Застосування рацемату піноцембрину у приготуванні лікарського препарату для лікування удару

Реферат: Винахід стосується застосування рацемату піноцембрину, рацемату солі піноцембрину, рацемату попередника піноцембрину або рацемату гідрату піноцембрину у виробництві лікарського препарату для профілактики та лікування удару, зокрема, гострого ішемічного удару. UA 102874 C2 (12) UA 102874 C2 UA 102874 C2 5 10 15 20 25 Дана заявка заявляє пріоритет китайської патентної заявки № 200810185559.0, поданої 11 грудня 2008 р., та яка має назву "Застосування піноцембрину у приготуванні лікарського препарату для лікування удару", розкриття якої включене в даний документ посиланням. Галузь техніки Даний винахід стосується застосування рацемату піноцембрину у приготуванні лікарського препарату для лікування та профілактики удару. Передумови винаходу (S)-піноцембрин формули II, хімічна назва якого (S)-2,3-дигідро-5,7-дигідрокси-2-беніл-4H-1бензопіран-4-кетон, представляє собою вид нерозчинного у воді флавонону та природну сполуку, екстраговану з прополісу. До того ж, ця сполука також знайдена в екстракті ряду рослин, таких як швейцарська п'ятихвойна сосна, листя евкаліпту та аравійська камедь. З 1980-х років досліди в усьому світі виявили кілька фармакологічних активностей (S)піноцембрину, включаючи антибіотичний, противірусний, антиоксидантний та протизапальний ефекти. Китайська академія медичних наук перша розкрила, що (S)-піноцембрин має функцію інгібування вазоконстрикції, викликаної різними факторами, та захисту багатьох видів нервових клітин від ушкоджень. Деталі можна знайти в документі CN200410037860.9, який розкриває застосування (S)-піноцембрину у лікуванні ішемії головного мозку, наслідків ішемії головного мозку та хвороб, пов'язаних з ураженнями та функціональними змінами нервових клітин, та його механізм захисту ішемічної тканини мозку та нервових клітин головним чином інгібуванням кальпаїну, NO та CRP (C-реактивний білок) та активацією експресії білку теплового шоку у мозку. Загалом (S)-піноцембрин може лікувати церебральний інфаркт. До того ж, Rui Liu та ін. з Китайської академії медичних наук розкрили, що (S)-піноцембрин має функцію захисту нерву, ушкодженого внаслідок ішемічної реперфузії головного мозку або подібних ситуацій, шляхом випробування на ішемію, гіпоксію та апоптоз тканини мозку, викликаних моделлю ішемічної реперфузії мозку (Pinocembrin protects rat brain against oxidation and apoptosis induced by ischemia-reperfusion both in vivo and in vitro. Brain Res. 2008 Jun 24;1216:104-15.). Yonghao Cheng та ін. розкрили синтез рацемату піноцембрину (формула І) (Yonghao Cheng, Yabo Duan, Yan Qi etc., Synthesis of 5,7-dihydroxy-flavanone, Chemical Reagents. 2006, 28(7):437). 30 35 Відомо з рівня техніки, що рацемат не має безпосереднього або безперечного зв'язку з ефективністю. Загалом, їх зв'язок можна звести до наступних кількох ситуацій: рацемат має кращій ефект у порівнянні з енантіомерами; енантіомери мають еквівалентні або близькі активності; енантіомери мають активності різної сили; енантіомери мають протилежні активності; енантіомери мають активності різних типів. Далі ці пункти розкриваються наступними прикладами. 1 UA 102874 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1. Енантіомери взаємно синергічні, тому рацемат має кращій ефект у порівнянні з енантіомерами. Як агоніст α-рецептора лівообертаючий ізомер добутаміну діє на β-рецептор слабко. Аналогічно, як агоніст β-рецептора правообертаючий ізомер добутаміну діє на α-рецептор слабко. Введення рацемату буде мати ефект підвищення скоротності міокарду, але не прискорення частоти серцевих скорочень або підвищення тиску крові. Оскільки це антигістамін, ефективність рацемату ізотипенділу при пероральному введенні в 1,4 рази вища ніж у (-)-ізомеру та в 2,5 рази вища ніж у (+)-ізомеру при пероральному введенні. Причиною вищої ефективності рацемату можливо є те, що один ізомер змінює абсорбцію іншого таким чином, що біологічна доступність останнього зростає, або те, що один ізомер пригнічує рівень метаболізму іншого так, що час дії останнього подовжується. 2. Енантіомери мають еквівалентні активності. Прометазин як антигістамін має одну хіральну молекулу. Хоча його рецептори не мають селективності до енантіомерів лікарського препарату, два його енантіомери мають схожі фармакологічні дії та показують схожі сили фармакологічних активностей. 3. Енантіомери мають активності різної сили. Пропранолол як антагоніст β-рецептора головним чином обумовлюється його лівообертальнім ізомером, що проявляє антагоністичну активність, через те, що його лівообертальний ізомер має таку саму конфігурацію агоніста β-рецептора та може селективно зв'язуватись з β-рецептором, в той час коли його правообертальний ізомер не може. В іншому критичному прикладі L-метилдопа в якості протигіпертонічного лікарського засобу має фармакологічні активності, в той час як D-метилдопа не має активності. 4. Енантіомери мають протилежні активності. Стосовно Bay k8644, структурного аналогa ніфедипіну, його правообертальний енантіомер є кальцієвим антагоністом, в той час коли його лівообертальний енантіомер є кальцієвим агоністом. Два енантіомери мають зовсім протилежні активності. 5. Енантіомери мають фармакологічні активності різних типів. D-енантіомер пропоксифену має сильну анальгетичну активність, яка у 6 разів вище активності L-енантіомеру, але не має протикашльового ефекту. Напроти, L-енантіомер пропоксифену має сильний протикашльовий ефект (Medicinal Chemistry, edited by Wensheng Ji, Anliang Li, Higher Education Press: 25-26). Крім того, з вищевказаних прикладів відомо, що відповідно до відомої фармакологічної активності (S)-піноцембрину, її неможливо визначити без випробувань, який з рацемату піноцембрину або (R)-піноцембрину має аналогічні (S)-піноцембрину фармакологічну активність та ефект. Наступні документи знаходяться в рівні техніки. Xiaoming Zhu та ін. розкрили, що піноцембрин може розширювати судину грудної аорти ендотелій-залежним механізмом та ендотелій-незалежним механізмом (Zhu XM, Fang LH, Li YJ, Du GH. Endothelium-dependent та Endothelium-independent relaxation induced by pinocembrin in rat aortic rings. Vascul Pharmacol. 2007; 46(3): 160). Mei Gao та ін. розкрили, що піноцембрин може знижувати індуковане глутаматом ушкодження клітин та апоптоз, а також зменшувати можливість апоптозу, який забезпечує прояв нейрозахисної активності піноцембрину на його ефект проти ішемії головного мозку (Mei Gao, Wen-cui Zhang, Qing-shan Liu, Juan-juan Hu, Geng-tao Liu, Guan-hua Du. Pinocembrin prevents glutamate-induced apoptosis in SH-S Y5Y neuronal cells via bax/bcl-2 ratio decrease. Eur J Pharmacol. 2008, 591(1-3):73-9). Mei Gao та ін. розкрили, що піноцембрин може захищати судини та нерви головного мозку від необоротної ішемії головного мозку у щурів (Acute neurovascular unit protective action of pinocembrin against permanent cerebral ischemia in rats. J Asian Nat Prod Res. 2008 May-Jun; 10(56): 551-8). Уперше була доказана захисна дія піноцембрину проти необоротної фокальної ішемії головного мозку. Цей механізм досі у стані дослідження. Hongmei Guang та ін. отримали модель недостатнього кровопостачання мозку білатеральним перев'язуванням сонної артерії та визначенням когнітивної функції тестом водного лабіринту Моріса. Було розкрито, що піноцембрин міг призводити до зменшення когнітивної дисфункції у щурів, викликаної недостатнім кровопостачанням мозку, та його механізм полягав у тому, що піноцембрин може захищати структуру та функцію мітохондрії (Protections of pinocembrin on brain mitochondria contribute to cognitive improvement in chronic cerebral hypoperfused rats. Eur J Pharmacol. 2006 Aug 7; 542 (1-3): 77-83). Вищезгадані документи розкривають в деякому обсязі фармакологічні активності піноцембрину, але обмежені дією розширення судин та нейроваскулярним захистом. 2 UA 102874 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відомо з рівня техніки, що гострий ішемічний удар головного мозку (ішемічна апоплексія головного мозку) має високу захворюваність, високу смертність та високий ступінь інвалідності. Зараз найбільш ефективним лікуванням є тромболізис. Чим раніше виконують тромболізис, тим кращій ефект лікування. Клінічний досвід багатьох минулих років показав, що лікування пацієнтів з ударом потребує швидкого реагування. Після того, як мозкову артерію блокують, клітини головного мозку в ішемічній зоні будуть швидко запускати каскадну електрохімічну ланцюгову реакцію та будуть продукувати надлишок вільних радикалів, активувати приток іонів кальцію, перевантажувати внутрішньоклітинними іонами кальцію та остаточно призводити до незворотного ушкодження у тканині мозку. Отже, час від приступу удару до початку лікування потрібно мінімізувати, наскільки це можливо. В клінічній практиці ішемічний удар головного мозку можна поділити за наступними типами: надпочаткова стадія, в межах 6 годин від початку; початкова стадія, протягом 6-72 годин від початку; гостра більш пізня стадія, протягом 72 годин - 1 тижня після початку; стадія відновлення, 1 тиждень після початку. Під час надпочаткової стадії ішемічного удару інфаркт головного мозку ще не виникає. Якщо нормальне кровопостачання можна швидко відновити та шкідливі метаболіти в ішемічних тканинах можна видалити, пацієнти будуть мати гарну можливість відновитись повністю. Тому лікування на надпочатковій стадії буде найкращою можливістю та буде давати гарний результат. Аж до ранньої стадії ішемічного удару, стійка ішемія, гіпоксія та особливо ушкодження гематоенцефалічного бар'єру призводять до того, що, як правило, утворюються зони центрального інфаркту. Лікування на цій стадії втрачає частину терапевтичного значення у порівнянні з надпочатковою стадією лікування. У 1996 р. рекомбінантний тканинний активатор плазміногену (tPA) пройшов клінічну валідацію FDA (Федеральне управління лікарськими засобами) та був схвалений для застосування в межах 3 годин після початку гострого ішемічного удару. Це єдиний лікарський препарат, який довів ефективність при лікуванні ішемічного удару. Обмежені терапевтичного інтервалом часу 95 % пацієнтів з гострим ударом за кордоном не можуть отримати своєчасного лікування тромболізисом, а в Китаї кількість пацієнтів, які отримують терапію тромболізисом, складає менш ніж 1 %. Протягом останнього десятиріччя наукові пошуки нейропротекторних засобів стали критичною точкою в лікуванні удару. Але в 114 дослідах удару (передбачені до 49 нейропротекторних засобів) у світі кілька дослідів були доказані успішними. Це означає, що досі жоден нейропротекторний засіб не є безпечним та ефективним при лікуванні гострого ішемічного удару. З вищевказаних аналізів можна побачити, що окрім tPA лікарські засоби для ефективного лікування удару досі потребують клінічної практики, та навіть tPA обмежений терапевтичним інтервалом часу лише 3 години. Вміст даного винаходу Експериментально даний винахід розкриває, що рацемат піноцембрину може бути використаний для лікування удару. Порівняно з (S)-піноцембрином рацемат піноцембрину має довший терапевтичний інтервал часу (приблизно 6 годин) та протягом довшого періоду часу після початку удару все ще буде мати терапевтичний ефект. Подовження терапевтичного інтервалу часу дає більше можливостей пацієнтам з ішемічним ударом. Експерименти на тваринах показують, що рацемат піноцембрину має значні терапевтичні ефекти. Однією ціллю даного винаходу є забезпечення застосування рацемату піноцембрину, рацемату солі піноцембрину, рацемату попередника піноцембрину або рацемату гідрату піноцембрину у виробництві лікарського препарату для лікування удару. Термінологія "рацемат" передбачає еквімолярну суміш хіральної молекули з оптичною активністю та її енантіомера, яку формують змішуванням еквівалентних кількостей двох молекул з протилежними обертаннями та еквівалентними обертальними силами так, що їх обертання нейтралізуються внаслідок їх внутрішньомолекулярної дії. Сіль піноцембрину представляє собою фармацевтично прийнятну сіль піноцембрину, таку як гідрохлорид, сульфат, цитрат та інше. Попередник піноцембрину представляє собою проліки піноцембрину, тобто сполуку, яка може здійснювати фармакологічні активності тільки після перетворення на піноцембрин шляхом перетворення in vivo. Переважно, удар представляє собою гострий ішемічний удар. Експериментально виявлено, що: 1) рацемат піноцембрину можна використовувати для лікування удару; 2) рацемат піноцембрину може покращувати зміни поведінки, викликані гострим ішемічним ударом; 3 UA 102874 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 3) рацемат піноцембрину може зменшувати зниження кровотоку мозку, викликане гострим ішемічним ударом; 4) рацемат піноцембрину може зменшувати об'єм інфаркту головного мозку, викликаного гострим ішемічним ударом; 5) рацемат піноцембрину може зменшувати набряк мозку, викликаний гострим ішемічним ударом; 6) рацемат піноцембрину може покращувати енергетичний метаболізм, викликаний гострим ішемічним ударом; 7) рацемат піноцембрину може зменшувати гостре запалення, викликане гострим ішемічним ударом; 8) рацемат піноцембрину може захищати нервові клітини від ушкодження, викликаного гострим ішемічним ударом. Отже, даний винахід також стосується фармацевтичної композиції рацемату піноцембрину, яка містить рацемат піноцембрину, рацемат солі піноцембрину, рацемат попередника піноцембрину або рацемат гідрату піноцембрину та фармацевтично прийнятний наповнювач. Композиція даного винаходу може бути придатною для перорального, крізьшкірного, м'язового, внутрішньовенного введення або введення в слизову. Композиція даного винаходу може бути твердим або рідким препаратом, який можна приготувати загальноприйнятим способом. Композиція даного винаходу може бути рідким препаратом, переважно ін'єкцією. Ін'єкцію готують інкапсуляцією рацемату піноцембрину з циклодекстрином або його похідними, а потім додають придатний наповнювач. Даний винахід також забезпечує застосування (R)-піноцембрину, його солей, його попередників або його гідратів у виробництві лікарського препарату для лікування та профілактики удару, у якому удар представляє собою ішемічний удар або геморагічний удар. Рацемат піноцембрину, який використовують в даному винаході, має перевагу низької токсичності та може бути застосованим для лікування гострого ішемічного удару. Короткий опис графічних матеріалів Фігура 1 показує ефекти рацемату піноцембрину на об'єм інфаркту. Фігура 2 показує ефекти рацемату піноцембрину на експресію TNF-α (фактор некрозу пухлин), IL-1β (інтерлейкін-1β), ICAM-1 (молекула міжклітинної адгезії 1), VCAM-1 (молекула адгезії судинного ендотелію 1 типу), iNOS (ген індуцибельної оксидсинтетази) та AQP-4 (аквапорин) в ішемічних тканинах головного мозку після MCAO (закупорювання середньої артерії головного мозку) протягом 24 годин; на якій A показує ефекти DL0108 на експресію TNF-α, IL-1β, ICAM-1, VCAM-1, iNOS та AQP-4; B представляє собою статистичну діаграму, яка кількісно визначає експресію TNF-α, IL-1β, ICAM-1, VCAM-1, iNOS та AQP-4 β-актином в якості внутрішнього стандарту. Фігура 3 представляє собою фігуру забарвлення Нісля (200×) області CA1 у корі головного мозку та гіпокампі, на якій A: група імітації операції; B: модельна група; C: група німодипіну 3 мг/кг; D: група DL0108 (рацемат піноцембрину) 1 мг/кг; E: група DL0108 (рацемат піноцембрину) 3 мг/кг; F: група DL0108 (рацемат піноцембрину) 10 мг/кг. Конкретні шляхи виконання даного винаходу Даний винахід ілюструють зокрема наступними прикладами. Приклад 1: Ефекти профілактики та лікування удару спонтанно гіпертензивних щурів, схильних до удару (SHRSP) 1. Тестові лікарські засоби: рацемат піноцембрину для ін'єкцій, (R)-піноцембрин для ін'єкцій та (S)-піноцембрин для ін'єкцій, які забезпечені Дослідницькою лабораторією нових лікарських засобів Науково-дослідного інституту лікарських засобів Китайської академії медичних наук (номер партії: 20050601, вміст: 2,36 %) та приготовані способом, розкритим в CN200810084682.3, тобто формуванням комплексу включення рацемату піноцембрину або енантіомерів піноцембрину з циклодекстрином або його похідними та розчиненням комплексу в фізіологічному розчині при застосуванні. Німодипін в якості лікарського засобу позитивного контролю був закуплений у Bayer Company (Німеччина). 2. Експериментальні тварини та групування Експериментальні тварини: 110 SHRSP щурів та 10 нормальних щурів Вістар віком 6 тижнів. 4 UA 102874 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Експериментальне групування: Щури Вістар були нормальною групою; SHRSP щури були згруповані як модельна група, група німодипіну (3 мг/кг), групи низької, середньої та високої дози рацемату піноцембрину (3, 10 та 30 мг/кг/день, відповідно), групи низької, середньої та високої дози (R)-піноцембрину (дози якого були ідентичні таким в групах рацемату піноцембрину, відповідно) та групи низької, середньої та високої дози (S)-піноцембрину (дози якого були ідентичні таким в групах рацемату піноцембрину, відповідно). 3. Експериментальний спосіб Окрім щурів з нормальної групи всі SHRSP щурі випивали 1 % розчин хлориду натрію щоденно. Лікарські засоби вводили у прописаних дозах відповідно для щурів групи німодипіну (3 мг/кг), груп низької, середньої та високої дози рацемату піноцембрину (3, 10 та 30 мг/кг/день, відповідно), груп низької, середньої та високої дози (R)-піноцембрину (дози якого були ідентичні таким в групах рацемату піноцембрину, відповідно) та груп низької, середньої та високої дози (S)-піноцембрину (дози якого були ідентичні таким в групах рацемату піноцембрину, відповідно). Фізіологічний розчин такого самого об'єму вводили модельній групі. Введення продовжували протягом 14 днів після приступу удару. 4. Стандарт початку удару Виникнення конвульсії однієї кінцівки, пари передніх кінцівок або всього тіла; виникнення геміплегії або загального паралічу, припадання живота до землі та нездатність встати; до більш серйозних, виникнення систематичного дрібного тремтіння, повзання, периферичного паралічу, навіть смерті. Крім симптомів, перерахованих вище, у деяких тварин можна спостерігати збудження (стрибання або підскакування). Як тільки спостерігали будь-який з вищевказаних симптомів, встановлювали початок удару та записували час початку для кожної тварини. 5. Набір зразків 1) Після останньої дози щурам не давали їсти протягом 6 годин та зразки крові зібрали забором крові в очному дні. Після декапітації цілий мозок щурів відділяли у льодоформах для застосування. 2) 3 мл крові швидко по краплях налили в кювету з 1 мл 0,074 % гепарину та перемішали. Загальну в'язкість крові, в'язкість плазми, індекс агрегації червоних кров'яних клітин (RBC) та індекс деформації RBC визначали детектором гемореології згідно його технічних вимог. 3) 2 мл крові швидко по краплях налили в кювету з 0,2 мл 0,13 моль/л цитрату натрію та перемішали. Суміш центрифугували протягом 10 хвилин при 1000 обертів на хвилину та коефіцієнт агрегації тромбоцитів визначали вимірювачем агрегації тромбоцитів згідно його технічних вимог. 4) 1 мл крові швидко по краплях налили в кювету з 0,1 мл 0,109 моль/л цитрату натрію та перемішали. Суміш центрифугували протягом 15 хвилин при 3000 обертів на хвилину та фібриноген плазми у рідкому супернатанті визначали ферментним імуносорбентним аналізом (ELISA). 5) 2 мл крові швидко по краплях налили в кювету з 30 мкл 7,5 % ЕДТУ-2Na і 40 мкл апротиніну та перемішали. Після центрифугування протягом 5 хвилин при 3000 обертів на хвилину ET-1 (ендотелін-1) плазми у рідкому супернатанті визначали ізотопним радіоімуноаналізом. 6) Цілі тканини мозку зважили одну за одною, висушили у вакуумній печі при 110±5 C протягом 48 годин, та потім знову зважили. 6. Індекси, що спостерігаються 1) Спостерігають стан організму тварин кожної групи після моделювання: включаючи зовнішній вид організму, психічний стан, чутливість, положення тіла при переміщенні, спонтанну активність, кількість води та їжі, вагу організма та ін. Оцінки неврологічних симптомів після початку удару 50 Оцінка СИМПТОМИ 0 нормальні 1 менше переміщення або помірне збудження конвульсія однієї передньої кінцівки або голови, є неактивним в куті клітки або 2 роздратоване збудження (поява стрибання або підскакування) параліч як передньої кінцівки, так і задньої кінцівки з однієї сторони або однієї передньої 3 кінцівки, нахил тіла, труднощі при ходьбі припадання животом до землі та неможливість встати, тетраплегія та дрібне тремтіння 4 усього тіла 5 UA 102874 C2 5 10 15 Після початку удару оцінки протягом 14 днів записували для кожної тварини, а оцінки в групах лікування порівнювали з оцінками у контрольної групи. 2) Гемореологія: включаючи загальну в'язкість крові, в'язкість плазми, індекс агрегації RBC, індекс деформації RBC та коефіцієнт агрегації тромбоцитів. 3) Фібриноген плазми. 4) ET-1 плазми. 5) Вміст води у мозку: залежно від ваги цілої тканини мозку перед та після розміщення у вакуумну піч, дані застосовували у наступній формулі та підраховували: Вміст води у мозку = (сира вага – суха вага) / сира вага ×100 %. 6. Статистичні способи: результати показали в форматі x ±SD (стандартне відхилення), та порівняння даних аналізували однофакторним дисперсійним аналізом (ANOVA). 7. Результати експерименту 1) Смерть щурів Загалом 24 щури вмерли під час експерименту. Після аналізу патологічної аутопсії виявили, що 4 з них вмерли через геморагічний удар, а інші 20 щурів вмерли через ішемічний удар. Деталі можна побачити в таблиці 1. Таблиця 1 Смерть щурів та таблиця аналізу Доза (мг/кг) Нормальні - - Модельні - 33,7±5,1 Німодипін Рацемат піноцембрину 3 30 10 3 30 (R)-піноцембрин 10 Кількість щурів Перед Після експериекспериментом менту 10 10 Час початку удару (d) Група 4 41,6±12,8 ** 43,9±6,4 ** 42,7±7,2 * 40,1±8,7 * 41,8±6,9 10 10 10 10 10 10 9 10 10 7 39,8±7,8 * 10 7 3 30 37,7±8,4 * 41,5±5,8 10 10 9 7 10 37,6±7,3 10 6 3 (S)-піноцембрин 10 34,3±6,9 10 7 * Причини смерті -геморагічний: 1 ішемічний удар: 5 -ішемічний удар: 1 --ішемічний удар: 3 геморагічний удар: 1 ішемічний удар: 2 ішемічний удар: 1 ішемічний удар: 3 геморагічний удар: 2 ішемічний удар: 2 ішемічний удар: 3 При порівнянні з модельною групою *P