Протимікробна композиція на основі штамів lactobacillus rhamnosus, lactobacillus paracasei

Реферат: Винахід стосується протимікробної композиції, яка включає штам Lactobacillus rhamnosus і/або штам Lactobacillus paracasei; застосування такої протимікробної композиції; харчового продукту, корму і фармацевтичного продукту, які включають таку протимікробну композицію; способу отримання такого харчового продукту, корму і фармацевтичного продукту. Винахід також стосується штамів Lactobacillus rhamnosus CHCC12697, депонованого під номером DSM24616, Lactobacillus rhamnosus CHCC14226, депонованого під номером DSM24652, і Lactobacillus paracasei CHCC12777, депонованого під номером DSM24651, які є придатними для виготовлення вказаної протимікробної композиції. UA 113059 C2 (12) UA 113059 C2 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь винаходу Даний винахід стосується галузі біозахисту, зокрема, протимікробної композиції, яка включає штам Lactobacillus rhamnosus і/або штам Lactobacillus paracasei. Крім того, даний винахід стосується застосування такої протимікробної композиції, харчового продукту, корму і фармацевтичних продуктів, які включають таку протимікробну композицію, способу отримання такого харчового продукту, корму і фармацевтичних продуктів і способу зниження вмісту небажаних мікроорганізмів в такому харчовому продукті, кормі і фармацевтичних продуктах. Попередній рівень техніки Біозахисні культури застосовують як альтернативу хімічним консервантам в різних харчових продуктах. У молочних продуктах контамінація дріжджами і пліснявими грибами може обмежувати тривалість зберігання молочних продуктів. Продукти, в яких зустрічається значна проблема контамінації дріжджами і пліснявими грибами, включають свіжі сири. Для подолання цих проблем в молочній промисловості розроблені біозахисні розчини. Деякими з найвідоміших і, ймовірно, протигрибкових біозахисних розчинів, які найбільше застосовуються на ринку, є культури HOLDBAC™ YM-b і HOLDBAC™ YM-C від компанії Danisco, які містять комбінації підвидів Propionibacteria і Lactobacillus. Застосування пропіоновокислих бактерій разом з молочнокислими бактеріями для інгібування росту мікроорганізмів описане в патентних заявках США 2005/0095318 і WO 2004/041305. Вважається, що види propionibacteria сприяють протигрибковій дії, головним чином, за допомогою утворення пропіонової кислоти, а також і за допомогою утворення оцтової кислоти і інших метаболітів. Однак ці види є дорогими в промисловому масштабі, і отримання пропіонової кислоти може викликати небажані органолептичні властивості у отриманих молочних продуктів. Інші протигрибкові біозахисні розчини на ринку молочних продуктів включають Lyofast LPRA від SACCO, а також Aroma-Prox®RP80 від BIOPROX. Обидва з цих продуктів включають комбінації Lactobacillus plantarum і Lactobacillus rhamnosus. Tharmaraj і Shah (2009) описують скринінг кандидатів біозахисних молочнокислих бактерій для cheese-based dips. Всі штами Lactobacillus rhamnosus і Lactobacillus paracasei, тестовані окремо, виявили максимальну інгібуючу дію проти дріжджів і пліснявих грибів. Однак ніякі комбінації Lactobacillus rhamnosus і Lactobacillus paracasei не досліджували. Таким чином, існує промислова потреба в розробці поліпшених біозахисних розчинів, які не включають види propionibacteria без загрози зниження протигрибкової ефективності. Суть даного винаходу Автори даного винаходу ідентифікували нові штами молочнокислих бактерій, які ефективні в інгібуванні росту бактеріальних і грибкових мікроорганізмів, які, як відомо, зустрічаються у вигляді контамінант в молоці і молочних продуктах. Автори даного винаходу додатково виявили, що певна група молочнокислих бактерій при об'єднанні з іншою групою молочнокислих бактерій демонструє значний синергічний протимікробний ефект. Протимікробний ефект двох об'єднаних груп бактерій, на подив, більший суми індивідуальних ефектів двох груп бактерій. Таким чином, перший аспект даного винаходу стосується протимікробної композиції, яка включає щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus і щонайменше один штам Lactobacillus paracasei. У переважному варіанті здійснення, вказана протимікробна композиція включає: (a) щонайменше один штам Lactobacillus, вибраний з групи, яка складається з Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 і Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 і їх мутантів, і (b) щонайменше один штам Lactobacillus paracasei, вибраний з групи, яка складається з Lactobacillus paracasei CHCC12777 і його мутантного штаму. У іншому переважному варіанті здійснення даний винахід описує протимікробну композицію, яка включає щонайменше один штам, вибраний з групи, яка складається з Lactobacillus rhamnosus штам CHCC12697, Lactobacillus rhamnosus штам CHCC14226, Lactobacillus paracasei штам CHCC12777 і їх мутантних штамів, де мутантні штами отримані із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. Композиції за даним винаходом забезпечують перевагу в тому, що може бути інгібований ріст небажаних мікроорганізмів, вибраних з грибів, бактерій і їх сумішей, наприклад, на харчовому продукті, кормі і фармацевтичних продуктах і у людей, і у тварин. Зокрема, передбачається запобігання і/або інгібування росту грибів, таких як дріжджі і плісняві гриби. Тому, в переважному варіанті здійснення, термін "протимікробний" необхідно розуміти як "протигрибковий". 1 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Тому другий аспект даного винаходу направлений на застосування однієї з протимікробних композицій першого аспекту для отримання харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту. Третій аспект стосується застосування однієї з протимікробних композицій першого аспекту для інгібування росту небажаних мікроорганізмів, вибраних з групи, яка складається з грибів, бактерій і їх сумішей. Зокрема, композиції за даним винаходом необхідно застосовувати для інгібування і/або запобігання росту грибів і бактерій, які є традиційно відомими контамінантами в процесах молочної промисловості, таких як процеси ферментації молока. Четвертий аспект стосується застосування однієї з протимікробних композицій першого аспекту як фармацевтичного продукту. Фармацевтичний продукт є переважним для застосування при лікуванні зараження об'єкта бактеріями або грибами, більш переважно, пліснявими грибами. П'ятий аспект стосується харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту, який включає одну з протимікробних композицій згідно з першим аспектом даного винаходу. Шостий аспект даного винаходу стосується способу отримання харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту згідно з п'ятим аспектом даного винаходу, способу, який включає додавання однієї з протимікробних композицій згідно з першим аспектом даного винаходу під час отримання харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту. Там, де спосіб включає додавання протимікробної композиції, яка включає штам Lactobacillus rhamnosus в комбінації зі штамом Lactobacillus paracasei, вказану композицію додають таким чином, щоб кожна з концентрацій щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і щонайменше одного 6 6 штаму Lactobacillus paracasei становила щонайменше 1×10 куо/г, переважно 5×10 куо/г, або 6 6 кожна становила щонайменше 1×10 куо/мл, переважно 5×10 куо/мл харчового продукту, корму 5 2 або фармацевтичного продукту, або кожна становила щонайменше 1×10 куо/см , переважно 7 2 1×10 куо/см поверхні харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту, і виробничі параметри контролюють під час отримання таким чином, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei збільшувалася або залишалася сталою. У сьомому аспекті даний винахід стосується Lactobacillus rhamnosus штаму CHCC12697, який депонували в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24616, або його мутантного штаму, де мутантний штам отриманий із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. У восьмому аспекті даний винахід стосується Lactobacillus rhamnosus штаму CHCC14226, який депонували в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24652, або його мутантного штаму, де мутантний штам отриманий із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. У дев'ятому аспекті даний винахід стосується Lactobacillus paracasei штаму CHCC12777, який депонували в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24651, або його мутантного штаму, де мутантний штам отриманий із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. Короткий опис креслень Фіг. 1 показує ріст дріжджів і пліснявих грибів в чашках з молоком, ферментованим тільки з однією стартовою культурою (контроль, перший стовпець), разом з Lb. rhamnosus CHCC12697 (другий стовпець), разом з Lb. paracasei CHCC12777 (третій стовпець) або разом з комбінацією Lb. rhamnosus CHCC12697 і Lb. paracasei CHCC12777 (четвертий стовпець). Цільові контамінанти додавали в концентраціях, вказаних в тексті зліва направо: K. marxianus, Р. fermentans, Y. lipolytica і С. sake, відповідно, у верхньому ряду чашок. На другому ряду чашок зверху додавали Р. nalgiovense, види Cladiosporium додавали нижче зліва і Р. commune додавали нижче праворуч. У останньому ряду чашок додавали тільки види Mucor. Чашки інкубували при 7±1ºС протягом 17 днів. Фіг. 2 показує підрахунок кількості клітин в ізоляті Yarrowia lipolytica, доданому до незбираного молока, інокульованого стартовою культурою CHN-19 окремо (залитий ромб) або разом з наступними штамами: HOLDBAC™ YM-B (незалитий квадрат), HOLDBAC™ YM-C (залитий ромб), Lb. paracasei CHCC12777 (залитий квадрат), Lb. rhamnosus CHCC12697 (залитий трикутник) або комбінаціяLb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC12697 (залите коло), всі з яких додавали перед ферментацією при 29±1ºС доти, поки значення pH не досягало 4,65±0,05. Фіг. 3 показує ріст дріжджів і пліснявих грибів на чашках з молоком, ферментованим зі стартовою культурою окремо (контроль, перший стовпець), разом з Lb. rhamnosus CHCC14226 (другий стовпець), разом з Lb. paracasei CHCC12777 (третій стовпець) або разом з комбінацією 2 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Lb. rhamnosus CHCC14226 і Lb. paracasei CHCC12777 (четвертий стовпець). Цільові контамінанти додавали в концентраціях, вказаних в тексті зліва направо: K. marxianus, Р. fermentans, Y. lipolytica і С. sake, відповідно, у верхньому ряді чашок. У нижньому ряді чашок зверху додавали Р. nalgiovense, види Cladiosporium додавали нижче зліва і Р. commune додавали нижче праворуч. Чашки інкубували при 7±1ºС протягом 15 днів. Фіг. 4 показує підрахунок кількості клітин в ізоляті Klyveromyces marxianus, доданому до незбираного молока, інокульованого стартовою культурою CHN-19 окремо (залитий ромб) або разом з наступними штамами: HOLDBAC™ YM-B (незалитий квадрат), HOLDBAC™ YM-C (залитий ромб), Lb. paracasei CHCC12777 (залитий квадрат), Lb. rhamnosus CHCC14226 (залитий трикутник) або комбінація Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 (залите коло), всі з яких додавали перед ферментацією при 29±1ºС доти, поки значення pH не досягало 4,65±0,05. Фіг. 5 показує ріст пліснявих грибів на чашках з молоком, ферментованим зі стартовою культурою окремо (контроль, перше зображення), разом з Lb. paracasei CHCC14676 (друге зображення), разом з Lb. rhamnosus CHCC5366 (третє зображення) або разом з комбінацією Lb. paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC5366 (четверте зображення). Цільові контамінанти додавали в концентраціях, вказаних в тексті з верхнього лівого кута до нижнього правого кута: Penicillium nalgiovese, Penicillium commune, Aspergillus versicolor і Penicillium crustosum, відповідно. Чашки інкубували при 7±1ºС протягом 12 днів. Фіг. 6 показує ріст пліснявих грибів на чашках з молоком, ферментованим тільки зі стартовою культурою (контроль, перше зображення) окремо, разом з Lb. paracasei CHCC14676 (друге зображення), разом з Lb. rhamnosus CHCC14226 (третє зображення) або разом з комбінацією Lb. paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC14226 (четверте зображення). Цільові контамінанти додавали в концентраціях, вказаних в тексті з верхнього лівого кута до нижнього правого кута: Penicillium nalgiovese, Penicillium commune, Aspergillus versicolor і Penicillium crustosum, відповідно. Чашки інкубували при 7±1ºС протягом 12 днів. Фіг. 7 показує ріст пліснявих грибів на чашках з молоком, ферментованим тільки зі стартовою культурою (контроль, перше зображення) окремо, разом з Lb. paracasei CHCC12777 (друге зображення), разом з Lb. rhamnosus CHCC14226 (третє зображення) або разом з комбінацією Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 (четверте зображення). Цільові контамінанти додавали в концентраціях, вказаних в тексті з верхнього лівого кута до нижнього правого кута: Penicillium nalgiovese, Penicillium commune, Aspergillus versicolor і Penicillium crustosum, відповідно. Чашки інкубували при 7±1ºС протягом 12 днів. Фіг. 8 показує результати дослідження на сметані за участю Lactobacillus paracasei CHCC12777. Продемонстровано, що Р. commune (M6), А. versicolor (M7), Р. brevicompactum (М1), Р. crustosum (М10) і Р. glabrum (M8) ростуть добре на сметані, отриманій з молока, ферментованого тільки зі стартовою культурою (верхній ряд) або зі стартовою культурою і культурою HOLDBAC™ YM-B (середній ряд). Навпаки, в присутності Lactobacillus paracasei CHCC12777 при ферментації молока (нижній ряд) інгібувався ріст всіх тестованих пліснявих грибів. Фіг. 9 показує дослідження на домашньому сирі за участю Lactobacillus rhamnosus CHCC12697. Продемонстровано, що види Mucor добре ростуть на домашньому сирі, отриманому з молока, ферментованого тільки зі стартовою культурою CHN-19 (Контроль). Плісняві гриби також добре ростуть на домашньому сирі, отриманому з молока, ферментованого зі стартовою культурою і культурою HOLDBAC™ YM-B, і в меншій мірі на домашньому сирі, отриманому з молока, ферментованого зі стартовою культурою і культурою HOLDBAC™ YM-C. Однак в присутності штаму CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus при ферментації молока спостерігається значно більш помітне інгібування росту видів Mucor. Фіг. 10 показує дослідження на йогурті за участю Lactobacillus rhamnosus CHCC14226. Р. brevicompactum (М1), Р. commune (M6), А. versicolor (M7) і Р. crustosum (M10) ростуть добре на йогурті, отриманому з молока, ферментованого тільки зі стартовою культурою YF-L901 (верхній ряд) або зі стартовою культурою і культурою HOLDBAC™ YM-B (середній ряд). Навпаки, в присутності Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 при ферментації молока (нижній ряд) інгібувався ріст всіх тестованих пліснявих грибів. Фіг. 11 показує кількісне визначення інгібуючої дії Lactobacillus paracasei CHCC12777 і Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 відносно K. lactis в домашньому сирі. Продемонстровано, що ріст K. lactis інгібувався в присутності штаму CHCC12777 Lactobacillus paracasei, і в присутності штаму CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus при інокуляції разом зі стартовою культурою CHN-19 перед ферментацією. Обидва штами, штам CHCC12777 Lactobacillus 3 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 paracasei і штам CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus, викликали значно більше інгібування, ніж комерційна культура HOLDBAC™ YM-B. Фіг. 12 показує кількісне визначення інгібуючої дії Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 відносно Debaromyces hansenii в йогурті. Ріст D. hansenii інгібувався в присутності штаму CHCC14226 Lactobacillus rhamnosus, при інокуляції разом зі стартовою культурою YF-L901 перед ферментацією. Штам надавав значно більшу інгібуючу дію, ніж комерційна культура HOLDBAC™ YM-B. Докладний опис даного винаходу Визначення Термін "молочнокисла бактерія" означає грампозитивну, мікроаерофільну або анаеробну бактерію, яка ферментує цукри з утворенням кислот, включаючи молочну кислоту як переважно утворювану кислоту. У промисловому відношенні найбільш корисні молочнокислі бактерії знаходяться в ряді "Lactobacillales", який включає види Lactococcus, види Streptococcus, види Lactobacillus, види Leuconostoc, види Pseudoleuconostoc, види Pediococcus, види Brevibacterium і види Enterococcus. Їх часто застосовують окремо як харчові культури або в комбінації з іншими молочнокислими бактеріями. Молочнокислі бактерії, включаючи бактерії видів Lactobacillus і Streptococcus thermophilus, звичайно постачаються в молочну промисловість або у вигляді заморожених культур, або у вигляді сублімованих культур для розмноження промислової закваски, або як так звані культури "Direct Vat Sat" (DVS), призначені для прямої інокуляції в посудину ферментації або чан для отримання молочного продукту, такого як ферментований молочний продукт або сир. Такі культури молочнокислих бактерій загалом називають "стартові культури" або "закваски". Термін "мезофіл" в даному описі стосується мікроорганізмів, які краще усього ростуть при помірних температурах (15ºС-40ºС). В промисловому відношенні найкорисніші мезофільні бактерії включають види Lactococcus і види Leuconostoc. Термін "мезофільна ферментація" в даному описі стосується ферментації при температурі між приблизно 22ºС і приблизно 35ºС. Термін "мезофільний ферментований молочний продукт" стосується ферментованих молочних продуктів, які отримуються мезофільною ферментацією мезофільної стартової культури, і включає такі ферментовані молочні продукти як пахта, кисле молоко, сквашене молоко, сметану, вершки і свіжий сир, такий як кварк, домашній сир і вершковий сир. Термін "термофіл" в даному описі стосується мікроорганізмів, які краще усього ростуть при температурах вищих 43ºС. У промисловому відношенні найкорисніші термофільні бактерії включають види Streptococcus і види Lactobacillus. Термін "термофільна ферментація" в даному описі стосується ферментації при температурі вище приблизно 35ºС, такої як від приблизно 35ºС до приблизно 45ºС. Термін "термофільний ферментований молочний продукт" стосується ферментованих молочних продуктів, які отримуються термофільною ферментацією термофільної стартової культури, і включає такі ферментовані молочні продукти як неперемішуваний йогурт, перемішуваний йогурт і питний йогурт. Термін "молоко" необхідно розуміти як молочну секрецію, яка отримується шляхом доїння будь-яких ссавців, таких як корови, вівці, кози, буйволи або верблюди. У переважному варіанті здійснення даного винаходу молоко є коров'ячим молоком. Термін молоко також включає білкові/жирові розчини, які отримуються з рослинних матеріалів, наприклад, соєве молоко. Термін "молочний субстрат" може означати будь-який сирий і/або перероблений молочний матеріал, який може бути підданий ферментації згідно зі способом за даним винаходом. Таким чином, корисні молочні субстрати включають, але не обмежені ними, розчини/суспензії будьяких молочних або молокоподібних продуктів, які містять білок, такі як незбиране або знежирене молоко, збиране молоко, пахта, відновлене з сухого молока, згущене молоко, сухе молоко, сироватка, сироватковий пермеат, лактоза, маточний розчин від перекристалізації лактози, концентрат сироваткового білка або крем. Очевидно, молочний субстрат може бути отриманий від будь-якого ссавця, наприклад, будучи істотно чистим молоком ссавця або відновленим з сухого молока. До ферментації молочний субстрат може бути гомогенізований і пастеризований згідно зі способами, відомими в галузі техніки. "Гомогенізація", як використовується в даному описі, означає інтенсивне змішування для отримання розчинної суспензії або емульсії. Якщо гомогенізація виконується до ферментації, вона може бути виконана так, щоб зруйнувати краплі молочного жиру до менших розмірів так, щоб він більше не відділявся від молока. Цього можна досягнути шляхом пропускання молока під високим тиском через невеликі отвори. "Пастеризація", як використовується в даному описі, означає обробку молочного субстрату для зниження кількості або видалення живих організмів, таких як мікроорганізми. Переважно, 4 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пастеризація досягається шляхом підтримання певної температури протягом певного періоду часу. Певна температура, як правило, досягається шляхом нагрівання. Температуру і тривалість можна вибирати так, щоб знищити або інактивувати конкретні бактерії, такі як шкідливі бактерії. Потім може йти стадія швидкого охолодження. "Ферментація" в способах за даним винаходом означає перетворення вуглеводів в спирти або кислоти під дією мікроорганізму. Переважно, ферментація за способами даного винаходу включає в себе перетворення лактози в молочну кислоту. Процеси ферментації, які застосовуються при отриманні молочних продуктів, відомі, і фахівець в галузі техніки знає як вибирати відповідні умови способу, такі як температура, вміст кисню, кількість і характеристики мікроорганізму(-ів) і тривалість. Очевидно, умови ферментації вибирають так, щоб підтримати досягнення даного винаходу, тобто щоб отримати молочний продукт в твердому вигляді (такому як сир) або рідкому вигляді (такому як ферментований молочний продукт). Термін "небажані мікроорганізми" в даному описі стосується мікроорганізмів, таких як бактерії і гриби, такі як дріжджі, які є патогенними і/або можуть погіршувати стан харчового продукту, корму або фармацевтичних продуктів. Терміни "інгібувати" і "бути інгібуючим" відносно небажаних мікроорганізмів означають, наприклад, що ріст або кількість або концентрація небажаних мікроорганізмів, наприклад, в продуктах харчування і/або на поверхні продуктів харчування, які включають протимікробну композицію, менші, ніж в продуктах харчування і/або на поверхні продуктів харчування, які не включають таку протимікробну композицію. У даному контексті термін "мутант" потрібно розуміти як штам, отриманий зі штаму за даним винаходом шляхом, наприклад, генної інженерії, опромінення і/або хімічної обробки. Переважно, щоб мутант був функціонально еквівалентним мутантом, наприклад, мутантом, який має по суті ті ж самі або поліпшені властивості (наприклад, відносно отримання діацетилу, в'язкості, жорсткості гелю, покриття ротової порожнини, аромату, постацидифікація, швидкість ацидифікації і/або живучість бактеріофагу) як материнський штам. Такий мутант є частиною даного винаходу. Зокрема, термін "мутант" стосується штаму, який отримується шляхом піддавання штаму за даним винаходом будь-якій мутагенній обробці, яка традиційно застосовується, включаючи обробку хімічним мутагеном, таким як етанметансульфонат (EMS) або N-метил-N'-нітро-N-нітрогуанідин (NTG), УФ світло, або до спонтанно виникаючого мутанта. Мутант може бути отриманий в результаті декількох мутагенних обробок (одиничну обробку потрібно вважати за одну стадію матагенізації з подальшою стадією скринінгу/відбору), але зараз вважається переважним, щоб проводилося не більше 20, або не більше 10, або не більше 5 обробок (або стадії скринінгу/відбору). У даному, в переважному мутанті менше 5 %, або менше 1 %, або навіть менше 0,1 % нуклеотидів в бактеріальному геномі зсунено іншим нуклеотидом або видалено в порівнянні з материнським штамом. Застосування термінів в однині в контексті опису даного винаходу (зокрема, в контексті формули винаходу) необхідно розглядати як такі, які охоплюють і однину, і множину, якщо не указано інакше в даному описі або немає чіткої суперечності з контекстом. Терміни "який включає", "який має" і "який містить" необхідно розглядати як такі, що означають "який включає", якщо не указано інакше. Перелік діапазонів значень в даному описі призначений для того, щоб служити коротким способом індивідуального звернення до кожного окремого значення, яке потрапляє в діапазон, якщо не указано інакше в даному описі, і кожне окреме значення включене в даний опис, так якби воно було індивідуально вказане в даному описі. Всі способи, описані в даному описі, можуть бути виконані в будь-якому відповідному порядку, якщо не указано інакше в даному описі або інакше чітко не суперечать контексту. Застосування будьякого і всіх прикладів або виразу, наприклад, "такий як", призначено для кращого висвітлення даного винаходу і не накладає обмеження на об'єм даного винаходу, якщо не заявлено інакше. Ніякі вирази в даному описі не повинні бути інтерпретовані як вказівка на який-небудь незаявлений елемент, що суттєво для практики даного винаходу. Здійснення і аспекти даного винаходу Автори винаходу провели широкий скринінг і дослідження для того, щоб описати протимікробну композицію, яка включає один або суміш двох різних штамів молочнокислих бактерій, ефективних проти небажаних мікроорганізмів, таких як плісняві гриби і дріжджі. Автори даного винаходу проскринували 200 кандидатів Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei і Lactobacillus rhamnosus для того, щоб знайти найефективніші одиночні штами або комбінації з двох штамів проти широкого діапазону мікроорганізмів, таких як дріжджі і плісняві гриби. 5 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Скринінги були виконані в модельному випробуванні, яке імітує в максимально можливій мірі мезофільні ферментовані молочні продукти в поживних середовищах на основі молока, до яких додавали відповідну стартову культуру з або без біозахисних кандидатів і які ферментували в умовах, відповідних мезофільним ферментованим молочним продуктам. З мезофільних ферментованих молочних продуктів виділяли цільові організми. Як очищені молочнокислі бактерії з культур HOLDBAC™ від Danisco А/S, Данія, так і повні культури HOLDBAC™ YM-B і HOLDBAC™ YM-C, які містять і молочнокислі бактерії, і пропіоновокислі бактерії, застосовували як контролі. Виявили, що сімнадцять кандидатів серед Lactobacillus paracasei і Lactobacillus rhamnosus в цілому інгібували 12 індикаторних грибів також добре або краще, ніж молочнокислі бактерії контролю при тестуванні при 25ºС. Таким чином, в першому аспекті даний винахід стосується протимікробної композиції, яка включає щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus або Lactobacillus paracasei. Дев'ять з ідентифікованих штамів-кандидатів також виявляли активність в тому ж самому діапазоні як і молочнокислі бактерії контролю при тестуванні в умовах охолоджування, і зокрема, три штами виявилися дуже ефективними: Lactobacillus paracasei CHCC12777 з номером доступу DSM24651, Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 з номером доступу DSM24616 і Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 з номером доступу DSM24652. Ці три штами були депоновані в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ). Ці окремі штами виявилися кращими або співставними по дії проти різних дріжджів при тестуванні в так званому пляшковому випробуванні в порівнянні з культурами HOLDBAC™. Таким чином, ці окремі штами є у високій мірі прийнятними для застосування як бактерицидних агентів. Таким чином, в переважному аспекті винахід описує протимікробну композицію, яка включає щонайменше один штам, вибраний з групи, яка складається з: Lactobacillus rhamnosus CHCC12697, який депонували в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24616, Lactobacillus rhamnosus CHCC14226, який депонували в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24652, Lactobacillus paracasei CHCC12777, який депонували в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24651, і їх мутантних штамів, де мутантні штами отримані із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. У окремому переважному варіанті здійснення протимікробна композиція за даним винаходом включає один з вищезгаданих штамів або його мутант у вигляді єдиного агента, який виявляє протимікробну активність. Крім трьох вказаних вище штамів, даний винахід також стосується мутантів, які походять від цих штамів, тобто їх отримують із застосуванням одного з депонованих штамів CHCC12777, CHCC12697 або CHCC14226 як вихідного матеріалу. Мутантний штам може бути отриманий з одного з цих штамів, наприклад, шляхом генної інженерії, опромінення, УФ світла, хімічної обробки і/або способами, які викликають зміни в геномі. Мутант за даним винаходом інгібує і/або запобігає росту певних бактерій або грибів, переважно пліснявих грибів. Переважно, щоб мутант мав істотну щонайменше 80 % або більше, щонайменше 90 % або більше, щонайменше 95 % або більше, або навіть аж до 100 % або більше протимікробну дію, наприклад, протигрибкову дію в порівнянні зі своїм материнським штамом при визначенні, наприклад, у випробуванні, як описано в прикладі 2, із застосуванням одних з дріжджів K. marxianus, Р. fermentas, Y. lipolytica або С. sake як контамінанту. Інгібуюча дія цих штамів відносно небажаних мікроорганізмів може бути визначена при зберіганні бутлів при відповідній температурі протягом відповідного часу зберігання, як описано в прикладах нижче. Загалом, відповідна температура, при якій потрібно здійснювати цей спосіб, залежить від температури, при якій, як правило, конкретний харчовий продукт, корм або фармацевтичний продукт зберігають і/або виробляють. Температури, при яких звичайно зберігають бутлі, становлять між 5ºС і 26ºС, переважно температура становить приблизно 8ºС. Тривалість зберігання при певній температурі залежить від часу, протягом якого, як правило, зберігають харчовий продукт, корм або фармацевтичний продукт (термін придатності). Тривалість зберігання звичайно становить 7-28 днів, переважно тривалість зберігання становить приблизно 21 день. При тестуванні комбінацій з 2 штамів несподівано виявили, що комбінації з найбільш ефективних окремих штамів були навіть більш ефективні, ніж будь-який зі штамів окремо, навіть коли загальні концентрації клітин, які додаються, були однакові в тестах окремих штамів і 6 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 комбінацій з 2 штамів. Комбінації Lactobacillus paracasei CHCC12777 і Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 або Lactobacillus paracasei CHCC12777 і Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 виявляли більшу ефективність, ніж контрольні культури HOLDBAC™ YM-B і HOLDBAC™ YM-C від Danisco, Данія. Відповідно, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується протимікробної композиції, яка включає щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus і щонайменше один штам Lactobacillus paracasei, в якій щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus вибраний з групи, яка складається з Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 з номером DSM24616, Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 з номером DSM24652 і їх мутантних штамів, де мутантні штами отримані із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. У іншому переважному варіанті здійснення щонайменше один штам Lactobacillus paracasei вибраний з групи, яка складається з Lactobacillus paracasei CHCC12777 з номером DSM24651 і його мутантних штамів, де мутантні штами отримані із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. У додаткових варіантах здійснення даний винахід стосується протимікробних, і більш переважний, протигрибкових композицій, включаючи щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus і щонайменше один штам Lactobacillus paracasei, в яких щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus вибраний з групи, яка складається з Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 з номером DSM24616, Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 з номером DSM24652 і їх мутантних штамів, де мутантні штами отримані із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу; і щонайменше один штам Lactobacillus paracasei вибраний з групи, яка складається з Lactobacillus paracasei CHCC12777 з номером DSM24651 і його мутантних штамів, де мутантні штами отримані із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. Протимікробна композиція, яка включає щонайменше Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 і Lactobacillus paracasei CHCC12777, є переважною. Аналогічно, протимікробна композиція, яка включає щонайменше Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 і Lactobacillus paracasei CHCC12777, є переважною згідно з даним винаходом. Протимікробна композиція, як правило, включає бактерії в концентрованій формі, включаючи заморожені, висушені або сублімовані концентрати, як правило, з концентрацією 4 12 життєздатних клітин в діапазоні 10 -10 куо (колонієутворювальних одиниць) на грам 4 5 композиції, включаючи щонайменше 10 куо на грам композиції, як, наприклад, щонайменше 10 6 7 куо/г, наприклад, щонайменше 10 куо/г, як, наприклад, щонайменше 10 куо/г, наприклад, 8 9 10 щонайменше 10 куо/г, як, наприклад, щонайменше 10 куо/г, наприклад, щонайменше 10 11 куо/г, як, наприклад, щонайменше 10 куо/г. Таким чином, протимікробна композиція за даним винаходом переважно знаходиться в замороженій, висушеній або сублімованій формі, наприклад, такій як культура Direct Vat Set (DVS). Однак, як використовується в даному описі, протимікробна композиція може також являти собою рідину, отриману після суспендування заморожених, висушених або сублімованих концентратів клітин в рідкому середовищі, такому як вода або фосфатно-сольовий буфер. Де протимікробна композиція за даним винаходом являє 4 12 собою суспензію, концентрація життєздатних клітин знаходиться в діапазоні 10 -10 куо 4 (колонієутворювальних одиниць) на мл композиції, включаючи щонайменше 10 куо на мл 5 6 композиції, як, наприклад, щонайменше 10 куо/мл, наприклад, щонайменше 10 куо/мл, як, 7 8 наприклад, щонайменше 10 куо/мл, наприклад, щонайменше 10 куо/мл, як, наприклад, 9 10 11 щонайменше 10 куо/мл, наприклад, щонайменше 10 куо/мл, як, наприклад, щонайменше 10 куо/мл. Композиція може додатково містити як додаткові компоненти кріопротектори і/або традиційні добавки, включаючи поживні речовини, такі як дріжджові екстракти, цукор і вітаміни, наприклад, вітамін А, С, D, K або вітаміни з сімейства вітаміну В. Прийнятні кріопротектори, які можуть бути додані до композицій за даним винаходом, є компонентами, які поліпшують стійкість мікроорганізмів до холоду, такими як манітол, сорбіт, триполіфосфат натрію, ксиліт, гліцерин, рафіноза, мальтодекстрин, еритрит, треїтол, трегалоза, глюкоза і фруктоза. Інші добавки можуть включати, наприклад, вуглеводи, ароматизатори, мінерали, ферменти (наприклад, ренін, лактаза і/або фосфоліпаза). У протимікробних композиціях за даним винаходом, які включають штам Lactobacillus rhamnosus і штам Lactobacillus paracasei, співвідношення між штамом Lactobacillus rhamnosus і штамом Lactobacillus paracasei, наприклад, співвідношення між концентрацією або кількістю бактерій Lactobacillus rhamnosus і концентрацією або кількістю бактерій Lactobacillus paracasei, переважно, складає від 1:100 до 100:1, переважно, від 1:10 до 10:1. 7 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Протимікробна композиція за даним винаходом може бути використана в будь-якому харчовому продукті, кормі і фармацевтичному продукті, який схильний до мікробного розкладання і/або контамінації дріжджами і пліснявими грибами. Вони включають, але не обмежені ними, плоди і овочі, включаючи похідні продукти, зерно і продукти, які отримуються із зерна, молочні продукти, м'ясо, домашню птицю і морепродукти. У особливо переважних варіантах здійснення композицію застосовують до молочних продуктів і/або м'яса і домашньої птиці. У переважному варіанті здійснення композиції за даним винаходом призначені для застосування як добавки при отриманні молочних продуктів, таких як йогурт, домашній сир, сметана, кварк і т. п. Протимікробна композиція згідно з даним винаходом також може застосовуватися для інгібування росту небажаних мікроорганізмів, вибраних з групи, яка складається з грибів і бактерій і їх сумішей. Композиції за даним винаходом особливо корисні для інгібування і/або запобігання росту грибів і бактерій, які є традиційно відомими контамінантами в процесах молочної промисловості, таких як процес ферментації молока. У переважному варіанті здійснення протимікробні композиції за даним винаходом застосовують проти грибів, таких як дріжджі і плісняві гриби. Це означає, що композиції застосовують для інгібування і/або запобігання росту грибів, які викликають контамінацію в процесах молочної промисловості, зокрема, в процесі ферментації молока. Протимікробні композиції за даним винаходом можуть застосовуватися, наприклад, для інгібування і/або запобігання росту дріжджів, таких як дріжджі родів Klyveromyces (наприклад, K. marxianus, K. lactis), Pichia (наприклад, Р. fermentans), Yarrowia (наприклад, Y. lipolytica), Candida (наприклад, С. sake) і т. п.; або пліснявих грибів, таких як плісняві гриби з роду Penicillium (наприклад, Р. nalgiovense, Р. commune, Р. crustosum, Р. brevicompactum, Р. glabrum), види Mucor, види Cladiosporium, Aspergillus (наприклад, А. versicolor), Debaromyces (наприклад, D. hansenii) і т. п. Особливо переважне застосування протимікробних композицій за даним винаходом для інгібування і/або запобігання росту видів Klyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica, Penicillium nalgiovense, видів Cladiosporium, Penicillium commune, видів Mucor, Penicillium brevicompactum, Aspergillus versicolor, Penicillium crustosum, Kluyveromyces lactis і/або Debaromyces hansenii. Протимікробна композиція за першим аспектом даного винаходу також може застосовуватися як фармацевтичний продукт для лікування інфекцій патогенними грибами, переважно, патогенними дріжджами. Як указано вище, даний винахід в одному аспекті стосується харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту, який включає протимікробні композиції за першим аспектом даного винаходу. У переважному варіанті здійснення даного винаходу такий харчовий продукт вибраний з групи, яка складається з фруктів, і продуктів, які отримуються з фруктів, овочів і продуктів, які отримуються з овочів, зерна і продуктів, які отримуються із зерна, молочних продуктів, м'яса, домашньої птиці і морепродуктів і їх сумішей. У більш переважному варіанті здійснення даного винаходу харчовий продукт є молочним продуктом, переважно мезофільним або термофільним ферментованим молочним продуктом, таким як кварк, йогурт, сметана або домашній сир. У іншому переважному варіанті здійснення даного винаходу харчовий продукт є м'ясом або домашньою птицею. У переважному варіанті здійснення даного винаходу фармацевтичний продукт є продуктом, корисним для введення протимікробної композиції згідно з першим аспектом даного винаходу людині або тварині для інгібування патогенних мікроорганізмів і полегшення симптомів, пов'язаних з патогенними мікроорганізмами. Приклади таких симптомів включають симптоми, пов'язані з дріжджовою інфекцією. У такому варіанті здійснення даного винаходу фармацевтичний продукт може являти собою одиничну лікарську форму, яка включає протимікробну композицію. Переважно, одинична лікарська форма являє собою капсулу або таблетку. Однак одинична лікарська форма також може бути прийнятною для застосування до слизової оболонки або шкіри і, таким чином, бути в формі пасти, крему, мазі і т. п. Інший аспект даного винаходу стосується способу отримання харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту згідно з п'ятим аспектом даного винаходу, який включає додавання протимікробної композиції згідно з першим аспектом даного винаходу під час отримання харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту. У переважному варіанті здійснення даного винаходу концентрація щонайменше одного 6 штаму Lactobacillus rhamnosus або Lactobacillus paracasei складає щонайменше 1×10 куо/г, 6 8 6 переважно 5×10 куо/г, найбільш переважно щонайменше 1×10 куо/г або щонайменше 1×10 6 8 куо/мл, переважно щонайменше 5×10 , найбільш переважно щонайменше 1×10 куо/мл 8 UA 113059 C2 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2 харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту або щонайменше 1×10 куо/см , 5 2 7 2 переважно щонайменше 1×10 куо/см , найбільш переважно щонайменше 1×10 куо/см поверхні харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту. Там, де харчовий продукт, корм або фармацевтичний продукт отримують шляхом додаванням композиції, яка включає щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus і щонайменше один штам Lactobacillus paracasei, кожна з концентрацій щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei становить 6 6 щонайменше 1×10 куо/г або щонайменше 1×10 куо/мл харчового продукту, корму або 5 2 фармацевтичного продукту або щонайменше 1×10 куо/см поверхні харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту. Переважно, кожна з концентрацій щонайменше одного штаму 6 Lactobacillus rhamnosus і щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei становить 5×10 6 куо/г, щонайменше 5×10 куо/мл харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту або 5 2 щонайменше 5×10 куо/см поверхні харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту. У додатковому варіанті здійснення даного винаходу кожна з концентрацій щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei становить 8 8 щонайменше 1×10 куо/г або щонайменше 1×10 куо/мл харчового продукту, корму або 7 2 фармацевтичного продукту або щонайменше 1×10 куо/см поверхні харчового продукту, корму або фармацевтичного продукту. У переважному варіанті здійснення даного винаходу параметри отримання контролюються під час отримання таким чином, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei збільшувалася або залишалася сталою. Протимікробну композицію за даним винаходом найбільш легко застосовувати шляхом змішування і/або нанесення на змішуваний харчовий продукт, корм або фармацевтичний продукт, але вона також повинна бути ефективна для обробки поверхні твердих харчових продуктів або внутрішньої частини таких продуктів, наприклад, шляхом ін'єкції. У все ще інших варіантах здійснення композиція може застосовуватися як маринад, панірування, приправа при в'ялінні, глазур, пігментна суміш і т. п., при цьому ключовим критерієм є те, що протимікробна композиція доступна на поверхні, яка піддається бактеріальному розкладанню і контамінації дріжджами і пліснявими грибами. У все ще інших варіантах здійснення даного винаходу композиція може бути приведена в контакт з поверхнею харчового продукту побічно, шляхом застосування композиції до упаковки харчових продуктів з подальшим застосуванням упаковки до поверхні харчового продукту. Оптимальна кількість для застосування залежить від складу конкретного оброблюваного харчового продукту і способу застосування композиції до поверхні харчового продукту, але може бути визначена простим експериментуванням. У більш переважному варіанті здійснення даного винаходу спосіб включає одну або більше стадій ферментації, і протимікробна композиція може бути додана в харчовий продукт, корм або фармацевтичний продукт до, під час або після такої однієї або більше стадій ферментації. У ще більш переважному варіанті здійснення даного винаходу спосіб включає ферментацію молочного субстрату зі стартовою культурою, яка включає щонайменше один штам з родів, вибраних з Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus і Leuconostoc, такий як щонайменше один штам Lactobacillus bulgaricus і щонайменше один штам Streptococcus thermophiles або такий як щонайменше один штам Lactococcus lactis підвиду lactis, щонайменше один штам Leuconostoc mesenteroides підвиду cremoris і щонайменше один штам Lactococcus lactis підвиду diacetylactis. Останні аспекти даного винаходу стосуються штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC12697, який депонували в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24616, або його мутантного штаму, штаму Lactobacillus rhamnosus CHCC14226, який депонували в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24652, або його мутантного штаму і штаму Lactobacillus paracasei CHCC12777, який депонували в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24651, або його мутантного штаму, де мутантні штами отримані із застосуванням депонованих штамів як вихідного матеріалу. Фахівцям в галузі техніки зрозуміло, що із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу, фахівець шляхом звичайного мутагенезу або техніки повторного виділення може рутинним чином отримати додаткові мутанти або їх похідні, які зберігають приведені в даному описі відповідні властивості і переваги. Відповідно, термін "їх мутант" в першому аспекті стосується мутантних штамів, які отримуються із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. Варіанти здійснення даного винаходу описані нижче за допомогою необмежувальних прикладів. 9 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклади Приклад 1: напівкількісні визначення інгібуючої дії Lb. Paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC12697 окремо і в комбінації проти різних дріжджів і пліснявих грибкових контамінант Для напівкількісних вимірювань інгібуючої дії Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC12697, як окремо, так і в комбінації, проводили випробування на агарі, відтворюючи виробничий спосіб і отримання свіжого сиру: Незбиране (3,5 % мас./об.) гомогенізоване молоко пастеризували при 79±1ºС протягом 20 секунд і негайно охолоджували. Комерційну стартову культуру (F-DVS CHN-19 виробництва Chr. Hansen А/S, Данія) інокулювали при 0,1 u/л, і інокульоване молоко розподіляли по бутлях об'ємом 220 мл. Різні бутлі інокульовані з Lb. paracasei CHCC12777 і/або Lb. rhamnosus 6 CHCC12697 в загальних концентраціях 5×10 куо/мл, і один бутель слугував контролем і був інокульований тільки стартовою культурою. Крім того, 5 % рН-індикатор з бромкрезолу фіолетового і бромкрезолу зеленого додавали для отримання показника швидкості окислення і отримання синього/зеленого кольору поживних середовищ, що дозволяло легше виявляти подальший ріст цільових дріжджів і пліснявих грибів. Всі бутлі інкубували на водяній бані при 29±1ºС і ферментували в цих умовах доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,1. Після ферментації бутлі відразу ж охолоджували на льоду і енергійно збовтували, щоб зруйнувати коагулят. Потім ферментоване молоко нагрівали до температури 40ºС і додавали до 40 мл 5 %ого стерильного розчину агару, розплавленого і охолодженого до 60ºС. Цей розчин ферментованого молока і агару потім заливали в стерильні чашки Петрі, і чашки висушували на лабораторному столі з ламінарним повітропотоком протягом 30 хвилин. 4 3 2 Відібрані дріжджі і плісняві гриби наносили краплями в концентраціях 10 , 10 і 10 куо/крапля, відповідно, для дріжджів Klyveromyces marxianus, Pichia fermentans, Yarrowia lipolytica і Candida sake. Повністю пророслі суспензії спор розбавлені в 1000, 100, 10 разів або застосовували нерозведені для пліснявих грибів Penicillium nalgiovense, видів Mucor, Penicillium commune і видів Cladiosporium, відповідно. Чашки інкубували при 7±1ºС і регулярно обстежували на предмет на росту дріжджів і пліснявих грибів. Результати аналізу на агарі, подані на Фіг. 1, показують, що всі тестовані дріжджі і плісняві гриби росли дуже добре в чашках з агаром, отриманим з молока, ферментованого тільки зі стартовою культурою (контроль). Однак, коли під час ферментації молока були присутні Lb. paracasei CHCC12777 або Lb. rhamnosus CHCC12697, отримувані чашки з агаром запобігали росту K. marxianus і Y. lipolytica, доданих у всіх концентраціях. Крім того, значне інгібування спостерігали для всіх пліснявих грибів, нанесених краплями на чашки, коли Lb. paracasei CHCC12777 або Lb. Rhamnosus CHCC12697 були присутні під час ферментації молока. Ні у випадку, коли додавали Lb. paracasei CHCC12777, ні у випадку, коли додавали Lb. rhamnosus CHCC12697 як єдиний штам, вони не надавали якої-небудь інгібуючої дії на Р. fermentans або штами С. sake. Однак, коли Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC12697 обидва були присутні під час ферментації молока, інгібування росту Р. fermentans спостерігали при його 2 3 нанесенні краплями в низьких концентраціях 10 і 10 куо/краплю, і плісняві гриби видів Cladiosporium, а також видів Mucor, інгібувались більше, ніж тоді, коли додавали тільки якийнебудь один з штамів Lb. paracasei CHCC12777 або Lb. rhamnosus CHCC12697. Ці результати ілюструють деяку синергічну протигрибкову дію двох штамів Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC12697. Приклад 2: Кількісні визначення інгібуючої дії Lb. Paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC12697 проти Yarrowia lipolytica окремо і в комбінації Для кількісного аналізу інгібуючої дії Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC12697 окремо і в комбінації проводили аналіз, який відтворює виробничий спосіб і отримання свіжого сиру: Незбиране (3,5 % мас./об.) гомогенізоване молоко пастеризували при 79±1ºС протягом 20 секунд і негайно охолоджували. Комерційну стартову культуру (F-DVS CHN-19 виробництва Chr. Hansen А/S, Данія) інокулювали з 0,1 u/л, і інокульоване молоко розподіляли по бутлях об'ємом 1 л. Різні бутлі інокулювали з Lb. paracasei CHCC12777 і/або Lb. rhamnosus CHCC12697 в 6 загальних концентраціях 5×10 куо/мл, і один бутель слугував контролем і був інокульований тільки стартовою культурою. Крім того, 2 бутлі інокулювали або HOLDBAC™ YM-B (50DCU/100L; Danisco А/S, Данія), або HOLDBAC™ YM-C (20 DCU/100L; Danisco А/S, Данія) разом зі стартовою культурою CHN-19. Всі бутлі інкубували на водяній бані при 29±1ºС і ферментували в цих умовах доти, поки значення pH не досягало 4,65±0,05. Після ферментації бутлі негайно охолоджували на льоду і енергійно збовтували, щоб зруйнувати коагулят. Вміст кожного бутля розподіляли по дрібніших пластмасових чашках для інокуляції штамом дріжджів Yarrowia lipolytica, раніше ізольованих як контамінанти зі свіжого сирного продукту. Дві 10 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 окремі чаші інокулювали об'ємом 1 % (об./мас.) для досягнення підсумкового рівня контамінації 2 Y. lipolytica в ферментованому молочному продукті приблизно 1×10 куо/м. Пластмасові чаші запечатували і зберігали при 8±1ºС. Проби ферментованих молочних продуктів регулярно відбирали для визначення рівня контамінації Y. lipolytica шляхом посіву в чашки відповідних 10кратних розведень, отриманих в сольовому пептоні, на Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC) агарі з подальшою аеробною інкубацією протягом 5 днів при 25ºС. Крім того, pH різних зразків ферментованого молока регулярно вимірювали протягом зберігання. Як проілюстровано на Фіг. 2, ріст Y. lipolytica інгібувався в присутності обох штамів Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC12697 при їх застосуванні як єдиного штаму разом зі стартовою культурою CHN-19 перед ферментацією. Обидва штами викликали значно більш сильне інгібування, ніж HOLDBAC™ YM-B і HOLDBAC™ YM-C. Крім того, синергічна інгібуюча дія була виявлена при застосуванні Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC12697 в комбінації в порівнянні з інгібуючою дією кожного штаму, застосованого окремо. При застосуванні в комбінації, штами Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC12697 різко впливали як на тривалість лаг-фази, так і на максимальну кількість клітин, отриману для Y. lipolytica в ферментованому молочному продукті, і цей синергічний ефект може сприяти продовженню терміну зберігання для подібних продуктів. Приклад 3: Напівкількісні визначення інгібуючої дії Lb. Paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 окремо і в комбінації проти різних дріжджів і пліснявих контамінант Для напівкількісного аналізу інгібуючої дії Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 окремо і в комбінації проводили випробування на агарі, яке відтворює виробничий спосіб і отримання свіжого сиру: Незбиране (3,5 % мас./об.) гомогенізоване молоко пастеризували при 79±1ºС протягом 20 секунд і негайно охолоджували. Комерційну стартову культуру (F-DVS CHN-19) інокулювали за допомогою 0,1 u/л, і інокульоване молоко розподіляли по бутлях об'ємом 220 мл. Різні бутлі інокулювали з Lb. paracasei CHCC12777 і/або Lb. rhamnosus CHCC14226 в загальних 6 концентраціях 5×10 куо/мл, і один бутель слугував контролем і був інокульований тільки стартовою культурою. Крім того, додавали 5 % рН-індикатор з бромкрезолу фіолетового і бромкрезолу зеленого для отримання індикації швидкості окислення і отримання синього/зеленого кольору поживних середовищ, що дозволяє легко виявляти подальший ріст цільових дріжджів і пліснявих грибів. Всі бутлі інкубували на водяній бані при 29±1ºС і ферментували в цих умовах доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,1. Після ферментації бутлі негайно охолоджували на льоду і енергійно збовтували, щоб зруйнувати коагулят. Потім ферментоване молоко нагрівали до температури 40ºС і додавали до 40 мл 5 %-ого стерильного розчину агару, розплавленого і охолодженого до 60ºС. Цей розчин ферментованого молока і агару потім заливали в стерильні чашки Петрі, і чашки висушували на лабораторному столі з ламінарним повітропотоком протягом 30 хвилин. 4 3 2 Відібрані дріжджі і плісняві гриби, нанесені по краплях з концентраціями 10 , 10 і 10 куо/крапля, відповідно, для дріжджів Klyveromyces marxianus, Pichia fermentans, Yarrowia lipolytica і Candida sake. Повністю пророслі суспензії спор розбавляли в 1000, 100, 10 разів або застосовували нерозведеними для пліснявих грибів Penicillium nalgiovense, видів Mucor, Penicillium commune і видів Cladiosporium, відповідно. Чашки інкубували при 7±1ºС і регулярно обстежували на предмет росту дріжджів і пліснявих грибів. Результати випробування на агарі, подані на Фіг. 3, показують що всі тестовані дріжджі і плісняві гриби росли дуже добре на агарових пластинках, отриманих з молока, ферментованого тільки зі стартовою культурою (контроль). Однак, коли під час ферментації молока був присутнім Lb. paracasei CHCC12777, отримані пластинки запобігали росту K. marxianus і Y. lipolytica, доданих у всіх концентраціях. Для Lb. rhamnosus CHCC14226, отримані пластинки також запобігали росту K. marxianus, доданого у всіх концентраціях, а також Y. lipolytica, доданого в двох найнижчих концентраціях. Коли Lb. paracasei CHCC12777 або Lb. rhamnosus CHCC14226 додавали як єдиний штам, вони також, здавалося, викликали невелику інгібуючу дію на Р. fermentans, доданий в найнижчих концентраціях. Однак, коли Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 обидва були присутні під час ферментації молока, ріст 2 Р. fermentans запобігався при його додаванні в найнижчій концентрації 10 куо/крапля. Для пліснявих грибів значне інгібування спостерігали тоді, коли Lb. paracasei CHCC12777 або Lb. rhamnosus CHCC14226 був присутнім під час ферментації молока. При застосуванні комбінації Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 ріст видів Cladiosporium інгібувався більше, ніж тоді, коли один зі штамів Lb. paracasei CHCC12777 або Lb. rhamnosus CHCC14226 додавали окремо. Ці результати ілюструють деяку синергічну протигрибкову дію двох штамів Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226. 11 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 4: Кількісні визначення інгібуючої дії Lb. Paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 окремо і в комбінації проти Klyveromyces marxianus Для аналізу інгібуючої дії Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 окремо і в комбінації проводили аналіз, який відтворює виробничий спосіб і отримання свіжого сиру: Незбиране (3,5 % мас./об.) гомогенізоване молоко пастеризували при 79±1ºС протягом 20 секунд і негайно охолоджували. Комерційну стартову культуру (F-DVS CHN-19) інокулювали з 0,1 u/л, і інокульоване молоко розподіляли по бутлях об'ємом 1 л. Різні бутлі інокулювали з Lb. 6 paracasei CHCC12777 і/або Lb. rhamnosus CHCC14226 в загальних концентраціях 5×10 куо/мл, і один бутель слугував контролем і був інокульований тільки стартовою культурою. Крім того, 2 бутлі інокулювали або з HOLDBAC™ YM-B (50DCU/100L) або з HOLDBAC™ YM-C (20 DCU/100L) разом з стартовою культурою CHN-19. Всі бутлі інкубували на водяній бані при 29±1ºС і ферментували в цих умовах доти, поки значення pH не досягало 4,65±0,05. Після ферментації бутлі негайно охолоджувалися на льоду і енергійно збовтували, щоб зруйнувати коагулят. Вміст кожного бутля розподіляли по більш дрібних пластмасових чашках для інокуляції штамом дріжджів Klyveromyces marxianus, раніше ізольованих як контамінанти з свіжого сирного продукту. Дві окремих чашки інокулювали об'ємом 1 % (об./мас.) для досягнення підсумкового 2 рівня контамінації K. marxianus в ферментованому молочному продукті приблизно 1×10 куо/г. Пластмасові чашки запечатували і зберігали при 8±1ºС. Регулярно відбирали проби ферментованих молочних продуктів для визначення рівня контамінації K. marxianus шляхом посіву в чашки відповідних 10-кратних розведень в сольовому пептоні на агарі Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC) з подальшою аеробною інкубацією протягом 3-5 днів при 25ºС. Крім того, pH різних зразків ферментованого молока регулярно вимірювали протягом зберігання. Як проілюстровано на Фіг. 4, ріст K. marxianus інгібувався в присутності обох штамів Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 при їх застосуванні як єдиного штаму разом зі стартовою культурою CHN-19 перед ферментацією. Як відмічено в прикладі 2, Lb. paracasei CHCC12777 також викликав значно вище інгібування K. marxianus, ніж культури HOLDBAC™ YM-B і HOLDBAC™ YM-C, тоді як інгібування, яке викликалося Lb. rhamnosus CHCC14226, як виявили, було на тому ж самому рівні, що і у культури HOLDBAC™. Синергічну інгібуючу дію виявили при застосуванні Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 в комбінації в порівнянні з інгібуючою дією кожного штаму, застосованого окремо. Застосування в комбінації штамів Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 приводило до більш повільного росту K. marxianus в ферментованому молочному продукті, і тому це може сприяти продовженню терміну зберігання для цього типу продуктів. Приклад 5: Напівкількісні визначення інгібуючої дії Lb. paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC5366 окремо і в комбінації проти різних пліснявих контамінант Для напівкількісного аналізу Lb. paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC5366 окремо і в комбінації проводили випробування на агарі, яке відтворює виробничий спосіб і отримання йогурту: Гомогенізоване молоко (вміст жиру 1,5 % мас./об.) пастеризували при 95ºС протягом п'яти хвилин і негайно охолоджували. Комерційну стартову культуру (F-DVS YC-350 виробництва Chr. Hansen А/S, Данія) інокулювали з 0,02 %, і молоко розподіляли по бутлях об'ємом 220 мл. Бутлі додатково інокулювали з Lb. paracasei CHCC14676, Lb. rhamnosus CHCC5366 і комбінацією цих 7 двох штамів, відповідно, в загальних концентраціях 1×10 куо/мл. Один бутель без додаткової інокуляції крім стартової культури слугував контролем. Крім того, 5 % рН-індикатор з бромкрезолу фіолетового і бромкрезолу зеленого додавали до всіх бутлів, щоб отримати індикацію швидкості окислення і отримати поживні середовища синього/зеленого кольору, які дозволяють легко виявляти подальший ріст цільових дріжджів і пліснявих грибів. Всі бутлі інкубували на водяній бані при 43±1ºС і ферментували в цих умовах доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,1. Після ферментації бутлі негайно охолоджували на льоду і енергійно збовтували, щоб зруйнувати коагулят. Потім ферментоване молоко нагрівали до температури 40ºС і додавали до 40 мл 5 %-ого стерильного розчину агару, розплавленого і охолодженого до 60ºС. Цей розчин потім заливали в стерильні чашки Петрі, і чашки висушували на лабораторному столі з ламінарним повітропотоком протягом 30 хвилин. Повністю пророслі суспензії спор з відповідним розведенням відібраних пліснявих грибів Penicillium nalgiovese (10×), Penicillium commune (100×), Aspergillus versicolor (100×) і Penicillium crustosum (100×) наносили по краплях на чашки. Чашки інкубували при 7ºС і оцінювали на предмет росту пліснявих грибів з відповідним, регулярним інтервалом. Результати випробування на агарі, подані на Фіг. 5, показують, що всі тестовані плісняві гриби росли дуже добре на агарових пластинках з молока, ферментованого тільки зі стартовою 12 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 культурою (контроль). Однак, коли Lb. paracasei CHCC14676 або Lb. rhamnosus CHCC5366 були присутнім під час ферментації молока, отримані пластинки запобігали росту всіх пліснявих грибів. Крім того, коли Lb. paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC5366 були присутні в комбінації під час ферментації молока, для Penicillium commune, Aspergillus versicolor і Penicillium crustosum, нанесених краплями на чашки з агаром, спостерігали значне інгібування. Приклад 6: Напівкількісні визначення інгібуючої дії Lb. paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC14226 окремо і в комбінації проти різних пліснявих контамінант Для напівкількісного аналізу Lb. paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC14226 окремо і в комбінації проводили випробування на агарі, яке відтворювало виробничий спосіб і отримання йогурту: Гомогенізоване молоко (вміст жиру 1,5 % мас./об.) пастеризували при 95ºС протягом п'яти хвилин і негайно охолоджували. Комерційну стартову культуру (F-DVS Yoflex® Mild виробництва Chr. Hansen А/S, Данія) інокулювали з 0,02 %, і молоко розподіляли по бутлях об'ємом 220 мл. Бутлі додатково інокульовані з Lb. paracasei CHCC14676, Lb. rhamnosus CHCC14226 і 7 комбінацією цих двох штамів, відповідно, в загальних концентраціях 1×10 куо/мл. Один бутель без додаткової інокуляції крім стартової культури слугував контролем. Крім того, 5 % рНіндикатор з бромкрезолу фіолетового і бромкрезолу зеленого додавали до всіх бутлів, щоб отримати індикацію швидкості окислення і отримати поживні середовища синього/зеленого кольору, що дозволяє легко виявляти подальший ріст цільових дріжджів і пліснявих грибів. Всі бутлі інкубували на водяній бані при 43±1ºС і ферментували за цих умов доти, поки показник pH не досягав 4,60±0,1. Після ферментації бутлі негайно охолоджували на льоду і енергійно збовтували, щоб зруйнувати коагулят. Потім ферментоване молоко нагрівали до температури 40ºС і додавали до 40 мл 5 %-ого стерильного розчину агару, розплавленого і охолодженого до 60ºС. Цей розчин потім заливали в стерильні чашки Петрі, і чашки висушували на лабораторному столі з ламінарним повітропотоком протягом 30 хвилин. Повністю пророслі суспензії спор з відповідними розведеннями відібраних пліснявих грибів Penicillium nalgiovese (10×), Penicillium commune (100×), Aspergillus versicolor (100×) і Penicillium crustosum (100×) наносили краплями на чашки. Чашки інкубували при 7ºС і оцінювали на предмет росту пліснявих грибів з відповідним, регулярним інтервалом. Результати випробування на агарі, подані на Фіг. 6, показують, що всі тестовані плісняві гриби росли дуже добре на агарових пластинках з молока, ферментованого тільки зі стартовою культурою (контроль). Однак, коли Lb. paracasei CHCC14676 або Lb. rhamnosus CHCC14226 були присутні під час ферментації молока, пластинки які отримувались, запобігали росту всіх пліснявих грибів. Крім того, коли Lb. paracasei CHCC14676 і Lb. rhamnosus CHCC14226 були присутні в комбінації під час ферментації молока, значне інгібування спостерігали для Penicillium commune, Aspergillus versicolor і Penicillium crustosum, нанесених краплями на чашки з пластинками агару. Приклад 7: Напівкількісні визначення інгібуючої дії Lb. Paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 окремо і в комбінації проти різних пліснявих контамінант Для напівкількісного аналізу Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 окремо і в комбінації проводили випробування на агарі, яке відтворює виробничий спосіб і отримання йогурту: Гомогенізоване молоко (вміст жиру 1,5 % мас./об.) пастеризували при 95ºС протягом п'яти хвилин і негайно охолоджували. Комерційну стартову культуру (F-DVS YC-350 виробництва Chr. Hansen А/S, Данія) інокулювали з 0,02 %, і молоко розподіляли по бутлях об'ємом 220 мл. Бутлі додатково інокулювали з Lb. paracasei CHCC12777, Lb. rhamnosus CHCC14226 і комбінацією 7 цих двох штамів, відповідно, в загальних концентраціях 1×10 куо/мл. Один бутель без додаткової інокуляції крім стартової культури слугував контролем. Крім того, 5 % рН-індикатор з бромкрезолу фіолетового і бромкрезолу зеленого додавали до всіх бутлів, щоб отримати індикацію швидкості окислення і отримати поживні середовища синього/зеленого кольору, що дозволяє легко виявляти подальший ріст цільових дріжджів і пліснявих грибів. Всі бутлі інкубували на водяній бані при 43±1ºС і ферментували в цих умовах доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,1. Після ферментації бутлі негайно охолоджували на льоду і енергійно збовтували, щоб зруйнувати коагулят. Потім ферментоване молоко нагрівали до температури 40ºС і додавали до 40 мл 5 %-ого стерильного розчину агару, розплавленого і охолодженого до 60ºС. Цей розчин потім заливали в стерильні чашки Петрі, і чашки висушували на лабораторному столі з ламінарним повітропотоком протягом 30 хвилин. Повністю пророслі суспензії спор у відповідних розведеннях відібраних пліснявих грибів Penicillium nalgiovese (10×), Penicillium commune (100×), Aspergillus versicolor (100×) і Penicillium 13 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 crustosum (100×) наносили краплями на чашки з агаром. Чашки інкубували при 7ºС і оцінювали на предмет росту пліснявих грибів з відповідним, регулярним інтервалом. Результати випробування на агарі, подані на Фіг. 7, показують, що всі тестовані плісняві гриби росли дуже добре на агарових пластинках з молока, ферментованого тільки зі стартовою культурою (контроль). Однак, коли Lb. paracasei CHCC12777 або Lb. rhamnosus CHCC14226 були присутні під час ферментації молока, отримувані пластинки запобігали росту всіх пліснявих грибів. Крім того, коли Lb. paracasei CHCC12777 і Lb. rhamnosus CHCC14226 були присутні в комбінації під час ферментації молока, значне інгібування спостерігали для всіх пліснявих грибів, нанесених краплями на чашки з агаром. Приклад 8: Дослідження задачі на сметані з Lactobacillus paracasei CHCC12777 Для візуальної оцінки інгібуючої дії окремого штаму CHCC12777 Lactobacillus paracasei на різні плісняві гриби Р. commune, А. versicolor, Р. brevicompactum, Р. crustosum і Р. glabrum отримували сметану: Пастеризоване незбиране молоко інокулювали комерційною гетероферментативною стартовою культурою (F-DVS DSG-2000 виробництва Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 0,01 %. Молоко додатково інокулювали HOLDBAC™ YM-B (10DCU/100L) або штамом CHCC12777 6 Lactobacillus rhamnosus (5×10 куо/г), і одну партію застосовували як контроль і інокулювали тільки стартовою культурою. Молоко ферментували при 28ºС±1ºС доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,05, і потім закінчували обробку сметани. Сметану перемішували і охолоджували до 20ºС±1ºС і зберігали при 7ºС±1ºС. Через один день після отримання сметани проводили інокуляцію різними пліснявими грибами у вигляді поверхневих контамінант з подвійною повторюваністю в чашки з йогуртом однією краплею на поверхні йогурту із вмістом цільової культури 100 спор/крапля. Ріст пліснявих грибів оцінювали візуально після зберігання протягом 45 днів при 7ºС±1ºС. Результат тесту на сметані, поданий на Фіг. 8, показує, що Р. commune (M6), А. versicolor (M7), Р. brevicompactum (М1), Р. crustosum (М10) і Р. glabrum (M8) добре росли на сметані, отриманій з молока, ферментованого тільки зі стартовою культурою (верхній ряд) або зі стартовою культурою і HOLDBAC™ YM-B культура (середній ряд). Навпаки, коли Lactobacillus paracasei CHCC12777 був присутнім під час ферментації молока (нижній ряд), ріст всіх тестованих пліснявих грибів інгібувався. Приклад 9: Дослідження задачі на домашньому сирі з Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 Для візуальної оцінки інгібуючої дії окремого штаму CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus на види mucor отримували домашній сир: Пастеризоване знежирене молоко інокулювали комерційною стартовою культурою (F-DVS CHN-19 виробництва Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 0,01 %. Молоко додатково інокулювали 6 HOLDBAC™ YM-B (5DCU/100L) або штамом CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus (5×10 куо/г), і одну партію застосовували як контроль і інокулювали тільки стартовою культурою. Молоко ферментували при 28ºС±1ºС доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,05. Температура варіння становила близько 38-40ºС. Після дренування сирнистий осад віджимали протягом 30 хвилин під тиском 1 бар. Через один день після отримання домашнього сиру проводили інокуляцію видами Mucor у вигляді поверхневих контамінант в чашках з подвійною повторюваністю з піпетки трьома краплями на поверхні домашнього сиру (100 г) із вмістом цільової культури 100 спор/крапля. Ріст пліснявих грибів оцінювали візуально після зберігання протягом 18 днів при 7ºС±1ºС. Результат тесту на домашньому сирі, поданий на Фіг. 9, показує, що види Mucor добре росли на домашньому сирі, отриманому з молока, ферментованого тільки зі стартовою культурою CHN-19 (контроль). Плісняві гриби також росли добре на домашньому сирі, отриманому з молока, ферментованого стартовою культурою і культурою HOLDBAC™ YM-B і в меншій мірі на домашньому сирі, отриманому з молока, ферментованого стартовою культурою і культурою HOLDBAC™ YM-C. Однак, коли штам CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus був присутнім під час ферментації молока, спостерігали значно більш помітне інгібування росту видів Mucor. Приклад 10: Дослідження задачі на йогурті з Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 Для візуальної оцінки інгібуючої дії окремого штаму CHCC14226 Lactobacillus rhamnosus на різних пліснявих грибах Р. brevicompactum, Р. commune, А. versicolor і Р. crustosum отримували йогурт із вмістом жиру 1,5 %: Гомогенізоване молоко (вміст жиру 1,5 %) пастеризували при 95ºС±1ºС протягом 5 хвилин в бутлях об'ємом 1 л на водяній бані і негайно охолоджували. Проводили інокуляцію комерційною стартовою культурою (F-DVS YF-L901 виробництва Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 0,02 %. 14 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Молоко було додатково інокульоване з HOLDBAC™ YM-B (20DCU/100L) або Lactobacillus 7 rhamnosus CHCC14226 (1×10 куо/мл), і один бутель, який слугував контролем, інокулювали тільки стартовою культурою. Молоко ферментували при 43ºС±1ºС доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,05. Отриманий йогурт виливали в чашки (100 г) і зберігали при 7ºС±1ºС. Через один день після отримання йогурту проводили інокуляцію різними пліснявими грибами у вигляді поверхневих контамінант на чашках з йогуртом з подвійною повторюваністю по одній краплі на поверхні йогурту із вмістом цільової культури 100 спор/крапля. Ріст пліснявих грибів оцінювали візуально після зберігання протягом 45 днів при 7ºС±1ºС. Результат тесту на йогурті, поданий на Фіг. 10, показує що Р. brevicompactum (М1), Р. commune (M6), А. versicolor (M7) і Р. crustosum (M10) росли добре на йогурті, отриманому з молока, ферментованого тільки зі стартовою культурою YF-L901 (верхній ряд) або зі стартовою культурою і HOLDBAC™ YM-B культура (середній ряд). Навпаки, коли Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 були присутні під час ферментації молока (нижній ряд), ріст всіх тестованих пліснявих грибів інгібувався. Приклад 11: Кількісні визначення інгібуючої дії Lactobacillus paracasei CHCC12777 проти K. lactis в домашньому сирі Для кількісного аналізу інгібуючої дії окремого штаму CHCC12777 Lactobacillus paracasei на K. lactis отримували домашній сир: пастеризоване знежирене молоко інокулювали комерційною стартовою культурою (F-DVS CHN-19 виробництва Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 0,01 %. Молоко додатково інокулювали 6 з HOLDBAC™ YM-B (20DCU/100L) або штамом CHCC12777 Lactobacillus rhamnosus (5×10 куо/г), і одну партію, яку застосовували як контроль, інокулювали тільки стартовою культурою. Молоко ферментували при 28ºС±1ºС доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,05. Температура варіння становила 38-40ºС. Після дренування сирнистий осад віджимали протягом 30 хвилин під тиском 1 бар. На наступний день після отримання домашнього сиру відрізали типові блоки домашнього сиру масою приблизно 10 г і вміщували в гомогенізуючі пакети. Потім блоки інокулювали з подвійною повторюваністю 0,1 мл дріжджового інокуляту з концентрацією 10000 куо/мл шляхом уприскування дріжджів всередину домашнього сиру тонкою голкою. Пакети обгортали навколо домашнього сиру і запечатували клейкою стрічкою. Зразки зберігали при 7ºС±1ºС і аналізували з відповідним інтервалом часу на рівень контамінації K. Lactis шляхом посіву в чашки 1 г домашнього сиру з додатковим відповідним 1кратним розведенням в сольовому пептоні на агарі Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC) з подальшою аеробною інкубацією протягом 5 днів при 25ºС. Як проілюстровано на Фіг. 11, ріст K. lactis інгібувався в присутності штаму CHCC12777 Lactobacillus paracasei, коли інокуляцію проводили разом зі стартовою культурою CHN-19 перед ферментацією. Штам CHCC12777 Lactobacillus paracasei викликав значно сильніше інгібування, ніж комерційна культура, HOLDBAC™ YM-B. Приклад 12: Кількісні визначення інгібуючої дії Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 проти K. lactis в домашньому сирі Для кількісного аналізу інгібуючої дії окремого штаму CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus на K. lactis отримували домашній сир: Пастеризоване знежирене молоко інокулювали комерційною стартовою культурою (F-DVS CHN-19 виробництва Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 0,01 %. Молоко додатково інокулювали 6 з HOLDBAC™ YM-B (5DCU/100L) або штамом CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus (5×10 куо/г), і одну партію, яку застосовували як контроль, інокулювали тільки стартовою культурою. Молоко ферментували при 28ºС±1ºС доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,05. Температура варіння становила близько 38-40ºС. Після дренування сирнистий осад віджимали протягом 30 хвилин під тиском 1 бар. Через один день після отримання домашнього сиру відрізали типові блоки домашнього сиру масою приблизно 10 г і вміщували в гомогенізуючі пакети. Потім блоки інокулювали з подвійною повторюваністю 0,1 мл дріжджового інокуляту з концентрацією 10000 куо/мл шляхом уприскування дріжджів всередину домашнього сиру тонкою голкою. Пакети обгортали навколо домашнього сиру і запечатували клейкою стрічкою. Зразки зберігали при 7ºС±1ºС і аналізували з відповідним інтервалом часу на рівень контамінації K. lactis шляхом посіву в чашки 1 г домашнього сиру з додатковим відповідним 1разовим розведенням в сольовому пептоні на агарі Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC) з подальшою аеробною інкубацією протягом 5 днів при 25ºС. 15 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Як проілюстровано на Фіг. 11, ріст K. lactis інгібувався в присутності штаму CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus, коли проводили інокуляцію разом зі стартовою культурою CHN-19 перед ферментацією. Штам викликав значно сильніше інгібування, ніж комерційна культура HOLDBAC™ YM-B. Приклад 13: Кількісні визначення інгібуючої дії Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 проти Debaromyces hansenii в йогурті Для кількісного аналізу інгібуючої дії окремого штаму CHCC14226 Lactobacillus rhamnosus на D. Hansenii отримували йогурт таким чином: Гомогенізоване молоко (вміст жиру 1,5 %) пастеризували при 95 °C±1 °C протягом 5 хвилин в бутлях об'ємом 1 л на водяній бані і потім негайно охолоджували. Проводили інокуляцію комерційною стартовою культурою (F-DVS YF-L901 виробництва Chr. Hansen А/S, Данія) в кількості 0,02 %. Молоко додатково інокулювали з HOLDBAC™ YM-B (20DCU/100L) або 7 Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 (1×10 куо/г), і один бутель, який слугував контролем, інокулювали тільки стартовою культурою. Молоко ферментували при 43ºС±1ºС доти, поки значення pH не досягало 4,60±0,1. Отриманий йогурт виливали в чашки (100 г) і зберігали при 7ºС±1ºС. Через один день після отримання йогурту чашки інокулювали з подвійною повторюваністю дріжджами в кількості 1,00 мл/чашка з концентрацією цільової культури 20 куо/г. Дріжджі рівномірно розподіляли в йогурті. Чашки зберігали під кришкою при 7ºС±1ºС і аналізували з відповідним інтервалом часу на рівень контамінації D. Hansenii шляхом посіву в чашки 1 мл йогурту з додатковим відповідним 1-разовим розведенням в сольовому пептоні на агарі Yeast Glucose Chloramphenicol (YGC) з подальшою аеробною інкубацією протягом 5 днів при 25ºС. Як проілюстровано на Фіг. 12, ріст D. hansenii інгібувався в присутності штаму CHCC14226 Lactobacillus rhamnosus, коли інокуляцію проводили разом зі стартовою культурою YF-L901 перед ферментацією. Штам викликав значно сильніше інгібування, ніж комерційна культура HOLDBAC™ YM-B. Депонування і експертне рішення Заявник просить, щоб зразок депонованих мікроорганізмів, вказаних нижче, міг бути доступним для експерта тільки до дати, до якої видається патент. Штам CHCC12697 Lactobacillus rhamnosus, депонований 01.03.2011 в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124, Брауншвейг, з присвоєним номером: DSM24616. Штам CHCC14226 Lactobacillus rhamnosus, депонований 15.03.2011 в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124, Брауншвейг, з присвоєним номером: DSM24652. Штам CHCC12777 Lactobacillus paracasei, депонований 15.03.2011 в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124, Брауншвейг, з присвоєним номером: DSM24651. Депонування були зроблені згідно з Будапештською угодою про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів з метою процедури видачі патенту. Джерела інформації: US 2005/0095318 (Schwenninger et al.) WO 2004/041305 (Valio Ltd) Tharmaraj, N. & Shah, N.P. (2009) Antimicrobial effects of probiotic bacteria against selected species of yeasts and molds in cheese-based dips. International Journal of Food Science & Technology. 44: 1916-1926. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 55 1. Протимікробна композиція, яка включає щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus і щонайменше один штам Lactobacillus paracaseі, в якій щонайменше один штам Lactobacillus rhamnosus вибраний з групи, яка складається з Lactobacillus rhamnosus СНСС12697 з номером DSM24616, Lactobacillus rhamnosus СНСС14226 з номером DSM24652 і їх мутантних штамів, де мутантні штами мають по суті ті ж самі або поліпшені властивості, як депоновані штами, і отримані із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. 2. Протимікробна композиція за п. 1, в якій щонайменше один штам Lactobacillus paracasei вибраний з групи, яка складається з Lactobacillus paracasei СНСС12777 з номером DSM24651 і його мутантних штамів, де мутантні штами мають по суті ті ж самі або поліпшені властивості, як і депоновані штами, і отримані із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. 16 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 55 60 3. Протимікробна композиція, яка включає щонайменше один штам, вибраний з групи, яка складається з: Lactobacillus rhamnosus СНСС12697, який депонували в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24616, Lactobacillus rhamnosus СНСС14226, який депонували в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24652, Lactobacillus paracasei СНСС12777, який депонували в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24651; і їх мутантних штамів, де мутантні штами мають по суті ті ж самі або поліпшені властивості, як депоновані штами, і отримані із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. 4. Застосування протимікробної композиції за будь-яким з пунктів 1-3 для отримання харчового продукту. 5. Застосування протимікробної композиції за будь-яким з пунктів 1-3 для отримання корму. 6. Застосування протимікробної композиції за будь-яким з пунктів 1-3 для отримання фармацевтичного продукту. 7. Застосування протимікробної композиції за будь-яким з пп. 1-3 для інгібування росту небажаних мікроорганізмів, вибраних з групи, яка складається з грибів і бактерій і їх сумішей, де небажані мікроорганізми є патогенними і/або можуть погіршувати стан їжі, корму або фармацевтичних продуктів. 8. Застосування за п. 7, в якому небажані мікроорганізми являють собою гриби, такі як дріжджі і плісняві гриби. 9. Застосування протимікробної композиції за будь-яким з пп. 1-3 як фармацевтичного продукту. 10. Харчовий продукт, який включає протимікробну композицію за будь-яким з пп. 1-3. 11. Харчовий продукт за п. 10, в якому харчовий продукт вибраний з групи, яка складається з фруктів і продуктів, які отримуються з фруктів, овочів і продуктів, які отримуються з овочів, зерна і продуктів, які отримуються із зерна, молочних продуктів, м’яса, свійської птиці і морських продуктів і їх сумішей. 12. Харчовий продукт за п. 11, в якому харчовий продукт є молочним продуктом. 13. Харчовий продукт за п. 12, в якому молочний продукт є мезофільним або термофільним ферментованим молочним продуктом, таким як свіжий сир або йогурт. 14. Харчовий продукт за п. 11, в якому харчовий продукт є м'ясом або свійською птицею. 15. Корм, який включає протимікробну композицію за будь-яким з пп. 1-3. 16. Фармацевтичний продукт, який включає протимікробну композицію за будь-яким з пп. 1-3. 17. Фармацевтичний продукт за п. 16, в якому фармацевтичний продукт є одиничною лікарською формою, яка включає композицію за будь-яким з пп. 1-3. 18. Фармацевтичний продукт за п. 17, в якому одинична лікарська форма є капсулою або таблеткою. 19. Спосіб отримання харчового продукту за будь-яким з пп. 10-14, який включає стадію, де протимікробну композицію за будь-яким з пп. 1-3 додають до харчового продукту. 20. Спосіб отримання корму за п. 15, який включає стадію, де протимікробну композицію за будь-яким з пп. 1-3 додають до корму. 21. Спосіб отримання фармацевтичного продукту за п. 16, який включає стадію, де протимікробну композицію за будь-яким з пп. 1-3 додають до фармацевтичного продукту. 22. Спосіб за п. 19, який включає: (a) додавання протимікробної композиції за будь-яким з пп. 1-3 під час виготовлення харчового продукту таким чином, щоб кожна з концентрацій щонайменше одного штаму Lactobacillus 6 rhamnosus і щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei становила щонайменше 1x10 6 5 2 КУО/г або щонайменше 1x10 КУО/мл харчового продукту або щонайменше 1x10 КУО/см поверхні харчового продукту, і (b) контроль виробничих параметрів під час отримання таким чином, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei збільшувалася або залишалася сталою. 23. Спосіб за п. 20, який включає: (a) додавання протимікробної композиції за будь-яким з пп. 1-3 під час виготовлення корму таким чином, щоб кожна з концентрацій щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і 6 щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei становила щонайменше 1x10 КУО/г або 6 6 2 щонайменше 1x10 КУО/мл корму або щонайменше 1x10 КУО/см поверхні корму, і (b) контроль виробничих параметрів під час отримання таким чином, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei збільшувалася або залишалася сталою. 17 UA 113059 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 24. Спосіб за п. 21, який включає: (а) додавання протимікробної композиції за будь-яким з пп. 1-3 під час виготовлення фармацевтичного продукту таким чином, щоб кожна з концентрацій щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei становила 6 6 щонайменше 1x10 КУО/г або щонайменше 1x10 КУО/мл фармацевтичного продукту або 5 2 щонайменше 1x10 КУО/см поверхні фармацевтичного продукту, і (b) контроль виробничих параметрів під час отримання таким чином, щоб концентрація щонайменше одного штаму Lactobacillus rhamnosus і щонайменше одного штаму Lactobacillus paracasei збільшувалася або залишалася сталою. 25. Спосіб за будь-яким з пп. 19-24, в якому спосіб включає одну або більше стадій ферментації. 26. Спосіб за п. 25, в якому спосіб включає ферментацію молочного субстрату зі стартовою культурою, яка включає щонайменше один штам родів, вибраних з Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus і Leuconostoc. 27. Спосіб за будь-яким з пп. 19, 22, в якому стадія додавання протимікробної композиції на стадії (а) до харчового продукту включає ретельне змішування протимікробної композиції з харчовим продуктом. 28. Спосіб за будь-яким з пп. 20, 23, в якому стадія додавання протимікробної композиції на стадії (а) до корму включає ретельне змішування протимікробної композиції з кормом. 29. Спосіб за будь-яким з пп. 21, 24, в якому стадія додавання протимікробної композиції на стадії (а) до фармацевтичного продукту включає ретельне змішування протимікробної композиції з фармацевтичним продуктом. 30. Спосіб за будь-яким з пп. 19, 22, 25, 26, 27, в якому стадія додавання протимікробної композиції на стадії (а) до харчового продукту включає застосування протимікробної композиції до однієї або більше поверхонь харчового продукту. 31. Спосіб за будь-яким з пп. 20, 23, 25, 26, 28, в якому стадія додавання протимікробної композиції на стадії (а) до корму включає застосування протимікробної композиції до однієї або більше поверхонь корму. 32. Спосіб за будь-яким з пп. 21, 24, 25, 26, 29, в якому стадія додавання протимікробної композиції на стадії (а) до фармацевтичного продукту включає застосування протимікробної композиції до однієї або більше поверхонь фармацевтичного продукту. 33. Штам Lactobacillus rhamnosus СНСС12697, придатний для виготовлення протимікробної композиції, депонований в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24616, або його мутантний штам, де мутантний штам має по суті ті ж самі або поліпшені властивості, як і депонований штам, і отриманий із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. 34. Штам Lactobacillus rhamnosus СНСС14226, придатний для виготовлення протимікробної композиції, депонований в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24652, або його мутантний штам, де мутантний штам має по суті ті ж самі або поліпшені властивості, як і депонований штам, і отриманий із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. 35. Штам Lactobacillus paracasei СНСС12777, придатний для виготовлення протимікробної композиції, депонований в німецькій Колекції мікроорганізмів і клітинних культур (DSMZ) під номером DSM24651, або його мутантний штам, де мутантний штам має по суті ті ж самі або поліпшені властивості, як і депонований штам, і отриманий із застосуванням депонованого штаму як вихідного матеріалу. 18 UA 113059 C2 19 UA 113059 C2 20 UA 113059 C2 21 UA 113059 C2 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 22