване молоко інокулювали комерційною заквашувальною культурою (FD-DVS SafeIT-1, яку можна одержувати з Chr. Hansen А/S, Denmark) при 40 Од. на 1000 л молока. Молоко додатково інокулювали HOLDBAC™ YM-B (10 DCU/100 л) або 6 комбінацією Lactobacillus rhamnosus штаму CHCC5366 (5×10 КУО/г) і Lactobacillus paracasei 6 штаму CHCC14676 (5×10 КУО/г). Одну партію використовували як контроль і інокулювали тільки заквашувальною культурою. Молоко обробляли сичужним ферментом при 36 °C±1 °C з використанням Chy-Max plus (яку можна одержувати з Chr. Hansen А/S, Denmark) при 220 мл на 1000 л протягом 90 хв. перед нарізанням. При pH 6,0 сирний згусток подавали насосом до плісняви і залишали для стікання рідини до кінцевого 4,8-4,7 (20-24 годин). Сири вміщували в банки з холодним розсолом (8 %) і зберігали при 5 °C±1 °C. Через добу після одержання білого розсільного сиру в банки інокулювали дріжджі в двох повторах з наміченими 20 КУО/мл. Дріжджі рівномірно розподіляли в розсолі. Банки зберігали під кришкою при 7 °C±1 °C протягом аж до 40 діб, і по 10 г аналізували у придатні інтервали по рівню зараження Saccharomyces cerevisiae за допомогою посіву відповідних 1-кратних розведень, одержаних в сольовому розчині пептону, на агар з дріжджовим екстрактом, глюкозою і хлорамфеніколом (YGC) з подальшою аеробною інкубацією протягом 5 діб при 25 °C. Як проілюстровано на фігурі 9, ріст Saccharomyces cerevisiae був пригнічений в присутності Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 в комбінації при інокуляції разом із заквашувальною культурою SafeIT-1. Штами спричиняли значно вище пригнічення, ніж комерційно доступна культура, HOLDBAC™ YM-B. Приклад 10: Друге дослідження зараження білого розсільного сиру з Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 в комбінації Для кількісної оцінки пригнічувального ефекту Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 в комбінації проти Kluyveromyces marxianus одержували білий розсільний сир, як описано в прикладі 1, за винятком того, що в банки інокулювали Kluyveromyces marxianus як зараження дріжджами. Як проілюстровано на фігурі 10, ріст Kluyveromyces marxianus був пригнічений в присутності Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 в комбінації при 12 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інокуляції разом із заквашувальною культурою SafeIT-1. Штами спричиняли значно вище пригнічення, ніж комерційно доступна культура, HOLDBAC™ YM-B. Приклад 11: Друге дослідженнязараження білого розсільного сиру з Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 в комбінації Для візуального дослідження пригнічувального ефекту Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 в комбінації проти Р. commune одержували білий розсільний сир, як описано в прикладі 1. Через 7 діб після одержання білого розсільного сиру сир виймали з розсолу і Р. commune інокулювали в двох повторах зразків сиру в формі зараження поверхні з трьома плямами на поверхні сиру з наміченими 100 спорами/пляма. Ріст двох різних ізолятів Р. commune оцінювали візуально після зберігання протягом 12 діб при 7 °C±1 °C, і потім 16 діб при 12 °C±1 °C. Результати білого розсільного сиру представлені на фігурі 11, яка показує, що два ізоляти Р. commune добре ростуть на білому розсільному сирі, одержаному з молока, інокульованого тільки заквашувальною культурою (зліва). На відміну від цього, коли Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 були присутніми під час виготовлення сиру (праворуч), ріст Р. commune був сильно пригнічений. Приклад 12: Дослідження зараження йогурту з Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і CHCC14676 проти Penicillium paneum Для візуального дослідження пригнічувального ефекту Lactobacillus rhamnosus штаму CHCC5366 окремо або в комбінації з Lactobacillus paracasei CHCC14676 на плісняву Р. paneum одержували йогурт з 1,5 % жиру: Гомогенізоване молоко (1,5 % жиру) піддавали тепловій обробці при 95 °C±1 °C протягом 5 хв. в 1 л бутлях у водяній бані і негайно охолоджували. Комерційну заквашувальну культуру (FDVS YF-L901, яку можна одержувати з Chr. Hansen А/S, Denmark) інокулювали при 0,02 %. У молоко додатково інокулювали HOLDBAC™ YM-B (20DCU/100 л), з Lactobacillus rhamnosus 7 6 CHCC5366 (1×10 КУО/мл) окремо або комбінацію Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5×10 6 КУО/мл) і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5×10 КУО/мл). Один бутель використовували як контроль і інокулювали тільки заквашувальною культурою. Молоко піддавали ферментації при 43 °C±1 °C до досягнення pH 4,60±0,1. Одержаний йогурт розливали в склянки (100 г) і зберігали при 7 °C±1 °C. Через добу після одержання йогурту різні види плісняви інокулювали в формі зараження поверхні в двох повторах склянок йогурту з однією плямою на поверхні йогурту з наміченими 100 спорами/пляма. Ріст плісняви оцінювали візуально після зберігання протягом 28 діб при 7 °C±1 °C Результат тесту йогурту представлений на фігурі 12, яка показує, що Р. paneum добре росте на йогурті, одержаному з молока, ферментованого тільки із заквашувальною культурою YF-L901 або із заквашувальною культурою і культурою HOLDBAC™ YM-B. На відміну від цього, коли Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 був присутнім під час ферментації молока, ріст Р. paneum був сильно знижений, і комбінація Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676 спричиняла навіть сильніше пригнічення росту Р. paneum. Приклад 13: Дослідження зараження йогурту з Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і CHCC14676 при різних температурах зберігання Для візуального дослідження пригнічувального ефекту Lactobacillus rhamnosus штаму CHCC5366 окремо або в комбінації з Lactobacillus paracasei CHCC14676 на плісняву Р. crustosum при різних температурах зберігання одержували йогурт з 1,5 % жиру: Гомогенізоване молоко (1,5 % жиру) піддавали тепловій обробці при 95 °C±1 °C протягом 5 хв. в 1 л бутлях у водяній бані і негайно охолоджували. Комерційну заквашувальну культуру (FDVS YF-L901, яку можна одержувати з Chr. Hansen А/S, Denmark) інокулювали при 0,02 %. Молоко додатково інокулювали HOLDBAC™ YM-B (20 DCU/100 л), Lactobacillus rhamnosus 7 6 CHCC5366 (1×10 КУО/мл) окремо або комбінацією Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5×10 6 КУО/мл) і Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5×10 КУО/мл). Один бутель використовували як контроль й інокулювали тільки заквашувальною культурою. Молоко піддавали ферментації при 43 °C±1 °C до досягнення pH 4,60±0,1. Одержаний йогурт розливали в склянки (100 г) і зберігали при 7 °C±1 °C. Через добу після одержання йогурту Penicillium crustosum інокулювали в формі зараження поверхні в двох повторах склянок йогурту з однією плямою на поверхні йогурту з наміченими 100 спорами/пляма. Ріст плісняви оцінювали візуально після зберігання протягом 36 діб при 7 °C±1 °C, 12 °C±1 °C або 22 °C±1 °C Результати тесту йогурту представлені на фігурі 13, яка показує, що Р. crustosum добре росте на йогурті, одержаному з молока, ферментованого тільки із заквашувальною культурою 13 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 YF-L901 або із заквашувальною культурою і культурою FIOLDBAC™ YM-B при всіх температурах зберігання. На відміну від цього, коли Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, окремо або в комбінації з Lactobacillus paracasei CHCC14676, був присутнім під час ферментації молока, ріст Р. crustosum був повністю відвернутий при зберіганні як при 7 °C±1 °C, так і при 12 °C±1 °C протягом 36 діб. При зберіганні при 22 °C±1 °C ріст Р. crustosum був сильно знижений в присутності Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і навіть сильніше - в присутності комбінації Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 і Lactobacillus paracasei CHCC14676. Депозити і висновок експерта Заявник клопочеться, щоб зразок депонованих мікроорганізмів, вказаних нижче, міг ставати доступним тільки для експерта, до дати видачі патенту. Lactobacillus paracasei штам CHCC14676 депонований 2012-02-02 в German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, і йому привласнений № доступу: DSM25612. Lactobacillus rhamnosus штам CHCC5366 депонований 2009-10-14 в German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, і йому привласнений № доступу: DSM23035. Lactobacillus rhamnosus штам CHCC12697 депонований 2011-03-01 в German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, і йому привласнений № доступу: DSM24616. Lactobacillus rhamnosus штам CHCC14226 депонований 2011-03-15 в German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, і йому привласнений № доступу: DSM24652. Депонування виконане згідно з положеннями Будапештського угоди про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Посилання US2011/0045134 EP1442113 EP11161609.0 Kosikowski, F.V. and Mistry, V.V., "Cheese and Fermented Milk Foods", 1997, 3rd Ed. F.V. Kosikowski, L.L.C. Westport, CT 35 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 40 45 50 55 1. Штам Lactobacillus paracasei для одержання протигрибкової композиції, який вибраний з групи, що складається із штаму Lactobacillus paracasei, депонованого в German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) під № доступу DSM25612, і одержаних з нього мутантних штамів, де мутантні штами мають по суті такі ж або поліпшені протигрибкові властивості, як і штам, депонований під № доступу DSM25612. 2. Протигрибкова композиція, яка містить щонайменше один штам Lactobacillus paracasei за п. 1. 3. Протигрибкова композиція, яка містить щонайменше один штам Lactobacillus paracasei за п. 1 і щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus. 4. Протигрибкова композиція за п. 3, де щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus вибраний з групи, яка складається з Lactobacillus rhamnosus з № доступу DSM24616, Lactobacillus rhamnosus з № доступу DSM24652, Lactobacillus rhamnosus з № доступу DSM23035 і одержаних з них мутантних штамів, де мутантні штами мають по суті такі ж або поліпшені протигрибкові властивості, як і штами, депоновані під № доступу DSM24616, DSM24652, DSM23035. 5. Харчовий продукт, що містить штам Lactobacillus paracasei за п. 1 або протигрибкову композицію за будь-яким з пп. 2-4. 6. Харчовий продукт за п. 5, який містить кількість штаму Lactobacillus paracasei за п. 1, ефективну для надання протигрибкових властивостей харчовому продукту. 7. Харчовий продукт за п. 5 або п. 6, де харчовий продукт вибраний з групи, яка складається з фруктів і продуктів переробки фруктів, овочів і продуктів переробки овочів, зерна і продуктів переробки зерна, молочних продуктів, м'яса, домашньої птиці і морепродуктів, і їх сумішей. 14 UA 115331 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8. Харчовий продукт за п. 7, де харчовий продукт являє собою молочний продукт, і молочний продукт являє собою мезофільний або термофільний кисломолочний продукт, такий як йогурт або сметана. 9. Кормовий продукт, що містить штам Lactobacillus paracasei за п. 1 або протигрибкову композицію за будь-яким з пп. 2-4. 10. Фармацевтичний продукт, що містить штам Lactobacillus paracasei за п. 1 або протигрибкову композицію за будь-яким з пп. 2-4. 11. Спосіб виготовлення харчового продукту, який включає додавання щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei за п. 1 або протигрибкової композиції за будь-яким з пп. 2-4 до харчового продукту в ході виготовлення і контроль параметрів виготовлення в ході виготовлення, так що концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei залишається постійною або збільшується. 12. Спосіб за п. 11, де концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei 6 6 становить щонайменше 1x10 KУО/г або кожного щонайменше 1×10 KУО/мл харчового 5 2 продукту, або щонайменше 1×10 KУО/см поверхні харчового продукту. 13. Спосіб за п. 11, який включає: (a) додавання протигрибкової композиції за будь-яким з пп. 2-4 в ході виготовлення харчового продукту, так що концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і/або 6 щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei кожна становить щонайменше 1×10 KУО/г 6 5 2 або щонайменше 1×10 KУО/мл харчового продукту, або щонайменше 1×10 KУО/см поверхні харчового продукту, і (b) контроль параметрів виготовлення в ході виготовлення, так що концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і/або щонайменше одного штаму Lactobacillus збільшується або залишається постійною. 14. Спосіб за будь-яким з пп. 11-13, де спосіб включає одну або декілька стадій ферментації. 15. Спосіб за п. 14, де спосіб включає ферментацію молочного субстрату із заквашувальною культурою, яка містить щонайменше один штам родів, вибраних з Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus і Leuconostoc. 16. Харчовий продукт, який можна одержувати способом за будь-яким з пп. 11-15. 17. Спосіб виготовлення кормового продукту, що включає додавання щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei за п. 1 або протигрибкової композиції за будь-яким з пп. 2-4 до кормового продукту в ході виготовлення і контролю параметрів виготовлення в ході виготовлення, так що концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei залишається постійною або збільшується. 18. Спосіб за п. 17, де концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei 6 6 становить щонайменше 1×10 KУО/г або кожного щонайменше 1×10 KУО/мл кормового 5 2 продукту, або щонайменше 1×10 KУО/см поверхні кормового продукту. 19. Спосіб за п. 17, який включає: (а) додавання протигрибкової композиції за будь-яким з пп. 2-4 в ході виготовлення кормового продукту, так що концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і/або 6 щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei кожна становить щонайменше 1×10 KУО/г 6 5 2 або щонайменше 1×10 KУО/мл кормового продукту, або щонайменше 1×10 KУО/см поверхні кормового продукту, і (b) контроль параметрів виготовлення в ході виготовлення, так що концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і/або щонайменше одного штаму Lactobacillus збільшується або залишається постійною. 20. Спосіб забудь-яким з пп. 17-19, де спосіб включає одну або декілька стадій ферментації. 21. Спосіб за п. 20, де спосіб включає ферментацію молочного субстрату з заквашувальною культурою, що містить щонайменше один штам родів, вибраних з Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus і Leuconostoc. 22. Спосіб виготовлення фармацевтичного продукту, що включає додавання щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei за п. 1 або протигрибкової композиції за будь-яким з пп. 24 до фармацевтичного продукту в ході виготовлення і контролю параметрів виготовлення в ході виготовлення, так що концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei залишається постійною або збільшується. 23. Спосіб за п. 22, де концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei 6 6 становить щонайменше 1×10 KУО/г або кожного щонайменше 1×10 KУО/мл фармацевтичного 5 2 продукту, або щонайменше 1×10 KУО/см поверхні фармацевтичного продукту. 24. Спосіб за п. 22, який включає: 15 UA 115331 C2 5 10 15 20 (а) додавання протигрибкової композиції за будь-яким з пп. 2-4 в ході виготовлення фармацевтичного продукту, так що концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і/або щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei кожна становить 6 6 щонайменше 1×10 KУО/г або щонайменше 1×10 KУО/мл фармацевтичного продукту, або 5 2 щонайменше 1×10 KУО/см поверхні фармацевтичного продукту, і (b) контроль параметрів виготовлення в ході виготовлення, так що концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і/або щонайменше одного штаму Lactobacillus збільшується або залишається постійною. 25. Спосіб за будь-яким з пп. 22-24, де спосіб включає одну або декілька стадій ферментації. 26. Спосіб за п. 25, де спосіб включає ферментацію молочного субстрату з заквашувальною культурою, що містить щонайменше один штам родів, вибраних з Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus і Leuconostoc. 27. Застосування штаму Lactobacillus paracasei за п. 1 або протигрибкової композиції за будьяким з пп. 2-4 для одержання харчового продукту. 28. Застосування штаму Lactobacillus paracasei за п. 1 або протигрибкової композиції за будьяким з пп. 2-4 для отримання кормового продукту. 29. Застосування штаму Lactobacillus paracasei за п. 1 або протигрибкової композиції за будьяким з пп. 2-4 для отримання фармацевтичного продукту. 30. Застосування штаму Lactobacillus paracasei за п. 1 або протигрибкової композиції за будьяким з пп. 2-4 для пригнічення росту дріжджів і плісняви. 16 UA 115331 C2 17 UA 115331 C2 18 UA 115331 C2 19 UA 115331 C2 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 20