Штам бактерій lactobacillus rhamnosus, що використовується у виробництві функціональних добавок для сільськогосподарських тварин та птиці

Реферат: Штам Lactobacillus rhamnosus IMB B-7379, що використовується у виробництві функціональних добавок для сільськогосподарських тварин та птиці. Винахід належить до галузі ветеринарії та біотехнології та є штамом, що використовується для отримання лікувально-профілактичної функціональної добавки для профілактики і лікування дисбактеріозів та шлунково-кишкових захворювань сільськогосподарських тварин та птиці. Штам Lactobacillus rhamnosus IMB В-7379 є високотехнологічний, має виражену антагоністичну дію відносно до широкого кола патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів, має високу адгезивність до еритроцитів, є антибіотикорезистентним та стійким до жовчі і шлункового соку. UA 109098 C2 (12) UA 109098 C2 UA 109098 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до галузі ветеринарії та біотехнології та є штамом лактобацил, що використовується для отримання функціональної добавки для профілактики і лікування дисбактеріозів та шлунково-кишкових захворювань сільськогосподарських тварин та птиці. В останнє десятиріччя в багатьох країнах світу з метою попередження захворювань тварин і птиці, що спричинені умовно-патогенною мікрофлорою широко використовують препарати нормальної мікрофлори. Відомо, що біопрепарати, виготовлені на основі лакто- та біфідобактерій є природними антагоністами патогенних мікроорганізмів. Ці препарати розглядаються як найбільш фізіологічні, екологічно чисті, практично нешкідливі і водночас високоефективні засоби корекції мікробіоценозу. Існує штам бактерій Lactobacillus plantarum № 12 ІЕКВМ [Пат. 13892 Україна, МПК (2006) C12N 7/00. Штам Lactobacillus plantarum ІЕКВМ, що використовують для виробництва пробіотиків, для профілактики та лікування шлунково-кишкових захворювань телят та для виготовлення бактерійної закваски для силосування кормів / Дідик Т.Б.; власник і заявник: Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини. - № u200510621, заявл. 10.11.2005, опубл. 17.04.2006, бюл. № 4]. Проте в доступних інформаційних джерелах дані про антагоністичну та ферментативну активності цього штаму Lactobacillus plantarum ІЕКВМ розкриті не повною мірою. Найближчим до штаму, що заявляється, є штам Lactobacillus rhamnosus 26. [Пат. 54994 Україна, МПК (2009) C12N 1/20 А61Р 31/00. Ізолят бактерії Lactobacillus rhamnosus 26 для виготовлення пробіотичного препарату / Руденко Павло Анатолійович; власник і заявник: Луганський Національний аграрний університет, № u201007098, заявл. 08.06.2010 10.11.2005, опубл. 25.11.2010, Бюл. № 22]. Недоліком цього штаму є обмежена сфера застосування, оскільки його вилучено із біоптату здорової шкіри від кота та застосовують у пробіотичному препараті для лікування гнійних ран у котів. Задачею винаходу було отримати штам молочнокислих бактерій Lactobacillus rhamnosus з високою біологічною активністю, який буде використано як компонент функціональних добавок для сільськогосподарських тварин та птиці. Штам було виділено із фекалій здорових телят. Ідентифікований як вид L. plantarum за основними морфологічними, культуральними і фізіолого-біохімічними властивостями (Краткий определитель Берги, 2009; Л.А. Банникова. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности, 1975). Штам первісно задепоновано у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України і зареєстровано за номером ІMB В-7379, родина Lactobacillaceae, рід Lactobacillus, вид Lactobacillus rhamnosus. Штам Lactobacillus rhamnosus ІMB В-7379 характеризується наступними ознаками і властивостями. Культурально-морфологічні властивості. Тонкі короткі палички товщиною від 0,5 мкм до 1,0 мкм та довжиною від 2 мкм до 4 мкм, часто зігнуті, розташовані поодиноко чи у ланцюжках. Грампозитивні, спор не утворюють, нерухливі, каталазонегативні. На твердому середовищі МРС утворюються через 24-48 годин колоній діаметром 2-5 мм, випуклі, з чітко окресленими краями, непрозорі, непігментовані. В гідролізованому бульйоні та рідкому середовищі МРС культура росте з утворенням рівномірної каламуті та дрібнодисперсного осаду на дні пробірки. На капустяному агарі на 24 годину культивування формуються колонії білого кольору, округлої форми, діаметром до 1,0 мм, з вираженою зоною просвітлення, через 48-72 години - колонії зірчасті, білого кольору, діаметром 2,0-3,0 мм, з добре вираженою зоною просвітлення агару. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Аеротолерантний, повільно росте за присутності кисню. Оптимальна температура росту (30-40)°С. Гранична кислотність у молоці 180°Т. 8 3 Максимальна кількість мікроорганізмів у молоці досягає 8,010 КУО/см . Штам ферментує: Lрамнозу, D-рибозу, D-галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-манозу, маніт, D-сорбіт, метил-βDглюкопіранозид, N-ацетилглюкозамін, амігдалин, арбутин, ескулін, саліцин, D-целобіоза, Dмальтоза, D-лактоза, D-сахароза, D-тригалоза, D-меліцитоза, гентибіоза, D-тагатоза, Dтураноза, глюконат. Глюкозу ферментує без утворення газу. Не ферментує гліцерол, еритритол, D-арабінозу, L-арабінозу, D-ксилозу, L-ксилозу, D-адонітол, метил-D-ксилопіранозид, L-сорбозу, дульцин, інозит, D-метил-D-манопіранозид, D-мелібіозу, інулін, D-рафінозу, глікоген, ксиліт, D-ліксозу, D-фукозу, L-фукозу, D-арабіт, L-арабіт. Росте за присутності NaCl та жовчі не вище 6,5 % та 20 % відповідно, не росте у м'ясопептонному бульйоні за рН 9,6 і вище; не утворює аміаку з аргініну, відновлює нітрит, желатину не розріджує, цитохромів не містить. Індол і сірководень не продукує. У разі внесення 3 % культури в молоко за температури 30 °C молокозсідальна активність штаму становить 18 год., за температури 37 °C-12 год. Метиленовий синій не відновлює. 1 UA 109098 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Визначення адгезивної активності штаму здійснювали користуючись середнім показником адгезії (СПА) за методом Бриліс В.І. та ін. [Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лаб. дело - 1986. - № 4. - С. 210-212.] у модельній системі на еритроцитах. Середній показник адгезії - СПА для штаму L. rhamnosus становив 4,22. Кількість утвореного діацетилу і ацетоїну складає близько 22 мг%, 0,58 мг% відповідно. Штам є кислотостійким за рН 2 і рН 3 зберігає чисельність своєї популяції на одному рівні протягом 3 год. Спосіб та умови культивування та довготривалого зберігання штаму. Основні умови зберігання: культури бактерій вирощують у знежиреному молоці і зберігають в холодильнику за температури + (4-6)°С. Пересів для збереження життєдіяльності і біохімічних властивостей проводять на знежирене молоко через 30-35 діб. Штам зберігають в ліофілізованому стані за температури мінус 18 °C не більше трьох років. Антагоністичну активність штамів досліджували in vitro за методом лунок. Як тест-культури використовували умовно-патогенні мікроорганізми: S. aureus 209, P. vulgaris ГІСК 160209, Е. соlі 0111, Е. соlі 113, Е. enterocolitica, P. aeruginosa ATCC 27853. Штам Lactobacillus rhamnosus має високу антагоністичну властивість відносно до патогенної та умовно-патогенної мікрофлори. Діаметр зони лізису тест-культур досягає 20,0 мм. Найвищим рівень антагонізму спостерігали для штамів P. vulgaris ГІСК 160209, Е. соlі 0111 - розмір зони затримки росту становив 20 мм. Табл. 1 - Антагоністична активність штаму Lactobacillus rhamnosus. Чутливість до антибіотиків. Штам резистентний до траконазолу та окремих антибіотиків групи цефалоспоринів - цефазолін, цефтнофур, цефепим та цефамексин. Крім того, вивчення спектра чутливості до антибіотиків та антибактеріальних препаратів виявило, що штам L. rhamnosus має природну стійкість до: азитроміцину, еритроміцину, лінкоміцину, клинзаміцину, левоміцетину, цепрофлоксацину, цефтриаксону, цефоперазону, доксицикліну, тетрацикліну, рифампіцину. Табл. 2. - Антибіотикостійкість штаму Lactobacillus rhamnosus. Ферментативна активність штаму молочнокислих бактерій. На молочному агарі, за шириною зони розчинення казеїну [Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхардта и др.; [пер. с англ. Е.Н. Кондратьевой и Л.В. Калакуцкого]: в 3 т. - М.: Мир, 1983-1984. - Т. 3. - 1984. - 264 с.], визначено казеїназну активність штаму L. rhamnosus, яка становить 9,0±2,0 мм. Приклад 1. Отримання лабораторної закваски L. rhamnosus. 3 У 100 см 10 %-ного стерильного знежиреного молока вносять 3 % чистої культури L. rhamnosus та культивують за температури 32-34 °C до утворення згустка, після чого охолоджують і використовують для приготування лабораторної або виробничої закваски. 7 3 Кількість життєздатних клітин L. rhamnosus у заквасці складає 8,610 КУО/см , титровна кислотність 64°Т, рН - 4,64. Приклад 2. Отримання бактеріального концентрату із сухого штаму L. rhamnosus. 3 - 1 пасаж: Вміст ампули з культурою L. rhamnosus розчиняють в (3,0±0,5) см фізіологічного 3 розчину з температурою (32,0±1,0)°С. Цією кількістю культури інокулюють 20 см поживного середовища МРС. Культивують упродовж (24±2) год. за температури (32,0±1,0)°С - 2 пасаж: Одержану первинну культуру контролюють на присутність сторонніх мікроорганізмів. Посівна доза для приготування вторинної культури складає 10 %. Посіви інкубують за температури (32,0±1)°С протягом (21±3) годин. - 3 пасаж: одержану біомасу в кількості до 10 % об'єму вносять у середовище наступного 3 складу. У 70 дм водопровідної води відновлюють 800 г сухого знежиреного молока, вносять 320 г пептону, 250 г лимоннокислого натрію, 150 г оцтовокислого натрію, 16 г MgSO 4, 25 г 3 MnSO4, 500 г лактози, 450 г дріжджового екстракту 70 см твін-80. Після розчинення в середовищі встановлюють рН 8,3 шляхом додавання 40 %-ного розчину гідроксиду натрію, стерилізують за 121 °C протягом 30 хвилин і охолоджують до температури 55 °C. 3 Окремо готують і вносять до основи стерильні розчини: 700 г глюкози, розчиненої в 2 дм 3 дистильованої води, 35 г аскорбінової кислоти - у 400 см води, стерилізовані за 105 °C протягом 15 хвилин. Після внесення всіх компонентів активна кислотність середовища повинна 3 бути на рівні рН 6,3±2. У підготовлене середовище вносять по (7,0-8,0) дм закваски L. 8 3 rhamnosus з концентрацією клітин не менше 10 КУО/см . Нагромадження бактеріальної маси проводять за (35-37)°С протягом 12 годин з періодичною нейтралізацією середовища 25 %-ним водним розчином аміаку до активної кислотності рН 6,5. Після закінчення процесу культуральну рідину охолоджують до 15 °C, нейтралізують до рН 6,8 і відділяють біомасу на суперцентрифузі за 15000 об/хв. Одержану біомасу змішують у співвідношенні 1:2 із стерильним захисним середовищем - сахарозо-желатинове середовище із 2 UA 109098 C2 5 знежиреним молоком. Суспензію клітин розливають в стерильні кювети шаром не більше 6 мм. Сушіння здійснюють за наступних режимів: початкова температура мінус (40±1)°С, кінцева 2 плюс (30±2)°С, залишковий тиск не більше 6,65 Па (0,679 кгс/м ). Тривалість сушіння - (30-34) год. Чисельність життєздатних клітин молочнокислих бактерій у 1 г сухого бактеріального 10 концентрату становить 2,310 КУО. Запропонований штам Lactobacillus rhamnosus IMB В-7379 рекомендується для виробництва функціональних добавок для профілактики і лікування дисбактеріозів, шлунково-кишкових захворювань та нормалізації мікробіоценозу сільськогосподарських тварин та птиці. Таблиця 1 Антагоністична активність штаму Lactobacillus rhamnosus S. aureus 209 МКБ L. rhamnosus P. vulgaris E. coli 0111 ГІСК 160209 16 20 E. coli 113 20 10 P. E. aeruginosa enterocolitica ATCC 27853 10 0 10 Таблиця 2 Антибіотикостійкість штаму Lactobacillus rhamnosus Антибіотики Група цефалоспоринів Цефтриаксон Цефазолін Цефтнофур Цефепим Цефамексин Цефоперазон Ряд фторхінолів Цепрофлоксацин Офлоксацин Група нітрофуранів Фурадонін Підклас азалідів Азитроміцин Еритроміцин 16 0 0 0 0 20 15 13 8 Стійкість до антибіотика Група аміноглікозидів Група тетрациклінів Гентаміцин 12 Доксициклін 14 Стрептоміцин 14 Тетрациклін 14 Амікацин 10 Неоміцин 8 Канаміцин 7 Група пеніцилінів Амоксицилін 10 Ампіцилін 12 Група карбапенемів Меропенем 14 Протигрибкові засоби 20 27 0 Група агзаміцинів Рифампіцин 25 Група хлорамфеніколу Левоміцетин 20 Ряд лінкозаміни Лінкоміцин 25 Клинзаміцин 24 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 Штам Lactobacillus rhamnosus IMB B-7379 для виробництва функціональних добавок для профілактики і лікування дисбактеріозів, шлунково-кишкових захворювань та нормалізації мікробіоценозу сільськогосподарських тварин та птиці. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3