Інгібітор сигнального шляху рецептора cd95 для застосування в лікуванні мієлодиспластичного синдрому

Реферат: Винахід стосується інгібітора сигнального шляху рецептора CD95 для застосування в лікуванні мієлодиспластичного синдрому (MDS), а також фармацевтичної композиції, яка містить зазначений інгібітор та додатково містить еритропоезстимулювальний агент. UA 116104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується інгібіторів сигнального шляху рецептора CD95 для застосування в лікуванні мієлодиспластичного синдрому (MDS), де MDS вибирають з підгрупи MDS низького ступеня ризику (за шкалою IPSS) та/або з підгрупи MDS проміжного-1 (int-1) ступеня ризику (за шкалою IPSS), а також способу діагностики MDS. Мієлодиспластичні синдроми (MDS) являють собою клональні порушення гемопоетичних стовбурових клітин, які характеризуються неефективним кровотворенням, яке веде до цитопеній, зокрема анемії, і часто розвиваються в гострий мієлоїдний лейкоз (AML). Зокрема, MDS може бути охарактеризований ростом ушкоджених еритроїдних клітин-попередників. Відповідно, MDS зазвичай класифікують на основі морфології і відсотку бластних клітин в крові та кістковому мозку (французько-американсько-британська класифікація (FAB) і класифікація ВООЗ) (Bennett et al., 1982; Vardiman et al., 2009). Еритропоез регулюється балансом між позитивними і негативними сигналами, що припускає наявність міжклітинної взаємодії і розчинних факторів в еритробластних острівцях кісткового мозку. Загальне зображення еритропоезу показано на Фіг. 1. Комітування гемопоетичних + стовбурових клітин (HSC) CD34 в еритроїдну лінію знаходиться під керуванням важливого фактора транскрипції, подібного GATA-1, і цитокінів, подібних c-Kit-ліганду, фактору стовбурових клітин (SCF). Розмір еритроїдного компартменту позитивно регулюється еритропоетином, який стимулює дозрівання CFU-E та про-еритробластів і запобігає їх апоптозу. На мембранах еритроїдних клітин відбувається експресія CD71 (рецептора трансферина), після чого відбувається експресія глікофорину A (GPA) на більш зрілих клітинах (Фіг. 1). Негативна регуляція еритропоезу залежить від Fas/FasL, що докладає свій внесок до апоптозу незрілих еритробластів, які експресують Fas при взаємодії з FasL, що експресується на зрілих попередниках еритроїдних клітин (De Maria et al., 1999), а також саморегуляції еритробластів на тій самій стадії диференціації (Socolovski et l., 2008). Дозрівання нормальних еритроїдних клітин-попередників потребує активації каспази-3, хоча активність каспази-8 не виявляється (De Maria et al., 1999; Zermati et al., 2001). Розщеплення субстрату каспази-3 є обмеженим. Наприклад, GATA-1 являє собою субстрат для каспази-3 за умов депривації еритропоетину, хоча в присутності EPO GATA-1 є захищеним від розщеплення взаємодією з Hsp70, що транслокується з цитозолю в ядро (Ribeil et al., 2007). Дизеритропоез у випадку MDS пов'язується з ектопічною активацією каспази-8 у низхідному напрямку відносно Fas. Автори цього винаходу та інші раніше продемонстрували, що Fas + надекспресується на поверхні незрілих клітин-попередників CD34 і в еритроїд-комітованих клітинах-попередниках. Експресія Fas збільшилась протягом диференціювання еритроїдних клітин з початком експресії Fas-ліганду в GPA-позитивних еритроїдних попередниках з наслідковою ектопічною активацією каспази-8 в еритроїдній лінії. Це спостерігали у свіжих клітин кісткового мозку (Bouscary et al., 1997), а також в еритроїдних клітинах, одержаних в двостадійній рідкій культурі (Claessens et al., 2002). Інгібування передачі сигналів Fas ектопічною експресією домінантного негативного мутанту адаптерного білку FADD, експресованого лентівірусом, знижувало активацію каспази-8 та інгібувало апоптоз еритроїдних попередників при MDS (Claessens et al., 2005). Fas/FasL може сприяти запобіганню нормального диференціювання еритроїдних клітин та індукувати апоптоз еритроїдних клітин при MDS. Останні дані показали, що дозрівання еритроїдних клітин сильно порушується при MDS низького ступеня ризику. Кількісне визначення попередників еритроїдних клітин здійснювали шляхом мічення CD71/GPA, яке описане Socolovski et al. (2007). Було відзначено, що в клітинних культурах MDS, в порівнянні з нормальними культурами, через 7 діб частка клітин high low int high CD71 /GPA збільшується, а частка клітин CD71 /GPA зменшується. Транскриптомні дослідження еритроїдних попередників на 14 добу продемонстрували двократне зниження експресії гену GYPA, що кодує глікофорин А (GPA). Крім того, зазнали зменшення рівня регуляції декілька інших генів еритроїдних клітин. MDS являє собою групу рідкісних захворювань (захворюваність 3-5/100000 осіб/рік), домінуючих у літніх людей (середній вік від 65 років до 70 років). У більшості випадків MDS лікують шляхом введення класичних еритропоез-стимулювальних агентів (ESA). Тим не менш до появи цього винаходу пацієнтів з MDS, несприйнятливих до ESA, було важко вилікувати. Отже, метою цього винаходу було надання нового методу лікування MDS, зокрема, для лікування пацієнтів з MDS, несприйнятливих до ESA. Перший аспект цього винаходу стосується інгібітору сигнального шляху рецептора CD95 для застосуванні в лікуванні мієлодиспластичного синдрому (MDS), який вибирають з підгрупи MDS низького ступеня ризику (за шкалою IPSS) та/або з підгрупи MDS проміжного-1 (int-1) 1 UA 116104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ступеня ризику (за шкалою IPSS). За цим винаходом терміни CD95, CD95R і CD95-рецептор можуть бути вжиті взаємозамінно. Синонімами є Аро-1 або Fas, які в цьому документі можуть бути вжиті взаємозамінно. Далі, терміни CD95L, CD95-ліганд і відповідні синоніми FasL, Аро-1L, CD178 або TNF-SF6 можуть бути вжиті взаємозамінно. "Інгібітором сигнального шляху рецептору CD95" за цим винаходом може бути будь-яка сполука, яка порушує або блокує, щонайменше частково, сигнальний шлях рецептору CD95. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, "інгібітор сигнального шляху рецептору CD95" блокує сигнальний шлях рецептору CD95. Методи визначення та/або оцінки активності сигнального шляху рецептору CD95 відомі фахівцю у цій галузі і є, наприклад, описаними Lavrik et al. (Cell Death Differ. 2012 Jan; 19(1):36-41 Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC). Інгібітор за цим винаходом може діяти на рівні білка та/або на рівні нуклеїнової кислоти. Інгібітори, які діють на рівні білка, можуть бути вибрані з-посеред антитіл, білків та/або малих молекул. Інгібітори, які діють на рівні нуклеїнової кислоти, являють собою, наприклад, антисмислові молекули, молекули RNAi та/або рибозими. За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддають особливу перевагу, інгібітор зв'язується з рецептором CD95 (CD95) та/або CD95-лігандом (CD95L). У іще одному варіанті здійснення цього винаходу може пригнічуватись взаємодія CD95/CD95L. У одному з варіантів здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, інгібітор за цим винаходом являє собою антитіло або його функціональний фрагмент. Інгібітор, який являє собою антитіло, може зв'язуватись з CD95, але, безумовно, також з CD95L. Прикладом антитіла, що зв'язується з CD95L, є Nok-1. Згаданим антитілом може бути, наприклад, моноклональне антитіло, поліклональне антитіло, рекомбінантне антитіло, гуманізуване антитіло, людське антитіло, химерне антитіло, мультиспецифічне антитіло або фрагмент антитіла (наприклад, Fab-фрагмент, Fab-фрагмент, F(аb')2-фрагмент, Fv-фрагмент, діатіло або молекула одноланцюгового антитіла). Цим антитілом може бути антитіло типу IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Згадане антитіло може бути використано з модифікацією або без модифікації, і може бути міченим, або ковалентно, або нековалентно, наприклад, репортерною групою або ефекторною групою. "Фрагмент антитіла" за цим винаходом являє собою по суті той самий епітоп-зв'язувальний центр, що і відповідне антитіло, та/або має по суті ті(ту) самі(-у) CD95 інгібувальну активність та/або CD95L інгібувальну активність, яку має відповідне антитіло. Способи одержання антитіл за цим винаходом відомі фахівцю в цій галузі. Одним з видів інгібітора, який охоплюються цим винаходом, може бути інгібітор CD95ліганду. Наприклад, інгібітори CD95-ліганду можуть бути вибрані з-посеред (а) інгібувального антитіла проти CD95-ліганду або його фрагменту, як описано вище; (b) розчинної молекули рецептора CD95 або його CD95-ліганд-зв'язувальної частини; і (с) інгібітора CD95-ліганду, вибраного з-посеред FLINT, DcR3 або їх фрагментів. Розчинні молекули рецептора CD95, наприклад, розчинна молекула рецептора CD95 без трансмембранного домену, описані в ЕР-А-0595659 та ЕР-А-0965637, або пептидні рецептори CD95, які описані в WO 99/65935. Інгібітор Fas-ліганду FLINT або DcR3 або фрагмент, наприклад, їх розчинний фрагмент, наприклад, позаклітинний домен, факультативно злитий з гетерологічним поліпептидом, зокрема, Fc-доменом молекули імуноглобуліну, описаний в WO 99/14330 або WO 99/50413. FLINT та DcR3 являють собою білки, які здатні зв'язувати CD95-ліганд. У іще одному варіанті здійснення цього винаходу згаданий інгібітор являє собою складений білок, зокрема, складений білок, який зв'язується з CD95L. У одному з варіантів здійснення цього винаходу інгібітор CD95L містить позаклітинний домен молекули CD95R, такий як амінокислоти 1-172 (MLG…SRS) зрілої послідовності CD95, яка відповідає патенту США № 5,891,434. Цей позаклітинний домен молекули CD95R може бути злитий з гетерологічним доменом поліпептиду, зокрема, з Fc-доменом молекули імуноглобуліну, в тому числі шарнірною ділянкою, наприклад, з молекули людського IgG1. Складений білок, який містить позаклітинний домен CD95 і людський Fc-домен, описаний в WO 95/27735. Таким чином, за варіантом здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, агент, який зв'язується з CD95L, являє собою складений білок, який містить позаклітинний домен CD95 і Fcдомен, зокрема Fc-домен людського походження. За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддають особливу перевагу, агент, який зв'язується з CD95L, являє собою APG101 або його функціональні фрагменти, ізоформи та/або їх похідні. APG101 включає домени CD95R (амінокислоти 26-172; позаклітинний домен ECD) та 2 UA 116104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 IgG1-Fc (амінокислоти 172-400) послідовності SEQ ID NO:1). APG101 і його похідні описані в WO95/27735 і WO2004/085478. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згаданий інгібітор являє собою нуклеїновокислотну ефекторну молекулу. Цією нуклеїновокислотною ефекторною молекулою може бути ДНК, РНК, ПНК або гібрид ДНК-РНК. Вона(він) може бути одноланцюговою(-им) або дволанцюговою(-им). Вектори експресії, похідні від геномів ретровірусів, аденовірусу, вірусу герпесу або вірусу вакцинії чи від різних бактеріальних плазмід, можуть бути використані для доставки нуклеотидних послідовностей до цільового органу, тканини або популяції клітин. Такі генно-інженерні конструкції можуть бути використані для введення в клітину смислових і антисмислових послідовностей, що не транслюються. Навіть за відсутності інтеграції в ДНК, такі вектори можуть продовжувати транскрибування молекул РНК, доки вони не будуть заблоковані ендогенними нуклеазами. Транзієнтна експресія з вектором, що не реплікується, може тривати протягом місяця або більше, і навіть довше, якщо відповідні елементи реплікації є частиною векторної системи. Нуклеїновокислотна ефекторна молекула може бути, зокрема, вибрана з-посеред антисмислових молекул, молекул RNAi і рибозимів, які переважно здатні пригнічувати експресію гена CD95R та/або гена CD95L. Як зазначено вище, цей винахід стосується, зокрема, лікування мієлодиспластичного синдрому (MDS), де MDS вибирають з підгрупи MDS низького ступеня ризику (за шкалою IPSS (Міжнародна шкала оцінки прогнозу або Міжнародна прогностична бальна система)) та/або з підгрупи MDS проміжного-1 (int-1) ступеня ризику (за шкалою IPSS). IPSS добре відома фахівцям у цій галузі. Основні прогностичні фактори MDS для прогресування до AML і виживання включають в себе кількість і важливість цитопеній, відсоток бластів кісткового мозку і цитогенетичних патологій кісткового мозку. Кожен показник оцінюють за його тяжкістю і рейтинги об'єднують в "бали", IPSS. IPSS розрізняє 4 підгрупи з істотно різним ризиком прогресування до AML і виживаністю: низького, проміжного-1 (int-1), проміжного-2 (int-2) і високого ступеня ризику. Підгрупи низького та int-1 ступеня ризику часто групуються разом, як MDS "сприятливого" або низького ступеня ризику, а підгрупи int-2 і високого ступеня ризику групуються разом, як MDS "несприятливого" або високого ступеня ризику (Greenberg et al., 1997). MDS низького ступеня ризику (з низькою або int-1 IPSS) характеризуються підвищеним апоптозом клітин-попередників кісткового мозку, що великою мірою призводить до цитопеній. У більшості пацієнтів еритроїдні клітини демонструють порушену диференціацію і збільшення апоптозу. Отже, підгрупа MDS, яка підлягає лікуванню за цим винаходом, тобто з низьким ступенем ризику або int-1 за IPSS, може бути охарактеризована збільшеним апоптозом протягом еритропоезу. За ще одним варіантом здійснення цього винаходу підгрупа MDS, яка підлягає лікуванню, може бути також охарактеризована важким порушенням еритропоезу без надлишку бластних клітин. Іншою характерною ознакою підгрупи MDS, яка підлягає лікуванню, може бути стійкість до класичних еритропоез-стимулювальних агентів (ESA) та/або колонієстимулювальних факторів. Еритропоез-стимулювальним агентом за цим винаходом може бути будь-яка сполука, яка стимулює продукування червоних кров'яних тілець. Приклади ESA і/або колонієстимулювальних факторів включають, але не обмежуються ними, еритропоетин (Еpo), епоетин альфа (Procrit/Epogen), епоетин бета (NeoRecormon), дарбепоетин альфа (Aranesp), метоксиполіетиленгліколь-епоетин бета (Mircera) та/або деякі цитокіни, наприклад, IL-3 або IL-9. Підгрупа MDS, яка підлягає лікуванню, може бути охарактеризована низьким рівнем еритроїдних бурстотвірних одиниць (BFU-E) та/або низьким рівнем еритроїдних колонієтвірних одиниць (CFU-E). Безумовно, характеристики, описані вище, можуть бути об'єднані в будь-яку можливу комбінацію для опису підгрупи MDS, яка підлягає лікуванню. Маючи на увазі підгрупу MDS, яка відповідає опису, наведеному вище, ще один варіант здійснення цього винаходу стосується застосування інгібіторів, які збільшують кількість BFU-E, і не впливають на кількість гранулоцитарно-макрофагальних колонієтвірних одиниць (CFU-GM) та/або не збільшують ризик розмноження лейкозних клітин. За варіантом, якому віддають перевагу, згаданим інгібітором може бути також сполука, яка посилює ріст еритроїдних клітинпопередників. Інгібітор сигнального шляху CD95, який застосовують за цим винаходом, безсумнівно, може бути представлений у вигляді фармацевтичної композиції. Ця композиція може містити 3 UA 116104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фармацевтично прийнятні носії, розріджувачі та/або ад'юванти тощо Більш докладні методики для виготовлення композицій та їх введення можна знайти в останньому виданні Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa.). Фармацевтичні композиції, які застосовують за цим винаходом, можуть бути введені багатьма зі шляхів, у тому числі, але не обмежуючись ними, пероральним, внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, внутрішньоартеріальним, інтрамедулярним, інтратекальним, інтравентрикулярним, черезшкірним, підшкірним, інтраперитонеальним, інтраназальним, ентеральним, місцевим, під'язичним або ректальним шляхами. Фармацевтичні композиції, придатні для застосування за цим винаходом, охоплюють композиції, які містять активні інгредієнти в кількості, ефективній для досягнення поставленої мети. Визначення ефективної дози може виконати фахівець у цій галузі. Терапевтично ефективна доза означає таку кількість активного інгредієнта, наприклад, нуклеїнової кислоти або білку за цим винаходом, або антитіла, яка є достатньою для лікування конкретного стану. Відповідне дозування буде визначено лікарем у залежності від факторів, пов'язаних з суб'єктом, який потребує лікування. Дози і шляхи введення встановлюють для забезпечення достатніх рівнів активної речовини або для підтримування бажаного впливу. Будь-якому фахівцю в цій галузі відомі інші способи забезпечення достатніх рівнів активної речовини та/або підтримування бажаного впливу. Фактори, які можуть бути прийняті до уваги, охоплюють тяжкість хворобливого стану, загальний стан здоров'я суб'єкта, вік, масу і стать суб'єкта, дієту, час і частоту введення, комбінацію(-ї) лікарських засобів, чутливість реакції і толерантність/реакцію на терапію. У варіанті здійснення цього винаходу, якому віддають перевагу, загальна кількість інгібітора сигнального шляху CD95, який відповідає цьому винаходу, для введення пацієнту, який страждає на MDS, становить від приблизно 50 мг/тиждень до приблизно 400 мг/тиждень, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від приблизно 100 мг/тиждень до приблизно 200 мг/тиждень. Щотижнева доза, якій віддають перевагу, може бути введена як разова доза або як декілька доз. Особливу перевагу віддають разовій дозі, зокрема, від 100 мг/тиждень до 200 мг/тиждень, яку вводять внутрішньовенним шляхом як разову дозу. Лікування може тривати протягом декількох тижнів. У кожному конкретному випадку тривалість лікування визначається лікарем і встановлюється, наприклад, на основі успіху лікування, виникнення побічних ефектів тощо. За ще одним аспектом цього винаходу ця фармацевтична композиція може містити щонайменше один додатковий активний інгредієнт, такий як агент, традиційно застосовуваний для лікування MDS, наприклад, 5-азацитидин, децитабін або леналідомід, еритропоезстимулювальний агент та/або апоптоз-інгібувальний агент. Приклади еритропоез-стимулювальних агентів були вказані вище. Приклади апоптоз-інгібувальних агентів включають інгібітори каспаз, такі як xIAP, c-IAP-1, cIAP2, сурвівін (Survivin), TNF-α-інгібувальні сполуки, такі як ревлімід (Revlimid), помалідомід (Pomalidomide), інгібітори білків родини Bcl-2 тощо Ще одним аспектом цього винаходу є фармацевтична композиція, яка містить інгібітор за цим винаходом і яка крім того містить еритропоез-стимулювальний агент, зокрема, еритропоезстимулювальний агент, як визначено вище. Ще один аспект цього винаходу стосується способу діагностики MDS, який включає крок визначення експресії CD95L в зразку, причому надекспресія CD95L є прогностичним фактором захворювання. Наступним кроком цього запропонованого за цим винаходом способу може бути inter alia порівняння визначеного рівня експресії CD95L з контрольним рівнем, таким як з проби, узятої у пацієнта з анемією іншого походження, ніж MDS. Звичайно, спосіб діагностики за цим винаходом може об'єднуватись з відомими способами, такими як система IPSS. Короткий опис фігур Фіг. 1: Загальне зображення еритропоезу. HSC: гемопоетична стовбурова клітина, BFU-E: еритроїдна бурстотвірна одиниця, CFU-E: еритроїдна колонієтвірна одиниця, PER: проеритробласт, ERB: базофільний еритробласт, ERP: поліхроматофільний еритробласт, ERA: ацидофільний еритробласт, reticulo: ретикулоцит, RBC: еритроцит, SCF: фактор стовбурових клітин, EPO: еритропоетин. Фіг. 2: Негативна регуляція нормального еритропоезу і еритропоезу при MDS. Нормальний еритропоез регулюється негативною регуляцією проліферації через Fas-залежний апоптоз незрілих клітин-попередників, опосередкований FasL-експресуючими зрілими клітинами (сині стрілки). У разі MDS, відбувається надекспресія Fas і FasL, що призводить до надмірного і невідповідного апоптозу (червоні стрілки). 4 UA 116104 C2 5 10 15 Фіг. 3: Роль/Концентрація Fas і FasL впродовж еритропоезу. Фіг. 4: Експресія FasL при MDS, sAML і в контрольних зразках. А. Розподіл FasL RFI. B. ROCаналіз, який порівнює MDS з контрольними зразками. low + Фіг. 5: Вплив експресії Fas на клітини CD45 /CD34 при діагностиці на загальну виживаність. Фіг. 6: Вплив APG101 на ріст BFU-E і CFU-GM на 14-добовій культурі на метилцелюлозі. Фіг. 7: Вплив APG101 на ріст CFU-E і CFU-L на 7-добовій культурі на метилцелюлозі. Фіг. 8: Вплив APG101 на BFU-E і CFU-GM, одержаних з рідких культур на 5-у добу. Фіг. 9: Вплив APG101, доданого на стадії диференціації в рідку культуру еритроїдних клітинпопередників. Фіг. 10: Вплив APG101 на диференціацію еритроїдних клітин. Зліва: цитоспіни, забарвлені за методикою MGG (методика Май-Грюнвальд-Гимза). Справа: Протоковий цитометричний аналіз подвійного маркування CD71/GPA. Фіг. 11: Вплив APG101 на ріст BFU-E. Порівняння Fas-позитивного і Fas-негативного MDS. low Фіг. 12: Вплив APG101 відповідно до експресії FasL на клітини CD45 . Фіг. 13: Вплив APG101 на ріст BFU-E відповідно до росту CFU-L і BFU-E на вихідному рівні. Матеріали та методики Лабораторні матеріали Опис Стабільний очищений тример CD95ліганду (CD95L-T4) APG101 Цитокіни SCF, IGF-1 Метилцелюлоза Культуральне середовище IDMD glutamax Антитіла і білки, мічені флуорохромом 20 25 Партія Постачальник Apogenix SCF 02630 IGF-1 04100 Promega SIGMA Stem Cell technologies 31980-022 Invitrogen CD95 клон UB2 IM1506 CD235a (GPA) клон 11E4B IM2212 CD71 клон YDJ1.2.2 IM0483 Beckman Coulter Зразки кісткового мозку Зразки нормального кісткового мозку і зразки кісткового мозку при MDS були одержані шляхом стернальної аспірації від пацієнтів Cochin Hospital, Париж, та з відповідних установ, які беруть участь в багатоцентрових біологічних дослідженнях, координованих професором M. Fontenay. Пацієнти надали свою інформовану згоду на проведення клітинно-біологічних та генетичних досліджень перед аспірацією кісткового мозку відповідно до рекомендацій місцевого комітету з етики. Обладнання Назва Колонка MIDI Macs Протоковий цитометр FC 500 Інкубатори (5 % CO2, 37 °C) Мікроскоп 30 Внутрішній ідентифікаційний індекс Компанія Milteny Biotech Компанія Beckman Coulter Компанія Jouan Компанія Zeiss Методи Відповідні стандартні операційні процедури Поточні стандартні операційні процедури рекомендовані і затверджені в "Guide de Bonne Execution des Analyses de Biologie medicale", M. Fontenay та C. Lacombe від 2002 року. Стандартна операційна процедура + Виділення клітин CD34 Культура еритроїдних клітин-попередників Дослідження в культурах на метилцелюлозі № GBEA2v1 GBEA2v1 GBEA1v1 Інструменти і платформи 5 Дата публікації 01/02/2002 01/02/2002 01/02/2002 UA 116104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - Хімера APG101 Fas-FC (компанія Apogenix): інгібітор Fas-залежного апоптозу; надана компанією Apogenix GmbH. - CD95L-T4: тримерний ліганд Fas, наданий компанією Apogenix. - Культури еритроїдних клітин, були приготовлені, як описано: клітини кісткового мозку + CD34 виділяли на колонці MIDI Macs, і культивували в SCF, EPO, IGF-1 та дексаметазоні для + індукування комітування клітин CD34 в еритроїдну лінію і цільової проліферації еритроїдних клітин. Через 10 діб заключне дозрівання еритроїдних клітин забезпечують шляхом переведення клітин на ЕРО та інсуліновмісне середовище. - Протокова цитометрія була використана для кількісної оцінки дозрівання еритроїдних клітин in vitro на рідкій культурі. Протоколи Протокова цитометрія Субпопуляції клітин були ідентифіковані за допомогою подвійного мічення з використанням моноклональних антитіл проти CD71 (рецептор трансферину) і глікофорину А (GPA CD235a). Окремими етапами дозрівання були клітини CD71-/GPA-, CD71+/GPA-, CD71+/GPA+ і, нарешті, CD71-/GPA+. Кількісне визначення експресії мембранного Fas здійснювали шляхом мічення із застосуванням CD95, з експресією, вираженою як відношення медіанної інтенсивності флуоресценції до ізотипового контролю (RFI (відносна інтенсивність флуоресценції)). ROCаналіз (ROC – робоча характеристика приймача), який являє собою графічне зображення взаємозв'язку між часткою істинних позитивних класифікацій та часткою хибних позитивних класифікацій для діапазону граничних значень, застосований для порівняння 132 зразків MDS з 25 контрольними зразками, продемонстрував, що порогом позитивності була RFI=1,8. Апоптоз визначали шляхом мічення анексином v/7-AAD. Зразки аналізували на пристрої FC500 (компанія Beckman Coulter). Ізоляція і культивування клітин Зразки кісткового мозку від пацієнтів і здорових контрольних суб'єктів збирали шляхом + + стернальної аспірації, і клітини CD34 очищали (85 % клітин CD34 ) на імуноафінних колонках MIDI-MACS (компанія Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Німеччина) (Claessens et al., 2002). + Очищені клітини CD34 культивували на модифікованому за способом Дульбекко середовищі Ігла (DMEM), яке містило 20 % BIT (бичачий сироватковий альбумін, інсулін, голотрансферин) і відповідні цитокіни: фактор стовбурових клітин (SCF) (50 нг/мл), еритропоетин (Epo) (1 МО/мл), -6 інсуліноподібний фактор росту 1 (IGF-1) (40 нг/мл), і 10 М дексаметазону до 10-ої доби -6 культивування, і ЕРО (1 МО/мл) та 10 М інсуліну після цього. Етапи культивування загалом показані на Фіг. 3. Клітини активно ділились до 10 доби і демонстрували незначні дозрівання еритроїдних клітин. Після зміни цитокінів, більшість клітин диференціювалась у еритробласти до 14 доби. Індукція апоптозу CD95L-Т4 у нормальних еритроїдних клітин Нормальні еритроїдних клітини обробляли зростаючими концентраціями CD95L-T4. При певній наданій концентрації визначали вплив CD95L-T4, доданого на ранній стадії комітування еритроїдних клітин, на ріст еритроїдних клітин (BFU-E і загальну ампліфікацію еритроїдних попередників). Досліджували вплив CD95L-T4, доданого до початку активації каспази-3, яка передувала дозріванню еритроїдних клітин. Потім каспази-3 і мішені досліджували із застосуванням протокової цитометрії та вестерн-блотингу. Зважаючи на 1/1 стехіометрію комплексу CD95L-T4/APG101 з афінністю зв'язування 11 нМ у людей, концентрація CD95L-Т4 і APG101 для випробування в культурі була в тому ж самому діапазоні (від 0,01 мкг/мл до 10 мкг/мл). Інгібування APG101 CD95L-T4-індукованого апоптозу у нормальних еритроїдних клітин Нормальні еритроїдних клітини були піддані попередній обробці APG101 із зростаючою концентрацією перед обробкою попередньо визначеною концентрацією CD95L-T4 на ранній стадії ампліфікації еритроїдних клітин або на пізній стадії диференціації чи на обох. Важливо, що додавання CD95L-T4 уникали в зразках з високим рівнем апоптозу на вихідному рівні. Оцінювали вплив APG101 на загальну ампліфікацію еритроїдних клітин, ріст BFU-E, апоптоз, активність каспази-3, розщеплення мішеней каспазою-3 і диференціацію (GPA, цитологія). Інгібування апоптозу MDS еритроїдних клітин APG101 Підвищені концентрації APG101 (від 0,001 мкг/мл до 100 мкг/мл) досліджували - на кількості BFU-E при клоногенних аналізах; - на швидкості ампліфікації; - на апоптозі (активність каспази-3, вплив фосфатиділсерину, мішені каспази-3) - на диференціації еритроїдних клітин (GPA/CD71, цитологічне дослідження, експресія гену еритроїдних клітин в мікрочіпах). 6 UA 116104 C2 + 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Раніше було показано, що Fas надекспресується на фракції клітин CD34 кісткового мозку. Тому порівняння здійснювали між еритроїдними і гранулоцитарними клітинами-попередниками у MDS зразках за конкретних умов культивування для кожної лінії. Досліджували, чи обробка APG101 відновлює нормальну кінетику активності каспази-3 і запобігає розщепленню мішеней каспазою-3. Дослідження зразків на метилцелюлозі Мононуклеарні клітини, виділені з аспіратів кісткового мозку після градієнту Ficoll, висівали в 0,8 % метилцелюлозу, яка містила ембріональну телячу сироватку, BSA (бичачий сироватковий альбумін) і цитокіни (IL3 (0,1 МО/мл), IL6 (10 нг/мл), GM-CSF (5 нг/мл), ЕРО (1 МО/мл) і SCF (20 6 нг/мл) при концентрації 10 клітин/мл). CFU-E і CFU-L підраховували на 7-у добу культивування, а BFU-E і CFU-GFM підраховували на 14-у добу. Додавали зростаючі концентрації APG101. Статистика Біологічні дані аналізували як медіанне значення  середня квадратична помилка середнього. Чутливість та специфічність протокової цитометрії для аналізів Fas і FasL оцінювали із застосуванням ROC-кривої (ROC – робоча характеристика приймача) з виведенням порогового значення. Безперервні змінні порівнювали за допомогою t-критерію Стьюдента (програмне забезпечення Excel 2003, компанія Microsoft). Для оцінки впливу Fas і FasL на загальну виживаність з перебігом часу в двох підгрупах досліджуваної групи пацієнтів застосовували алгоритм оцінювання Каплана-Мейєра і порівнювали з логарифмічним ранговим критерієм. Всі статистичні аналізи були 2-сторонніми, і P-значення менші ніж 0,05 вважались значущими. Статистичні аналізи проводились із застосуванням програмного забезпечення GraphPad. Результати Експресія FasL і діагнозування MDS low + Експресію FasL вимірювали на обох популяціях клітин кісткового мозку (CD45 /CD34 і + CD71 ) в 84 MDS, 21 sAML і 17 контрольних зразках. Рівень FasL був значно більш підвищеним у MDS, ніж у sAML або у контрольних зразках (Фіг. 4а) і, відповідно до ROC, поріг позитивності дорівнював 6. При порівнянні MDS з контрольними зразками, прогностична цінність експресії FasL для розпізнавання MDS та контрольних зразків була доброю (площа під кривою: 0,73; Р=0,002; Фіг. 4В). Клінічна інформація була зібрана у 166 MDS або sAML пацієнтів з відомим значенням експресії Fas на момент постановки діагнозу та у 42 MDS/sAML пацієнтів з відомим значенням FasL на момент постановки діагнозу для дослідження впливу експресії Fas або FasL на прогноз. В групі з 166 пацієнтів з MDS, 41 % був позитивним по FAS, і не демонстрував будь-якої різниці з точки зору віку, статі, параметрів гемограми, % бластів кісткового мозку, мультилінейної дисплазії, каріотипу, IPSS та лікування. Експресія Fas не чинила впливу на загальну виживаність (Фіг. 5). Крім того, експресія Fas не була прогностичною щодо реакції на EPO. В групі з 42 пацієнтів з MDS/sAML, 18 пацієнтів були позитивними на FasL (RFI5). Рівень Hb і медіанне значення загальної виживаності були еквівалентними у FasL-позитивного і FasLнегативного пацієнта (Р=0,57 і P=0,97, відповідно). Крім того, експресія FasL в невеликій групі пацієнтів (n=22) не була прогностичною щодо реакції на лікування. Таким чином, ці дані показують, що Fas і FasL надекспресувались при MDS, і надекспресія FasL є прогностичною щодо MDS. Ні експресія Fas, ні експресія FasL не являють собою прогностичні параметри для загальної виживаності. Вплив APG101 на ріст гемопоетичних клітин-попередників Дослідження показали, що блокування FasL надлишком розчинного Fas (Fas:Fc), а також порушення передачі сигналів Fas через ектопічну експресію домінантної негативної форми адаптерного білку FADD, "рятувало" ріст BFU-E. При дослідженні впливу збільшення концентрації APG101 (0 мкг/мл, 0,01 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл) на еритроїдні і грануло-моноцитарні клітини-попередники в дослідженнях зразків на метилцелюлозі стало зрозумілим, що APG101 не стимулював росту CFU-GM, в той час як спостерігався помірний позитивний вплив на ріст BFU-E (Фіг. 6). Крім того, вплив APG101 на ріст зрілих еритроїдних клітин-попередників (CFU-E) та реакцію лейкозних бластів аналізували шляхом підрахунку кількості CFU-L (нееритроїдні кластери із щонайменше 50 клітин) на 7 добу культивування на метилцелюлозі (Фіг. 7). Було виявлено, що APG101 не "рятував" росту CFU-E і не збільшував кількості CFU-L навіть в зразках від RAEB2 пацієнтів (MDS з більш ніж 10 % бластів на момент постановки діагнозу), що дозволяє зробити припущення про те, що APG101 не стимулює росту лейкозних бластів. + Для подальшого розуміння впливу APG101 на MDS еритропоез, клітини CD34 кісткового мозку від пацієнта з MDS виділяли, і висівали за "еритроїдних умов" для комітування. Клітини 7 UA 116104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 збирали на 5 добу з рідкої культури, і потім висівали на метилцелюлозу для визначення кількості BFU-E і CFU-GM. Як показано на Фіг. 7, початкове число BFU-E було зменшене при MDS у порівнянні з контрольними зразками. APG101 індукував 3-кратне збільшення кількості BFU-E без досягнення нормального рівня. CFU-GM були менш сильно порушені, аніж BFU-E, і не зазнавали впливу з боку APG101. Ці результати свідчать про специфічний вплив APG101 на еритроїдну лінію. Для перевірки впливу APG101 на диференціацію клітин протягом еритропоезу, різні концентрації APG101 додавали в культури клітин при їх переведенні на Epo та інсулін, що співпадало з початком експресії FasL. На 14-у добу культивування загальна кількість клітин зросла в середньому на 60 %, а апоптоз виявився зменшеним до 33 % (Фіг. 9). APG101 не чинив впливу на диференціацію еритроїдних клітин, та, що більш важливо, він не блокував дозрівання клітин (Фіг. 10). Для визначення групи пацієнтів, які могли б одержати користь від цього лікарського препарату, дані досліджень зразків на метилцелюлозі були повторно проаналізовані відповідно до первинних клінічних та біологічних характеристик. Дослідження зразків на метилцелюлозі раніше були визнані як корисний інструмент для прогнозування реакції на Epo, і дані, одержані за їх допомогою, добре корелюють з властивостями еритропоезу (Frisan et al., 2010). По-перше дані клоногенних досліджень були проаналізовані за початковою експресією Fas. Як показано на Фіг. 11, посилення росту BFU-E у присутності 10 мкг/мл APG101 суттєво не відрізнялось у Fas-позитивних і Fas-негативних пацієнтів. По-друге, вплив APG101 аналізували за експресією FasL на CD71-позитивній групі пацієнтів. У цій серії поріг позитивності дорівнював 2,8. FasL-позитивні MDS мали медіанний FasL RFI 3,7, та FasL-негативні пацієнти мали медіанний FasL RFI 2,2. Вплив APG101 не відрізнявся між FasL-позитивних пацієнтів з високим рівнем експресії FasL і FasL-негативних пацієнтів з низьким рівнем експресії FasL. По-третє, намагались встановити можливу кореляцію між впливом APG101 на ріст BFU-E і початковий ріст CFU-L на момент постановки діагнозу. У пацієнтів з надлишком лейкозних кластерів APG101 не "рятував" ріст BFU-E, разом з тим, що він дуже ефективно підвищував кількість BFU-E у пацієнтів з низьким вихідним ростом CFU-L (Фіг. 13, ліворуч). Нарешті, APG101 більш ефективно посилював ріст BFU-E в клітинах кісткового мозку пацієнтів з MDS з сильною зміною еритропоезу на початковому рівні, аніж у пацієнтів зі збереженим еритропоезом (Фіг. 13, праворуч). Суть винаходу + Було показано, що в in vitro культурі гемопоетичних стовбурових клітин (клітини CD34 ) пацієнтів з MDS низького та INT-1 ступеня ризику з тяжким порушенням еритропоезу, APG101 "рятує" ріст еритроїдних клітин. APG101 не сприяє росту лейкозних клітин і тому не збільшує ризик розмноження лейкозних клітин. Надекспресія FasL являє собою прогностичний фактор хвороби. Тим не менш, не було чітко продемонстровано, що експресія Fas або FasL має вплив на загальну виживаність. Fas є одним з головних дійових факторів апоптичного некрозу клітин гемопоетичних клітинпопередників, який призводить до анемії. Тому інгібування взаємодії Fas і FasL з використанням розчинного рецептора Fas (тобто APG101) може "рятувати" еритропоез у пацієнтів з MDS. APG101 "рятує" ріст еритроїдних клітин в підгрупі пацієнтів з MDS з тяжким порушенням еритропоезу і без надлишку лейкозних бластів. APG101 не стимулює ріст лейкозних клітин, який оцінювали шляхом підрахунку CFU-L, проте APG101 був неспроможним "врятувати" ріст BFU-E у пацієнтів з надлишком CFU-L на момент постановки діагнозу. Одночасно APG101 є ефективним щодо "рятування" росту BFU-E в гемопоетичних стовбурових клітинах у пацієнтів з MDS з тяжкими порушеннями еритропоезу на момент постановки діагнозу і без надлишку бластів. Ці пацієнти були попередньо визначені стійкими до еритропоез-стимулювальних агентів (ESA) частково через надекспресію Fas і високий рівень апоптозу (Frisan et al., 2010). Джерела інформації: Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR, et al. Proposals for the classification of the myelodysplastic syndromes. Br. J. Haematol. 1982 Jun;51(2):189-199. Bouscary D, De Vos J, Guesnu M, Jondeau K, Viguier F, Melle J, Picard F, Dreyfus F, FontenayRoupie M. Fas/Apo-1 (CD95) expression and apoptosis in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 1997 Jun;11(6):839-45. Carlile GW, Smith DH, Wiedmann M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood. 2004 Jun 1;103(11):4310-6. Claessens YE, Bouscary D, Dupont JM, et al. In vitro proliferation and differentiation of erythroid 8 UA 116104 C2 5 10 15 20 25 30 progenitors from patients with myelodysplastic syndromes: evidence for Fas-dependent apoptosis. Blood. 2002; 99: 1594-1601. Claessens YE, Park S, Dubart-Kupperschmitt A, Mariot V, Garrido C, Chrétien S, Dreyfus F, Lacombe C, Mayeux P, Fontenay M. Rescue of early-stage myelodysplastic syndrome-deriving erythroid precursors by the ectopic expression of a dominant-negative form of FADD. Blood. 2005 May 15;105(10):4035-42. De Maria R, Zeuner A, Eramo A, Domenichelli C, Bonci D, Grignani F, Srinivasula SM, Alnemri ES, Testa U, Peschle C. Negative regulation of erythropoiesis by caspase-mediated cleavage of GATA-1. Nature. 1999 Sep 30;401(6752):489-93. Frisan E, Pawlikowska P, Pierre-Eugène C, Viallon V, Gibault L, Park S, Mayeux P, Dreyfus F, Porteu F, Fontenay M. p-ERK1/2 is a predictive factor of response to erythropoiesis-stimulating agents in low/int-1 myelodysplastic syndromes. Haematologica. 2010 Nov;95(11):1964-8. Greenberg P, Cox C, LeBeau MM, Fenaux P, Morel P, Sanz G, Sanz M, Vallespi T, Hamblin T, Oscier D, Ohyashiki K, Toyama K, Aul C, Mufti G, Bennett J. International scoring system for evaluating prognosis in myelodysplastic syndromes. Blood. 1997 Mar 15;89(6):2079-88. Liu Y, Pop R, Sadegh C, Brugnara C, Haase VH, Socolovsky M. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 2006 Jul 1;108(1):123-33. Ribeil JA, Zermati Y, Vandekerckhove J, Cathelin S, Kersual J, Dussiot M, Coulon S, Moura IC, Zeuner A, Kirkegaard-Sørensen T, Varet B, Solary E, Garrido C, Hermine O. Hsp70 regulates erythropoiesis by preventing caspase-3-mediated cleavage of GATA-1. Nature. 2007 Jan 4;445(7123):102-5. Socolovsky M, Murrell M, Liu Y, Pop R, Porpiglia E, Levchenko A. Negative autoregulation by FAS mediates robust fetal erythropoiesis. PLoS Biol. 2007 Oct;5(10):e252. Tehranchi R, Fadeel B, Forsblom AM, et al. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits spontaneous cytochrome c release and mitochondria-dependent apoptosis of myelodysplastic syndrome hematopoietic progenitors. Blood. 2003; 101: 1080-1086. Vardiman JW, Thiele J, Arber DA, Brunning RD, Borowitz MJ, Porwit A, Harris NL, Le Beau MM, Hellström-Lindberg E, Tefferi A, Bloomfield CD. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood. 2009 Jul 30;114(5):937-51. Zermati Y, Garrido C, Amsellem S, et al. Caspase activation is required for terminal erythroid differentiation. J Exp Med. 2001;1 93: 247-254. 9 UA 116104 C2 10 UA 116104 C2 11 UA 116104 C2 12 UA 116104 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 1. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування в лікуванні мієлодиспластичного синдрому (MDS), де MDS вибирають з підгрупи MDS низького ступеня ризику (за шкалою IPSS) та/або з підгрупи MDS проміжного-1 (int-1) ступеня ризику (за шкалою IPSS), причому згаданий інгібітор зв'язується з рецептором CD95 (CD95) та/або СD95-лігандом (CD95L). 2. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування за п. 1, який відрізняється тим, що згаданий інгібітор являє собою сполуку, яка посилює ріст еритроїдних клітинпопередників. 3. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що згаданий інгібітор являє собою антитіло, зокрема антитіло або його фрагмент, яке(ий) зв'язує CD95L. 4. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що згаданий інгібітор являє собою молекулу рецептора CD95 або його СD95-лігандзв'язувальну частину і/або інгібітор СD95-ліганду. 5. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що згаданий інгібітор являє собою складений білок, який зв'язується з CD95L. 6. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування за п. 5, який відрізняється тим, що згаданий складений білок містить позаклітинний домен CD95 або його функціональний фрагмент і Fc-домен людського походження або його функціональний фрагмент. 7. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування за п. 6, який відрізняється тим, що згаданий інгібітор являє собою APG101 та/або його функціональну похідну, причому 13 UA 116104 C2 5 10 15 20 APG101 містить домени CD95R (амінокислоти 26-172) послідовності SEQ ID NO:1 та IgGl-Fc (амінокислоти 172-400) послідовності SEQ ID NO:1. 8. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування за будь-яким з пп. 1-7, де група пацієнтів з MDS характеризується підвищеним апоптозом у процесі еритропоезу. 9. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування за будь-яким з пп. 1-8, де група пацієнтів з MDS характеризується тяжким порушенням еритропоезу без надлишку бластів. 10. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування за будь-яким з пп. 1-9, де група пацієнтів з MDS характеризується стійкістю до еритропоезстимулювальних агентів (ESA) та/або колонієстимулювальних факторів. 11. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування за будь-яким з пп. 1-10, який надається у вигляді фармацевтичної композиції, яка містить фармацевтично прийнятні носії, розріджувачі та/або ад'юванти. 12. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування за будь-яким з пп. 1-11, який надається у вигляді фармацевтичної композиції, яка містить щонайменше один додатковий активний інгредієнт, наприклад еритропоезстимулювальний агент та/або апоптозінгібувальний агент. 13. Інгібітор сигнального шляху рецептора CD95 для застосування за будь-яким з пп. 1-12, який має бути введений у загальній кількості від 50 мг/тиждень до 400 мг/тиждень, за варіантом, якому віддають перевагу, від 100 мг/тиждень до 200 мг/тиждень. 14. Фармацевтична композиція, яка містить інгібітор за будь-яким з пп. 1-12, яка додатково містить еритропоезстимулювальний агент. 14 UA 116104 C2 15 UA 116104 C2 16 UA 116104 C2 17 UA 116104 C2 18 UA 116104 C2 Комп’ютерна верстка М. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 19