Спосіб виготовлення препарату на основі азотфіксуючих бактерій – продуцентів екзополісахаридів

1 Спосіб виготовлення біопрепарату на основі азотфіксуючих бактерій - продуцентів екзополі сахаридів, що включає підготовку поживних середовищ з гелеутворюючими компонентами, стерилізацію, перевірку на наявність сторонньої мікрофлори і вирощування азотфіксуючих бактерій у поживних середовищах, який відрізняється тим, що як складові поживного середовища для культивування бактерій вибрані меляса, кукурудзяний екстракт та силікагель, що утворюється безпосередньо у середовищі з рідкого скла і соляної кислоти 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що поживне середовище містить 1,2 % рідкого скла, 5,0 % меляси, 1,0 % кукурудзяного екстракту, соляної кислоти (20 %-ний розчин НСІ) до рН середовища 7,2-7,5 Винахід відноситься до прикладної мікробіологи, а саме до способу виготовлення препаративної форми азотфіксуючих бактерій (діазотрофів) для підвищення урожайності сільськогосподарських рослин За найближчий аналог обрано спосіб виготовлення препарату азотфіксуючих штамів агробактерій на торф'яній основі - ризоагрин (ТУ 565 1032407-002-92) Ризоагрин призначений для передпосівної обробки насіння злакових культур з метою підвищення їх врожайності і якості Дія ризоагрину основана на використанні здатності дізотрофних агробактерій фіксувати атмосферний азот в асоціації з рослинами В основі ризоагрину - культура бактерій Agrobactenum radiobacter 204 (А С СССР №162143 C05F11/08, C12N1/20) Клітини агробактерм являють собою рухомі палички шириною 0,8мкм і довжиною 1,5 - З.Омкм Спор не утворюють Грам негативні На середовищах з вуглеводами утворюють густий полісахаридний слиз Спосіб виготовлення ризоагрину включає отримання шокуляційних культур, які вирощують, поступово збільшуючи об'єм ємностей, у колбах, бутлях, ферментерах з коефіцієнтом заповнення поживним середовищем 0,6% при постійної аера ції, температурі 28 - 30°С протягом 48 годин Отриману культуральну рідину використовують для інокуляції стерильного торфу (гама-торфіну) За наповнювач у ризоагрині використовується торф з рН 4,5 - 5,0 Його висушують до повітряносухого стану (20 - 25% вологості), розмелюють на млинах з одночасним просіюванням до розміру часток не більше 1мм Розмолотий торф завантажують у змішувач і додають біля 5% СаСОз або доломітову муку для отримання рН 6,8 - 7,0 та воду для отримання вологості 35 - 40% Після цього торф розфасовують у поліетиленові пакети і стерилізують, гамма-промінням в яких є Со60, дозою 2,5 - 5,0Мрад Далі стерильний торф заражають ІН'ЄКЦІЄЮ охолодженої до 3 - 8°С суміші інокуляційної культури азотфіксуючого штаму бактерій із розчином поживних добавок (2% меляси, 1% кукурудзяного екстракту) Ознаками прототипу, що збігаються із суттєвими ознаками винаходу є спосіб отримання шокуляційних культур підготовка поживного середовища, його стерилізація, перевірка на наявність сторонньої мікрофлори та уведення в нього азотфіксуючих бактерій, культивування азотфіксуючих бактерій при визначених технологічних параметрах Причинами, що перешкоджають досягненню очікуваного технічного со о (О ю 56032 результату при використанні прототипу є використання торфу за субстрат-наповнювач, що потребує значної енергоємності при отриманні гаматорфину, а також потребує його висушування, розмелювання, нейтралізацію, зволожування, при цьому виявляється нестабільність фізико-хімічних властивостей і висока інфікованість різними мікроорганізмами Окрім того, в Україні відсутнє виробництво гама-торфіну для вироблення торф'яних біопрепаратів, а механізація процесу обробки насіння препаратом зв'язана з великими труднощами із-за нерозчинності торфу В основу винаходу, що заявляється, поставлено технічну задачу створення способу виготовлення препаративної форми діазотрофних бактерій, що продукують речовини полісахарид ноі природи у середовищах з вуглеводами, зокрема агробактерій Технічним результатом винаходу є виготовлення поживного середовища з утворюючим мінеральний гель компонентом, що дозволило виключення енергоємної і дорогої стадії виготовлення препарату, а саме, підготовки гама-торфіну, і, як результат цього, зниження коштовних і трудових витрат технологічного процесу як виготовлення, так і застосування Поставлена технічна задача вирішується шляхом підготовки поживних середовищ з гельутворюючими компонентами, їх стерилізації, перевірці на наявність сторонньої мікрофлори і вирощування азотфіксуючих бактерій у поживних середовищах, при цьому, в якості складових поживного середовища для культивування бактерій обрані меляса, кукурудзяний екстракт та силікагель, що утворюється безпосередньо у середовищі з рідкого скла і соляної кислоти Поставлена технічна задача вирішена спільно в Південному філіалі Інституту сільськогосподарської мікробіологи УААН і Інституті агроекології та біотехнологм УААН, де розроблено спосіб виробництва біопрепарату на основі середовища з мінеральним гелем і використанням властивості мікроорганізмів синтезувати захисні екзополісахариди в підібраному поживному середовищі У способі виготовлення препарату на основі агробактерій, що містить виготовлення поживних середовищ, який включає їх нейтралізацію, стерилізацію, перевірку на наявність сторонньої мікрофлори, розмноження посівного матеріалу азотфіксуючих бактерій, уведення у рідке поживне середовище азотфіксуючих бактерій і їх культивування у підібраному технологічному режимі, згідно винаходу, за поживне середовище використовують середовище, в якому у процесі виготовлення утворюється силікагель з уведених для цього компонентів, стимулюється синтез нативних екзополісахаридів бактеріями Мінеральний гель та екзополісахариди азотфіксуючей бактеріальної культури, що синтезуються у процесі м росту та розвитку, сприяють збереженню життєздатності та азотфіксуючої активності діазотрофів Найбільш важливими перевагами нової препаративної форми перед торф'яною є об'єм гектарної порції нового препарату в дватри рази менше торф'яного, собівартість нового препарату нижче торф'яного і його легше поставити на виробничу основу, він майже увесь розчиняється у воді, що виключає втрату титру при десорбції з поверхні твердих частинок, обробка насіння новим препаратом не потребує використання клейких речовин, що є необхідним при обробці торф'яним препаратом, завдяки рідкої консистенції суспензії нового препарата у воді, згідно технологи, процес обробки насіння можна механізувати Як показали польові дослідження, за ефективністю дії на урожайність обидві форми біопрепаратів практично однакові (таблиця 1) Використання нового способу виготовлення біопрепарату на основі азотфіксуючих бактерій дозволяє одержати ВИСОКОЯКІСНІЙ біопрепарат за значно нижчими, у порівнянні з найближчим аналогом, енергоємністю та трудовитратами на його виробництво та застосування Приклад Спосіб здійснюється таким чином Виготовлюють розчин у воді мінеральних речовин, джерел вуглецю і азоту (г/л) K2NPO4 0,5, MgSO4 0,3, ЛІГНІН фракції до 0,2мм 30,0, Рідке скло 12,0, Меляса 50,0, Кукурудзяний екстракт 10,0, Вода водопровідна 1000 рН до 7,2 - 7,5 довести 20%-ним розчином соляної кислоти Одержане поживне середовище розливають, ВІДПОВІДНО стадії технологічного процесу виготовлення, у колби (стерилізувати при 1 атмосфері протягом 1 години) і бутлі (стерилізувати при 1,5 атмосферах протягом 1,5 годин), потім охолоджують Перевіряють якість стерилізації методом висіву однієї краплини середовища на МПА з вуглеводами і інкубуванням при температурі 28° і 37°С Далі, дотримуючись правил антисептики стерильне поживне середовище заражають посівним матеріалом з агарового косяка і вирощують маточну культуру на качалці при 220об /хв і температурі 27 - 30°С протягом двох діб Одержаною маточною культурою заражають поживне середовище у бутлях, тобто вливають и у КІЛЬКОСТІ 5 - 10% від об'єму середовища у бутлях, і культивують до одержання густої консистенції 4 доби при тому ж режимі Визначають титр біопрепарату методом граничних розведень з висівом на гороховий агар Готовий біопрепарат містить живі клітини азотфіксуючих бактерій (титр 1 - 5млрд, клітин в 1мл), має коричневий колір, в'язку консистенцію, характерний запах Зберігають препарат розфасованим по ЮОмл (1 гектарна порція) у пакети з поліетиленової ПЛІВЦІ при температурі 3 - 8°С до 6 МІСЯЦІВ ЯКІСТЬ препарату визначають титр бактерій методом граничних розведень з наступним висівом на відповідне потребам мікроорганізму, що культивують, середовище, зокрема гороховий агар, чистоту - висівом на м'ясопептоний агар з вуглеводами Титр препаратів одержаних за способом, що запропоновано Agrobactenum radiobacter штам 56032 204 - 3,7млрд клітин у 1мл, Alcahgenes paradoxus штам 060207 - 3,5, Agrobactenum radiobacter штам 10 - 3,8, Bacillus polymyxa П - 0,4 (таблиця 2) Застосування біопрепарату ЮОмл препарату розмішують у водопровідної воді (2% води від маси насіння) і вручну або механізовано рівномірно наносять на одну гектарну норму насіння Обробку насіння проводять у день посіву або безпосередньо перед посівом Біопрепарати на основі азот фіксуючих бактерій поліпшують мінеральне харчування сільськогосподарських рослин, підвищують їх урожайність і якість одержаної продукції рослинництва Токсикологічна оцінка показала екологічну та біологічну безпечність використаних діазотрофів при виробництві та застосуванні біопрепаратів на їх основі Таблиця 1 Спосіб виготовлення препарату на основі азотфіксуючих бактерій - продуцентів екзополісахаридів Варіант досліду Контроль Рідка культура Урожайність, ц/га Чорний пар 52 53 Прибавка, ц/га 1 Новий препарат Торф'яний препарат HIPos Контроль Рідка культура Новий препарат Торф'яний препарат HIPos 60 8 56 4 2 Стерня 18 24 6 25 7 27 9 2 Таблиця 2 Вид і штам діазотрофних бактерій Культура, під яку Млрд, клізастосовується тин у 1мл препарат препарату Agrobactenum raпшениця diobacter 204 Agrobactenum raовочеві diobacter 10 Alcahgenes paraрис, пшениця doxus 060207 Bacillus polymyxa пшениця, ячмінь, П овочеві Підписано до друку 05 05 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24 3,7 3,8 3,5 0,4